UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA
Avaliação in vitro da adesão e proliferação de células
mesenquimais do ligamento periodontal humano em diferentes
superfícies de titânio
Rodrigo Alves Ribeiro
Natal/RN
2011
1
Rodrigo Alves Ribeiro
Avaliação in vitro da adesão e proliferação de células
mesenquimais do ligamento periodontal humano em diferentes
superfícies de titânio
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós Graduação em Odontologia do CCS/UFRN,
como requisito parcial para obtenção do grau de
mestre em Odontologia, com área de concentração
em Periodontia e Prótese Dentária.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Natal/RN
2011
2
Dedico este trabalho...
À Deus,
“Você se fez presente em todos os momentos,
firmes ou trêmulos. E passo a passo, pude sentir
suas mãos nas minhas, trasmitindo-me a segurança
necessária para enfrentar meu caminho a seguir...”
(Vinícuis de Moraes)
À minha Família;
Henry, Socorro e Camila,
dedico à vocês, que estão ao meu lado e que
me fazem sentir seguro a cada passo dado. Sem
vocês não teria conseguido.
3
Agradecimento Especial
À DEUS, por me permitir enxergar muito além daquilo que se
postava em minha frente, por me dar forças quando eu julgava não mais as
ter, pela saúde, pelos amigos e por, através dos obstáculos, mostrar-me a
força, o potencial e a fé existentes em mim.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, meu
profundo agradecimento pelos valiosos ensinamentos acadêmicos e de
vida, por toda confiança depositada, apoio, paciência, estímulo e pelo
exemplo de competência e simplicidade que representa em minha formação
acadêmica. Que Deus o abençoe e ilumine.
Ao Prof. Dr. José Sandro Pereira da Silva, pelas amostras de
titânio, pela disposição constante em ajudar e por sua incansável vontade
de aprimoramento deste trabalho, além dos muitos conhecimentos
transmitidos e tempo dispensado. Muito obrigado!
4
Agradecimentos
Ao Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, na pessoa de seu chefe, Prof. Dr. Ricardo Calazans, da
qual tenho orgulho de fazer parte da minha formação.
Ao Laboratório de Processamento a Plasma (LabPlasma), em nome
do seu coordenador, Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior, por ter oferecido
todas as condições para as etapas laboratoriais desse estudo.
Ao Prof. Dr. Hugo Rocha, pela cessão do laboratório de cultivo
celular do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da
UFRN e aos seus alunos Raniere e Ruth pela ajuda dispensada
Ao meu Pai, Henry Rodrigues Ribeiro, por não ser somente um Pai,
mas um amigo fiel, com quem eu sempre pude contar. E que ensinou, com
seu exemplo, os princípios de honestidade, humildade e apoiou-me nas
conquistas e dificuldades incondicionalmente, com muito amor e carinho.
À minha mãe, Maria do Socorro Alves Soares, essencial alicerce,
porto seguro onde encontro paz e muito amor, que transforma minhas
angústias, agitações e tristezas, em segurança e força. Braço direito que
esteve ao meu lado em todos os momentos em que o chão me faltou aos
pés.
À minha namorada Bárbara Vanessa de Brito Monteiro, por seu
incentivo, apoio, compreensão e companheirismo, que tanto contribuiu
para esta conquista, e por me dar forças quando essa tendia faltar.
Obrigado pelo seu amor e carinho.
À minha irmã, Camila Alves Ribeiro, pela amizade, apoio e
incentivo durante toda esta jornada.
5
Ao Professor e amigo, Dr. Josué Alves, agradeço pela força e
incentivo dado para o começo de uma carreira acadêmica. É um grande
exemplo para minha vida profissional.
Ao amigo Rodrigo Gadelha Vasconcelos, exemplo de humildade,
bondade e esforço. Sua valiosa ajuda e dedicação foi fundamental no
desenvolvimento dos experimentos laboratoriais deste trabalho. Meu
sincero agradecimento!
À aluna de iniciação científica, Fernanda Ginani, por compartilhar
o conhecimento sobre cultura celular na fase experimental deste estudo.
Ao amigo Alexandre da Cunha Diniz, pela solidariedade em todos
os momentos, incentivo, amizade constante e alegria sempre presente
durante nossa convivência diária. Obrigado por tudo e conte comigo,
sempre.
À amiga que com o tempo e as circunstâncias de convivência tornouse muito querida, Anna Paula Serêjo da Costa. Que todo o suporte e
ombro-amigo que você me deu te retornem em bênçãos. Obrigado por toda
paciência, compreensão, sincera amizade e carinho. Uma alegria
compartilhada se transforma em dupla alegria; uma dor compartilhada,
em meia dor. Obrigado por tudo.
À todos os colegas do curso de mestrado por compartilharem suas
experiências, em especial aos amigos Eudes Euller, Maria Regina, Jânio
Rêgo, Gisele Chaves, Ângela Medeiros, Jaiane Ribeiro, Camila e Alberto
Gurgel. Aprendi muito com vocês.
Aos Professores da disciplina de Periodontia, Dr. Bruno Gurgel e
Dra. Delane Rego pelos valiosos ensinamentos transmitidos,
engrandecendo nossa formação.
Aos Professores da disciplina de Prótese Dentária, Dra. Adriana da
Fonte Porto Carreiro, Dr. Gustavo Augusto Seabra Barbosa, Dra.
6
Patrícia dos Santos Calderon e Dr. Ricardo Calazans pelo importante
conhecimento científico que nos foi proporcionado.
Ao Prof. Dr. Kênio Costa Lima, pela grande ajuda na realização da
análise estatística deste trabalho.
Aos Professores Dra. Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa e Dr. José
Sandro Pereira da Silva, pela participação na banca da qualificação,
contribuindo para o aprimoramento deste trabalho de dissertação.
À TODOS os professores do Programa de Pós-gaduação em
Odontologia da UFRN, pela competência em ministrar as disciplinas do
curso.
Aos funcionários, Sandra e Lucas, meus agradecimentos pela
eficiência, disponibilidade, paciência e colaboração.
Ao Departamento de Energia Nuclear, na pessoa da Profa. Dra.
Helen Jamal Khoury, pela colaboração na irradiação das amostras.
À Profa. Dra. Christina Alves Peixoto, do CETENE (UFPE), pela
realização da Microscopia Eletrônica de Varredura.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo suporte financeiro na forma de bolsa de mestrado.
À toda minha família e amigos, pelo estímulo no sucesso deste
trabalho e pela compreensão em todos os momentos de ausência.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho, meu sincero agradecimento!
7
“Entrega o teu caminho ao Senhor,
Confia Nele, e Ele o fará”
Salmos 37:5
8
RESUMO
Nos últimos anos, várias pesquisas científicas em Implantodontia têm buscado
alternativas que proporcionem maior rapidez e qualidade no processo de
osseointegração. Diferentes métodos de tratamento podem ser utilizados para
modificar as propriedades topográficas e químicas da sua superfície do titânio,
a fim de otimizar as reações tecido-implante através de uma resposta tecidual
favorável. O presente trabalho teve como objetivo analisar a adesão e
proliferação de células mesenquimais de ligamento periodontal humano a
diferentes superfícies de titânio, através de técnicas de cultivo celular. Discos
de titânio grau II receberam diferentes tratamentos de superfície, constituindo
dois grupos distintos: polido e nitretado a plasma na configuração de gaiola
catódica. Células mesenquimais obtidas do ligamento periodontal de dentes
humanos hígidos foram cultivadas sobre os discos de titânio em placas de
cultivo de 24 poços, na densidade de 2 x 104 células/poço, incluindo poços sem
discos como controle positivo. Os dados obtidos das contagens das células
aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo gaiola catódica) e à
superfície plástica (grupo controle), nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após o
plaqueamento, foram utilizados para analisar a adesão e proliferação celular e
obter a curva de crescimento celular nos diferentes grupos. Os dados foram
submetidos a análises não paramétricas e as diferenças entre os grupos foram
comparadas pelos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Friedman. Não foram
encontradas diferenças estatísticas significativas nas contagens celulares entre
os grupos estudados (p>0,05). Conclui-se que ambos os tratamentos
produziram superfícies compatíveis com adesão e proliferação de células
mesenquimais do ligamento periodontal humano.
Palavras-chave: Células-tronco, Técnicas de cultura celular, Titânio.
9
ABSTRACT
In the last years, many scientific researches in implantology have been focused
on alternatives that would provide higher speed and quality in the process of
osseointegration. Different treatment methods can be used to modify the
topographic and chemical properties of titanium surface in order to optimize the
tissue-implant reactions by a positive tissue response. This study aimed to
evaluate the adhesion and proliferation of mesenchymal cells from human
periodontal ligament on two different titanium surfaces, using cell culture
techniques. Grade II titanium discs received different surface treatments,
forming two distinct groups: polished and cathodic cage plasma nitriding.
Human periodontal ligament mesenchymal cells were cultured on titanium discs
in 24-well cell culture plates, at a density of 2 x 104 cells per well, including wells
with no discs as positive control. Data obtained by counting the cells that
adhered to the titanium surfaces (polished group and cathodic cage group) and
to the plastic surface (control group), in the 24, 48 and 72-hour periods after
plating, were used to analyze cell adhesion and proliferation and to obtain the
cell growing curve in the different groups. The data were submitted to nonparametric analysis and the differences between groups were compared by
Kruskal-Wallis and Friedman statistical tests. No statistically significant
differences were found in the cells counts between the groups (p>0.05). It was
concluded that both treatments produced surfaces compatible with the adhesion
and proliferation of human periodontal ligament mesenchymal cells.
Keywords: Stem cells, Cell culture techniques, Titanium.
10
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ASTM Sociedade Americana para análise e padronização de Materiais
ºC Graus Celsius
CCC Cúbica de corpo centrado
CD Marcador de superfície celular
Cm Centímetro
cm2 Centímetro quadrado
CO2 Gás carbônico
Dina/cm² Dinas por centímetro quadrado
Dp Desvio-padrão da média
DRX Difração de raio-X
FBS Soro Fetal Bovino
GN/m² Giganewton por metro quadrado
g/cm³ Grama por centímetro cúbico
HC Hexagonal compacta
K Constante dielétrica
kGy Quilogray
kGy/h Quilogray por hora
M Molar
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
mA Miliampére
Mbar Milibar
mg/L Miligramas por litro
mg/mL Miligramas por mililitro
ml Mililitro
MPa Mega Pascal
mm Milímetro
mm2 Milímetro quadrado
mM Milimolar
µl Microlitro
µm Micrômetros
µg/ml Microgramas por mililitro
11
pH Potencial hidrogeniônico
Ra Rugosidade média
RPM Rotações por minuto
Sccm Centímetro cúbico padrão por minuto
SBF Fluido corpóreo simulado
Ti Titânio
Ti-cp Titânio comercialmente puro
TiO Óxido de titânio
TiO2 Dióxido de titânio
Ti2O3 Trióxido de titânio
Ti6Al4V Titânio-Alumínio-Vanádio
TiN Nitreto de titânio
Torr Unidade de pressão em mmHg
U.I. Unidades internacionais
UV Ultra-violeta
V Volt
Vo Potencial elétrico
∂ Alfa
α-MEM Meio essencial mínimo tipo alfa
ß Beta
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais propriedades do titânio.
Tabela 2 – Concentrações máximas permitidas para as impurezas nas
principais formas de Ti cp e ligas (% em peso).
Tabela 3 – Variáveis estudadas.
Tabela 4 – Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Tabela 5 – Análise da adesão celular em 24 horas referente aos diferentes
grupos de estudo.
Tabela 6 – Análise da proliferação celular em 48 horas referente aos diferentes
grupos de estudo.
Tabela 7 – Análise da proliferação celular em 72 horas referente aos diferentes
grupos de estudo.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica.
Figura 2. Processo de nitretação em gaiola catódica mostrando que o
“sputtering” atua diretamente na tela, arrancando átomos de titânio que, por
sua vez, se combinam com o nitrogênio havendo deposição de nitreto de titânio
na superfície da amostra.
Figura 3. Discos de titânio embutidos em resina de poliéster.
Figura 4. Discos de titânio após o polimento.
Figura 5. Representação esquemática do processo de nitretação em gaiola
catódica.
Figura 6. Amostras de titânio sendo nitretadas em gaiola catódica.
Figura 7. Remoção das células do ligamento periodontal dos terceiros molares.
Figura 8. Digestão enzimática do extrato celular com dispase e colagenase.
Figura 9. Desenho esquemático da placa de 24 poços e a distribuição dos
discos para o cultivo das células nos diferentes grupos.
Figura 10.
Curva de crescimento das células em diferentes intervalos de
tempo.
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................
17
2 REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................
19
2.1 Titânio.................................................................................................
19
2.2 Tratamento de superfície..................................................................
23
2.3 Nitretação Iônica................................................................................ 30
2.4. Células mesenquimais indiferenciadas do ligamento
periodontal.....................................................................................................
34
2.4.1 Respostas celulares ao tratamento de superfície......................
37
3 PROPOSIÇÃO.............................................................................................
41
4 METODOLOGIA..........................................................................................
42
4.1 Implicações éticas.............................................................................
42
4.2 Caracterização do estudo.................................................................
42
4.2.1 Tipo do estudo.............................................................................
42
4.2.2 Desenho do estudo.....................................................................
42
4.3 Desenho do estudo...........................................................................
42
4.4 Amostras............................................................................................
43
4.4.1 Preparo das amostras..................................................................
43
4.5 Protocolo de nitretação....................................................................
44
4.6 Esterilização das amostras..............................................................
45
4.7 Cultura de células.............................................................................
46
4.7.1 Obtenção dos elementos dentários..............................................
46
4.7.2 Obtenção das células mesenquimais do ligamento periodontal..
46
4.7.3 Cultivo das células mesenquimais do ligamento periodontal.......
47
4.8 Cultivo celular sobre discos de Titânio........................................... 48
4.8.1 Análise da adesão e proliferação celular.....................................
49
4.9 Análise estatística.............................................................................
49
5 RESULTADOS.............................................................................................
50
5.1 Adesão e Proliferação celular......................................................
50
5.2 Curva de Crescimento..................................................................
51
15
6 DISCUSSÂO................................................................................................
53
7 CONCLUSÕES...........................................................................................
61
REFERÊNCIAS...............................................................................................
62
ANEXOS.......................................................................................................... 73
16
1 INTRODUÇÃO
A partir do estabelecimento de critérios clínicos e experimentais para o
alcance da osseointegração, tornou-se necessária a busca de alternativas que
proporcionem maior qualidade e rapidez nesse processo. As pesquisas na área
de Implantodontia têm se direcionado para a viabilização mais rápida dos
implantes dentários para estabelecimento de função, na tentativa até mesmo
de eliminar o período de cicatrização óssea livre de carga funcional, como
recomendado nos protocolos iniciais de Bränemark (TEIXEIRA, 2001).
A osseointegração requer a utilização de implantes confeccionados com
material e superfície atrativas à deposição óssea. O titânio comercialmente
puro é o material de escolha para a confecção dos implantes endósseos, pois
exibe características peculiares: é um biomaterial que possibilita uma resposta
tecidual favorável; apresenta estabilidade química dos seus componentes;
estimula a atividade celular na formação da matriz óssea; tem elevada
resistência à corrosão; e não provoca reações de hipersensibilidade ou
imunológicas (JOLY, LIMA, 2003). A camada de óxido de titânio é responsável
pela adaptação íntima – denominada osseointegração ou anquilose funcional entre o osso mineralizado e a superfície do implante (BRANEMARK et al.,
1969; SCHROEDER et al., 1981).
De acordo com Sul, Johansson, Albrektsson (2002), a cicatrização ao
redor dos implantes usinados ocorre através de um gradual processo de
mineralização do osso para o implante. As células em contato com a superfície
permitem a mineralização óssea; além disso, o processo de cicatrização ocorre
em vários dias e o processo de remodelação leva semanas ou anos. O tempo
de cicatrização para implantes dentais sem tratamento de superfície é maior do
que os que utilizam uma superfície tratada. O tratamento da superfície de
titânio reduz o tempo de mineralização e acelera os mecanismos de adesão
entre implante e osso.
Com o tratamento de superfície, é possível modificar as características
dos implantes dentais, tais como a composição química, a morfologia, a
topografia e a rugosidade (RUPP et al., 2006).
A utilização de culturas celulares, com o objetivo de avaliar o efeito do
substrato sobre o comportamento dos osteoblastos durante o processo de
17
osseointegração,
tem
sido
amplamente
empregada
na
pesquisa
em
Implantodontia. Diversos eventos biológicos associados à cicatrização óssea
sobre superfícies de implantes podem ser investigados com a utilização de
culturas celulares apropriadas. Adesão, proliferação e diferenciação celular,
assim como produção e mineralização de matriz extracelular, são alguns dos
eventos que podem ser analisados isoladamente. Interpretações legítimas de
experimentos in vitro devem ser discutidas em termos de limitações práticas,
técnicas e biológicas referentes à utilização de culturas celulares. A utilização
dessas culturas permite o acesso a informações celulares e moleculares que
favorecem uma abordagem de engenharia nanoestrutural no desenho do
implante e hipóteses significativas para serem testadas. Neste contexto,
culturas celulares oferecem uma oportunidade única dentro do processo e
fenômeno de osseointegração (COOPER et al., 1998).
O
titânio
tem
sido
o
material
mais
utilizado
atualmente
em
implantodontia. As células do ligamento periodontal quando cultivadas sobre
esse biomaterial mostraram ser capazes de formar tecidos semelhantes a um
verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio, através do processo de
osseointegração (CHOI, 2000), fato este o que justifica o aprofundamento dos
estudos relativos à integração entre estes componentes (titânio e células do
ligamento periodontal).
A busca por uma superfície de titânio que favoreça os eventos celulares
que podem resultar em uma osseointegração mais rápida e eficiente foi o que
motivou o presente estudo. Nesse sentido, busca-se avaliar a adesão e a
proliferação de células mesenquimais obtidas do ligamento periodontal de
terceiros molares hígidos de humanos em superfícies de titânio polidas e
nitretadas por plasma.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Titânio
Segundo Williams (1999) um biomaterial é qualquer material, sintético ou
natural, que pode ser usado como um sistema ou parte de um sistema que
repare ou substitua algum tecido, órgão ou função do corpo. Já a
biocompatibilidade de um dispositivo médico implantável por longo período
compreende a capacidade de o dispositivo cumprir com sua função destinada,
com o desejado grau de incorporação no hospedeiro, sem provocar efeitos
locais ou sistêmicos indesejáveis.
O metal titânio e suas ligas têm sido usados com sucesso como
biomateriais, devido às suas propriedades mecânicas e químicas, excelente
resistência à corrosão e biocompatibilidade (HAMADA et al., 2002). A alta
resistência à corrosão sob condições normais resulta da formação de uma
película natural da superfície. Embora a película de óxido tenha uma estrutura
não densa, é estável e protege o metal contra a maioria dos ambientes. A nova
camada passiva é formada em milisegundos pela reação com o ambiente local,
mas íons metálicos são liberados no processo (AZADEH, ASHRAFIZADEH,
2009).
Diversos biomateriais têm sido utilizados em cirurgias ortopédicas e
odontológicas. Suas aplicações incluem dispositivos de fixação de vértebras,
discos vertebrais, além de stents cardiovasculares. O titânio e as ligas à base
de titânio possuem biocompatibilidade, resistência à corrosão, baixo módulo de
elasticidade e baixa densidade. Devido a estas qualidades, o titânio é o
material de escolha para as cirurgias de implantes odontológicos e ortopédicos.
A forma do implante é outro fator importante a ser considerado para a
substituição do tecido duro, pois havendo concentração de tensão, o fenômeno
de reabsorção do osso natural pode acontecer, promovendo o enfraquecimento
da interface osso-implante. Esta é a causa principal do insucesso da
osseointegração (RACK, QAZI, 2006).
O titânio apresenta-se como um elemento alotrópico, ou seja, ele existe
em mais de uma forma cristalina. Em temperatura ambiente apresenta uma
estrutura cristalina tipo hexagonal compacta (HC) que é a fase alfa (α). Esta
19
estrutura transforma-se em cúbica de corpo centrado (CCC), denominada de
fase beta (ß), na temperatura de 882,5ºC (LIU; CHU; DING, 2004). A tabela 1
apresenta algumas das principais propriedades do titânio.
Tabela 1 – Principais propriedades do titânio (DONACHIE, 1988).
Propriedades químicas, físicas,
físico-químicas e mecânicas
Valores para o Titânio Puro
Número atômico
22
Peso atômico
47,9
Estrutura cristalina 1
α - hexagonal compacta para
temperaturas menores que 882,5 Cº
ß – cúbica de corpo centrado para
temperaturas acima de 882,5 Cº
Estrutura cristalina 2
Cor
Cinza escuro
Ponto de fusão
1668 ± 10ºC
Dureza
HBR 70 a 74
Resistência à tração
520 Mpa
Módulo de elasticidade
107 GN/m2
Densidade
4,51 g/cm3
Para a Sociedade Americana para Análise e Padronização de Materiais
(ASTM), o titânio é classificado em 12 diferentes graus de pureza, sendo que
os quatro primeiros seriam o que se convencionou chamar de titânio
comercialmente puro (Ti cp) e as graduações restantes seriam ligas. Para a
confecção de implantes odontológicos e ortopédicos deve ser utilizada uma
composição química de titânio próxima da pureza absoluta, pois muitos
componentes não possuem efeito totalmente conhecido sobre o organismo
humano, especialmente quando em longo período de contato (TROTA FILHO,
2007). As diferentes concentrações dos elementos nitrogênio, carbono,
hidrogênio, ferro, oxigênio e titânio, assim como suas propriedades mecânicas,
distinguem os diferentes graus de pureza do titânio (tabela 2).
20
Tabela 2 - Concentrações máximas permitidas para as impurezas nas
principais formas de Ti cp e ligas (% em peso) (ADAPTADO DE DONACHIE,
1988).
Liga
Elemento (% Impureza)
N
C
H
Fe
O
Al
V
Ti
Ti grau I
0,03
0,10
0,015
0,02
0,18
-
-
Balanço
Ti grau II
0,03
0,10
0,015
0,03
0,25
-
-
Balanço
Ti grau III
0,05
0,10
0,015
0,03
0,35
-
-
Balanço
Ti grau IV
0,05
0,10
0,015
0,05
0,40
-
-
Balanço
Ti grau V
0,05
0,10
0,015
0,03
0,25
-
-
Balanço
Ti grau VII
0,03
0,08
0,015
0,03
0,25
-
-
Balanço
Ti6Al4V
0,05
0,08
0,012
0,25
0,13
5,5 – 6,5
3,5 – 4,5
Balanço
Esse metal é bastante reativo e em contato com pequenas
concentrações de oxigênio ou água (na faixa de parte por milhão) forma óxidos
que podem ser TiO, Ti2O3 ou TiO2, sendo este último o mais comumente
encontrado. Esta variedade ocorre em consequência de existirem diversas
formas estáveis desse óxido e devido ao fato do oxigênio ser bastante reativo
com o titânio. O óxido mais estável é o TiO2 uma vez que é
termodinamicamente estável devido a sua energia livre de Gibbs altamente
negativa em comparação com os outros óxidos de titânio (LIU; CHU; DING,
2004).
As propriedades dessas ligas dependem da composição, da proporção
relativa das fases α e ß, dos tratamentos térmicos e das condições de
processamento termo-mecânicas. As ligas do tipo ß oferecem propriedades
únicas, possuindo baixo módulo de elasticidade e alta resistência à corrosão
(LIU; CHU; DING, 2004; RACK; QAZI, 2006). O titânio, todavia, sofre uma
redução de suas propriedades depois que é exposto a um ambiente fisiológico.
A sua modificação superficial é capaz de prevenir essas alterações e pode ser
21
usada para melhorar a resposta óssea e a eficácia do implante (BRAMA et al,
2007).
O aumento do uso do titânio e suas ligas como biomateriais deve-se ao
seu baixo módulo de elasticidade, superior biocompatibilidade e alta resistência
à corrosão quando comparado ao aço inoxidável e ligas a base de cobalto que
também possuem aplicações médicas e odontológicas (LIU; CHU; DING,
2004).
Uma contribuição para a sua biocompatibilidade é a grande resistência à
corrosão que é conferida por seu óxido, que forma uma película contínua e
aderente (SILVA, 2006).
A camada de Ti02, formada espontaneamente
durante o processo de torneamento dos implantes, é semicondutora ou não
condutora e previne a troca de elétrons e qualquer reação redox na superfície.
Dessa forma, os produtos de corrosão nos tecidos não estão em forma de íon,
mas como óxidos estáveis. Em meios fisiológicos a camada de óxido é
altamente protetora prevenindo o contato entre o meio e o metal base, o que
significa que não existe o contato direto entre o metal e seus tecidos
hospedeiros, mas certamente entre o tecido e a superfície do óxido formado
(KASEMO, 1998).
Outra vantagem desse material é a sua constante dielétrica (k) alta (de
20 a 50) quando comparada com a de outros óxidos, propriedade essa que
pode retardar o movimento celular sobre superfícies e causar menor
desnaturação das proteínas (Branemark et al., 1985). Segundo Silva (2006), o
TiO2 promove forças de Van der Waals maiores do que a dos outros óxidos,
apresentando propriedades catalíticas em diversas reações químicas. A
natureza, bem como a composição e espessura da camada do óxido depende
das condições do meio circunvizinho. Geralmente, em meio aquoso, o óxido
presente é o TiO2. No entanto, pode haver uma mistura de outros óxidos como
Ti2O3 e TiO.
Embora a camada de óxido seja termodinamicamente muito estável,
reações com o fluido ou meio biológico podem ocorrer. Espécies contendo
titânio são liberadas nos tecidos adjacentes e, ao mesmo tempo, espécies
contendo oxigênio nos fluidos biológicos são adsorvidas, levando ao aumento
na espessura da camada de óxido. Existe a possibilidade de dissolução da
camada protetora de óxido, o processo químico, denominado corrosão, que
22
representa um problema sério para alguns materiais de implante, parece ser
um processo muito lento com o titânio, provavelmente devido à alta
estabilidade de seus óxidos (SILVA, 2009).
A estabilidade de implantes dentais depende da integração do material
artificial com o tecido ósseo. As propriedades físicas e químicas dos implantes
podem influenciar a osseointegração; todavia, apesar de se reconhecer a
importância desta interface, pouco se sabe sobre os fatores que promovem sua
atuação no processo de osseointegração (CIRANO, 2007).
Antes das aplicações os biomateriais são frequentemente analisados e
testados in vitro e in vivo quanto às suas propriedades osteocondutivas e
indutivas. Para a osteoindução é necessário haver células capazes de se
diferenciarem em células formadoras de osso. O parâmetro mais confiável para
a diferenciação final e formação óssea consiste na produção de células
intermediárias controladas pela matriz extracelular calcificada. Os implantes
removidos do organismo humano apresentam clara correlação entre a corrosão
do metal e a resposta tecidual. Além disso, os íons liberados pela degradação
da prótese podem afetar a resposta celular em locais sadios do corpo humano.
O efeito da dissolução dos íons depende da taxa de difusão, através da
camada de óxidos do metal e da dissolução dos óxidos (MARQUES, 2007).
Apesar do sucesso obtido com o titânio, desde seu lançamento
comercial, outras alternativas de tratamento de superfícies nunca deixaram de
ser investigadas, sobretudo aquelas superfícies rugosas com grande potencial
de ancoragem óssea. Ainda que o método de implantes osseointegrados já
tenha se consolidado como uma possibilidade para a restauração das perdas
dentais, uma confirmação de que determinadas superfícies possibilitam maior e
mais rápido contato ósseo na fase de cicatrização e contato ósseo duradouro
quando em função poderá seguramente colaborar para a otimização do
procedimento.
2.2 Tratamento de superfície
Albrektsson et al. (1981) propuseram seis fatores que tem sido
geralmente aceitos como especialmente importantes para o estabelecimento
de uma osseointegração de confiança: material do implante, desenho do
23
implante, condições da superfície, o estado do osso, técnica cirúrgica e
condições de carga.
A superfície do implante parece exercer influência nos processos
biológicos da interface implante/osso que determinarão o sucesso ou falha da
implantação. Na tentativa de aumentar o índice de sucesso dos implantes, temse adotado o controle das características da superfície dos implantes,
principalmente em termos de topografia, composição química e energia
superficial. Para alterar a morfologia dessa superfície são empregados
diferentes tratamentos, tais como: jateamento com partículas abrasivas, ataque
ácido, tratamento a plasma, tratamento com laser, etc.
Os parâmetros adequados para uma superfície apropriada de implantes
ainda não estão bem definidos na literatura. Assim, novas técnicas de
modificação de superfícies vêm sendo estudadas. Estas técnicas produzem
modificações físico-químicas e morfológicas. Os tratamentos podem ser
classificados de duas maneiras: subtração e adição (SYCARAS et al., 2000).
Os processos de subtração são aqueles que retiram uma camada da
superfície, incluem o processo de jateamento de partículas, ataque químico e
mais recentemente a modificação a laser (SILVA et al., 2006); já o processo de
adição, por sua vez, é caracterizado pela deposição de uma camada sobre a
superfície, podem produzir superfícies porosas e rugosas, características estas
que influenciarão na camada de óxido a ser produzida. Nestes casos, um dos
processos mais usados tem sido a aspersão térmica, através do processo de
plasma spray, que serve para revestir implantes com titânio ou hidroxiapatita
(LANCHETTA, GUEZENNEC, 2001).
É unânime entre os pesquisadores que as propriedades físico-químicas
das superfícies dos implantes exercem um papel fundamental no sucesso da
osseointegração. As interações moleculares e celulares que norteiam o destino
biológico dos implantes ocorrem nos estágios iniciais da cicatrização
(AMARANTE, LIMA, 2001). In vivo, as superfícies ásperas induzem uma
melhor fixação óssea do que superfícies usinadas, sugerindo que a rugosidade
superficial poderia ter um efeito direto na adesão, proliferação e diferenciação
dos osteoblastos (VEIS et al., 2004), processos estes que traduzem a resposta
das células à superfície do material.
24
O objetivo das modificações mecânicas é obter uma superfície com
topografia e rugosidade específicas, remover contaminações superficiais e/ou
aumentar a aderência dos tratamentos que serão feitos posteriormente
(LAUSMAA, 2001).
Tratamentos químicos são utilizados para garantir aos implantes
metálicos características tais como: limpeza e assepsia para o seu uso em
cirurgias, eliminação de impurezas oriundas do processo de fabricação;
rugosidade adequada da superfície visando o aumento de biocompatibilidade;
obtenção de uma camada homogênea regular de óxido de espessura variável
sobre a sua superfície (SENA, 2001). São baseados nas reações que ocorrem
na interface do titânio e da solução, podendo ser ácidos ou alcalinos. Os
alcalinos são tratamentos químicos superficiais aos quais são submetidos o
titânio e suas ligas a fim de que se tornem bioativos. Os tratamentos ácidos são
frequentemente usados para remover óxidos ou contaminações, objetivando
obter-se uma superfície limpa e uniforme (SCHWARTZ et al., 1996; NANCI et
al., 1998).
Os processos físicos têm como característica a não ocorrência de
reações químicas durante o processo de modificação da superfície. A formação
de uma camada modificada, de filmes ou de revestimentos é atribuída à
energia térmica, cinética e elétrica que são utilizadas nesses procedimentos,
nos quais se incluem a deposição física de vapor e a aspersão térmica (VAZ,
2007).
Desde que Bränemark et al. (1977) descreveram o mecanismo e os
efeitos da osseointegração, há quase quatro décadas, diversas pesquisas
biomédicas e de materiais têm procurado encontrar um desenho ideal da
superfície de implante dentário capaz de garantir uma longa permanência de
ancoragem ao tecido ósseo (VANZILLOTTA et al., 2006). O desenvolvimento
da interface osso-implante depende das interações diretas dos osteoblastos
com os biomateriais. A ligação celular parece ser muito sensível às variações
na superfície de composição química e topografia (forma e rugosidade) do
titânio comercialmente puro grau 4 (FENG et al., 2004). Características
superficiais como: energia de superfície, rugosidade, topografia e aspectos
químicos, como pH, são condições importantes para as interações do implante
com o tecido ósseo do hospedeiro (NAYAB et al., 2005).
25
Alguns estudos mostram que a superfície rugosa pode direcionar o
processo
de
osseointegração,
influenciando
mecanismos
celulares
importantes. Na verdade, o desenho microrrugoso do implante parece
favorecer a adesão e diferenciação dos osteoblastos, além da produção da
matriz extracelular mineralizada, in vitro (MARTIN et al., 1995) e in vivo
(COCHRAN et al., 1998) .
Os osteoblastos aderem à superfície de titânio e, frequentemente,
cobrem a superfície restante com a proliferação celular. O fenótipo dos
osteoblastos é mantido nas células cultivadas sobre o titânio. Estas células,
porém, não respondem da mesma maneira em cultura sobre discos de titânio
com diferentes rugosidades (CIRANO, 2007).
O processo original de fabricação de implantes de titânio para
implantação nos maxilares produz a superfície usinada com valores de
rugosidade média (Ra) entre 0,5 e 1,0µm. Implantes com este tipo de superfície
têm sido utilizados com sucesso no decorrer das ultimas décadas, embora
estudos tenham demonstrado que a modificação da topografia tende a
aumentar a área de contato osso-implante e a resistência da união na interface
(WENNERBERG, 1999).
A rugosidade superficial dos implantes pode ser analisada em três níveis
de grandeza: macroscópica, microscópica e nanorugosidade. Cada tamanho
de rugosidade propicia contatos diferentes com as células e biomoléculas e são
responsáveis pela intensidade e tipos de ligações biológicas individuais. A
macrorugosidade com ordem de grandeza de milímetro não influencia na
osseointegração, mas afeta a distribuição das forças para o osso e na
estabilidade do implante. As rugosidades entre 0,5 µm e 1,0 µm são
encontradas nos implantes usinados e foram usadas na maioria dos implantes
anteriores a 1995. No implantes usinados a ligação osso-implante ocorre
devido à presença das ranhuras (ELIAS, LIMA, SANTOS, 2008). Há uma
tendência atual de se obter superfícies híbridas, com morfologias com micro e
nanorugosidade.
Superfícies com valores de rugosidade média (Ra) menor ou igual a 1µm
são consideradas lisas e aquelas acima de 1µm, rugosas. O modo como a
superfície é produzida pode gerar topografias orientadas ou aleatórias. Por
exemplo, em superfícies usinadas em tornos mecânicos, a direção e o fio da
26
ferramenta de corte originam sulcos periódicos de orientação paralela. Esta
característica da topografia parece ter a capacidade de influenciar a orientação
e a locomoção de tipos específicos de células e de diretamente afetar a forma
e função celular (SYKARAS, 2000).
O processo de crescimento de células sobre a superfície do implante
se faz tão dependente da variação de rugosidade, que implantes com
superfície no estado como usinada apresentam proliferação de células,
preferencialmente, ao longo das marcas de usinagem. Trata-se de uma
rugosidade com forte direcionalidade. Em contrapartida, nas superfícies
submetidas ao tratamento para mudança da morfologia e rugosidade observouse uma menor direcionalidade quanto à rugosidade e, consequentemente uma
melhor interação das células na superfície dos implantes. Outro aspecto a ser
considerado em relação ao efeito da microestrutura superficial na adesão
celular é o tipo de célula presente no micro-ambiente. Existem células com
características de rugofilia, cujas superfícies rugosas são preferidas, como
osteoblastos, macrófagos, células epiteliais e leucócitos, e células que são
mais atraídas por superfícies lisas, como fibroblastos (ELIAS et al., 2004).
Com base na identificação da rugosidade, as células iniciam diferentes
reações e com diferentes velocidades. Nas superfícies de titânio lisas
(rugosidades inferiores a 0,5 µm) há ligação de fibroblastos, enquanto nas
superfícies com rugosidade entre 0,5 µm e a 1,5 µm há a adesão de
osteoblastos. Ou seja, não basta que a célula identifique a presença do Ti cp
para ocorrer a osseointegração, as reações que são desencadeadas na
superfície dependem também da rugosidade superficial. Cada superfície
provoca
uma
reação
específica
com
várias
fases
que
ocorrem
simultaneamente (DAVIES, 1998; JOOS et al., 2006).
Procura-se ter controle das características da superfície dos implantes
para garantir adequada adsorção de proteínas, adesão, espalhamento,
crescimento e ativação celular. O emprego do titânio na fabricação dos
implantes dentários não é suficiente para garantir a osseointegração; para
tanto, a rugosidade deve ter valores capazes de atrair células específicas que
levam à deposição de matriz e sua mineralização. Assim, é importante que
ocorra uma resposta especifica dos tecidos: na região em contato com tecidos
duros a superfície do implante deve ter rugosidade para favorecer a atração e
27
adesão de osteoblastos, enquanto na região de contato com tecidos moles a
superfície deve ser lisa para permitir a aderência de fibroblastos (ELIAS, LIMA,
SANTOS, 2008).
Outro fator de grande importância e que é alterado pelos tratamentos de
superfície é a molhabilidade. Segundo Elias et al. (2004), a molhabilidade pode
ser entendida como a energia livre superficial dos sólidos ou a capacidade do
líquido molhar o sólido, e pode ser quantificada pela medida do ângulo de
contato de um líquido com a superfície. Quando esse ângulo de contato é
maior que 90 graus a superfície é hidrofóbica e quando é menor que 90 graus,
a superfície é hidrofílica. Materiais com alta energia livre superficial adsorvem
mais facilmente macromoléculas e possuem maior número de sítios favoráveis
para permitir ligações das células. A regra geral é que materiais com tensão
superficial entre 20 e 30 dinas/cm2 exibem baixa bioadesão e os materiais com
valores de tensão superficial superiores a essa faixa apresentam melhores
resultados para a osseointegração (BAIER, MEYER, 1988).
A composição química da superfície determina a estabilidade e
reatividade do implante, a qual deve ser constituída unicamente por óxido de
titânio. Apesar de não existirem trabalhos conclusivos da influência das
impurezas na superfície dos implantes, a superfície deve conter os menores
níveis possíveis de contaminação. A energia de superfície e a existência de
tensões residuais após o jateamento modificam a reatividade da superfície. A
incorporação de revestimento, independendo do tipo e espessura da camada,
modifica o comportamento das células e a cascata de reações (CARVALHO et
al., 2009).
Marques
(2007)
analisou
quatro
tipos
de
superfícies
usadas
comercialmente: usinada, superfície tratada com ácido, superfície anodizada e
superfície tratada com flúor; e comparou a influência dos tratamentos
superficiais do Ti cp na deposição de íons após a imersão em solução de fluído
corpóreo simulado (SBF) durante 10, 20 e 30 dias. Os resultados mostraram
que entre os três tratamentos superficiais, as superfícies com melhor resultado
de deposição de íons da solução SBF foram às superfícies anodizada e a
tratada com ácido.
Guimarães (2010) avaliou a influência de diferentes tratamentos de
superfície do titânio na adesão e proliferação de osteoblastos humanos,
28
através da análise quantitativa do número de células aderidas em diferentes
períodos de cultura celular. Foram testadas as superfícies ácido-condicionadas,
superfície com cobertura de hidroxiapatita e superfície com bisfosfonato
imobilizado na cobertura de hidroxiapatita. Células osteoblásticas derivadas de
osteossarcoma humano (SaOS-2) foram cultivadas sobre os discos e a
contagem celular foi realizada em 3, 7 e 14 dias. O estudo concluiu que o tipo
de tratamento de superfície do titânio e período de cultura celular, bem como a
interação de ambos, afetam significativamente o crescimento celular e que a
superfície de titânio, seja ela usinada ou ácido-condicionada, obteve melhores
resultados de adesão e proliferação de células osteoblásticas quando
comparada in vivo com superfícies de hidroxiapatita.
Bucci-Sabattini et al. (2010), compararam uma superfície jateada com
alumina e condicionada com ácido (grupo controle) com uma superfície de
baixa impregnação de cálcio e fósforo (grupo experimental). A morfologia da
superfície foi caracterizada através de microscopia eletrônica de varredura e de
difração de raios-X (DRX).
Adesão e proliferação celular e atividade da
fosfatase alcalina foram avaliadas com osteoblastos humanos SaOS-2 e
células mesenquimais do osso em condições de cultura não osteogênica. Os
resultados mostraram que ambas as superfícies se apresentaram como um
substrato adequado para adesão e crescimento de osteoblastos humanos
SaOS-2 e nenhum sinal de citotoxidade foi detectado. Em relação à
proliferação de células SaOS-2, as duas superícies não mostrarm diferenças
estatísticas significantes. No grupo experimental, a atividade da fosfatase
alcalina foi maior que no grupo controle. Para as células mesenquimais, a
proliferação foi significante menor no grupo experimental em relação ao
controle, embora a atividade da fosfatase alcalina tenha sido maior do grupo
testado.
Rosales-Leal et al. (2010), avaliaram o efeito da rugosidade,
molhabilidade e morfologia de quatro tratamentos de superfície em titânio
comercialmente puro na adesão de células osteoblásticas. Foram testados o
condicionamento com ácido fluorídrico (eTi), o jateamento com óxido de
alumina (bTi), a combinação de jateamento com óxido de alumina e
condicionamento com ácido fluorídrico (beTi) e o titânio polido como grupo
controle (pTi). A adesão celular (< 24h) foi maior nas superfícies bTi e beTi e
29
após 48 horas ocorreu uma aumento nas amostras do grupo eTi, seguidas pelo
grupo beTi. O grupo titânio polido apresentou a superfície mais regular, seguido
pelo grupo condicionamento ácido, que mostrou microporos de 1,5 a 2,5 µm de
diâmetro. Na superfície jateada foram encontradas cavidades de 10 a 50 µm,
sendo esta superfície a mais irregular. O grupo que teve a combinação do
jateamento e do ataque ácido apresentou-se com características semelhantes
ao grupo eTi. Em relação à molhabilidade, pTi obteve os menores valores,
seguido por eTi, bTi e beTi. Os autores concluíram que para uma superfície
com uma mesma composição química, o crescimento celular é dirigido pelas
características topográficas da superfície; a adesão celular aumenta de acordo
com a rugosidade da superfície, ou seja, quanto mais rugosa maior será a
adesão celular; e que o grupo eTi teve melhores resultados porque gerou uma
superfície com rugosidade de comprimento horizontal que se aproximava do
tamanho da célula, facilitando sua acomodação.
Macedo (2008) avaliou a influência da microestrutura produzida por
diferentes tratamentos térmicos na resposta à proliferação de células
osteoblásticas. Foram utilizados 21 discos de titânio de 15mm X 1,5mm
(diâmetro X espessura) divididos em 7 grupos: têmpera (1100°C), têmpera e
revenimento a 200°C, 300°C e 500°C, tratamento térm ico a 300°C e 500°C e
controle (sem tratamento). Os discos foram colocados em placa de cultura
celular de 24 poços e foram utilizadas células MC3T3-E1 (40.000 células por
poço), mantidas em condições e cultura celular (5% de CO2 e 37°C) durante 24
horas. Pode-se concluir que a proliferação celular foi maior nos discos
temperados e revenidos do que nos discos apenas com tratamento térmico e
não tratados, ou seja, a proliferação foi maior nos discos que apresentavam
maior tensão residual e não foi observada qualquer organização celular
preferencial influenciada pela microestrutura.
2.3 Nitretação iônica
A nitretação iônica (ion-nitriding) é um processo de tratamento
termoquímico, usado para endurecimento superficial de metais ferrosos e um
crescente número de materiais não ferrosos como ligas de titânio e alumínio
(MICHEL et al.,1995), pela obtenção de uma camada de nitretos, que eleva a
30
resistência ao desgaste das superfícies tratadas (NICOLETO, TUCCI,
ESPOSITO, 1996).
O processo consiste em ionizar um gás ou mistura gasosa, contendo
nitrogênio, através de uma descarga luminescente, gerada por uma diferença
de potencial entre a amostra (cátodo) e o anodo, em uma atmosfera a baixa
pressão. Os íons produzidos no plasma são acelerados em direção a amostra
(cátodo), chocando-se com ela e fornecendo energia suficiente para aquecê-la
até a temperatura de nitretação (O’BRIEN J.M.; GOODMAN D, 1991).
A nitretação a plasma é um processo bem aceito industrialmente, porque
apresenta várias vantagens em relação aos outros processos de nitretação (a
gás e em banho de sais), tais como maior economia de gases e menor duração
do processo, uma vez que a velocidade de difusão do nitrogênio é maior. É
utilizada na melhoria das propriedades superficiais como dureza, resistências
ao desgaste e à corrosão, com o objetivo de aumentar a vida útil das peças
nitretadas (ALVES Jr., 2001).
O termo “plasma” se aplica a um gás contendo espécies neutras e
eletricamente carregadas como elétrons, íons positivos, íons negativos, átomos
e moléculas. Na média, um plasma é eletricamente neutro porque qualquer
desbalanceamento de carga resultará em campos elétricos que tendem a
mover as cargas de modo a restabelecer o equilíbrio. Como resultado disso, a
densidade de elétrons mais a densidade de íons negativos deve ser igual à
densidade de íons positivos. As cargas livres no plasma podem mover-se em
resposta a qualquer campo elétrico e neutralizá-lo. Se uma carga qualquer é
inserida num plasma ou num campo é imposto, produzindo um potencial
elétrico (Vo), as cargas livres, compostas de elétrons na grande maioria, se
moverão formando uma blindagem elétrica, denominada blindagem de Debye
(Alves Jr, 1995).
Um equipamento típico de nitretação iônica é constituído basicamente
de um sistema de vácuo, uma fonte de potência e um reator. O esquema de
vácuo deve ser capaz de atingir em torno de 10–2 torr de pressão e possuir
válvulas para controlar a vazão dos gases introduzidos para o tratamento. A
fonte de potência possui uma saída CC, com voltagem máxima de
aproximadamente 1500V, e uma corrente capaz de fornecer energia à peça,
31
para que ela seja aquecida a uma temperatura entre 300 e 700º C (Alves Jr,
1995).
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica
(ALVES Jr, 1995).
O processo consiste em expor superfícies metálicas a um plasma
nitretante, o qual é gerado devido a uma diferença de potencial entre dois
eletrodos. Esses eletrodos estão contidos num reator hermeticamente fechado,
onde é introduzida a atmosfera nitretante (tipicamente uma mistura de N2-H2, a
uma pressão entre 1 e 10mbar. Os íons criados devido a essa diferença de
potencial, em torno de 600V bombardeiam a superfície da peça presa ao
catodo, aquecendo-a até a temperatura de trabalho. Nestas condições, o
plasma já está revestindo completamente o catodo e a peça a ser nitretada. Os
íons deste plasma estão sendo acelerados para a superfície do catodo onde
diversos efeitos ocorrem, dentre eles o aquecimento da peça devido ao
bombardeamento pelos íons. A partir daí, é contado o tempo de duração do
processo. Após este tempo, a fonte é desligada e a peça é deixada para
resfriar naturalmente (SILVA, 2009).
No processo de nitretação iônica planar, o “sputtering” – que é definido
como um processo de desarranjo e ejeção de átomos da superfície de um
sólido devido a troca de momentum associado com o bombardeamento da
superfície por partículas energéticas (HUDIS, 1973) – vai atuar diretamente na
superfície das amostras, enquanto no processo em gaiola catódica o
32
“sputtering” atua na tela de titânio (gaiola), arrancando seus átomos que, por
sua vez, se combinam com o nitrogênio da atmosfera e se condensam na
superfície da amostra (LI, BELL, 2004). Na nitretação por gaiola catódica, as
amostras isoladas eletricamente são envolvidas por uma tela, na qual um alto
potencial catódico é aplicado. Dessa forma, o plasma atua na tela e não na
superfície das amostras. Os componentes a serem tratados estão em um
potencial flutuante ou sujeitos a uma baixa tensão de polarização, por exemplo
-100 a - 200 V. Por esse motivo, configuração gaiola catódica reduz alguns
danos causados pelo método de nitretação planar, como abertura de arco e
efeito do cátodo oco (LI; BELL; DONG, 2002).
Figura 2. Processo de nitretação em gaiola catódica mostrando que o
“sputtering” atua diretamente na tela, arrancando átomos de titânio que, por
sua vez, se combinam com o nitrogênio havendo deposição de nitreto de titânio
na superfície da amostra. (ALVES Jr., 2005)
A técnica de nitretação a plasma de metais é um método bem
estabelecido com inúmeras aplicações industriais devido a resultados
peculiares nas características físicas e químicas dos materiais, como o
aumento na dureza, resistência ao desgaste e oxidação, além de comprovada
biocompatibilidade (FIGUEROA, ALVAREZ, 2006).
Guerra Neto, Silva, Alves Jr. (2009) estudaram a adesão e proliferação
celular em superfícies de titânio nitretadas em plasma visando uma melhor
osseointegração. Foram utilizadas 12 placas de titânio divididas em dois grupos
com 6 amostras cada: grupo tratado com nitretação a plasma e grupo controle
33
sem tratamento. Foi utilizada a linhagem celular Osteo-1 com 1 X 104 células
por poço que foram analisadas com 24, 48 e 72 horas. Tanto a adesão como a
proliferação celular nas placas nitretadas foram superiores as placas sem
tratamento. Além disso, a superfície nitretada apresentou melhores resultados
no que se refere a molhabilidade e rugosidade que os implantes sem
tratamento.
Sá et al. (2009) modificou a superfície do titânio através do plasma por
diferentes
configurações
e
observou
as
alterações
das
propriedades
relacionando-as com adesão e proliferação celular. Foram utilizadas as
configurações de nitretação em gaiola catódica (G1); cátodo planar (G2);
cátodo oco (G3); e oxidação em cátodo oco (G4). Das técnicas utilizadas, a
nitretação por cátodo oco foi a que produziu melhores modificações nas
propriedades da superfície para aplicações biomédicas (molhabilidade,
microdureza, rugosidade e textura). Em relação a proliferação celular, foi mais
acentuada nas amostras nitretadas em cátodo oco e na gaiola catódica,
indicando que esses métodos de tratamento superficiais são viáveis e
eficientes na avaliação in vitro da proliferação de células-tronco.
2.4 Células mesenquimais indiferenciadas do ligamento
periodontal
O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo especializado, altamente
vascularizado e rico em células, que desempenha um papel importante dando
suporte ao dente, atuando na manutenção da homeostase e reparando danos
teciduais causados pela doença periodontal ou por trauma mecânico
(SHIMONO et al., 2003). Esse tecido contém uma população celular
heterogênea, incluindo fibroblastos, cementoblastos, osteoblastos, células
endoteliais e epitelias (LEKIC et al., 2001).
O conceito de que células mesenquimais indiferenciadas podem estar
presentes no ligamento periodontal foi inicialmente proposto por Melcher em
1976, o qual observou que estas células presentes no ligamento periodontal
eram capazes de formarem fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos. A
partir de então, a capacidade regeneradora das células do ligamento
34
periodontal tem sido bastante pesquisada, conforme mostra a revisão realizada
por Alves, Lins, Barboza (2010).
As células-tronco são comumente definidas como células multipotentes,
com capacidade de se diferenciarem em um ou mais tipos de células
especializadas (COSTA, MIGUEL, ROSA, 2005). Há duas categorias de
células-tronco: as células-tronco embriononárias pluripotentes, que são
procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula do embrião e que são
capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo e a categoria
de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas,
que têm a capacidade de originar tipos celulares específicos (SOUZA et al.,
2003).
Existem várias fontes de células-tronco adultas, tais como: a medula
óssea, o sangue, a córnea e a retina, o cordão umbilical, o fígado, a pele, o
trato gastrointestinal e o pâncreas (SLACK, 2000). Há alguns anos, inúmeros
estudos têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas dos
tecidos orais, incluindo a polpa dentária (MIURA et al., 2003; SHI,
GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e o ligamento
periodontal
(AKIZUKI, 2005; CHEN et al., 2006; NAGATOMO, 2006).
A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua
capacidade de proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares.
Contudo, existem desvantagens, como a sua instabilidade genética, a
obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros imunocomprometidos
e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética (SOARES et
al., 2007).
As
células-tronco
adultas
apresentam
a
vantagem
de
serem
autogênicas, não incorrendo em limitações morais e responsivas aos fatores de
crescimento inerentes ao hospedeiro. No entanto apresentam algumas
desvantagens como o fato de não serem pluripotentes, a dificuldade de obtêlas, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor
quantidade nos tecidos (RISBUD, SHAPIRO, 2005).
Nagatomo et al. (2006) isolaram células do ligamento periodontal de prémolares e terceiros molares extraídos de humanos a fim de verificar as
propriedades de renovação, multiplicação e expressão de marcadores dessas
células. Análise de fluorescência ativada revelou que essas células
35
expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e STRO-1. Esses
resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem célulastronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras.
Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo em que células do
ligamento periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e
separadas em meio de cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de
diferenciação em osso, cartilagem e tecido adiposo. Células da medula óssea
foram usadas como controle nas mesmas condições de cultivo e indução. Os
autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm células
mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos,
condrócitos e adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea.
Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento
periodontal de cães e investigaram se essas células eram capazes de formar
uma nova inserção do ligamento periodontal quando utilizadas sobre a
superfície de implantes de titânio. Os implantes com as células cultivadas do
ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3
meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas
superfícies do implante, uma camada com tecido semelhante ao cemento com
inserção de fibras colágenas
tinha sido alcançada. Estes resultados
demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal podem formar
tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio,
o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia
através do processo de osseointegração.
A capacidade de expandir as células-tronco em cultura é um passo
indispensável para medicina regenerativa, e um esforço considerável tem sido feito
para avaliar as consequências do cultivo no comportamento das células-tronco e tem
como objetivo recriar gradualmente in vitro todos os mecanismos e processos
que a natureza utiliza durante a iniciação e morfogênese de um determinado
órgão. Neste contexto, a pesquisa em células-tronco oferece um potencial
singular para a homeostase corporal, reparação e regeneração (BLUTEAU,
2008).
Na bioengenharia, é essencial uma tríade composta por: (1) célulastronco ou progenitoras; (2) uma matriz que funcione como arcabouço e (3)
proteínas sinalizadoras, denominadas fatores de crescimento, que atuam
36
estimulando a proliferação e diferenciação celular (SOARES et al., 2007). As
células-tronco mesenquimais proporcionam, ao menos teoricamente, essa
inesgotável fonte celular que, a depender do tipo e do fator de crescimento
envolvido, pode originar determinado tecido ou vários tecidos do corpo, tais
como ósseo, cartilaginoso, adiposo, fibroso, muscular e medular. Os fatores de
crescimento, por sua vez, desempenham papel fundamental no controle da
proliferação e diferenciação desses tipos específicos de células (CANCEDDA
et al., 2003).
2.4.1 Respostas celulares ao tratamento de superfície
A
osseointegração está
associada
às respostas
celulares
que
contribuem para a formação de osso em superfícies aloplásticas. As reações
iniciais entre os tecidos e a superfície dos implantes têm o papel de determinar
os eventos seguintes que caracterizam a atividade biológica da superfície e a
resposta celular. Essa resposta celular depende das propriedades da
superfície, que vão influenciar na natureza da composição subsequente do
filme de proteínas adsorvido na superfície do implante (ELLINGSEN, 2000;
SCHEIDELER et al., 2003). Assim, imediatamente após a instalação, os
implantes de titânio interagem com os fluidos biológicos e com tecidos, dando
início à osseointegração. É nesta fase que as propriedades físicas (rugosidade,
molhabilidade) e a composição química da superfície do implante têm
importância primordial (ELIAS, LIMA, SANTOS, 2008).
A fixação biológica do implante ao osso é influenciada por numerosos
fatores, incluindo a composição química e a topografia da superfície
(ALBREKTSSON, WENNERBERG, 2004; PULEO, THOMAS, 2006). Essas
propriedades de superfície são cruciais durante a fase de cicatrização óssea na
região periimplantar. Depois da implantação, a superfície do implante fica em
contato com fluidos corporais e interagem com uma quantidade de proteínas e
diferentes tipos celulares. O desafio na engenharia de superfícies de implantes
é atrair, sobretudo, osteoblastos que produzem a matriz óssea extracelular, a
qual irá garantir um alto contato implante-osso. Adesão celular é um dos
estágios iniciais para subsequente proliferação e diferenciação de células
osteoblásticas produtoras de tecido ósseo (ANSELME, 2000a). Embora alguns
37
experimentos in vitro estudem o comportamento de células sobre superfícies
de titânio, as propriedades de superfície ideais para adesão, proliferação e
diferenciação celular ainda não foram claramente definidas (MUSTAFA, 2001).
Os estudos de biocompatibilidade de novas superfícies de titânio focam
na avaliação da resposta celular à superfície do material. Essa resposta é
traduzida pelo processo de adesão, proliferação e diferenciação das células,
embora a multiplicidade de modelos experimentais torne difícil a interpretação
dos resultados (SILVA, 2009).
A adesão celular está envolvida em vários fenômenos naturais, tais
como embriogênese, manutenção da estrutura dos tecidos, cicatrização de
lesões, resposta imune, metástase, bem como a integração do biomaterial. A
biocompatibilidade
do
material
está
intimamente
relacionada
com
o
comportamento celular no contato com esse material, e em particular, a adesão
celular a sua superfície. Características de superfícies dos materiais como
topografia, composição química ou energia de superfície desempenha um
papel essencial na adesão dos osteoblastos, assim, a adesão e o
espraiamento celular fazem parte da primeira fase da interação célula/material
e a qualidade dessa primeira fase irá influenciar a capacidade da célula
proliferar e se diferenciar quando em contato com o implante (ANSELME,
2000).
O termo “adesão” ao biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase
de adsorção, a qual ocorre rapidamente e envolve pequenas ligações físicoquímicas entre as células e o material – tais como ligações iônicas e força de
Van der Walls – e a fase de adesão, que ocorre lentamente envolvendo
moléculas biológicas – tais como proteínas da matriz extracelular, proteínas de
membrana celular e proteínas do citoesqueleto – as quais interagem juntas
para induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcrição
e consequentemente regulando a expressão gênica. Esta fase é a mais
importante da integração tecidual, pois a qualidade desta adesão influenciará
na morfologia e na capacidade para proliferação e diferenciação das células
(ANSELME, 2000).
Características hidrofóbicas e hidrofílicas de um material são de grande
importância para a adesão celular. A adesão celular é geralmente melhor em
superfícies hidrofílicas. Quando inserido no meio biológico, o material é
38
condicionado pelos componentes do fluido biológico. O pH, composição iônica,
energia de ligação, temperatura, grupo funcional de proteínas são fatores
determinantes para adsorção protéica. A energia da superfície pode influenciar
a adsorção protéica e o arranjo estrutural das proteínas no material, atraindo
células precursoras ósseas. Quando ocorrem mudanças conformacionais
destas células devido a superfícies hidrofóbicas e/ou baixa energia superficial,
sua afinidade com o receptor da superfície para células ósseas é diminuída,
atraindo fibroblastos e formando tecido fibroso em torno do material
(ANSELME, 2000).
Lee et al. (2009), tiveram como objetivo determinar a dimensão da
microrrugosidade
em superfícies de titânio que mostra a maior influência
positiva sobre o comportamento e características celulares específicas. As
amostras de titânio foram confeccionadas com rugosidades de profundidade
padronizada (3,5 µm), variando a largura em 15 µm (TiD15), 30 µm (TiD30) e
60 µm (TiD60), fabricadas usando fotolitografia, além do grupo controle liso.
Foram cultivados fibroblastos gengivais humanos sobre os discos e analisados
quanto à adesão, proliferação e viabilidade celular. Os autores encontraram
que TiD15 aumentou significantemente a viabilidade e proliferação em relação
ao grupo controle após 72 horas da cultura celular e concluíram que a
rugosidade superficial com profundidade de 3,5 µm e largura tanto de 15 µm
quanto de 30 µm influenciou positivamente no comportamento dos fibroblastos.
Uma vez que a função primária dos implantes dentais é a de promover
suporte e estabilidade funcional para a substituição de elementos dentários
perdidos,
torna-se
importante
a
compreensão
dos
eventos
celulares
envolvendo células mesenquimais indiferenciadas envolvidos na formação e
remodelação do tecido ósseo ao redor dos implantes. O processo de
osseointegração depende previamente de osteoindução e osteocondução, que
são fenômenos inter-relacionados, mas não idênticos (ALBREKTSSON,
JOHANSSON, 2001). A osteoindução ocorre quando células mesenquimais
indiferenciadas são estimuladas e transformam-se em pré-osteoblastos e, em
seguida,
em
osteoblastos,
iniciando
o processo
de
osteogênese. A
osteogênese pode ocorrer sobre uma determinada superfície ou arcabouço,
sendo este processo denominado osteocondução. Na fase de osteocondução,
a reparação da ferida cirúrgica começa logo após a instalação do implante por
39
meio da formação do coágulo (DAVIES, 1998). A superfície do implante é
condicionada por proteínas séricas, íons minerais, glicosaminoglicanas, lipídios
e
citocinas
produzidas
por
células
do
sistema
imunológico
(RAGHAVENDRA,WOOD, TAYLOR, 2005). Por volta do 4º. Dia após a
instalação do implante, as células mesenquimais indiferenciadas migram em
direção à superfície do implante e enquanto não estiverem secretando matriz
óssea estas células continuarão migrando e se diferenciando em osteoblastos.
Ocorre também a formação de uma rede de fibrina que se adere à superfície
do implante que permite a migração de células mesenquimais indiferenciadas,
macrófagos, leucócitos polimorfonucleares e células linfóides. Durante a
migração dessas células, a rede de fibrina se retrai acelerando o seu processo
de diferenciação celular (DAVIES, 1998), seguindo com os eventos celulares e
moleculares que proporcionam a neoformação e remodelação óssea.
40
3 PROPOSIÇÃO
O estudo tem como objetivo avaliar comparativamente, através de
experimentos in vitro utilizando cultura celular, a capacidade de adesão e
proliferação de células mesenquimais procedentes do ligamento periodontal de
humanos após contato com superfícies de titânio polidas e tratadas por plasma,
nos intervalos de tempo de 24, 48 e 72 horas.
41
4 METODOLOGIA
4.1 Implicações éticas
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN (parecer nº 080/2010,
protocolo 018/10, CAEE/SISNEP 0021.0.051.000-10 - ANEXO I, Emenda ao
projeto – Anexo II). Todos os voluntários da pesquisa receberam um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - ANEXO III), explicando a
realização do estudo, os objetivos, os riscos e os benefícios aos quais estariam
expostos, de acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras do
Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96).
4.2 Caracterização do estudo
4.2.1 Tipo do Estudo
Tratou-se de um estudo experimental in vitro.
4.2.2 Desenho do Estudo
Foi realizado um estudo do tipo longitudinal, prospectivo e controlado.
4.3 Desenho do estudo
O estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa foi realizado o
preparo das amostras através do tratamento de superfície das placas de titânio
no Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Na segunda etapa realizouse um ensaio in vitro com células isoladas do ligamento periodontal de
humanos e cultivadas sobre os discos de titânio tratados e a superfície controle
(plástico). Esta etapa foi realizada no laboratório de cultura de células do
Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN.
42
4.4 Amostras
Foram utilizados no experimento dois dentes humanos hígidos (terceiros
molares inclusos), que seriam desprezados após a cirurgia, para a obtenção
das células mesenquimais do ligamento periodontal. Os dentes foram extraídos
de pacientes que apresentavam indicação cirúrgica prévia de remoção desses
dentes por motivos ortodônticos e que não apresentavam doenças bucais e/ou
doenças sistêmicas.
Foram utilizados também 18 (dezoito) discos de titânio fornecidos pelo
Departamento de Física/UFRN, para que as células obtidas fossem cultivadas
sobre os mesmos.
4.4.1 Preparo das Amostras
As amostras de titânio foram preparadas segundo o protocolo
estabelecido no LabPlasma do Departamento de Física da UFRN (ALVES Jr.,
1995). Dezoito discos de titânio grau II ASTM F86 nas dimensões de 15mm de
diâmetro por 1,5mm de espessura, foram embutidos em resina poliéster (figura
3) e lixados gradualmente com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400,
600, 1200 e 2000 em água corrente e depois polidas (politriz AROTEC, modelo
APL-2 e série 212560, BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, sílica
coloidal com partículas de 0,1µm (ATM-GMBH, Alemanha) e água oxigenada
(H2O2) 20 volumes até um acabamento final de 0,04µm.
Em seguida, as amostras foram desembutidas (figura 4) e submetidas a
um protocolo de limpeza com objetivo de remover contaminantes que
pudessem interferir no processo de nitretação iônica, sendo limpas em banho
de ultra-som durante 30 minutos. Esta limpeza foi dividida em três etapas de 10
minutos cada. A primeira foi feita com detergente enzimático (EndoZime AW
Plus), a segunda com álcool absoluto e a por último usou-se água destilada As
amostras foram secas em temperatura ambiente e acondicionadas em
embalagem apropriada para uso posterior.
43
Figura 3. Discos de titânio
embutidos em resina de poliéster.
Figura 4. Discos de titânio após
o polimento.
4.5 Protocolo de nitretação
Após o polimento e limpeza, seis amostras por vez foram colocadas em
uma câmara de aço inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de
comprimento, hermeticamente fechada para receber o tratamento de
superfície. Utilizou-se configuração no reator de plasma para nitretação em
gaiola catódica (figura 5).
Figura 5. Representação esquemática do processo de nitretação em
gaiola catódica (ALVES Jr., 2005).
Internamente, a câmara possui um eletrodo em forma de disco, sobre o
qual colocou-se a amostra. Inicialmente foi feito um vácuo no reator até uma
44
pressão de 10-1 mbar e então introduziu-se hidrogênio com um fluxo de
12sccm, como gás de arraste de impurezas, até uma pressão de 1,6 mbar por
20 minutos. Após esta etapa, o N2 a 3sccm foi introduzido até conseguir uma
atmosfera de trabalho estável em torno de 680V, 0,5 miliampére (mA),
temperatura de 450ºC e pressão de nitretação de 2,5mbar. Nestas condições
as amostras foram nitretadas por 60 minutos (figura 6).
Figura 6. Amostras de titânio sendo nitretadas em gaiola catódica
As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo a um fluxo de
gases de 15sccm (tabela 4).
Tabela 4. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Grupo
experimental
Atmosfera do
plasma
Tempo de
tratamento
Pressão
do
plasma
Temperatura
do plasma
Fluxo do
gás total
Polidas
-
-
-
-
-
Gaiola
catódica
N20%H80%
1h
2,5mbar
450°C/17.5mA
15sccm
4.6 Esterilização das amostras
Em seguida, todas as amostras (nitretadas em gaiola catódica e polidas)
foram acondicionadas em placas de cultura de 24 poços de 2cm2 de área e
esterilizadas por radiação gama no DEN (Departamento de Energia Nuclear da
45
UFPE – Universidade Federal de Pernambuco). A dose total de radiação por
amostra foi de 25 kGy, liberada a
uma
dose média de 8,993 kGy/h (2h
46minutos a uma distância de 50mm), em irradiador GAMMACELL 220 Excel
(MDS Nordion, Ca).
4.7 Cultura de células
4.7.1 Obtenção dos Dentes
Os dois dentes utilizados (terceiros molares retidos) foram extraídos de
pacientes com indicação cirúrgica prévia, em sala de cirurgia apropriada,
localizada no setor de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial do
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN), através de protocolo cirúrgico, utilizando técnicas cirúrgicas
convencionais, obedecendo às rigorosas técnicas assépticas. Em seguida, os
elementos dentários foram imediatamente armazenados em tubos tipo Falcon
de 50 ml contendo 10 ml de meio de cultura alfa-MEM (Cultilab, Brasil).
Os dentes foram submetidos a três lavagens de 15 minutos cada, com
10 ml de solução contendo meio alfa-MEM (Cultilab, Brasil) enriquecido com
10.000 U.I./ml de Penicilina (Gibco, USA), 10.000 µg/ml de Estreptomicina
(Gibco, USA), 100 mg/ml de Gentamicina (Gibco, USA) e 250 µg/ml de
Anfotericina B (Gibco, USA), objetivando eliminar possível contaminação. Este
procedimento foi realizado em uma câmara de fluxo laminar. Depois de
processados, os elementos dentários obtidos encontravam-se aptos para a
obtenção e cultivo das células do ligamento periodontal.
4.7.2 Obtenção das Células Mesenquimais do Ligamento Periodontal
Foi utilizado um protocolo adaptado de Akizuki et al. (2005). As células
mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal foram removidas
através da raspagem delicada da superfície radicular com o uso de uma lâmina
de bisturi (figura 7) e em seguida foram submetidas à digestão enzimática
(figura 8) com 3 mg/mL de colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/ml de dispase
46
(Gibco, USA), por 1 hora a 37°C. Em seguida a soluç ão foi aspirada e
processada em filtro de 70 µm (BD Falcon, USA); a suspensão foi centrifugada
a 1200 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante retirado. As células
precipitadas foram então ressuspensas e cultivadas.
Figura 7. Remoção das células do
ligamento
periodontal
dos
terceiros molares.
Figura 8. Digestão enzimática do
extrato celular com dispase e
colagenase.
4.7.3 Cultivo das Células Mesenquimais Indiferenciadas do Ligamento
Periodontal
As células mesenquimais do ligamento periodontal foram cultivadas em
placas com área de crescimento de 25cm2 (TTP®, USA), com meio básico αMEM (Cultilab, Brasil) suplementado com 15% de soro fetal bovino – FBS
(Cultilab, Brasil). As culturas foram mantidas a 37º C em 5% de CO2, com troca
de meio a cada três dias, até atingirem 70 – 90% de confluência.
47
No subcultivo,
tivo, removeu-se
removeu se o meio básico e então adicionou-se
adicionou
às
garrafas 2 ml de tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA –
Gibco/USA). A suspensão celular foi colocada em um tubo cônico com o
mesmo volume de meio α-MEM
MEM suplementado com 15% de FBS com o
objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante
5 minutos, retirou-se
se o sobrenadante e as células foram ressuspensas em 1 ml
de meio α-MEM. Uma
ma alíquota dessa suspensão foi separada para a contagem
na Câmara de Neubauer, utilizando o método da exclusão de células coradas
pelo Azul de Trypan.
4.8 Cultivo celular sobre os discos de titânio
Na terceira passagem (subcultivo), as células do ligamento periodontal
foram cultivadas em três placas (uma para cada intervalo de tempo)
t
de 24
poços (TTP®, Swizterland),
Swizterland) na densidade de 2 x 104 células por poço.
poço Utilizouse 24 discos de titânio, sendo 12 de cada grupo (polido e gaiola catódica). A
mesma densidade celular foi cultivada em poços sem disco, como controle
positivo. A disposição
posição dos discos nos poços está esquematizada na figura 9.
Figura 9. Desenho esquemático da placa de 24 poços e a distribuição dos
discos para o cultivo das células nos diferentes grupos.
48
4.8.1 Análise da Adesão e Proliferação Celular
Para análise da adesão e proliferação celular e obtenção da curva de
crescimento nos diferentes grupos foram utilizados os dados obtidos das
contagens de células aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo
gaiola catódica) e à superfície de plástico (grupo controle), nos intervalos de
24, 48 e 72 horas após o plaqueamento. O número de células colhidas de cada
poço foi obtido pela contagem de células viáveis através do uso de
hemocitômetro e o método da exclusão de células coradas pelo azul de trypan
(FRESHNEY, 2000), obedecendo-se a seguinte equação matemática:
Nº de céls. =
݊ú݉݁‫ܿ ݁݀ ݋ݎ‬é݈‫݅ݑ݈݅݀ ܺ ݏܽ݀ܽݐ݊݋ܿ ݏ݈ܽݑ‬çã‫ ܺ ݋‬10ସ
݊ú݉݁‫ ݋݀ ݏ݋݀ܽݎ݀ܽݑݍ ݁݀ ݋ݎ‬ℎ݁‫ݐ݅ܿ݋݉ݎ‬ô݉݁‫݉݁݃ܽݐ݊݋ܿ ܽ݊ ݋݀ܽݏݑ ݋ݎݐ‬
4.9 Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise não paramétrica. Cada dado das
contagens corresponde à média ± dp (desvio padrão da média) das três
amostras por grupo por intervalo de tempo (24, 48 e 72 horas). As diferenças
entre os grupos foram comparadas pelos testes estatísticos Kruskal-Wallis,
Mann Whitney e Friedman. A diferença estatística foi considerada quando
p<0.05.
49
5 RESULTADOS
5.1 Adesão e proliferação celular
As células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal
humano comportaram-se de maneira particular quanto à topografia e
composição química das superfícies expostas. Entre as diferentes superfícies
do titânio a adesão foi mais pronunciada na superfície nitretada, indicando que
a microarquitetura resultante deste processo favorece a acomodação celular,
embora não tenha havido diferenças significativas para os valores de adesão
celular em 24 horas entre as superfícies de titânio e o controle (tabela 5).
Tabela 5. Análise do número de células (x104) em 24 horas referente aos
diferentes grupos de estudo.
24 horas
Média ± dp
Média dos postos
Grupo controle
5,66 ± 0,57
7,83
Grupo polido
3,33 ± 0,57
2,83
Grupo nitretado
4,00 ± 1,00
4,83
Valor de p*
0,061
p* Kruskal Wallis
A proliferação celular em 48 horas foi diferente entre os grupos
estudados. (tabela 6). Superfícies nitretadas favoreceram a proliferação celular
em relação as superfícies polidas, enquanto o controle exibiu maiores valores.
Tabela 6. Análise do número de células (x104) em 48 horas referente aos
diferentes grupos de estudo.
48 horas
Média ± dp
Média dos postos
Grupo controle
7,33 ± 0,57
8,00
Grupo polido
4,66 ± 0,57
2,67
Grupo nitretado
5,33 ± 0,57
4,33
Valor de p*
0,038
p* Kruskal Wallis
50
A proliferação celular progrediu quantitativamente em 72 horas no grupo
controle e nas superfícies de titânio polidas, embora não tenham ocorrido
diferenças estatísticas significativas entre a superfície polida e nitretada (tabela
7).
Tabela 7. Análise do número de células (x104) em 72 horas referente aos
diferentes grupos de estudo.
72 horas
Média ± dp
Média dos postos
Grupo controle
9,33 ± 2,08
7,50
Grupo polido
7,33 ± 1,52
5,33
Grupo nitretado
4,66 ± 1,52
2,17
Valor de p*
0,054
p* Kruskal Wallis
5.2 Curva de crescimento
Os
resultados
relativos
à
curva
de
crescimento
das
células
mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal são observados na
figura 10:
10
p = 0,097*
9
8
p = 0,05*
7
6
Controle
5
p = 0,44*
4
Polido
Nitretado
3
2
p* Friedman
1
0
24 h
Figura 10.
48 h
72 h
Curva de crescimento das células em diferentes intervalos de
tempo.
51
O crescimento celular aumentou de modo linear no grupo controle nos
períodos de avaliação. As células proliferaram de modo expressivo em 48
horas, com discreta diferença entre os grupos polido e nitretado. Os resultados
indicam que a adesão sofre mais impacto das características físico-químicas
das superfícies do titânio.
52
6 DISCUSSÃO
O conceito básico de bioengenharia baseada em células-tronco consiste
no isolamento e expansão celular, seguido pelo procedimento de reimplantação
combinado com um arcabouço material. As células mesenquimais têm sido
utilizadas através de experimentos in vitro nos estudos de bioengenharia como
meta de entender os eventos biológicos que ocorrem na interação entre as
células
e
as
superfícies
dos
biomateriais
empregados
em
cirurgias
maxilofaciais e implantodontia (SHANTI et al., 2007).
A biocompatibilidade de um material está relacionada não só à sua
composição química, mas também ao tipo de superfície utilizada, o que reflete
no comportamento das células quando em contato com a superfície. A adesão
celular é provavelmente o aspecto mais importante desta interação
célula/superfície, pois é pré-requisito para as outras etapas, tais como
proliferação e diferenciação (ANSELME, 2000).
Uma grande variedade de biomateriais tem sido testada, visando um
melhor
aproveitamento
do
potencial
osteogênico
das
células
tronco
mesenquimais para a engenharia de tecido ósseo, dentre os quais, o titânio é o
mais utilizado, devido às suas propriedades mecânicas, estabilidade química e
biocompatibilidade (AMARANTE, LIMA, 2001)
De acordo com Huré et al. (1996), os tipos básicos de materiais usados
para implantes dentários são limitados. Três grupos têm sido descritos: o grupo
dos metais e ligas metálicas, o grupo dos materiais cerâmicos, e o do carbono
e polímeros sintéticos. Embora vários materiais sejam citados, comercialmente
só são disponibilizados dois tipos para uso odontológico: as cerâmicas e o
titânio. Durante as últimas décadas, implantes metálicos têm sido os mais
frequentemente utilizados, sendo que o titânio, em sua forma comercial pura,
se tornou o material de escolha para a fabricação de implantes em cirurgia oral
e craniofacial. Haubenreich et al. (2005) relataram que os implantes cerâmicos
possuem algumas características mais estéticas quando comparados com o
titânio, porém problemas como fratura do implante, microfissuras, dor e perda
da osseointegração parecem ser mais freqüentes quando comparados com
implantes de titânio.
53
O titânio se tornou o material mais utilizado em implantes intraósseos,
segundo Hansson et al. (1983), pois esse metal possui características físicas e
químicas excepcionais que permitem a sua instalação nos tecidos vivos sem
que haja incompatibilidade entre eles. Propriedades físicas como seu
coeficiente elástico, de deformação e sua resistência à tração são diferentes do
tecido ósseo, porém não influenciam no sucesso deste tipo de tratamento. Sua
grande resistência à fratura possibilita resistir aos esforços necessários para
uma boa função mastigatória.
É sabido que a adesão celular na superfície do titânio é um fator
primordial para a osseointegração. Os ensaios de biocompatibilidade em novas
superfícies de titânio são realizados com diferentes tipos de células (primárias,
clones, imortalizadas) que guardam propriedades específicas quanto ao grau
de interação com o microambiente do material. Usualmente linhagens de
células imortalizadas com o potencial de expressar características fenotípicas
dos osteoblastos como SaoS-2, MG-63, L929, ROS17/2.8, MC3T3, são
utilizadas
para
estudar
as
interações
célula/material,
essenciais
no
desenvolvimento de novos materiais (JAYAMARAN, 2004; FAGHIHI et al.,
2006; ABDIZINA et al., 2007).
As células do ligamento periodontal humano adulto têm sido utilizadas
como uma fonte de células com potencial de diferenciação. Segundo Seo et al.,
(2004), o ligamento periodontal humano possui células com potencial de
diferenciação em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, podendo ser
comparadas às células-tronco da medula óssea. Ainda, as células-tronco do
ligamento periodontal podem ser utilizadas para regeneração do próprio
ligamento e do cemento.
A escolha do tipo celular adotado no presente estudo baseou-se no fato
de células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal serem
relatadas (NAGATOMO et al., 2006; GAY, CHEN, MACDOUGALL, 2007) como
responsáveis
tanto
pela
regeneração
óssea
alveolar,
como
pela
osseointegração de implantes de titânio após instalação imediata após
extração do dente do alvéolo.
Têm sido dada muita ênfase ao papel das propriedades superficiais do
titânio como o principal responsável pela adesão e proliferação de diferentes
fenótipos celulares e a consequente formação de tecido mineralizado na
54
interface com o implante (MARTIN et al., 1995; ONG, 1996; CASTELLANI,
1999; LAVOS-VALERETO et al., 2002; SCHIMIDT et al., 2002; HUANG et al.,
2004; NEBE et al., 2004) embora trabalhos demonstrem que superfícies com
diferentes rugosidades respondam de maneira semelhante no que diz respeito
a adesão e proliferação celular (MUSTAFA et al., 2001; ROSA, BELOTI, 2003;
XAVIER et al., 2003; ANSELME, BIGERELE, 2006).
As características de superfície do material apresentam um papel
importante na adesão celular, pois estas dão condições de adesão das
proteínas adsorverem e ajudarem no processo de adesão celular. Dentre quais,
as mais importantes são a composição química da superfície, rugosidade e
molhabilidade (ANSELME, 2000; SILVA, 2009). Contudo, atualmente existem
várias técnicas de tratamento de superfície dos metais que buscam otimizar
estas características, tais como a aspersão com plasma de titânio, jateamento
com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto de titânio, condicionamento
ácido, e outros (LI, CHU, DING, 2004).
Avaliou-se neste trabalho o efeito da modificação de superfícies de
titânio puro grau II pela técnica de nitretação em plasma. Este método de
tratamento foi introduzido na modificação de materiais para implante dentais e
consiste na deposição de nitretos em superfícies metálicas quando inseridas
em plasma de nitrogênio (ALVES Jr., 2005). A nitretação foi realizada na
configuração em gaiola catódica, onde as amostras foram circundadas por uma
gaiola de titânio com o objetivo de potencializar o efeito do plasma (ALVES Jr.,
2006).
A superfície plástica ou placa de cultura celular de poliestireno foi usada
como controle positivo, pois é a superfície padrão no cultivo de células por
apresentar excelentes características hidrofílicas (MAEDA et al., 2007). No
presente trabalho, as células mesenquimais do ligamento periodontal reagiram
de modo distinto em relação às superfícies expostas. A adesão celular foi mais
pronunciada no grupo controle, comportamento semelhante ao observado em
estudos de biocompatibilidade de superfícies (LINCKS et al., 1998; ANSELME
et al., 2000a; LINEZ-BATAILON et al., 2002).
A literatura mostra que a adesão celular parece ser favorecida em
superfícies rugosas em comparação a polidas (MARTIN et al., 1995; LAMPIN
et al., 1997; BÄCHLE, KOHAL, 2004). Entre as diferentes superfícies do titânio
55
do presente estudo, embora não tenha ocorrido diferença estatística
significante, os valores numéricos mostram que a adesão foi mais pronunciada
na superfície nitretada, sugerindo que a rugosidade obtida por esse tratamento
na superfície do material favorece a acomodação celular. Estudos anteriores
demonstraram que os discos tratados com nitretação na configuração de gaiola
catódica apresentam superfície mais rugosa quando comparados a superfícies
obtidas por nitretação a plasma em configuração planar (SÁ et al., 2009;
SILVA, 2009) e tiveram mais células aderidas em 24 horas, achados
semelhantes aos do presente estudo. Os resultados sugerem um efeito positivo
da gaiola na capacidade de gerar superfícies texturizadas homogêneas, pela
concentração de íons energizados próximos às amostras. Além disso, as
amostras nitretadas em gaiola catódica podem ter a superfície com mais
compostos de TiN devido a alta densidade de íons concentrada sobre as
mesmas, de modo que a célula interage com uma superfície nos aspectos
topográficos e químicos (SILVA, 2009).
No
presente
estudo,
a
proliferação
das
células
mesenquimais
indiferenciadas do ligamento periodontal humano adulto aumentou de modo
linear no grupo controle e o grupo polido nos períodos de avaliação. No
controle essa proliferação foi mais exacerbada, enquanto que na superfície
polida a proliferação aconteceu de forma discreta. Embora o grupo controle
tenha apresentado maiores valores do que o grupo polido, esse resultado
indica que essas células possuem uma boa interação com o material.
No grupo nitretado, a proliferação celular progrediu quantitativamente no
intervalo de tempo de 48 horas, o que não ocorreu em 72 horas. A diminuição
no número de células pode corresponder ao início do processo de
diferenciação celular, onde há redução na atividade proliferativa e o início da
produção de matriz extracelular, embora a diferenciação celular não tenha sido
avaliada nessas circunstâncias. Silva (2009) realizou um estudo utilizando
células pré-osteoblásticas MC3T3 em superfícies de titânio nitretada na
configuração de gaiola catódica e encontrou resultados similares ao presente
estudo em relação à proliferação celular, ou seja, diferentes tipos celulares
comportaram-se de forma semelhante em relação à superfície nitretada.
De forma semelhante, Lincks et al. (1998) observaram que
células
osteoblásticas MG63 cultivadas sobre Ti comercialmente puro (Ti cp) ou liga Ti56
6Al-4V (Ti-A) com superfícies de diferentes rugosidades apresentaram queda
no índice de proliferação e aumento na atividade da fosfatase alcalina sobre a
superfície mais áspera. A síntese de matriz extracelular também foi afetada e
as células nas superfícies mais rugosas apresentaram maior produção de
osteocalcina, apoiando a hipótese de que as células expressavam um fenótipo
mais diferenciado.
Alves (2008) utilizou dois tipos celulares distintos – (a) células da medula
óssea de camundongos e (b) células do ligamento periodontal de ratos – e
observou diferentes comportamentos celulares em relação a superfícies
nitretada e polida. A capacidade de adesão das células da medula óssea
mostrou-se similar entre o grupo nitretado e o controle, não apresentando
diferença estatística significativa, o que demonstra um bom resultado da
superfície nitretada. Em contrapartida, as células do ligamento periodontal de
ratos exibiu uma adesão semelhante nas superfícies polida e controle, e
menores valores na superfície nitretada.
Utilizando
células
mesenquimais
indiferenciadas
de
ligamento
periodontal humano, Heo et al. (2010) observaram um comportamento celular
sensível as diferentes magnitudes de rugosidade, sendo a superfície rugosa
mais propensa à adesão celular. Além disso, a medida que aumentou a
rugosidade superficial nos discos de titânio também foi aumentada a produção
de osteocalcina, o que sugere uma maior diferenciação desse tipo de células.
Ball et al. (2008) observaram que osteoblatos cultivados em superfícies
de titânio com magnitude de rugosidade semelhante e com um padrão
ordenado
ou
desordenada
gerou
resultados
diferentes.
As
células
apresentaram aumento da adesão em superfícies ordenadas em comparação
com aquelas que tinham uma descontinuidade aleatória. Isso sugere que a
morfologia da superfície desempenha um papel importante para influenciar as
respostas das células. Vários estudos têm indicado correlações com atividade
celular e a rugosidade do substrato (MARTIN, 1995; HATANO et al., 1999;
BOYAN et al., 2001; DELIGIANNI et al., 2001). No entanto, pesquisas indicam
que a magnitude da rugosidade isolada pode não ser fator de influência
(ANSELME et al., 2000b; ANSELME et al., 2002). Esses dados indicam que
osteoblastos cultivados, in vitro, em superfícies com uma descontinuidade
aleatória aderem menos e são menos ativos metabolicamente do que aqueles
57
cultivados em uma superfície mais regular ou até mesmo uma superfície plana
(BALL et al., 2008).
Experimentos in vitro demonstraram que células osteoblásticas humanas
(NHOst) responderam à rugosidade da superfície com uma diminuição na
atividade da fosfatase alcalina, assim como as células de calota craniana de
ratos (LOHMANN et al., 2000) e células da cartilagem costocondral de ratos
(SCHWARTZ et al., 1996) cultivadas sobre as mesmas superfícies. Em
contraste, a expressão da fosfatase alcalina não é afetada em osteócitos de
camundongos (MLO-Y4)
(LOHMANN et al., 2000) por mudanças na
rugosidade da superfície. O efeito diferencial da microtopografia da superfície
pode refletir o fenótipo da população celular de resposta, bem como na
atividade da fosfatase alcalina, produção de osteocalcina e nas diferenças no
estado de maturação das células (LINCKS, 1998; LOHMANN et al., 2000).
As diferenças na topografia de superfície, incluindo rugosidade e textura,
afetam a adsorção de fibronectina e albumina in vitro (PARK, DAVIES, 2000;
DELIGIANNI et al., 2001), influenciando na adesão celular (KELLER et al.,
2003). Proliferação e diferenciação de células osteoblásticas são dois fatores
sensíveis a alterações na microarquitetura da superfície (MARTIN et al., 1995;
LOHMANN et al., 2002; LOSSDÖRFER et al., 2004; SCHWARTZ et al., 2006).
Quando células osteoblásticas MG63 ou NHOst são cultivadas em superfícies
de titânio com diferentes microtopografias, o número de células é reduzido, e a
diferenciação, representada pela produção de osteocalcina, é aumentada na
superfície rugosa (MARTIN et al., 1995; LOHMANN et al., 2002). Por outro
lado, Balloni et al. (2009) não encontrou diferença na adesão de células-tronco
mesenquimais humanas (hMSCs) em superfícies lisas e rugosas, porém na
superfície rugosa as células apresentaram uma maior atividade da fosfatase
alcalina e também uma maior produção de osteocalcina.
Levando em consideração que as características da superfície
influenciam no comportamento celular, foi encontrado em estudos anteriores
(ALVES Jr., 2005; ALVES, 2008; GUERRA NETO, SILVA, ALVES Jr., 2009a;
MACEDO, 2008; SÁ et al., 2009; SILVA, 2009) uma discreta diferença na
morfologia celular, supostamente resultante de maiores valores de rugosidade
média e de molhabilidade na superfície das amostras nitretadas em relação às
amostras polidas. As células aderidas mostraram-se alongadas, com presença
58
de projeções dendríticas, representando pontos de adesão focal em resposta a
rugosidade superficial. Na superfície nitretada as células exibiram uma
morfologia mais achatada e lamelipódios. Na superfície polida foi observado
um formato mais arredondado e presença de filopódios (GUERRA NETO,
SILVA, ALVES Jr., 2009a; SILVA, 2009). Sá et al. (2009) utilizaram célulastronco mesenquimais de cordão umbilical e confirmou o aspecto poligonal das
células-tronco em todas as amostras, com emissão de prolongamentos, um
achado sugestivo de que existe biocompatibilidade entre essas células e o
titânio.
No caso do tratamento por plasma, os resultados confirmaram a
viabilidade do uso da técnica e seu efeito positivo nos eventos celulares iniciais
do processo de osseointegração. Este método foi capaz de produzir
modificações na superfície do titânio mantendo as características de
biocompatibilidade dessa nova superfície, conforme os nossos estudos e
corroborando os resultados de SÁ et al. (2009) e SILVA, (2009).
Escolheu-se a nitretação em plasma pelas excelentes propriedades
mecânicas, estabilidade química e biocompatibilidade (PARK et al., 2003)
quando aplicada ao titânio. Seu uso para implantes de quadril, joelho, ombro e
tornozelo tem levado a uma crescente resistência à abrasão e colonização
bacteriana reduzida, comparada a outras superfícies de implantes clinicamente
utilizadas (BAIER, MEYER, 1988). Entretanto, uma limitação do uso da
nitretação em implantes dentais está na alta temperatura do processo, entre
700 e 800ºC, podendo causar distorções no implante devido a sua geometria e
precisão dimensional (MISHRA, 2003). Guerra Neto et al. (2009b) identificaram
que a nitretação a plasma na técnica de descarga em cátodo oco produziu uma
mudança significativa na textura superficial das placas e dos implantes, sem
que houvesse distorção dos mesmos e ainda observou uma proliferação celular
2,5 vezes superior nas placas nitretadas em relação às placas controles. O
torque de remoção dos implantes nitretados foram em média 2 vezes superior
aos torques para remoção dos implantes controles. Portanto, os autores
concluíram que a nitretação provou ser uma técnica eficiente para o tratamento
de superfícies de biomateriais.
59
60
7 CONCLUSÕES
A adesão e a proliferação celular não foram influenciadas pelos
diferentes tipos de tratamento de superfície. Ambos os tratamentos produziram
superfícies compatíveis com adesão e proliferação de células mesenquimais do
ligamento periodontal humano.
61
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72
ANEXOS
73
ANEXO I - Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa – CEP
74
75
ANEXO II – Emenda ao projeto original
76
ANEXO III – Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PÓS
EM ODONTOLOGIA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Convidamos você para participar da pesquisa sobre Avaliação in vitro da
adesão e proliferação de células mesenquimais do ligamento periodontal
humano em diferentes superfícies de titânio, o que significa estudar o
comportamento destas células após o seu contato com o biomaterial, com a
finalidade de entender os princípios para o desenvolvimento de substitutos
biológicos capazes de restaurar, manter ou melhorar a função do ser vivo,
diante do
o papel desempenhado por estas células (mesenquimais do ligamento
periodontal de humanos) usadas nesse processo.
A sua participação não trará nenhum risco previsível ou desconforto.
Você não será submetido a nenhum procedimento (extra) além da cirurgia
77
conforme à indicação cirúrgica, assim os riscos envolvidos nesta pesquisa são
mínimos, porém você deve autorizar os pesquisadores a examinarem os seus
fragmentos teciduais (dentes removidos), que seriam tirados de sua boca e
desprezados após a cirurgia. As informações confidenciais serão guardadas
em local seguro e somente usadas com o propósito científico, sem divulgação
do seu nome.
Sua participação é voluntária, caso queira, você poderá desistir a
qualquer momento, sem que isso lhe traga prejuízo ou penalidade, basta que
retire o seu consentimento em participar.
A pesquisa deverá contribuir para o aumento do conhecimento na área
de engenharia de tecidos, que abrange um campo interdisciplinar onde
princípios de engenharia e ciências biológicas são utilizados para o
desenvolvimento de substitutos biológicos (Implantes dentários) capazes de
recuperar a função do ser vivo. A importância desta pesquisa, portanto, está no
fato da necessidade do desenvolvimento e aprimoramento, assim como, um
melhor entendimento para facilitar na escolha de tratamentos mais eficazes em
regeneração tecidual, trazendo assim, benefícios para a sociedade de um
modo geral.
Você não terá nenhum gasto financeiro por qualquer procedimento
executado por essa pesquisa e terá direito a reembolso (ressarcimento) de
qualquer gasto comprovadamente que você tenha feito para a realização desse
estudo, bem como será indenizado em caso de dano comprovadamente
ocorrido por sua participação na mesma.
Você receberá uma cópia desse termo no seu endereço via correio com
aviso de recebimento e qualquer dúvida a respeito da pesquisa poderá
perguntar a Carlos Augusto Galvão Barboza, no Campus Universitário S/N no
Departamento de Morfologia do Centro de Biociências da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Lagoa Nova, Natal/RN fone (84) 3215-3431 celular
(84-91156660) E-mail: carlosaugusto2000@hotmail.com
78
Consentimento Livre e Esclarecido
Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será
realizada, os riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar
voluntariamente da pesquisa “Avaliação in vitro da adesão, proliferação e
diferenciação de células mesenquimais do ligamento periodontal humano
em diferentes superfícies de titânio”.
Assinatura ou impressão
Digital do voluntário: _____________________________ Data:___/___/___
Assinatura do pesquisador: ________________________Data:___/___/___
Quanto à ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de
Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo
telefone 3215-3135.
79
Download

Dissertação - Rodrigo Alves Ribeiro