DANTON SPOHR CORRÊA
Estudo do valor prognóstico de fatores
clínico-patológicos e moleculares relacionados à
regulação do ciclo celular, proliferação e
angiogênese em portadores de
sarcomas sinoviais de extremidades.
Tese apresentada ao Departamento de Cirurgia
da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área de Concentração: Clínica Cirúrgica
Orientador: Prof. Dr. Ademar Lopes
São Paulo
2005
DANTON SPOHR CORRÊA
Estudo do valor prognóstico de fatores
clínico-patológicos e moleculares relacionados à
regulação do ciclo celular, proliferação e
angiogênese em portadores de
sarcomas sinoviais de extremidades.
Tese apresentada ao Departamento de Cirurgia
da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área de Concentração: Clínica Cirúrgica
Orientador: Prof. Dr. Ademar Lopes
São Paulo
2005
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Corrêa, Danton Spohr
Estudo do valor prognóstico de fatores clínico-patológicos e moleculares
relacionados à regulação do ciclo celular, proliferação e angiogênese em
portadores de sarcomas sinoviais de extremidades / Danton Spohr Corrêa-São Paulo, 2005.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Cirurgia.
Área de concentração: Clínica Cirúrgica.
Orientador: Ademar Lopes.
Descritores: 1.SARCOMA SINOVIAL 2.SARCOMA SINOVIAL/
fisiopatologia 3.PROGNÓSTICO
USP/FM/SBD-328/05
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Régis e Maria Luiza, pela educação e exemplo,
sem os quais eu nada seria na minha vida.
À minha esposa, Anne Claudine, pelo amor, carinho e incentivo,
sem os quais eu não teria terminado este trabalho.
À minha irmã, Cybele, pelo constante incentivo e por sempre
acreditar no meu trabalho.
Ao meu filho, João Vitor, por inspirar-me a ser uma pessoa
melhor que um dia possa servir-lhe de exemplo, como meus
pais foram para mim.
Aos meus orientadores e amigos, Dr. Ademar Lopes e Dr.
Fernando Augusto Soares, pelo exemplo de seriedade e
trabalho, aos quais tenho a ambição de um dia alcançar.
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes do Hospital do Câncer AC Camargo, sem os quais esta tese
não teria sido executada.
Aos amigos e sócios Dr. Fábio Accioli de Vasconcellos e Dr. Rafael Klee de
Vasconcellos, pelo incentivo e auxílio no cuidado de meus pacientes, nos
períodos em que me ausentei para que fosse possível concluir este trabalho.
Ao Dr. Eugênio Ferreira, professor do Departamento de Cirurgia da FMUSP,
pelo incentivo ao desenvolvimento desta tese.
Aos Profs. Drs. Ademar Lopes e Fernando Augusto Soares, por terem
acreditado na minha capacidade de realização, pela amizade, orientação e
incentivo durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Sra. Hirde Contesine, Chefe do Serviço de Arquivo Médico do Hospital do
Câncer AC Camargo, pela ajuda e dedicação durante o levantamento de
prontuários.
À Dra. Isabela Werneck da Cunha, médica patologista do Hospital do Câncer
AC Camargo, pela amizade e incansável auxílio na preparação e análise do
material anatomopatológico desta tese.
Ao Dr. Roberto Fauzoni, médico patologista consultor em tumores de partes
moles do Hospital do Câncer AC Camargo, pela revisão de lâminas da
casuística deste estudo.
Ao Sr. José Ivanildo Neves, biólogo do Departamento de Anatomia
Patológica do Hospital do Câncer AC Camargo, pela realização das reações
imuno-histoquímicas da casuística desta pesquisa.
À Alexandra Cardozo Longo, secretária do Departamento de Anatomia
Patológica do Hospital do Câncer AC Camargo, pela colaboração na
organização do processo de obtenção de financiamento à presente tese
junto à FAPESP.
Ao Dr. André Lopes Carvalho, médico cirurgião do Departamento de Cirurgia
de Cabeça e Pescoço do Hospital do Câncer AC Camargo, pela orientação e
revisão estatística deste estudo, além da revisão do texto final.
Ao Dr. Getúlio Rodrigues de Oliveira Filho, médico anestesiologista do
Hospital Governador Celso Ramos, Florianópolis, pelas lições de estatística
e uso de software durante a elaboração desta tese.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP processo 02/03008-8), pelo financiamento desta pesquisa.
Aos Cirurgiões do Departamento de Cirurgia Pélvica do Hospital do Câncer
AC Camargo, pelos ensinamentos de oncologia que recebi.
"A mais bela experiência que podemos ter é a do mistério. É a
emoção fundamental existente na origem da verdadeira arte e
ciência. Aquele que não a conhece e não pode se maravilhar
com ela está praticamente morto e seus olhos estão
ofuscados".
Albert Einstein, (1879-1955).
Esta tese está de acordo com:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journal Editors
(Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado Poe Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,
Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,
Valéria Vilhena. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2004.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Jornals
Indexed in Index Medicus.
SUMÁRIO
Lista de siglas
Lista de tabelas
Lista de figuras
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO......................................................................................02
1.1
Sarcomas de partes moles .........................................................02
1.2
Sarcomas sinoviais.....................................................................08
1.3
Marcadores moleculares ............................................................10
1.3.1 p53..................................................................................11
1.3.2 Ki67 ................................................................................12
1.3.3 EGFR e c-ERB-B2..........................................................13
1.3.4 Neoangiogênese ............................................................14
1.3.5 Óxido nítrico ...................................................................16
2
OBJETIVO ............................................................................................25
3
CASUÍSTICA E MÉTODO ....................................................................27
3.1
Casuística...................................................................................27
3.1.1 Critérios de elegibilidade para o estudo..........................27
3.2
Método .......................................................................................29
3.2.1 Preparo das lâminas.......................................................29
3.1.1.1 Imuno-histoquímica e CISH .............................29
3.2.2 Variáveis estudadas .......................................................32
3.2.3 Descrição das variáveis..................................................32
3.2.3.1 Variáveis demográficas e clínicas....................32
3.2.3.2 Variáveis anatomopatológicas .........................35
3.2.3.3 Variáveis moleculares......................................37
3.2.4 Análise estatística...........................................................44
4 RESULTADOS ......................................................................................48
4.1
Dados demográficos e clínicos...................................................48
4.2
Dados anatomopatológicos ........................................................53
4.3
Dados da análise molecular .......................................................54
4.4
Dados de seguimento.................................................................56
4.5
Sobrevida livre de recidiva local .................................................56
4.6
Sobrevida livre de metástases....................................................60
4.7
Sobrevida doença-específica .....................................................66
4.8
Associação entre variáveis .........................................................70
4.8.1 Associação de variáveis clínicas entre si........................70
4.8.2 Associação entre variáveis clínicas e moleculares .........71
4.8.3 Associação das variáveis moleculares entre si ..............73
3 DISCUSSÃO..........................................................................................75
4 CONCLUSÕES......................................................................................96
5 ANEXO ..................................................................................................98
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................101
LISTA DE SIGLAS
AJCC
COX 2
CISH
c-NOS
c-GMP
DAB
DNA
EDRF
EGFR
EMA
e-NOS
GTP
HRP
IFN
i-NOS
L-NAME
LPS
MMP 2
mRNA
NADPH
NO
NOS
n-NOS
PBS
SNC
SE
TIMP
TNM
UICC
VEGF
American Joint Committee on Cancer
ciclo-oxigenase tipo 2
chromogenic in situ hybridization
óxido nítrico sintase constitutiva
guanina monofosfato - cíclico
diaminobenzidina
ácido desoxirribonucleico
endothelium derived relaxing factor ou fator de relaxamento
derivado do endotélio
epidermal growth factor receptor ou receptor de fator de
crescimento epidermal
epithelial membrane antigen
óxido nítrico sintase endotelial
guanina trifosfato
horse radish peroxidase
interferon
óxido nítrico sintase induzível
N-nitro L-arginina metil éster
lipopolissacarídeo
matrix metalloproteinase-2
ácido ribonucleico mensageiro
nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato (forma reduzida)
óxido nítrico
óxido nítrico sintase
óxido nítrico sintase neuronal
phosphate buffered saline
sistema nervoso central
standard error
tissue inhibitor of metalloproteinase
Tumour, Nodes, Metastasis
International Union Against Cancer
vascular endothelium growth fator ou fator de crescimento do
endotélio vascular
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Alterações citogenéticas em sarcomas de partes moles .............03
Tabela 2
Anticorpos utilizados, clones, origem e diluição...........................31
Tabela 3
Localização, intensidade e freqüência .........................................42
Tabela 4
Dados demográficos ....................................................................48
Tabela 5
Localização detalhada dos tumores ............................................49
Tabela 6
Dados referentes ao tumor ..........................................................52
Tabela 7
Dados referentes ao tratamento ..................................................53
Tabela 8
Resultados do tratamento............................................................53
Tabela 9
Dados anatomopatológicos .........................................................54
Tabela 10 Distribuição das variáveis moleculares ........................................55
Tabela 11 Sobrevida livre de recidiva local em 5 e 10 anos – variáveis
clínicas .........................................................................................57
Tabela 12 Sobrevida livre de recidiva local em 5 e 10 anos – variáveis
moleculares..................................................................................58
Tabela 13 Hazard ratios para recidiva local – modelo multivariado pelo
método de Cox.............................................................................58
Tabela 14 Sobrevida livre de metástases em 5 e 10 - variáveis clínicas ......62
Tabela 15 Sobrevida livre de metástases em 5 e 10 anos - variáveis
moleculares..................................................................................63
Tabela 16 Hazard ratios para metástases – modelo multivariado pelo
método de Cox.............................................................................63
Tabela 17 Sobrevida doença específica em 5 e 10 anos - variáveis
clínicas .........................................................................................67
Tabela 18 Sobrevida doença específica em 5 e 10 anos - variáveis
moleculares..................................................................................68
Tabela 19 Hazard ratios para óbito por câncer – modelo multivariado pelo
método de Cox.............................................................................68
Tabela 20 Associação de variáveis clínicas selecionadas entre si ...............71
Tabela 21 Associação entre variáveis clínicas selecionadas e variáveis
moleculares..................................................................................72
Tabela 22 Associação entre variáveis moleculares ......................................73
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Sarcoma sinovial subtipo histológico bifásico ..............................36
Figura 2
Sarcoma sinovial subtipo histológico monofásico ........................36
Figura 3
Expressão imuno-histoquímica de p53 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração dos núcleos em marrom ........................38
Figura 4
Expressão imuno-histoquímica de Ki67 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração dos núcleos em marrom ........................39
Figura 5
Expressão imuno-histoquímica de EGFR em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de membrana em marrom .....................40
Figura 6
Expressão imuno-histoquímica de c-erb-B2 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de membrana em marrom .....................41
Figura 7
Expressão imuno-histoquímica de CD34 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de células endoteliais em marrom .........42
Figura 8
Expressão imuno-histoquímica de NOS 1 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração predominantemente nuclear em
marrom.........................................................................................43
Figura 9
Expressão imuno-histoquímica de NOS 2 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração citoplasmática em marrom ....................43
Figura 10 Expressão imuno-histoquímica de NOS 3 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração predominantemente citoplasmática em
marrom.........................................................................................44
Figura 11
Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico ................................................59
Figura 12
Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial de
extremidades com doença localizada ao diagnóstico, em função
do status local na admissão.........................................................59
Figura 13
Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial de
extremidades com doença localizada ao diagnóstico, em função
da presença ou ausência de expressão nuclear de Ki67 ≥5% ....60
Figura 14
Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico ................................................64
Figura 15
Curva de sobrevida livre de metástases em meses, comparandose os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função do status
local .............................................................................................64
Figura 16
Curva de sobrevida livre de metástases em meses, comparandose os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função da presença
ou ausência de expressão nuclear de Ki67 ≥5% .........................65
Figura 17
Curva de sobrevida livre de metástases em meses, comparandose os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função da presença
ou ausência de positividade para c-erb-B2..................................65
Figura 18
Curva de sobrevida doença específica em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico ................................................69
Figura 19
Curva de sobrevida doença específica em meses, comparando-se
os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função do tamanho do
tumor ≤ 8cm ou > 8cm .................................................................69
Figura 20
Curva de sobrevida doença específica em meses, comparando-se
os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função da presença
ou ausência de expressão nuclear de Ki67 ≥5% .........................70
RESUMO
Corrêa DS. Estudo do valor prognóstico de fatores clínico-patológicos e
moleculares relacionados à regulação do ciclo celular, proliferação e
angiogênese em portadores de sarcomas sinoviais de extremidades [tese],
São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2005. 124p.
INTRODUÇÃO: O sarcoma sinovial é um tumor raro e agressivo,
representando entre 5 a 10% dos sarcomas de partes moles. Fatores
prognósticos clínicos para esta doença são bem estabelecidos, mas
pacientes com caractérísticas clínicas similares podem apresentar evoluções
distintas. Alterações moleculares relacionadas ao controle do ciclo celular,
proliferação e angiogênese podem ser responsáveis por isso. O objetivo
deste estudo é testar esta hipótese. MÉTODO: Cinqüenta e sete pacientes
com sarcomas sinoviais de extremidades com doença localizada ao
diagnóstico tratados entre 1970 e 2001 foram selecionados, assim como os
respectivos tecidos em arquivo. Fatores demográficos, clínicos e patológicos
foram registrados para análise. Imuno-histoquímica para p53, Ki67, EGFR
(epidermal growth factor receptor), c-erbB-2, e sintases do óxido nítrico 1,2
e 3 foram realizadas. A contagem de microvasos e teste para amplificação
do gene c-erbB-2 por análise de CISH (chromogenic in situ hybridization)
também foram feitas. Os desfechos analisados no estudo foram as
sobrevidas livre de recidiva local, livre de metástases e doença específica.
RESULTADOS: A recidiva local ocorreu em 17 (30%) pacientes. A
sobrevida livre de recidiva local em 5 anos foi de 60,9% ±8,7. Fatores
prognósticos negativos na análise multivariada foram apresentação como
recidiva (p=0,014) e Ki67 score ≥5% (p<0,001). Metástases a distância
ocorreram em 33 (58%) pacientes. A sobrevida livre de metástase em 5
anos foi de 47,3 % ±7,3. Fatores prognósticos negativos para metástases
incluíram Ki67 score ≥5% (p<0,001) e positividade para c-erb-B2 (p=0,010).
Vinte e nove (51%) pacientes morreram da doença. A sobrevida doença
específica em 5 anos foi de 57.9% ±7.5. O único fator prognóstico negativo
para óbito por câncer na análise multivariada foi o tamanho do tumor >8cm
(p=0,047). Nenhuma associação foi verificada entre as variáveis
moleculares. Tumores distais estão associados a maior vascularização
(p=0,045); o tamanho do tumor à positividade de c-erb-B2 (p=0,049); a
cirurgia preservadora de membros à positividade de EGFR (p=0,036) e
NOS2 (p=0,023); tumores bifásicos à positividade de p53 (p=0,029) e c-erbB2 (0,002) e tumores monofásicos à positividade de NOS2 (p=0.002).
CONCLUSÃO: Em conclusão, tanto Ki67 como c-erbB2 são marcadores de
prognóstico independenes de fatores clínicos. A expressão de p53 e
contagem de microvasos não tiveram impacto no prognóstico. A influência
do óxido nítrico na progressão tumoral de sarcomas sinoviais não pôde ser
provada. A correlação entre positividade para p53, proliferação celular e
neovascularização demonstrada em outros estudos não foi confirmada neste
trabalho.
Descritores: sarcoma sinovial, sarcoma sinovial/fisiopatologia, prognóstico.
SUMMARY
Corrêa DS. Prognostic Analysis of Clinical, Pathological and Molecular
Factors related to Cell Cycle regulation , proliferation and angiogenesis in
patients with localized Extremity Synovial Sarcoma [thesis], São Paulo:
¨Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2005. 124p.
INTRODUCTION: Synovial sarcoma is a rare and aggressive tumor,
representing between 5 to 10% of soft tissue sarcomas. Clinical prognostic
factors for this disease are well established, but patients with similar clinical
characteristics may still have distinct outcomes. Molecular alterations related
to cell cycle regulation, proliferation and angiogenesis may account for that.
The aim of this study is to test this hypothesis. METHOD: Fifty-seven
patients with localized extremity synovial sarcoma surgically treated between
1970 and 2001 were selected as well as the correspondent archive tissues.
Demographic, clinical and pathological variables were recorded for analysis.
Immunohistochemestry for p53, Ki67, EGFR (epidermal growth fator
receptor), c-erbB-2, and the nitric oxide synthases 1, 2 and 3 were done.
Analysis of microvessel counts and testing for the amplification of the c-erbB2 gene by CISH (chromogenic in situ hybridization) analysis were also
performed. The end points of the study were local recurrence free,
metastasis free and disease specific survival. RESULTS: Seventeen (30%)
patients developed local recurrence. The 5 year local recurrence- free
survival was 60.9% ±8.7. Negative prognostic factors for local recurrence on
multivariate analysis were local status as recurrent tumor (p=0.014) and Ki67
score ≥5% (p<0.001). Distant metastasis occurred in 33 (58%) patients. The
5 year metastasis-free survival was 47.3 % ±7.3. Negative prognostic factors
for metastasis on multivariate analysis included Ki67 score ≥5% (p<0.001)
and positive c-erb-B2 (p=0.010). Twenty nine (51%) patients died of their
disease. The 5 year disease-specific survival was 57.9% ±7.5. The only
negative prognostic factor on multivariate analysis was tumor size >8cm
(p=0.047). No association was detected among molecular markers. Distal
tumors were associated to increased vascularity (p=0.045); tumor size to
positive c-erb-B2 expression (p=0.049); limb sparing procedures to positive
EGFR (p=0.036) and NOS2 (p=0.023) expression; bifasic tumors to positive
p53 (p=0.029) and c-erb-B2 (0.002) expression and monofasic tumors to
positive NOS2 (p=0.002) expression. CONCLUSIONS: In conclusion, both
Ki67 and c-erbB2 are prognostic factors independent of clinical variables.
The p53 and EGFR expression as well as the microvessel count had no
impact on prognosis. The influence of nitric oxide in tumor progression in
synovial sarcomas could not be proven. Also, its correlation with p53 status,
proliferation rate and vascularity, described previously in other studies, could
not be shown.
Keywords: synovial sarcoma, synovial sarcoma/physiopathology, prognosis.
INTRODUÇÃO
Introdução
1
INTRODUÇÃO
1.1
Sarcomas de partes moles
2
Os sarcomas de partes moles são neoplasias malignas raras,
compreendendo menos de 1% das neoplasias sólidas no adulto. Devido a
este fato, são tumores pouco conhecidos pela classe médica não
especializada, o que acarreta em retardo diagnóstico e, muitas vezes, em
um tratamento inicial mal conduzido. Por isso, são um problema de grande
importância na oncologia atual (Lopes et al., 1999).
Os sarcomas de partes moles são um grupo heterogêneo de tumores,
com mais de 50 subtipos descritos (Coindre et al., 2001). Apesar da
heterogeneidade, originam-se de uma célula mesenquimal primitiva comum,
que se diferencia nos diversos subtipos histológicos. Sua nomenclatura
deriva do tecido ao qual o tumor se assemelha. Deste modo, se o tumor
assemelha-se a tecido gorduroso chama-se lipossarcoma, se a tecido
muscular esquelético, rabdomiossarcoma, e assim sucessivamente (Lopes
et al., 1999; Graadt van Roggen et al., 1999). Mais recentemente, alterações
genéticas específicas de alguns deles foram descritas, facilitando esta
classificação (Graadt van Roggen et al., 1999; Fletcher et al., 1991)
(Tabela 1).
Diferenças no comportamento entre os diversos subtipos, antes não
apreciadas por estudos em que eram analisados como um todo, tem se
tornado mais evidentes à medida que instituições de referência com bancos
Introdução
3
de dados prospectivos aumentam sua casuística e permitem tal análise
(Koea et al., 2003). Apesar destas diferenças, em sua maioria os sarcomas
de partes moles ainda são tratados como uma entidade única (Lawrence et
al., 1987; Cormier e Pollock, 2004).
Tabela 1 - Alterações citogenéticas em sarcomas de partes moles
Sarcomas de partes moles
subtipos histológicos
Característica
citogenética
Freqüência
Sarcoma de células claras
t(12;22)(q13;q12)
>75%
Dermatofibrosarcoma protuberans
Cromossomo em anel 17
>75%
Sarcoma de Ewing
t(11;22)(q24;q12)
95%
Condrosarcoma mixóide extraesquelético
t(9;22)(q31;q12)
50%
Liposarcoma mixóide
t(12;16)(q13;p11)
75%
Liposarcoma, bem diferenciado
Cromossomo em anel 12
80%
Rabdomiosarcoma alveolar
t(2;13)(q35;q14)
80%
Sarcoma sinovial
t(X;18)
95%
Levando-se em conta suas características em comum, os sarcomas
de partes moles apresentam-se como uma tumoração de crescimento lento,
por vezes dolorosa, que progressivamente infiltra os tecidos adjacentes
(Lawrence et al., 1987). Originam-se em qualquer parte do corpo, embora
sejam mais comuns nas extremidades, principalmente membros inferiores
(Lawrence et al., 1987; Cormier e Pollock, 2004). Apresentam com
freqüência metástases a distância, disseminadas por via hematogênica,
sendo os pulmões o sitio mais acometido (Gadd et al., 1993). Metástases
linfonodais são raras (Fong et al., 1993).
O tratamento dos sarcomas de partes moles é multidisciplinar, com a
cirurgia sendo a principal modalidade (Pisters, 1998). A utilização da
Introdução
4
radioterapia e quimioterapia isoladamente ou associadas, antes ou após a
cirurgia, permitiu que ressecções mais conservadoras fossem possíveis,
inaugurando a era da cirurgia preservadora de membros (Tierney et al.,
1997; Henshaw et al., 2001; Pisters et al., 2002; Ottaiano et al., 2002;
O’Sullivan et al., 2002; Sadoski et al., 1993). No passado, devido aos altos
índices de recidiva local, as amputações eram bastante freqüentes (Abbas et
al., 1981). Atualmente, com o tratamento multimodal, os índices de recidiva
são semelhantes com ou sem amputação (Rosenberg et al., 1982). Apesar
disto, na ausência de drogas quimioterápicas eficazes no tratamento de
metástases a distância, a sobrevida permanece a mesma (Rosenberg et al.,
1982). Metástases a distância quando com tumor primário controlado e
passível de ressecção completa, ainda permitem sobrevida em 5 anos em
torno de 30% (Billingsley et al., 1999). Recentemente, a utilização de
quimioterapia em altas doses sem radioterapia associada no período préoperatório tem mostrado índices de necrose tumoral de até 95%, sendo a
mais nova tendência no tratamento destas neoplasias (Eilber et al., 2001;
Ottaiano et al., 2002). Apesar destes avanços, os índices de mortalidade
específica dos sarcomas de partes moles são de duas a dez vezes maiores
que as de tumores malignos com incidências semelhantes, mostrando a falta
de efetividade dos tratamentos atualmente disponíveis para doença
sistêmica (Weitz et al., 2003).
O estadiamento dos sarcomas de partes moles é motivo de
controvérsia (Wunder et al., 2000). O sistema mais utilizado é o que leva em
consideração características do tumor primário, comprometimento linfonodal
Introdução
5
e metástases a distância, conhecido como sistema AJCC/UICC TNM
(Greene et al., 2002). Os parâmetros do tumor primário avaliados são o
tamanho, a invasão de planos profundos e o grau histológico. O
acometimento linfonodal regional e de sítios distantes é computado como
presente ou ausente (Quadro 1).
Tumores maiores que 5cm, profundos e de alto grau possuem maior
chance de apresentar metástases e, portanto, tem pior prognóstico (Gaynor
et al., 1992). Obviamente, pacientes com metástases linfonodais ou a
distância ao diagnóstico possuem pior evolução e são marcadores tardios da
agressividade tumoral. Ainda assim, estudo recente acredita ser um erro de
categorização considerar comprometimento linfonodal como estadio IV, já
que a sobrevida destes pacientes assemelha-se aos do estadio III (Riad et
al., 2004). Apesar de o estadiamento fornecer importantes informações com
relação ao prognóstico, pacientes dentro de um mesmo estadio podem
apresentar evoluções distintas. Falhas nítidas no sistema contribuem para
este fato. Por exemplo, um tumor de 4.9cm não é diferente em
comportamento de um tumor de 5.1cm, apesar de ambos possuírem
estadiamentos diferentes. Além disso, mesmo quando tumores são
totalmente comparáveis em tamanho, histologia, grau, comprometimento
local e disseminação a distância, ainda assim estes podem possuir
comportamentos
diversos.
Outros
sistemas
de
estadiamento
foram
propostos levando em conta diferentes fatores, porém com limitações
semelhantes (Wunder et al., 2000). Os fatores responsáveis por isso são
pouco conhecidos e parecem estar relacionados tanto a características
Introdução
6
clínicas e anatomopatológicas não levadas em conta no estadiamento como
a alterações genéticas que tornam o tumor mais ou menos agressivo. Um
estadiamento molecular que leve em conta estas alterações e tenha uma
acurácia maior que 50% pode ser uma ferramenta importante na
identificação do paciente de alto risco (O’Sullivan e Pisters, 2003).
Quadro 1 - Estadiamento TNM para sarcomas de partes moles
T - Tumor Primário
Tx Tumor primário não pode ser avaliado
TO Não há evidência de tumor primário
T1 Tumor com 5cm ou menos em sua maior dimensão
T1a = tumor superficial
T1b = tumor profundo
T2 Tumor com mais de 5cm em sua maior dimensão
T2a = tumor superficial
T2b = tumor profundo
N - Linfonodo Regionais
NX Linfonodo regionais não podem ser avaliados
NO Ausência de metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em linfonodos regionais
M - Metástases a distância
MX Presença de metástases a distância não pode ser avaliada
MO Ausência de metástase a distância
M1 Metástase a distância
G - Grau Histológico de Malignidade
Gx Grau de diferenciação não pode ser avaliado
G1 Bem diferenciado G2 Moderadamente diferenciado
G3-4 Pouco diferenciado/indiferenciado
Agrupamento por Estadios
Estadio IA
G1,2
G1,2
T1a
T1b
NO
NO
MO
MO
Estadio IB
G1,2
T2a
NO
MO
Estadio IIA
EstadioIIB
G1,2
G3,4
G3,4
T2b
T1a
T1b
NO
NO
NO
MO
MO
MO
Estadio IIC
Estadio III
Estadio IV
G3,4
G3,4
Qualquer G
Qualquer G
T2a
T2b
Qualquer T
Qualquer T
NO
NO
N1
Qualquer N
MO
MO
MO
M1
Introdução
7
Fatores prognósticos, além dos avaliados pelo estadiamento, estão
relacionados a aspectos clínicos, patológicos e terapêuticos. Idade acima de
50 anos, localização proximal no membro, apresentação como recidiva local,
subtipos histológicos leiomiossarcoma e tumor maligno da bainha nervosa
periférica e margens cirúrgicas microscópicas comprometidas são os
principais (Pisters et al., 1996). O uso de transfusão de hemoderivados
também parece afetar adversamente o prognóstico (Heslin et al., 1984;
Rosenberg et al., 1995). Fatores que interferem com a sobrevida livre de
recidiva local podem não ser os mesmos que interferem com a sobrevida
livre de metástases e sobrevida doença-específica. Por exemplo, idade
acima de 50 anos e tipo histológico fibrossarcoma são fatores prognósticos
para sobrevida livre de recidiva local, mas não para sobrevida livre de
metástases ou doença-específica (Pisters et al., 1996).
Entre todos os fatores prognósticos, o que melhor define o
comportamento dos sarcomas de partes moles é o grau histológico de
malignidade (Coindre et al., 1996; Coindre et al., 2001). A definição do grau
histológico é dependente do número de mitoses, diferenciação celular e
extensão da necrose, separando os tumores em bem (G1), moderadamente
(G2) e pouco diferenciados (G3), podendo ser incluído outro grupo chamado
de sarcomas indiferenciados (G4) (Russell et al., 1977). Do ponto de vista
prático, são divididos em baixo e alto grau (Lewis e Brennan, 1996).
Alguns tipos histológicos são considerados de alto grau de
malignidade por definição. Por possuírem esta característica uniformizada,
servem como bons modelos para análise de fatores prognósticos que
Introdução
8
independam do grau. Neste estudo, escolhemos o sarcoma sinovial como
foco de nossa investigação (Fisher, 1998).
1.2
Sarcomas sinoviais
Os
sarcomas
sinoviais
são
tumores
raros,
compreendendo
aproximadamente 5 a 10% dos sarcomas de partes moles (Bergh et al.,
1999). São mais comuns em extremidades, embora possam originar-se em
qualquer parte do corpo sem qualquer relação com membranas sinoviais
(Weiss e Goldblum, 2001). Acometem principalmente adultos jovens e
apresentam-se como uma massa dolorosa de crescimento lento próxima a
uma grande articulação, especialmente a região do joelho (Weiss e
Goldblum, 2001). Histologicamente podem ser de dois tipos, monofásico e
bifásico, baseados na presença ou ausência de diferenciação glandular
epitelial junto a células tumorais fusiformes (Brodsky et al., 1992; Singer et
al., 1996; Deshmukh et al., 2004). Apresentam uma translocação
característica entre o cromossomo 18 e o X, t(X;18)(p11; q11), presente em
mais de 90% deles, o que pode auxiliar no diagnóstico em casos não
característicos (Sreekantaiah et al., 1994; Kawai et al., 1998). São tumores
agressivos, recidivando localmente em torno de 12 a 31%, mesmo com
tratamento adequado e a distância entre 39 e 54% dos casos (Mullen e
Zagars, 1994; Bergh et al., 1999; Lewis et al., 2000). Metastatizam
principalmente para pulmões e em torno de 3-7%, para linfonodos (Spillane
et al., 2000 e Trassard et al., 2001; Paulino, 2004; de Silva et al., 2004;
Behranwala et al., 2004; Riad et al., 2004). Apresentam índices mais altos de
Introdução
9
resposta à quimioterapia do que o restante dos sarcomas em adultos
(Kampe et al., 1993; Rosen et al., 1994; Van Glabbeke et al., 1999) e índices
de sobrevida doença-específica, em 5 anos, de 57 a 63% (Bergh et al.,
1999; Spillane et al., 2000; Trassard et al., 2001).
Fatores prognósticos específicos para sarcomas sinoviais têm sido
estudados em separado.
Em uma série de 112 sarcomas sinoviais somente com tumores de
extremidade intactos, o tamanho do tumor e a invasão de estruturas ósseas
ou neurovasculares tiveram impacto negativo na sobrevida (Lewis et al.,
2000). Estudos envolvendo pacientes com sarcoma sinovial também em
outras localizações e com manipulação prévia identificaram outros fatores
adversos: sexo masculino (Wright et al., 1982; Trassard et al., 2001), idade
acima de 25 anos (Mullen e Zagars, 1994; Bergh et al., 1999; Paulino, 2004;
de Silva et al., 2004), ocorrência de recidiva (Bergh et al., 1999; Spillane et
al., 2000; Deshmukh et al., 2004), localização proximal no membro
(Moberger et al., 1968; Oda et al., 1993), amputação (Skytting, 2000),
margem microscópica comprometida (Singer et al., 1996; Trassard et al.,
2001) e subtipo monofásico (ZIto, 1984; Cagle et al., 1987; Paulino, 2004).
Estes fatores não são tão claros, havendo discordâncias na literatura. Entre
todos, o tamanho parece ser o mais importante (Mullen e Zagars, 1994;
Singer et al., 1996; Bergh et al., 1999; Lewis et al., 2000; Deshmukh et al.,
2004; Paulino, 2004; de Silva et al., 2004).
Recentemente, foram identificados 2 tipos de transcritos relacionados
com a translocação entre o cromossomo 18 e o X (Kawai et al., 1998). A
Introdução
10
translocação funde o gene SYT do cromossomo 18 com um dos genes
altamente homólogos do cromossomo X, SSX1 e SSX2. O produto SYTSSX1 está associado ao subtipo histológico bifásico e o SYT-SSX2 ao
subtipo monofásico. Pacientes com o produto de fusão SYT-SSX2 parecem
ter um período de sobrevida livre de metástase mais longo que os pacientes
com o produto SYT-SSX1(Ladanyi et al., 2002).
1.3
Marcadores moleculares
Fatores moleculares que atuem como marcadores de agressividade
tem sido estudados em vários tipos tumorais (Hanahan e Weinberg, 2000),
inclusive nos sarcomas de partes moles (Bell et al., 1999; Levine, 1999).
Proteínas
envolvidas
no
processo
de
transcrição,
diferenciação
e
proliferação celular, reparo de DNA e apoptose ou ainda em processos de
neovascularização tumoral foram identificadas, suas alterações estudadas e
relacionadas a prognóstico. Apesar da presença de algumas destas
alterações realmente conferir à célula tumoral um fenótipo mais agressivo, a
sua significância do ponto de vista prático não foi apreciada (Borden et al.,
2003). Nos sarcomas de partes moles, nenhuma delas provou-se ser um
fator prognóstico tão importante que resultasse em mudanças no
estadiamento ou na prática clínica. Apesar disto, o seu estudo levou a uma
melhor compreensão no processo de progressão tumoral. Neste contexto,
alterações na proteína p53, proliferação celular e neovascularização são
descritas a seguir, assim como o possível papel de uma pequena molécula,
o óxido nítrico, na interação entre estes fatores.
Introdução
11
1.3.1 p53
O p53 é um gene supressor de tumor localizado no cromossomo 17
que codifica uma fosfoproteína com mútiplas funções, entre elas a parada do
ciclo celular em G1 para reparo de DNA ou eventual apoptose (Levine et al.,
1991). A mutação deste gene é o defeito genético mais comumente
encontrado em neoplasias malignas humanas (Hollstein et al., 1991). O
acúmulo nuclear da proteína denota uma maior meia vida desta, sugerindo
que mutações no DNA que a codificam ocorreram e permitiram a detecção
imuno-histoquímica dela (Finlay et al., 1988). O papel da mutação do p53 na
carcinogênese difere entre os diversos tipos tumorais, podendo ser uma
alteração precoce detectada em células pré-malignas até uma das mutações
que desencadeia a tranformação de um tumor benigno em maligno (Nigro et
al., 1989). A presença de mutações no gene p53 provou-se ter influência no
prognóstico de alguns tipos tumorais (Thor et al., 1992; Horio et al., 1993;
Thorlacius et al., 1993; Sarkis et al. 1993), inclusive nos sarcomas de partes
moles (Drobnjak et al., 1994; Hieken e Das Gupta, 1996; Taubert et al.,
1996; Nakanishi et al., 1997). Nos sarcomas, esta mutação pode estar
presente em até 60% dos casos e correlacionar-se tanto com o intervalo livre
de doença como com a sobrevida doença específica (Hieken e Das Gupta,
1996). Tanto a proporção de sarcomas mostrando a mutação como a
correlação com o prognóstico é variável de acordo com o subtipo histológico.
No caso do sarcoma sinovial, o percentual de expressão alterada da
proteína variou de 16-67%. A relação com prognóstico foi controversa, não
Introdução
12
havendo consenso entre os estudos (Oda et al., 2000; Antonescu et al.,
2000 e Barbashina et al., 2002).
1.3.2 Ki-67
O Ki-67 é uma proteína nuclear e nucleolar que está altamente
associada à proliferação celular (Endl e Gerdes, 2000). Durante a interfase,
pode exclusivamente ser detectada dentro do núcleo. Durante a mitose, a
proteína se relocaliza na superfície cromossomal. O fato de a proteína Ki-67
estar presente durante todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2 e M),
mas estar ausente em células em repouso (G0), faz dela um excelente
marcador para determinar a chamada fração de crescimento de uma
determinada população celular. Embora a caracterização molecular desta
proteína esteja bem determinada, seu significado funcional no ciclo celular
ainda não é claro. Existem indícios, no entanto, que a sua presença é de
fundamental importância para a progressão de uma célula pelas fases do
ciclo de divisão (Scholzen e Gerdes, 2000). Anticorpos desenvolvidos contra
esta proteína pavimentaram a via para a determinação imuno-histoquímica
da fração de crescimento celular, utilizada em numerosos estudos para
determinação de valor prognóstico em várias neoplasias humanas. Os
melhores exemplos neste contexto são os carcinomas de mama e próstata
(Bubendorf et al., 1998; Caly et al., 2004). Para estes tipos tumorais, o valor
prognóstico
para
sobrevida
e
recidiva
tumoral
foi
repetidamente
demonstrado em análises uni e multivariadas. A significância prognóstica
deste marcador em sarcomas de partes moles também foi determinada em
Introdução
13
alguns estudos. Em um deles, envolvendo sarcomas de alto grau de vários
subtipos histológicos, o Ki-67 mostrou ser um marcador prognóstico
independente para sobrevida livre de metástases e doença específica
(Heslin et al., 1998). Já em outro estudo, envolvendo apenas fibrohistiocitomas malignos, este valor não foi demonstrado (Choong et al.,
1995). No caso dos sarcomas sinoviais, o maior índice proliferativo
determinado pelo Ki-67 parece estar associado a um pior prognóstico (Lopes
et al., 1998; Antonescu et al., 2000).
1.3.3 Receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) e c-erb-B2
O receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) e seu homólogo
c-erbB-2 são receptores transmembrana com atividade tirosina-quinase
relacionada à transdução de sinal (Ciardiello e Tortora, 2003; Menard et al.,
2004). Sua ativação em células normais está relacionada ao crescimento,
diferenciação, motilidade e adesão celular. Alterações em sua função e
relação com prognóstico foram estudadas em vários tipos tumorais,
principalmente em carcinomas mamários (Slamon et al., 1987; Harris et al.,
1989; Pierce et al., 1991; Salomon et al., 1995). A sinalização nuclear
alterada leva a uma maior proliferação e invasividade celular, assim como
formação de novos vasos sangüíneos (Menard et al., 2004). O uso destes
receptores como alvos terapêuticos através do seu bloqueio com anticorpos
monoclonais ou inibição de sua atividade proteína-quinase foi idealizado e
encontra-se em prática clínica (Baselga et al., 1996; Baselga e Averbuch,
2000). A expressão de EGFR e c-erbB2 também foi descrita em sarcomas,
Introdução
14
mas com papel na progressão tumoral duvidoso (Gusterson et al., 1985;
Beech et al., 1998; Foster et al., 2003; Sato et al., 2003; Potti et al., 2004).
Da mesma forma, a expressão de EGFR e c-erbB-2 foi relatada em
sarcomas sinoviais, e sua relação com prognóstico também não está
totalmente esclarecida. Os estudos foram realizados com número muito
pequeno de pacientes, portanto com conclusões limitadas (Barbashina et al.,
2002; Nuciforo et al., 2003).
1.3.4 Neoangiogênese
Angiogênese é a formação de vasos sangüíneos a partir de um leito
vascular pré-existente, e é fundamental para o crescimento tumoral, invasão
e metástases (Folkman, 1990). O crescimento de tumores sólidos além de 1
a 2 mm em tamanho não é possível sem ela, quando a difusão sozinha de
oxigênio não é suficiente para manter um nível de oxigenação tecidual
adequado. As células de um tumor em fase pré-vascular podem replicar-se
tão rápido quanto às de um tumor bem vascularizado em crescimento, mas
sem a formação de novos vasos o número de células em proliferação atinge
um equilíbrio com o número de células que morrem (Hanahan et al., 1996;
Skobe et al., 1997). O processo de formação de novos vasos sangüíneos é
complexo e depende de um balanço local entre vários fatores próangiogênicos e antiangiogênicos, liberados tanto por células tumorais como
do hospedeiro, incluindo células estromais adjacentes e células do sistema
imune. Este processo consiste em uma série de passos interligados,
incluindo a separação de células endoteliais dos pericitos, invasão e
Introdução
15
migração através da membrana basal e subseqüente extensão para dentro
da massa tumoral (Fox et al. 2001). Vasos formados sob a influência destas
vias são anormais, com alterações de permeabilidade e fluxo (Jain, 2000;
Fox et al., 2001). Como resultado, apesar de novos vasos terem sido
formados, a oferta sangüínea e conseqüentemente de oxigênio não se dá de
forma adequada se comparada a tecidos normais. Este novo ambiente pode
levar à seleção genética de células resistentes a drogas e à radiação. A
determinação da quantidade de vascularização em um tumor e a sua relação
com prognóstico foi primeiro mostrada por Weidner et al., em 1991 em casos
de carcinoma mamário. O número de vasos neoformados no tumor
correlacionou-se com o estadio da doença e mostrou-se ser um fator de
prognóstico independente dos normalmente utilizados. Desde então, uma
série de estudos tem demonstrado uma correlação significativa entre a
densidade de microvasos tumoral e prognóstico em uma variedade de outros
tumores, como carcinomas do trato gastrointestinal, melanoma, carcinoma
prostático, ovariano, de bexiga e outros (Weidner e Folkman, 1996). Embora
a densidade vascular tenha se mostrado útil como fator prognóstico em
carcinomas, o mesmo não aconteceu com sarcomas (Saenz et al., 1998;
Tomlinson et al., 1999). Estes estudos incluíram todos os subtipos
histológicos sem distinção, inclusive sarcomas sinoviais, e sugerem que a
angiogênese não desempenha um papel importante no mecanismo de
metástases deste tipo tumoral. Em estudo fase II, não foi identificada
resposta a um agente antiangiogênico utilizado em pacientes com sarcomas
de partes moles em estadio avançado (Heymach et al., 2004). Apesar disto,
Introdução
16
estudos preliminares com drogas antiangiogênicas mostraram resultados
também em pacientes com sarcomas, lançando dúvida sobre esta primeira
conclusão (Heymach, 2001).
1.3.5 Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma das 10 menores moléculas existentes e
também uma das mais antigas, já que se pensa que foi primeiro formada na
atmosfera primitiva deste planeta durante a sua resfriação (Moncada e
Martin, 1993). Apesar do seu tamanho, ela está envolvida em uma ampla
variedade de funções biológicas, muitas das quais pouco compreendidas. O
estudo do seu papel nestas funções começou em 1980, quando Furchgott e
Zadawaski descreveram o endotélio como a fonte de uma substância capaz
de provocar relaxamento da musculatura lisa vascular, o EDRF (endothelium
derived relaxing factor). Em 1986, foi proposto por Ignarro et al. que o EDRF
seria o óxido nítrico, o que se confirmou no ano seguinte. Entre 1987 e 1988,
Palmer et al. também confirmaram esta hipótese. Também em seu
laboratório, descreveu-se a via sintética desta molécula, que é produzida a
partir da L-arginina por uma enzima, a óxido nítrico sintase (NOS). Nos
últimos 10 anos, outras duas isoformas do óxido nítrico sintase foram
descritas além da endotelial. A isoforma neuronal, identificada em tecidos
neurais (principalmente cérebro) e a isoforma induzível, produzida por
macrófagos ativados por lipopolissacarídeos ou citocinas (Moncada, 1999).
Nos últimos anos, mais de 20 mil artigos foram escritos sobre o óxido nítrico
e suas ações no sistema cardiovascular e neural, assim como seu papel na
Introdução
17
inflamação e imunologia (Singh e Evans, 1997). Ele está implicado na
patogênese das mais diversas doenças, como hipertensão, asma, choque
séptico e demência (Shinde et al., 2000). Atualmente, seu papel na biologia
tumoral tem sido extensamente investigado (Lala e Chakraborty, 2001).
Três isoformas da NOS foram identificadas como já descrito acima:
endotelial (e-NOS ou tipo 3) e neuronal (n-NOS ou tipo 1) que são expressas
constitutivamente e são denominadas em conjunto NOS constitutivas
(cNOS); e uma forma derivada de macrófagos que não é normalmente
expressa, mas é induzida (i-NOS ou tipo2) por citotoxinas e mediadores
inflamatórios, como as citocinas. Os genes que codificam estas isoformas
estão localizados nos cromossomos 7 (e-NOS), 12 (n-NOS) e 17 (i-NOS). As
enzimas constitutivas produzem quantidades limitadas de NO e são ativadas
por cálcio e calmodulina. Agonistas ativam as c-NOS através de um rápido
aumento na concentração de cálcio intracelular, resultando na liberação de
óxido nítrico em segundos ou minutos. A e-NOS localiza-se na membrana
celular e foi identificada em células endoteliais, plaquetas, endocárdio e
miocárdio. A n-NOS é citossólica e é achada em musculatura esquelética e
em tecidos nervosos. Ambas c-NOS também já foram identificadas em
neutrófilos e mastócitos. A i-NOS tem 50% de homologia com as cNOS , é
citossólica e cálcio- independente. Foi descrita inicialmente em macrófagos
murinos tratados com lipopolissacarídeos e interferon gama, mas desde
então foi identificada em vários tipos celulares, incluindo musculatura lisa
vascular,
endotélio
vascular,
endocárdio,
miocárdio,
hepatócitos,
fibroblastos, astrócitos e células imunes. Após um estímulo apropriado,
Introdução
18
como interferon gama, interleucina 1 beta, fator de necrose tumoral alfa,
endo ou exotoxinas, a i-NOS é produzida pelo tipo celular relevante através
de transcrição gênica, provavelmente através do fator de transcrição nuclear
kappa B. A i-NOS é capaz de gerar até 1000 vezes mais NO que as cNOS, e
a produção celular pode continuar por horas. Os efeitos do NO produzidos
pela iNOS são então mais pronunciados e disseminados, o que pode
determinar sua ação benéfica ou maléfica, dependendo das circunstâncias
clínicas (Wolf, 1997).
Devido à sua habilidade única de difundir-se tanto em meio aquoso
quanto lipídico, o NO dissemina-se por tecidos vizinhos, independentemente
da presença de membranas. Ao contrário de outras moléculas que agem
através de receptores específicos, o óxido nítrico funciona através de
reações químicas que ora geram radicais livres, ora controlam sistemas
enzimáticos (Wolf, 1997). O NO é um radical livre, por ter um elétron não
pareado. Isto o faz muito reativo com outros radicais, como o superóxido
(Beckman e Crow, 1993). Sua meia vida em concentrações fisiológicas é de
segundos, e ele se decompõe em solução aquosa em nitrito (NO2-) e óxido
nitroso (NO3-) (Zapol et al., 1994). O ânion superóxido se combina com o
NO três vezes mais rápido do que com a superóxido dismutase, levando à
formação de peroxinitrito (OONO-), uma molécula instável, pró-oxidante, que
causa danos em muitas outras moléculas (ácidos nucleicos, lipídios,
proteínas) (Van der Vliet et al., 1994). Por estas reações, o NO participa no
mecanismo de dano a células cancerosas ou a bactérias. Os efeitos
celulares do NO são atribuídos em parte à sua ligação com a guanylyl
Introdução
19
ciclase solúvel. Esta enzima catalisa a conversão de GTP para cGMP, que é
um segundo mensageiro. Outros sistemas de segundo mensageiro também
parecem ser regulados pelo NO, como a ativação de proteína-kinases,
inibição de inositol-trifosfato e outros (Singh e Evans, 1997). Mediante este
mecanismo, por exemplo, o óxido nítrico produz relaxamento da musculatura
lisa vascular. Outras funções atribuídas ao óxido nítrico são o controle de
canais
iônicos,
transcrição
genética
e
respiração
mitocondrial.
Fisiologicamente, o NO participa de funções regulatórias em todos os
sistemas orgânicos (Wolf, 1997).
A mensuração do NO em tecidos é difícil devido à sua curta meia vida
em sistemas biológicos, que varia de 0.1 a 5 segundos (Gaston et al., 1994).
No entanto, ela pode ser feita usando a quimioluminescência, após reação
com ozônio, cromatografia gasosa e técnicas com microeletrodos. Um
método mais fácil é verificar indiretamente a sua presença. Em uma das
técnicas, um anticorpo monoclonal específico para o seu co-produto, a Lcitrulina, pode ser utilizado em uma reação imuno-histoquímica. Para que
esta reação tenha sucesso, o tecido deve ter sido fixado com glutaraldeído e
paraformaldeido. No processo de fixação com formalina, a citrulina é retirada
dos tecidos, sendo este método ineficaz (Archer, 1993). Outra forma para
acessar indiretamente a presença de NO é a utilização deste mesmo
método, mas com anticorpos específicos para as diferentes NOS (Springall
et al., 1992). Esta técnica permite que tecidos embebidos em formalina
sejam corados e detecta a presença das enzimas. No entanto, este ensaio
não dá informações a respeito da atividade destas enzimas. Outra técnica
Introdução
20
utilizada para localização da NOS nos tecidos é a NADPH diaforase
histoquímica. Ela se vale da capacidade da NOS transferir eletrons de
NADPH para outros substratos, como os sais de tetrazolium. Estes, após
reagirem com a NOS, formam sais insolúvies e visíveis de formazan,
permitindo sua localização. No entanto, como outras enzimas também
apresentam atividade NADPH diaforase, esta reação é um pouco
inespecífica. Uma técnica adicional e que permite a avalição da atividade
enzimática, é a hibridização in situ com sondas radiomarcadas contra NOS
mRNA (Archer, 1993).
O papel do NO no câncer é ambíguo e importante em várias etapas.
O NO pode exercer uma função pró-tumoral ou antitumoral dependendo da
quantidade, local e tipo celular em que é produzido (Brennan e Moncada,
2002). Apresenta efeito antitumoral quando é produzido por macrófagos em
resposta a estímulo antigênico, destruindo células neoplásicas (Li et al.,
1991). A sua produção em grande quantidade pelas próprias células
neoplásicas também tem efeito inibitório, provocando morte celular
(Sveinbjornsson et al., 1995; Xie et al., 1995 b). Além disso, é capaz de
induzir apoptose em células com DNA danificado e potencialmente
neoplásicas, aumentando a expressão de p53 e ativando o sistema das
caspases (Nicotera et al., 1995). Em contrapartida, a presença de níveis
persistentemente aumentados de NO em processos inflamatórios crônicos
produzidos por um aumento da atividade da iNOS tem sido associada à
formação de radicais livres, dano de DNA e mutagênese. Este dano pode
tanto ser direto, através de quebras únicas ou duplas nas fitas de DNA ou
Introdução
21
trocas de pares de base, como indireto, inativando sistemas enzimáticos de
reparo. Na dependência de alguns fatores, como, por exemplo, a presença
concomitante de O2- ou a expressão de COX-2, faz com que o NO ao invés
de induzir a apoptose impeça o seu acontecimento (Tamir e Tannenbaum,
1996; Tamir et al., 1996).
A expressão de NOS pelas células tumorais em quantidades não tão
altas que provoquem sua morte tem efeito pró-neoplásico. O NO em
concentrações adequadas é capaz de facilitar a migração de células
tumorais, degradar matriz extracelular e induzir angiogênese, o que resulta
em maior invasividade local e propensão para metástases a distância
(Orucevic et al., 1999; Jadeski e Lala, 1999; Jadeski et al., 2000). A
superexpressão das NOS e/ou atividade das NOS tem sido positivamente
correlacionada com o grau tumoral em câncer ginecológico, de mama, e
sistema nervoso central (Thomsen et al., 1994; Thomsen et al., 1995; Cobbs
et al., 1995; Duenas-Gonzalez et al., 1997). Em relação à hiperplasia
prostática benigna, a expressão de iNOS é maior em carcinoma de próstata
(Klotz et al., 1998). A atividade total da NOS também está aumentada em
cânceres de laringe, orofaringe, cavidade oral (Gallo et al., 1998) e
adenocarcinoma de pulmão quando comparada a tecido normal (Fujimoto et
al., 1997). A inibição da NOS com L-NAME (N-nitro L-arginina metil éster)
em um modelo experimental de adenocarcinoma de rato demonstrou
diminuição da produção de óxido nítrico e do crescimento tumoral. A
estimulação da i-NOS com LPS e IFN gama em células murinas de tumor de
mama EMT-6 resultou em maior crescimento tumoral e metástases in vivo
Introdução
22
(Edwards et al., 1996). A produção de NO por células de câncer de mama
C3L5 em uma matriz resultou em sua degradação, devido ao desbalanço
entre metaloproteases e seus inibidores, diminuindo a quantidade de mRNA
de TIMP 2 e 3 e aumentando a quantidade de mRNA de MMP2. Além disso,
quando expostas a L-NAME, a capacidaede migratória in vitro destas células
diminuiu (Jadeski et al., 2000). Ainda em outro estudo, a transdução de
i-NOS em uma linha celular de adenocarcinoma de cólon resultou em
aumento do crescimento tumoral e vascularização quando estas células
foram transplantadas para o dorso de camundongos nus (Jenkins et al.,
1995; Thomsen et al., 1995). Um possível mecanismo pelo qual o NO induz
angiogênese foi postulado. A vasodilatação provocada pelo NO aumenta o
“alongamento” da célula endotelial, o que aumenta a sensibilidade da célula
para um estímulo mitogênico, provocado pelo VEGF (fator de crescimento
do endotélio vascular). Por sua vez, a própria produção de VEGF provoca
um aumento na produção de óxido nítrico. Os dois agiriam em conjunto
provocando angiogênese máxima (Garcia-Cardena e Folkman, 1998). A
manipulação do óxido nítrico pode ser realizada in vivo tanto para mais como
para menos e, desta forma, influenciar sua ação sobre uma determinada
neoplasia. Drogas utilizadas para o tratamento da angina, como o dinitrato
ou mononitrato de isossorbida, gliceril trinitrato ou nitroprussiato de sódio,
são conhecidos doadores de NO que podem ter algum efeito sobre tumores
(Xie et al., 1995 a e b). Ao contrário, inibidores de NOS, como o L-NMMA,
também são disponíveis para uso clínico e têm sido usados para tratamento
de choque séptico (Petros et al., 1991). Infelizmente, esta inibição não é
Introdução
23
enzima específica, afetando a produção de NO pelas 3 isoformas. No
entanto, estas drogas também podem ter efeitos antitumorais. O efeito
destas
modulações
nunca
foi
determinado
em
seres
humanos
e
representam um grande potencial terapêutico. No momento, aguardam
estudos clínicos.
A expressão das sintases do óxido-nítrico nunca foi estudada em
sarcomas de partes moles, incluindo os sarcomas sinoviais. Não se sabe
qual a porcentagem de expressão destas enzimas neste tipo de tumor ou se
existe coincidência de disfunção na proteína p53 e a expressão das sintases
do óxido-nítrico. O seu papel no processo de ploidia tumoral e
neovascularização também é desconhecido, assim como se isso possui
algum valor na determinação do comportamento da neoplasia.
OBJETIVO
Objetivo
2
25
OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi estudar retrospectivamente fatores
clínicos e histopatológicos relacionados à sobrevida livre de recidiva local,
sobrevida livre de metástases e sobrevida doença específica em sarcomas
sinoviais de extremidades, assim como a relação destes com a expressão
imuno-histoquímica da proteína do gen supressor de tumor p53, da proteína
relacionada a proliferação celular Ki67, dos receptores de fatores de
crescimento EGFR (epidermal growth factor receptor) e c-erb-B2, do
marcador de células endoteliais CD34 (índice de neovascularização) e das
sintases de óxido nítrico. Além disso, foi estudada a associação entre os
fatores clínicos e moleculares citados acima entre si.
CASUÍSTICA E MÉTODO
Casuística e Método
3
CASUÍSTICA E MÉTODO
3.1
Casuística
27
Foram estudados, retrospectivamente, 57 pacientes selecionados
entre 89 portadores de sarcoma sinovial de extremidades tratados no
Departamento de Cirurgia Pélvica do Hospital do Câncer, Fundação Antônio
Prudente, São Paulo, no período de janeiro de 1970 até dezembro de 2001.
Os dados foram coletados do Serviço de Arquivo Médico Estatístico
(SAME)
do
referido
Hospital
e
foram
sumarizados
em
formulário
padronizado.
3.1.1 Critérios de elegibilidade para o estudo
Os pacientes incluídos no estudo obedeceram aos seguintes critérios de
elegibilidade:
• confirmação anatomopatológica de sarcoma sinovial: blocos de
parafina, contendo tecido neoplásico representativo de cada caso foram
separados, novas lâminas foram preparadas e revistas por 3 patologistas
(Dr. Fernando Augusto Soares, Dr. Roberto Fauzoni e Dra. Isabela Werneck
da Cunha). Sempre que possível o tecido utilizado foi o da biópsia inicial.
Pacientes sem material disponível para nova análise foram excluídos;
• localização em extremidades: pacientes com sarcomas sinoviais de
tronco, cabeça e pescoço ou não especificados foram excluídos. A
Casuística e Método
28
determinação da localização foi realizada mediante a revisão de prontuários,
utilizando as anotações do médico-examinador e descrições cirúrgicas;
• todos
os
pacientes
incluídos
no
estudo
foram
tratados
e
acompanhados no Hospital do Câncer A.C Camargo. Casos tratados
primeiramente
em
outro
hospital,
mas
que
tiveram
tratamento
e
acompanhamento subseqüentes nesta instituição também fizeram parte do
estudo;
• pacientes submetidos à neoadjuvância e que não possuíam tecido de
biópsia prévia disponível para análise foram incluídos quando o tecido da
peça operatória não apresentava alterações morfológicas relacionadas à
quimioterapia e à radioterapia.
Do grupo inicial de 89 casos, não foi confirmado o diagnóstico de
sarcoma sinovial em 17 e, em 8 casos, a quantidade de material disponível
não era adequada para nova análise. Dos 64 casos remanescentes, 7
apresentavam doença metastática no momento da admissão, sendo também
excluídos do estudo. Dos casos não correspondentes a sarcomas sinoviais,
6 foram identificados pela morfologia e 11 após painel imuno-histoquímico. A
análise foi realizada, portanto, nos 57 casos de pacientes com sarcomas
sinoviais de extremidades com doença localizada ao diagnóstico.
Casuística e Método
3.2
29
Método
3.2.1 Preparo das lâminas
Após pesquisa no arquivo do Departamento de Anatomia Patológica,
identificaram-se as lâminas histológicas referentes à peça cirúrgica (sarcoma
sinovial). Em virtude de haver, em vários casos, mais de uma lâmina
representativa do tumor primário, todas elas foram revistas por um único
patologista (Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, Diretor do Departamento de
Anatomia Patológica do Hospital do Câncer A C Camargo), selecionando-se
aquela mais representativa da lesão. Após esta seleção inicial, as lâminas
foram revistas para confirmação diagnóstica por 2 outros patologistas
(Prof. Dr. Roberto Fauzoni e Dra. Isabela Werneck da Cunha).
3.2.1.1
Imuno-histoquímica e chromogenic in situ hybridization
Para a realização de imuno-histoquímica, as lâminas utilizadas foram
previamente
revestidas
por
solução
de
3-aminopripyltriethosy-silano
(APTS-Sigma® A3648) diluído a 4% em acetona. Os cortes histológicos
foram desparafinizados e preparados por passagens sucessivas por xilol e
etanol e submetidos à recuperação antigênica pelo calor com irradiação por
panela de pressão, utilizando-se tampão citrato 10mM pH 6.0 por 15
minutos, deixando mais 10 minutos à temperatura ambiente. A seguir, foi
feito o bloqueio da peroxidase endógena com solução de peróxido de
hidrogênio a 3% (água oxigenada 10 vol.) com três trocas de 5 minutos
cada. No caso das sintases de óxido nítrico (NOS), após o bloqueio da
Casuística e Método
30
peroxidase, também se fez o bloqueio da avidina/biotina (DAKO® Biotin
Blocking System) e proteína (DAKO® Protein Block Serum-Free) 20 minutos
cada, com três lavagens de 5 minutos com PBS, entre eles. A seguir, as
lâminas foram incubadas com os anticorpos primários pesquisados, diluídos
em títulos preestabelecidos (Tabela 2) em tampão PBS, contendo albumina
bovina (BSA) 1% (SIGMA, A9647, USA) e azida sódica (NaN3), 0,1% por 2
horas, em câmara úmida, à temperatura ambiente. Após a incubação, as
lâminas foram lavadas em tampão PBS com três trocas de 5 minutos cada.
A seguir, foram incubadas com o Link (DAKO A/S, K0690, Denmark) por 30
minutos à temperatura ambiente, seguidas por três lavagens de 5 minutos
em PBS, e incubação com streptavidina HRP (DAKO A/S, K0690, Denmark)
por 30 minutos à temperatura ambiente. Sofreram novas lavagens com PBS
(três
de
5
minutos)
e
então,
foram
reveladas
com
solução
de
Diaminobenzidina (DAB, Sigma®) a 60% e contra-coradas com hematoxilina
de Harris (Merck®). O protocolo da reação foi executado de forma manual
para os anticorpos anti NOS 1, NOS 2, NOS 3, c-erbB2, EGFR e de forma
automatizada, utilizando-se a máquina Biogenex i6000 para os anticorpos
anti p53, Ki67 e CD34. Nos casos em que foi testada a amplificação do gene
HER2/neu pelo método de CISH (chromogenic in situ hybridization), os
cortes histológicos foram desparafinizados e preparados por passagens
sucessivas por xilol e etanol e submetidos à recuperação antigênica pelo
calor com irradiação por panela de pressão, utilizando-se tampão citrato
10mM pH 6.0 por 15 minutos, deixando mais 10 minutos à temperatura
ambiente. A seguir, foi feito o bloqueio da peroxidase endógena com solução
Casuística e Método
31
de peróxido de hidrogênio a 3% (água oxigenada 10 vol.) com três trocas de
5 minutos cada. Após estas etapas, NucleoDetector HER2 DNA Probe foi
aplicado sobre as lâminas de acordo com as instruções do fabricante (BIO
SB, Inc, USA). As lâminas foram desnaturadas por 10 minutos a 95°C e a
hibridação feita overnight a 37°C. Após a hibridização, as lâminas foram
lavadas com tampão e incubadas com HybriWash por 15 minutos a 72°C.
Depois, as lâminas foram incubadas por 30 minutos em um bloqueador de
proteína. Foi aplicado um anticorpo mouse anti-digoxigenin e incubado por
30 minutos, após lavagem com tampão, foi aplicado um anti-mouse HRP
Label por 30 minutos. Por fim, as lâminas foram reveladas com DAB durante
15 minutos (Isola e Tanner, 2004). Controles positivos e negativos foram
utilizados em todas as reações.
Tabela 2 - Anticorpos utilizados, clones, origem e diluição
Antígeno
Clone
Origem
Diluição
EMA
E29
DAKO
1:400
C-erbB-2
-
DAKO
1:100
EGFR
H11
Novocastra
1:50
P53
DO-7
DAKO
1:800
Ki67
Ki-S5
DAKO
1:100
CD34
QBEnd10
DAKO
1:50
NOS 1
-
Transduction
1:50
NOS 2
6
Transduction
1:25
NOS 3
3
Transduction
1:100
EMA: epithelial membrane antigen; EGFR: epidermal growth factor receptor; NOS: sintase
de óxido nítrico.
Casuística e Método
32
3.2.2 Variáveis estudadas
As variáveis estudadas com o objetivo de verificação de valor
prognóstico e papel nos eventos de progressão tumoral foram as seguintes:
a) variáveis demográficas e clínicas: sexo, idade, localização na
extremidade, tamanho do tumor, comprometimento linfonodal, status na
admissão, tipo de ressecção, transfusão de sangue, uso de neoadjuvância e
uso de adjuvância;
b) variáveis anatomopatológicas: subtipo histológico e margem.
Todos os tumores foram considerados de alto grau por definição (Fisher,
1998);
c) variáveis moleculares: expressão nuclear de p53 e ki67,
expressão dos receptores de membrana c-erbB2 e EGFR, percentual de
neovascularização através de contagem de microvasos corados por CD34 e
expressão de NOS 1, 2 e 3.
3.2.3 Descrição das variáveis
3.2.3.1 Variáveis demográficas e clínicas
Idade: acima e abaixo de 25 anos. O ponto de corte foi escolhido de
acordo com literatura precedente (Mullen e Zagars, 1994; Bergh et al., 1999;
Paulino, 2004; de Silva et al., 2004).
Sexo: masculino e feminino.
Localização na extremidade: proximal e distal. A localização
proximal foi considerada quando o tumor estava localizado no cotovelo,
Casuística e Método
33
braço e ombro ou no joelho, coxa e glúteo. Tumores abaixo do cotovelo ou
do joelho foram considerados distais.
Tamanho do tumor: Os tumores foram divididos em ≤8cm e > 8cm.
O ponto de corte foi estabelecido pelo método de Miller e Siegmund (1982).
As dimensões foram estabelecidas como o maior diâmetro mensurado pelo
médico examinador ou pelo laudo anatomopatológico quando a informação
não estava disponível, exceto nos casos em que foi utilizada neoadjuvância.
Em pacientes previamente operados estas informações foram obtidas da
mesma maneira quando disponíveis no prontuário.
Comprometimento
linfonodal:
os
pacientes
foram
divididos
comprometimento linfonodal ausente ou presente. Pacientes com linfonodos
locais ou regionais clinicamente comprometidos foram submetidos a
linfadenectomia. Pacientes foram incluídos no grupo comprometimento
linfonodal positivo quando houve confirmação anatomopatológica. Pacientes
com comprometimento linfonodal em cadeias de drenagem linfática distantes
da região do tumor foram considerados como doença metastática e
excluídos da análise.
Status na admissão: os pacientes foram divididos em primários e
recidivados. Os primários incluíram tumores intactos que não sofreram
nenhuma forma de manipulação prévia e tumores manipulados, que
sofreram algum tipo de biópsia ou ressecção completa ou incompleta até 3
meses antes da admissão. Os recidivados foram operados há mais de 3
meses antes da admissão e apresentavam-se com tumor recorrente.
Casuística e Método
34
Tipo de ressecção: o tipo de cirurgia realizada foi dividido em
preservação de membro ou amputação. Os pacientes submetidos à cirurgia
com preservação de membro incluíram as ressecções amplas e ampliações
de margem. Os pacientes submetidos à amputação incluíram qualquer forma
de amputação, desde amputação de dígitos até desarticulações.
Transfusão de sangue: sim ou não. Toda transfusão no período intra
e pós-operatório foi considerada, independentemente do volume.
Neoadjuvância: sim ou não. Qualquer forma de tratamento préoperatório
foi
considerada,
independente
de
combinações
entre
quimioterapia e radioterapia. Os esquemas quimioterápicos utilizados foram
à base de doxorubicina. A radioterapia foi administrada na forma de
teleterapia com dose média de 3000 cGy fracionada em 250cGy/dia 5 vezes
por semana. Neoajuvância foi aplicada em tumores volumosos ou como
protocolo institucional.
Adjuvância: sim ou não. Qualquer forma de tratamento pósoperatório foi considerada, independentemente de combinações entre
quimioterapia e radioterapia. Os esquemas quimioterápicos utilizados foram
à base de doxorubicina. A radioterapia foi administrada na forma de
teleterapia ou braquiterapia. As doses foram variáveis. Adjuvância foi
aplicada após ressecções de tumores volumosos, margens exíguas ou como
protocolo institucional.
Casuística e Método
3.2.3.2
35
Variáveis anatomopatológicas
Margem anatomopatológica microscópica: livre ou comprometida.
Margens exíguas porém livres (tumores aderidos ao feixe vasculonervoso,
mas sem invasão deste em cirurgia preservadora de membro) foram
classificadas como livres. A margem foi considerada comprometida quando
microscopicamente positiva.
Subtipo histológico: monofásico ou bifásico. A classificação foi
realizada de acordo com a presença ou não de componente epitelial
glandular, permeando componente mesenquimal fusiforme. O diagnóstico
dos
tumores
bifásicos
foi
realizado
mediante
padrão
histológico
característico (Figura 1), enquanto os monofásicos tiveram confirmação pela
da expressão imuno-histoquímica de EMA (epithelial membrane antigen)
(Figura 2).
Casuística e Método
Figura 1 - Sarcoma sinovial subtipo histológico bifásico
Figura 2 - Sarcoma sinovial subtipo histológico monofásico
36
Casuística e Método
3.2.3.3
37
Variáveis moleculares
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas nos cortes
histológicos representativos da neoplasia, pela técnica de complexo
estreptavidina-biotina-peroxidase (Santos et al., 1999). Os resultados imunohistoquímicos foram avaliados da forma tradicional, sendo considerado
positivo o depósito marrom de DAB (diaminobenzidina).
p53: positivo ou negativo. As células foram consideradas p53
positivas quando apresentavam coloração nuclear marrom após reação
imuno-histoquímica. Foram contadas células em 5 campos consecutivos de
grande aumento em áreas hot spot, com um mínimo de 800 células
contadas/caso. Para leitura das lâminas, foi utilizado o software para
contagem Axio-Vision 3.1 (Karl Zeiss). Inicialmente, as células positivas
foram identificadas e marcadas. O passo seguinte constituiu-se de marcação
das células negativas. A quantificação e razão das marcações foram
realizadas pelo software sendo expressas em porcentagem de células
positivas. Para efeito de resultado, considerou-se a média aritmética dos
cinco campos. O resultado foi expresso como porcentagem de núcleos
corados e quando esta porcentagem excedeu o valor de 10%, o caso foi
considerado como p53 positivo (Oda et al., 2000; Antonescu et al., 2000 e
Barbashina et al., 2002) (Figura 3).
Casuística e Método
38
Figura 3 - Expressão imuno-histoquímica de p53 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração dos núcleos em marrom
Ki67: positivo ou negativo. As células foram consideradas ki67
positivas quando apresentavam coloração nuclear marrom, após reação
imuno-histoquímica. Foram contadas células em 5 campos consecutivos de
grande aumento em áreas hot spot, com um mínimo de 800 células
contadas/caso. Para leitura das lâminas, foi utilizado o software para
contagem Axio-Vision 3.1 (Karl Zeiss). Inicialmente, as células positivas
foram identificadas e marcadas. O passo seguinte constituiu-se de marcação
das células negativas. A quantificação e razão das marcações foram
realizadas pelo software, sendo expressas em porcentagem de células
positivas. Para efeito de resultado, considerou-se a média aritmética dos
cinco campos. O resultado foi expresso como porcentagem de núcleos
corados e quando esta porcentagem igualou ou excedeu o valor de 5%, o
Casuística e Método
39
caso foi considerado como ki 67 positivo (Figura 4). O ponto de corte foi
estabelecido pelo método de Miller e Siegmund (1982).
Figura 4 - Expressão imuno-histoquímica de Ki67 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração dos núcleos em marrom
EGFR: positivo ou negativo. As células foram consideradas EGFR
positivas quando apresentavam forte marcação marrom de membrana ou
citoplasma. Foram contadas células em 5 campos de grande aumento, com
um mínimo de 800 células contadas. O resultado foi expresso como
porcentagem
de
membranas/citoplasma
corados
e
quando
esta
porcentagem excedeu o valor de 10%, o caso foi considerado como EGFR
positivo (Barbashina et al., 2002; Potti et al., 2004) (Figura 5).
Casuística e Método
40
Figura 5 - Expressão imuno-histoquímica de EGFR em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de membrana em marrom
c-erbB2: positivo ou negativo. A expressão de c-erbB-2 foi feita de
acordo com os critérios especificados pelo HercepTest® sendo 0=sem
marcação, (+) = marcação incompleta de membrana, em menos de 10%das
células tumorais, (++) = intensidade moderada com completa marcação de
membrana em mais que 10% das células tumorais e (+++) = intensidade
forte com completa marcação de membrana em praticamente 100% das
células tumorais. Foram considerados negativos os escores 0 e 1+ e positivo
2+ e 3+(Barbashina et al., 2002; Nuciforo et al., 2003). Nos casos
considerados
positivos
e,
em
cinco
casos
negativos
pela
imuno-
histoquímica, foi testada a amplificação do gene HER2/neu pelo método de
CISH (chromogenic in situ hybridization). A interpretação dos resultados do
CISH foi feita de acordo com o sistema proposto por Isola e Tanner (2004).
Os casos foram divididos em dois grupos; amplificados e não amplificados.
Casuística e Método
41
Foram considerados amplificados os casos que apresentavam pelo menos
6-10 sinais por núcleo em mais de 50% das células tumorais (Figura 6).
Figura 6 - Expressão imuno-histoquímica de c-erb-B2 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de membrana em marrom
CD34: positivo ou negativo para neoangiogênese. A quantificação da
neoangiogênese realizada pela da marcação com CD34 de células
endoteliais foi feita através de ocular estequiométrica, no aumento de 400x.
Vasos foram definidos como agrupamentos de células endoteliais,
independente da presença de lumen vascular ou hemácias. A partir das
áreas hot spot, foram contados 10 campos consecutivos. A porcentagem de
área vascular de um tumor foi o resultado da média aritmética dos 10
campos. Foram considerados positivos os casos com percentual de área
vascular igual ou maior que 15% (Figura 7). O ponto de corte foi
estabelecido pelo método de Miller e Siegmund (1982).
Casuística e Método
42
Figura 7 - Expressão imuno-histoquímica de CD34 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração de células endoteliais em marrom
NOS 1,2 e 3: positivo ou negativo. Para avaliação das sintases de
óxido nítrico, foi utilizado microscópio óptico comum, sendo considerado o
padrão de marcação conforme ilustrado na Tabela 3. Considerados
negativos os casos com somatório 0, 1 e 2; positivo fraco 3, 4 e 5 (1 de
intensidade e 4 de freqüência) e positivo forte 5 (2 de intensidade e 3 de
freqüência), 6 e 7. Para análise, foram considerados positivos apenas os
positivos fortes. (Figuras 8, 9 e 10).
Tabela 3 – Localização, intensidade e freqüência
Localização
Membrana
Citoplasma
Núcleo
Intensidade
0=negativo
1=fraco
2=moderado
3=forte
Freqüência
0=<1
1=1-10%
2=11-50%
3=51-90%
4=>90%
Casuística e Método
Figura 8 -
43
Expressão imuno-histoquímica de NOS 1 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração predomonantemente nuclear em marrom
Figura 9 - Expressão imuno-histoquímica de NOS 2 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração citoplasmática em marrom
Casuística e Método
Figura 10 -
44
Expressão imuno-histoquímica de NOS 3 em sarcoma sinovial
avaliada pela coloração predominantemente citoplasmática
em marrom
3.2.4 Análise estatística
Foi utilizado o programa estatístico SPSS 12.0 for Windows para a
digitação e análise estatística dos dados.
A análise estatística utilizou os testes de qui-quadrado bi-caudal e
exato de Fischer para verificar a associação entre as variáveis de interesse,
utilizando-se da categorização das mesmas.
Para análise do prognóstico, o tempo de sobrevida livre de recidiva
local foi calculado como o período entre o início do tratamento e a data da
ocorrência da recorrência tumoral local ou a data do último seguimento (para
os casos que não apresentaram recorrências). Para pacientes com
tratamento prévio à admissão, foi considerada recidiva local a primeira
recorrência após a operação realizada no Hospital AC Camargo, não sendo
levado em conta o número de recidivas prévias. O tempo de sobrevida livre
Casuística e Método
45
de metástase foi calculado como o período entre o início do tratamento e a
data da ocorrência da primeira metástase detectada por exame de imagem
ou a data do último seguimento (para os casos que não apresentaram
metástases). O tempo de sobrevida doença específica (ou específica por
câncer) foi calculado como o período entre o início do tratamento e a data da
ocorrência do óbito, decorrente da doença ou a data do último seguimento
(para os pacientes vivos ou que faleceram por causa não decorrente da
doença).
A sobrevida estimada foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e a
comparação das curvas por meio de teste de Log-rank (Kaplan e Meier,
1958; Cox, 1972). O modelo de regressão de Cox foi utilizado para o cálculo
das hazard ratios para recidiva local, metástases a distância e óbito por
câncer. A técnica Stepwise foward foi utilizada para construção do modelo
multivariado. Nos modelos multivariados, foram utilizadas, de forma
selecionada, as variáveis que atingiram significância estatística com p<0,1
na análise univariada.
Os critérios de censura para curva de sobrevida pelo método de
Kaplan-Meier ou para utilização da regressão de Cox foram:
•
no cálculo de sobrevida livre de recidiva - pacientes sem recorrência
da doença até a data do último seguimento;
•
no cálculo de sobrevida livre de metástases - pacientes sem
metástases até a data do último seguimento;
•
no cálculo de sobrevida específica por câncer - pacientes vivos na
data do último seguimento ou pacientes que foram a óbito e cuja causa
Casuística e Método
46
mortis não foi relacionada ao câncer.
Todas as variáveis foram analisadas quanto à sua importância em
relação ao prognóstico para sobrevida livre de recidiva local, sobrevida livre
de metástases e sobrevida doença-específica.
Pacientes que não compareceram ao hospital em um período maior
do que 2 vezes o período estipulado pelo médico para seu retorno, foram
considerados como perdidos de seguimento na data da última informação.
Estes pacientes contribuíram para curva de sobrevida até esta data, sendo,
então, classificados como sob censura.
Optou-se por efetuar a simplificação dos números, utilizando técnicas
padronizadas de arredondamento com eliminação de casas decimais para
os valores referentes a freqüências. A significância estatística foi
determinada para um valor de p<0,05.
RESULTADOS
Resultados
4
RESULTADOS
4.1
Dados demográficos e clínicos
48
Para os 57 pacientes avaliados, a idade variou de 4 a 73 anos, com
mediana de 26 e média de 30,12. Divididos entre maiores ou menores de 25
anos, 24 (42%) eram menores que 25 anos. Com relação ao sexo, 32
pacientes eram do sexo masculino (56%) e, 25, do sexo feminino (44%).
Quanto à raça, 45 pacientes eram brancos (79%) e, 12, não-brancos (21%).
Os dados demográficos encontram-se sumarizados na Tabela 4.
Tabela 4 - Dados demográficos
Variável
Sexo
Idade
Raça
Categoria
n
%
masculino
feminino
< 25 anos
> 25 anos
brancos
não-brancos
32
25
24
33
45
12
56
44
42
58
79
21
Levando-se em conta a localização, 5 pacientes apresentavam tumor
na região proximal do membro superior (9%); 9, na região distal do membro
superior (16%); 25, na região proximal do membro inferior (44 %); e, 18, na
região distal do membro inferior (30%).
A localização detalhada encontra-se na Tabela 5.
Resultados
49
Tabela 5 - Localização detalhada dos tumores
Local
n
%
Ombro
2
3
Braço
1
2
Cotovelo
2
3
Antebraço
2
3
Punho
1
2
Mão
5
9
Quirodáctilo
1
2
Coxa
22
38
Joelho
3
5
Perna
4
7
Tornozelo
2
5
Pé
11
19
Pododáctilo
1
2
TOTAL
57
100,0
O sintoma mais comum foi a presença isolada de tumor em 24
pacientes (42%). A presença de dor associada ao tumor ocorreu em 21
pacientes (37%). A associação de dor e tumor à parestesia ocorreu em 6
casos (11%), destes 2, com impotência funcional (4%). A presença de dor e
tumor associados à ulceração ocorreu em 2 casos (4%) e a de dor
isoladamente em 1 caso (2%). A associação do tumor à trauma local foi
referida espontaneamente por 8 pacientes (14%). A duração dos sintomas
foi avaliada somente em pacientes intactos ou com biópsias prévias (22
pacientes) e variou de 2 a 144 meses, com média de 19,59 meses e
mediana de 8 meses.
Resultados
50
No momento da admissão, com relação à manipulação prévia do
tumor, 34 (60%) eram primários e, 23, recidivados (40%).
Com relação ao tamanho do tumor, 16 tumores (28%) tinham
tamanho menor ou igual a 8cm, 16 tumores (28%) eram maiores que 8cm e
25 (44%) tumores tinham o tamanho não avaliável (os pacientes com
tumores de tamanho não avaliável apresentaram-se na admissão com
tumores recidivados ou previamente operados, impedindo o registro
adequado de sua verdadeira dimensão inicial). De acordo com o
comprometimento linfonodal, 3 pacientes (5%) apresentavam metástase em
linfonodos ao diagnóstico.
De acordo com a avaliação clínica quanto à ressecabilidade, 10
pacientes tiveram indicação de amputação desde a primeira avaliação
(18%), 19 pacientes foram avaliados como tendo ressecabilidade duvidosa
(33%) e, 28 pacientes, como sendo ressecáveis sem amputação (49%).
Todos os pacientes com ressecabilidade duvidosa foram submetidos à
neoadjuvância, além de 7 outros pacientes com grandes tumores (45%).
Destes 26, 4 receberam quimioterapia isolada (15%); 13, quimioterapia
associada à radioterapia (50%) e, 9, radioterapia isolada (35%). Após
tratamento neoadjuvante, a amputação foi necessária em 7 casos (37%); foi
possível a preservação do membro em 12 pacientes (63%). No total, a
ressecção ampla foi a cirurgia mais utilizada, possível em 40 pacientes. O
reparo da ferida operatória foi primário em 50 casos (88%); em 6 casos, foi
necessária a rotação de retalhos (10%) e, em 1 caso, enxerto livre de
pele (2%).
Resultados
51
Com relação à necessidade de transfusão, esta foi necessária em 10
casos (18%), enquanto 47 pacientes não receberam sangue (82%).
Complicações de ferida operatória aconteceram em 13 pacientes
(23%). Destes pacientes, 8 receberam alguma forma de neoadjuvância
(61,5%).
Com relação à terapia adjuvante, 24 pacientes (43,1%) não
realizaram nenhuma forma de terapia, enquanto 33 receberam alguma forma
de tratamento (56,9%). Destes, 15 pacientes receberam apenas radioterapia
(45,4%); 9 pacientes receberam químio e radioterapia (27,3%) e, 9
pacientes, apenas quimioterapia (27,3%). Dos 33, 20 não haviam recebido
nenhuma forma de neoadjuvância. Os dados referentes às características
tumorais e ao tratamento encontram-se sumarizados nas Tabelas 6, 7 e 8.
A recidiva local após admissão no Hospital do Câncer AC Camargo
aconteceu em 17 pacientes (30%). O tempo mediano até a primeira recidiva
foi de 27 meses. O tratamento da recidiva local foi exclusivamente cirúrgico
em 10 casos (59%); cirurgia associada à radioterapia em 4 casos (23%);
quimioterapia associada radioterapia em 1 caso (6%) e, quimioterapia
exclusiva, em 1 caso (6%). A amputação ou desarticulação foi indicada
como tratamento cirúrgico da recidiva em 9 casos (53%), mas foi realizada
em 8 pacientes (47%) e, 1 recusou o procedimento. O caso em que foi
administrada apenas quimioterapia tratava-se de uma recidiva em coto de
amputação associado a metástases pulmonares.
Metástases a distância ocorreram em 33 pacientes (58%). O tempo
mediano até a primeira metástase foi de 15,9 meses. Os sítios de metástase
Resultados
52
mais freqüentes foram pulmões (85%) e ossos (24%). Em 19 pacientes, as
metástases eram exclusivamente pulmonares (55,8%). Nestes, 11 foram
submetidos à ressecção cirúrgica delas, 7 associados à quimioterapia. No
restante, quimioterapia exclusiva ou combinada com radioterapia foi
administrada. Em 3 pacientes, nenhum tratamento foi realizado.
Tabela 6 - Dados referentes ao tumor
Variável
Local no membro
Sintomas
Status local
Tamanho do tumor
Comprometimento linfonodal
Categoria
n
%
MS proximal
5
9
MS distal
9
16
MI proximal
25
44
MI distal
17
30
Tumor
24
42
Tumor +dor
21
37
Outros
12
21
Primário
34
60
recidivado
23
40
≤8cm
16
28
>8cm
16
28
não
3
5
sim
54
95
MS=membro superior; MI=membro inferior
53
Resultados
Tabela 7 - Dados referentes ao tratamento
Variável
Neoadjuvância
Tipo de cirurgia
Transfusão
Complicações de ferida operatória
Adjuvância
Categoria
n
%
sim
26
46
não
31
54
preservação de membro
40
70
amputação
17
30
sim
10
18
não
47
82
sim
13
23
não
44
77
sim
33
58
não
24
42
Tabela 8 - Resultados do tratamento
Desfecho
Recidiva local
Metástases
Óbito por tumor
4.2
Categoria
n
%
sim
17
30
não
40
70
sim
33
58
não
24
42
sim
29
51
não
28
49
Dados anatomopatológicos
As margens foram consideradas microscopicamente livres em 50
pacientes (88%), microscopicamente comprometidas em 3 (5%) pacientes e
não avaliáveis em 4 pacientes (7%).
Quanto ao subtipo histológico, 29 pacientes tiveram o diagnóstico de
sarcomas sinoviais bifásicos (51%) e 28 monofásicos (49%). Os dados são
sumarizados na Tabela 9.
Resultados
54
Tabela 9 - Dados anatomopatológicos
Variável
Margem
Subtipo histológico
4.3
Categoria
n
%
livre
50
88
comprometida
3
5
não avaliável
4
7
monofásico
29
51
bifásico
28
49
Dados da análise molecular
O tecido tumoral mostrou expressão imuno-histoquímica para p53
acima de 10 % em 42 casos (74%) e para Ki67 igual ou maior que 5% em 11
casos (19%); uma forte expressão de membrana ou citoplasmática para
EGFR acima de 10% em 18 casos (32%) e uma forte e completa
imunoreatividade de membrana para c-erb-B2 em 12 casos (21%). A análise
de CISH para amplificação do gene HER2/neu não mostrou 6 a 10 sinais por
núcleo em nenhum caso. Amostras
tumorais, apresentando áreas
vasculares iguais ou acima de 15% estavam presentes em 7 casos (12%).
Tecidos tumorais submetidos à imunoreatividade para NOS 1 mostraram um
padrão predominantemente nuclear, algumas vezes associado a padrão
citoplasmático. Apenas em 5 casos houve apenas marcação citoplasmática.
Todos os casos foram positivos para a presença desta enzima. A
positividade para NOS 3, foi na maior parte, citoplasmática, alguns casos
mostrando marcação nuclear associada. Em 16 casos, houve marcação
nuclear exclusiva. Também todos os casos foram positivos para a sua
presença.
Resultados
55
A imunoreatividade para NOS 2 foi uniformemente citoplasmática em
34 casos (60%) e, em nenhum caso, houve coloração nuclear. Os dados são
sumarizados na Tabela 10.
Tabela 10 - Distribuição das variáveis moleculares
Marcador
p53
ki67
EGFR
c-erb-B2
CD34
NOS 1
NOS 2
NOS 3
Status
n
%
≤10%
15
28
>10%
42
72
<5%
46
81
≥5%
11
19
negativo
39
68
positivo
18
32
negativo
45
79
positivo
12
21
<15%
50
88
≥15%
7
12
negativo
0
0
positivo
57
100
negativo
23
40
positivo
34
60
negativo
0
0
positivo
57
100
EGFR=epidermal growth factor receptor: NOS=óxido nítrico sintase
Resultados
4.4
56
Dados do seguimento
O período de seguimento foi calculado a partir da data do início do
tratamento e variou de 1 a 334 meses, com média de 59,5 e mediana de
36,4 meses. Ao término do seguimento, 29 pacientes apresentavam-se
mortos por câncer (50%), 2 mortos por outras causas (4%), 8 vivos com
doença (14%) e, 18 vivos sem doença (32%). O seguimento foi considerado
completo em 46 pacientes (81%) e 11 pacientes perderam seguimento
(19%).
4.5
Sobrevida livre de recidiva local
Dezessete pacientes desenvolveram recorrência local (30%). O tempo
mediano para a primeira recorrência foi de 27 meses. A sobrevida mediana
livre de recidiva local foi de 70.7 meses. As sobrevidas livres de recidiva
local em 5 e 10 anos foram, respectivamente, 60,9% (±8,7) e 46,9% (±9,8).
As Tabelas 11 e 12 mostram comparações das sobrevidas em 5 e 10 anos
entre as variáveis clínicas e moleculares estudadas com os respectivos
valores de significância. Embora não significantes, o status local, tipo de
cirurgia e margem chegaram próximos à significância (p=0,069, p=0,052 e
p=0,076, respectivamente). O único fator que influenciou o risco de recidiva
local na análise univariada foi a expressão nuclear de Ki67 (p<0,001).
Quando submetidos à análise multivariada pelo método de Cox, tanto o
status local como recidiva quanto a expressão nuclear de Ki67 ≥5% foram
significativos (p=0,014 e p<0,001, respectivamente). Os hazard ratios para
recidiva local associados à apresentação como recidiva a expressão nuclear
Resultados
57
de Ki67 ≥5% foram 4,1 (95%CI 1,3-12,6) e 10,2 (95%CI 2,9-35,9)
respectivamente (Tabela 13). A Figura 11 mostra a curva de sobrevida livre
de recidiva local. As curvas de sobrevida para os fatores prognósticos
significativos são mostradas nos Figuras 12 e 13.
Tabela 11 - Sobrevida livre de recidiva local em 5 e 10 anos - variáveis
clínicas
Sobrevida livre de recidiva local
Variável
Sexo
Idade
Local no Membro
Status Local
Tamanho do Tumor
Comprometimento
Linfonodal
Cirurgia
Margem
Transfusão
Neoadjuvância
Adjuvância
Subtipo Histológico
SE=Standard error
n(%)
5 anos (%)
±SE
10 anos (%)
±SE
mascuilino
32 (56)
56,3 ± 12,6
56,3 ± 12,6
feminino
25 (44)
66,5 ± 11,7
41,6 ± 13,5
< 25 anos
24 (42)
58,0 ± 14,0
48,4 ±14,6
> 25 anos
33 (58)
63,4 ± 11,0
45,3 ±13,3
proximal
30 (53)
72,0 ± 11,4
41,1 ± 14,9
distal
27 (47)
48,3 ± 12,9
48,3 ± 12,9
primário
34 (60)
70,7 ± 10,4
55,0 ± 12,7
recidivado
23 (40)
45,3 ± 14,7
-
≤8cm
16(28)
65±14,8
65±14,8
>8cm
16(28)
65,6±20,8
65,6±20,8
não
54 (95)
59,3 ± 9,0
44,5 ± 10
sim
3 (5)
100
-
preservação
40 (70)
53,2 ± 9,9
35,5 ± 10,6
amputação
17 (30)
94,1 ± 5,7
94,1 ± 5,7
livre
50 (88)
65± 9,1
59,1± 10
comprometida
3 (5)
66,6 ± 2,2
-
sim
10 (18)
100
-
não
47 (82)
52,8 ± 9,9
47,5 ± 10,2
sim
26 (46)
72,8 ± 12,0
58,3 ± 16,2
não
31 (54)
52,0 ± 11,7
39,0 ± 11,9
sim
33 (58)
57,3±10,8
43,0±11,9
não
24 (42)
70,7 ± 13,0
56,5 ± 16,3
monofásico
28 (49)
57,1 ± 14,2
57,1 ± 14,2
bifásico
29 (51)
65,1 ± 10,9
40,7 ± 13,0
p (Log
Rank)
0,825
0,721
0,458
0,069
0,773
0,314
0,052
0,076
0,362
0,219
0,600
0,924
Resultados
58
Tabela 12 - Sobrevida livre de recidiva local em 5 e 10 anos -variáveis
moleculares
Sobrevida livre de recidiva local
Variável
p53
Ki67
EGFR
c-erbB2
CD34
NOS2
n(%)
5 anos(%)
±SE
10 anos(%)
±SE
p (Log
Rank)
positivo
42(74)
54,6 ± 10,9
46,8 ± 11,8
0,8208
negativo
15(26)
73,8 ± 13,8
49,2 ± 16,9
positivo
11(19)
28,6 ± 21,9
-
negativo
46(81)
67,4 ± 9,3
56,2 ± 10,6
positivo
18(32)
52,7 ± 16,6
-
negativo
39(68)
65,4 ± 4,8
52,3 ± 11,4
positivo
12(21)
75,7 ± 15,6
50,5 ± 23,0
negativo
45(79)
55,9 ± 10,3
44,7 ± 10,9
positivo
7(12)
64,2 ± 21,0
-
negativo
50(88)
60,4 ± 9,6
42,3 ± 11,0
positivo
34(60)
49,1 ± 15,7
49,1 ± 15,7
negativo
23(40)
64,8 ± 10,8
43,2 ± 12,5
0,0002
0,6839
0,4290
0,5455
0,6971
EGFR=epidermal growth factor receptor: NOS=óxido nítrico sintase. SE=Standard error
Tabela 13 - Hazard ratios para recidiva local – modelo multivariado pelo
método de Cox.
Variável
Categoria
hazard ratio
Intervalo
de Confiança (95%)
status local
Ki67
recidiva
≥5%
4,1
10,2
1,3-12,6
2,9-35,9
p
0,014
<0,001
Resultados
59
1,0
sobrevida (%)
0,8
0,6
0,4
0,2
n=57
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 11 - Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico
1,0
status local
primário (n=34)
recidiva (n=23)
primáriocensoreados
0,8
sobrevida (%)
recidivacensoreados
0,6
0,4
0,2
p=0.069
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 12 - Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial de
extremidades com doença localizada ao diagnóstico em função
do status local na admissão
Resultados
1,0
60
Ki67
<5% (n=46)
≥5% (n=11)
<5%-censoreados
sobrevida (%)
0,8
≥ 5%-censoreados
0,6
0,4
0,2
p<0,001
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 13 - Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial de
extremidades com doença localizada ao diagnóstico, em função
da presença ou ausência de expressão nuclear de Ki67 ≥5%
4.6
Sobrevida livre de metástases
Metástases a distância ocorreram em 36 pacientes (63%). O tempo
mediano para ocorrência da primeira metástase foi 17,6 meses. A sobrevida
mediana livre de metástases foi de 33,1 meses. As sobrevidas livres de
metástases em 5 e 10 anos foram, respectivamente, 41,2 % ±7,2 e 22,1 % ±
6,9. As Tabelas 14 e 15 mostram comparações das sobrevidas em 5 e 10
anos entre as variáveis clínicas e moleculares estudadas com os respectivos
valores de significância. Os fatores que influenciaram o risco de metástase
na análise univariada foram o status local (p=0,036), expressão nuclear de
Ki67 (p<0,001) e o status do receptor de membrana c-erb-B2 (p=0,007).
Resultados
61
Foram considerados fatores adversos: a apresentação como recorrência, a
expressão nuclear de ki67 ≥5% e a ausência de expressão do receptor de
membrana c-erb-B2. Os demais fatores estudados não atingiram níveis de
significância para valores de p<0,05. Quando submetidos à análise
multivariada pelo método de Cox, tanto a expressão nuclear de ki67 ≥5%
como a ausência de expressão do receptor de membrana c-erb-B2
permaneceram significativos (p<0,001 e p=0,010 respectivamente). Os
hazard ratios para metástases associados à expressão nuclear de ki67 ≥5%
e positividade para c-erb-B2 foram 4,6 (95%CI 2,1-10) e 0,2 (95%CI 0,060,68) respectivamente (Tabela 16). A Figura 14 mostra a curva de sobrevida
livre de metástase. As curvas de sobrevida para os fatores prognósticos
significativos são mostradas nas Figuras 15, 16 e 17.
62
Resultados
Tabela 14 - Sobrevida livre de metástases em 5 e 10 - variáveis clínicas.
Sobrevida livre de metástases
Variável
Sexo
Idade
Local no Membro
Status Local
Tamanho do tumor
Comprometimento
Linfonodal
Cirurgia
Margem
Transfusão
Neoadjuvância
Adjuvância
Subtipo histológico
SE=Standard error
n(%)
5 anos (%)
±SE
10 anos (%) p
(Log
±SE
Rank)
masculino
32 (56)
34 ± 9,3
22,7 ± 9
feminino
25 (44)
49,7 ± 11,0
23,3 ± 10,6
<25 anos
24 (42)
43,6 ± 10,9
31,1 ± 10,7
>25 anos
33 (58)
40 ± 9,6
17,1 ± 8,5
proximal
30 (53)
51,3 ± 9,8
35,2 ± 11,7
distal
27 (47)
32,2 ± 9,8
13,8 ± 7,3
primário
34 (60)
55,7 ± 9,4
37,6 ± 10,7
recidivado
23 (40)
23,9 ± 9,3
9,5 ± 6,4
≤8cm
16(28)
57,4±13,5
34,4±14,9
>8cm
16(28)
35,8±14,8
35,8±14,8
não
54 (95)
39,1 ± 7,2
20,1 ± 6,7
sim
3 (5)
100
-
preservação
40 (70)
47,2 ± 8,7
24,7 ± 8,7
amputação
17 (30)
27 ± 12,1
18 ± 10,9
livre
50 (88)
41,4 ± 7,8
29,3 ± 8,1
comprometida
3 (5)
33,3 ± 27,2
-
sim
10 (18)
44,0 ± 8,1
23,3±7,3
não
47 (82)
44,4 ± 16,5
-
sim
26 (46)
41,3 ± 10,3
10,3 ± 9,3
não
31 (54)
42,3 ± 9,9
29,0 ± 9,9
sim
33 (58)
48,3 ± 9,2
27,1 ± 9,5
não
24 (42)
30,6 ± 11,0
16,3 ± 9,6
monofásico
28 (49)
23,4 ±8,8
23,4 ±8,8
bifásico
29 (51)
59,3 ±10,1
16,0 ± 9,9
0,271
0,533
0,243
0,036
0,131
0,121
0,119
0,562
0,896
0,272
0,322
0,131
Resultados
63
Tabela 15 - Sobrevida livre de metástases em 5 e 10 anos - variáveis
moleculares
Sobrevida livre de metástases
Variável
p53 10%
Ki67 5%
EGFR
c-erbB2
CD34 15%
NOS2
n(%)
5 anos(%)
±SE
10 anos(%)
±SE
p (Log
0,415
positivo
42(74)
42,1± 8,4
18,9 ± 7,9
negativo
15(26)
40,6 ± 13,6
30,4 ± 13,5
positivo
11(19)
9,0 ± 8,6
-
negativo
46(81)
49,9 ± 8,3
29,7 ± 8,6
positivo
18(32)
39,3 ± 12,2
29,5± 12,5
negativo
39(68)
42,7± 8,9
19,5 ± 8,1
positivo
12(21)
85,7 ± 13,2
42,8 ± 22,4
negativo
45(79)
29,9 ± 7,4
17 ± 6,4
positivo
7(12)
28,5 ± 17
-
negativo
50(88)
46 ± 7,9
23,7 ± 7,7
positivo
34(60)
32,9 ± 9,8
26,3 ± 9,8
negativo
23(40)
51,2 ± 10,5
19,9 ± 9,7
Rank)
<0,001
0,954
0,007
0,213
0,266
EGFR=epidermal growth factor receptor: NOS=óxido nítrico sintase. SE=Standard error
Tabela 16 - Hazard ratios para metástases – modelo multivariado pelo
método de Cox
Variável
Categoria
hazard ratio
Intervalo de
Confiança (95%)
p
c-erb-B2
positivo
0,2
0,06-0,68
0,010
Ki67
≥5%
4,6
2,1-10
<0,001
Resultados
64
1,0
sobrevida (%)
0,8
0,6
0,4
0,2
n=57
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 14 - Curva de sobrevida livre de recidiva local em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico
1,0
status local
primário (n=34)
recidivado (n=23)
primáriocensoreados
0,8
sobrevida (%)
recidivadocensoredos
0,6
0,4
0,2
p=0,036
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 15 - Curva de sobrevida livre de metástases em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial de
extremidades com doença localizada ao diagnóstico em função
do status local
Resultados
1,0
65
Ki67
<5%(n=46)
≥5%(n=11)
<5%-censoreados
sobrevida (%)
0,8
0,6
0,4
0,2
p<0,001
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 16 - Curva de sobrevida livre de metástases em meses, comparandose os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função da presença
ou ausência de expressão nuclear de Ki67 ≥5%
1,0
C-erb-B2
negativo (n=45)
positivo (n=12)
negativocensoreados
0,8
sobrevida (%)
positivocensoreados
0,6
0,4
0,2
p=0,007
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 17 - Curva de sobrevida livre de metástases em meses, comparandose os pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades
com doença localizada ao diagnóstico, em função da presença
ou ausência de positividade para c-erb-B2
Resultados
4.7
66
Sobrevida doença específica
O óbito por tumor ocorreu em 29 pacientes (51%). O tempo mediano
para ocorrência do óbito foi 36,3 meses. A sobrevida mediana doençaespecífica foi de 72,6 meses. As sobrevidas doença-específica em 5 e 10
anos foram, respectivamente, 57,9% ±7,5 e 26,8% ±8,2. As Tabelas 17 e 18
mostram comparações das sobrevidas em 5 e 10 anos entre as variáveis
clínicas
e
moleculares
estudadas
com
os
respectivos
valores
de
significância. Os fatores que influenciaram o risco de óbito por tumor na
análise univariada foram o tamanho do tumor (p=0,034) e a expressão
nuclear de Ki67 (p=0,032), sendo considerados como fatores adversos
quando > 8cm e ≥5%, respectivamente. Os demais fatores estudados não
atingiram níveis de significância para valores de p<0,05. Quando submetidos
à análise multivariada pelo método de Cox, o tamanho do tumor permaneceu
significativo (p=0,043). O hazard ratio para óbito por tumor associado a
tumores >8cm é 2.9 (95%CI 1.0-8.5)(Tabela 19). A Figura 18 mostra a curva
de sobrevida doença específica. As curvas de sobrevida para os fatores
prognósticos significativos são mostradas nas Figuras 19 e 20.
Resultados
67
Tabela 17 - Sobrevida doença específica em 5 e 10 anos -variáveis clínicas
Sobrevida doença-específica
Variável
n(%)
5 anos (%)
±SE
10 anos (%)
±SE
p (Log
Rank)
masculino
32 (56)
47,3 ± 10,1
19,1 ± 9,2
0,153
feminino
25 (44)
70,5 ± 10,5
36,2 ± 14,2
< 25 anos
24 (42)
64,9 ± 11,9
38,9 ± 13,7
> 25 anos
33 (58)
52,7 ± 9,7
18,0 ± 9,8
Local no
Membro
proximal
30 (53)
59,9 ± 10,0
46,2 ± 11,6
distal
27 (47)
56,4 ± 11,0
13,7 ± 8,7
Status
Local
primário
34 (60)
66 ± 9,4
24,3± 10,2
recidivado
23 (40)
46,4 ± 11,7
34,8 ± 11,3
≤8cm
16 (28)
81,4 ± 11,9
18,6 ± 16,2
>8cm
16 (28)
40 ± 14,9
15± 12,7
não
54 (95)
57,8 ± 7,7
29,4 ± 8,4
sim
3 (5)
66,6 ± 27,2
-
preservação
40 (70)
65,1 ± 8,6
32,4 ± 10,1
amputação
17 (30)
38,7 ± 14,2
12,9 ± 11,5
livre
50(65)
57.2± 8
28.2± 8.9
comprometida
3 (28)
-
-
sim
10 (18)
66,6 ± 15,7
33,3 ± 24,8
não
47 (82)
56,1 ± 8,4
25,4 ± 8,6
sim
26 (46)
59,8 ± 11,3
21,8 ± 12,6
não
31 (54)
56,5 ± 10,0
28,2 ± 10,6
sim
33 (58)
60,2 ± 9,5
26,9 ± 10,4
não
24 (42)
53,5 ± 12,3
25,5 ± 13,4
monofásico
28 (49)
41,5 ± 10,7
29,0 ± 10,6
bifásico
29 (51)
72,4 ± 9,7
20,8 ± 11,7
Sexo
Idade
Tamanho do Tumor
Comprometimento
Linfonodal
Cirurgia
Margem
Transfusão
Neoadjuvância
Adjuvância
Subtipo
Histológico
SE=Standard error
0,098
0,481
0,419
0,034
0,576
0,107
0.434
0,848
0,598
0,756
0,443
Resultados
68
Tabela 18 - Sobrevida doença específica em 5 e 10 anos - variáveis
moleculares
Sobrevida doença-específica
Variável
p53 10%
Ki67 5%
EGFR
c-erbB2
CD34 15%
NOS2
n(%)
5 anos(%)
±SE
10 anos(%)
±SE
p (Log Rank)
0,105
positivo
42(74)
50,8 ± 8,9
14,6 ± 8,6
negativo
15(26)
78,5 ± 10,9
53,8 ± 16,4
positivo
11(19)
40,0 ± 17,3
-
negativo
46(81)
61,7 ± 8,2
31,3 9,4
positivo
18(32)
56,8 ± 13,4
39,0 ± 14,0
negativo
39(68)
58,5 ± 9,0
23,3 ± 9,4
positivo
12(21)
85,7 ± 13,2
42,8 ± 22,4
negativo
45(79)
50,6 ± 8,4
23,2 8,2
positivo
7(12)
53,5 ± 20
-
negativo
50(88)
58,8 ± 8,0
34,9 ± 9,2
positivo
34(60)
37,1 ± 10,6
22,2 ± 10,3
negativo
23(40)
80,8 ± 8,6
33,5 ± 12,6
0,032
0,746
0,104
0,292
0,150
EGFR=epidermal growth factor receptor: NOS=óxido nítrico sintase. SE=Standard error
Tabela 19 - Hazard ratios para óbito por câncer – modelo multivariado pelo
método de Cox
Variável
Categoria
hazard ratio
Intervalo de
Confiança (95%)
p
Tamanho do tumor
>8cm
2,9
1,0-8,5
0,043
Resultados
69
1,0
sobrevida (%)
0,8
0,6
0,4
0,2
n=57
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento
Figura 18 - Curva de sobrevida doença específica em meses para os 57
pacientes portadores de sarcoma sinovial de extremidades com
doença localizada ao diagnóstico
1,0
tamanho do tumor
≤8cm (n=16)
>8cm (n=16)
≤8cm-censoreados
sobrevida (%)
0,8
>8cm-censoreados
0,6
0,4
0,2
p=0,034
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 19 -
Curva de sobrevida doença específica em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial
de extremidades com doença localizada ao diagnóstico, em
função do tamanho do tumor ≤ 8cm ou > 8cm
Resultados
1,0
70
Ki67
<5% (n=11)
≥5% (n=46)
<5%-censoreados
sobrevida (%)
0,8
≥5%-censoreados
0,6
0,4
0,2
p=0,032
0,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
tempo de seguimento (meses)
Figura 20 -
4.8
Curva de sobrevida doença específica em meses,
comparando-se os pacientes portadores de sarcoma sinovial
de extremidades com doença localizada ao diagnóstico, em
função da presença ou ausência de expressão nuclear de Ki67
≥5%
Associações entre variáveis
4.8.1 Associação de variáveis clínicas entre si
As variáveis clínicas utilizadas na análise foram o local no membro, o
tipo de cirurgia, o uso de transfusão sangüínea, o uso de neoadjuvância e o
subtipo histológico. A localização proximal do tumor associou-se com
preservação de membro (p=-0,001) e subtipo bifásico (p=0,047). Os
tumores distais associaram-se com amputação (p=-0,001), e subtipo
monofásico
(p=0,047).
O
uso
de
neoadjuvância
associou-se
com
71
Resultados
necessidade de transfusão (p= 0,032) e subtipo bifásico (p= 0,035). Os
resultados estão resumidos na Tabela 20.
Tabela 20 - Associação de variáveis clínicas selecionadas entre si
local
prx
Local
dst
amp
prx
27(47)
3(5)
dst
13(23) 14(25) 25(44)
prv
Cirurgia amp
p
0,001
27(47) 13(23)
3(5)
14(25)
0,001
22(39) 25(44) 35(61) 12(21)
não
8(14)
2(4)
0,083
sim
neoadjv
não
sim
5(9)
não
22(39) 8(14) 14(25) 16(28)
2(4)
17(30) 10(18)
0,083
subtipo
mnf
bif
11(19)
19(33)
17(30)
10(18)
0,217
0,047
35(61)
5(9)
22(39) 18(32)
14(25)
26(46)
12(21)
5(9)
9(16)
14(25)
3(5)
0,145
sim
p
Neoadj
transf
prv
p
Transf
cirurgia
8(14)
0,886
29(51) 18(32)
5(9)
2(4)
0,145
8(14)
0,001
25(44)
22(39)
3(5)
7(12)
0,032
0,297
sim
14(25) 17(30) 22(39)
9(16)
29(51)
2(4)
19(33)
12(21)
não
16(28) 10(18) 18(32)
8(14)
18(32) 8(14)
9(16)
17(30)
p
mnf
Subtipo bif
p
0,217
0,886
0,032
11(19) 17(30) 14(25) 14(25) 25(44)
19(33) 10(18) 26(46)
0,047
3(5)
0,001
3(5)
0,045
19(33)
9(16)
22(39) 7(12) 12(21) 17(30)
0,297
transf=transfusão; neoadj=neoadjuvância; prx=proximal;
amp=amputação; mnf=monofásico; bif=bifásico
0,045
dst=distal;
prv=preservação,
4.8.2 Associação entre variáveis clínicas e moleculares
As variáveis clínicas utilizadas na análise foram: local no membro,
status local, tamanho do tumor, comprometimento linfonodal, tipo de cirurgia
e subtipo histológico. Todas as variáveis moleculares foram utilizadas, sendo
categorizadas como expressão positiva ou negativa de acordo com os
critérios já citados. Tumores distais associaram-se à área vascular do tumor
≥ 15% (p=0,045); tamanho do tumor >8cm à expressão positiva de C-erb-B2,
72
Resultados
cirurgia preservadora de membros associou-se à expressão positiva de
EGFR (p=0,036) e NOS 2 (p=0,023); tumores bifásicos associaram-se à
expressão positiva de p53 (p=0,029) e c-erb-B2 (p=0,002); e tumores
monofásicos a expressão positiva de NOS 2 (p=0,002). Os resultados estão
sumarizados na Tabela 21.
Tabela 21 - Associação entre variáveis clínicas selecionadas e variáveis
moleculares
P53
Local
CD34
NOS2
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
n(%)
N(%)
8(14)
29(51)
1(2)
4(7)
21(37) 6(11) 10(18) 17(30)
7(12)
23(40) 25(44)
dst
8(14)
19(33) 21(37) 6(11) 21(37)
0.590
5(9)
0.596
18(32) 12(21) 22(39)
6(11)
0.149
23(40)
0.273
0.045
13(23) 17(30)
0.629
prm
9(16)
25(44) 28(49) 6(10) 24(42) 10(18) 25(44)
9(16)
29(51)
5(9)
15(26) 19(33)
rcr
6(10)
17(30) 18(32)
3(5)
21(37)
2(3)
8(14)
1
5(9)
0.742
15(26)
8(14)
0.774
20(35)
0.223
0.498
15(26)
0.586
≤8
4(12)
12(38) 14(44)
2(6)
9(28)
7(22)
9(28)
7(22)
12(38) 4(12)
5(16)
11(34)
>8
3(9)
13(41) 14(44)
2(6)
12(38)
4(12)
14(44)
2(6)
14(44)
7(22)
9(28)
p
Prs
Tipo de
cirurgia
CerbB2
-
p
Tamanho
do tumor
EGFR
prx
p
Status
local
Ki67
amp
p
mnf
Subtipo
histológico bif
p
0.669
1
0.458
0.049
0.365
10(18) 30(53) 33(58) 7(12) 24(42) 16(28) 29(51) 11(19) 37(65)
5(9)
12(21) 13(23)
0.751
4(7)
0.717
15(26)
0.036
11(19) 17(30) 20(35) 8(14) 19(33)
4(7)
25(44) 26(46)
0.029
3(5)
0.081
2(4)
20(35)
16(28)
1(2)
0.085
13(23)
3(5)
4(7)
0.180
0.716
20(35) 20(35)
3(5)
14(25)
0.023
9(16)
27(47)
25(44)
3(5)
6(11)
9(16)
18(32) 11(19) 25(44)
4(7)
17(30) 12(21)
0.928
1(2)
2(6)
0.002
1
22(39)
0.007
prx=proximal; dst=distal; prm=primário; rcr=recorrente prv=preservação, amp=amputação;
mnf=monofásico; bif=bifásico; EGFR=epidermal growth factor receptor; NOS=óxido nítrico
sintase
73
Resultados
4.8.3 Associação das variáveis moleculares entre si
Todas as variáveis moleculares foram utilizadas na análise sendo
categorizadas como expressão positiva ou negativa de acordo com os
critérios já citados. Não houve associação das variáveis moleculares entre si
com valores de p<0,05. Os resultados são sumarizados na Tabela 22.
Tabela 22 - Associação entre variáveis moleculares
P53
-
Ki67
+
n(%) n(%)
p53
-
+
n(%)
-
12 (21)
+
34(60)
-
EGFR
+
1
-
12(21) 27(47)
+
-
14(25) 31(54)
1(2)
11(19)
p
0,152
-
12(21) 38(67)
+
p
NOS2
15(26)
0,342
CerbB2 +
CD34
3(5)
3(5)
3(5)
4(7)
+
-
+
1(2)
8(14)
8(14)
27(47) 15(26) 31(54) 11(19) 38(67)
4(7)
15(26) 27(47)
0,152
0,365
5(9)
6(11)
10(18)
1(2)
6(11)
10(18)
0,426
1(2)
1
5(9)
32(56)
7(12)
33(58)
6 (11)
12(21)
6(10)
13(23)
5(9)
17(30)
1(2)
0,084
35(61)
0,489
10(18) 32(56) 13(23)
11(19)
1(2)
0,426
40(70)
7(12)
5(9)
0,413
6(11)
1
1(2)
0,413
8(14)
10(18)
0,669
6(11)
6(11)
0,517
21(37) 29(51)
1(2)
2(4)
1
5(9)
0,689
18(32)
5(9)
15(26)
17(30)
6(11)
21(37)
2(4)
+
7(12)
27(47)
28(49)
6(11)
24(42) 10(18) 28(49)
6(11)
29(51)
5(9)
0,669
15(26) 15(42)
17(30) 28(49)
15(26)
0,742
6(11)
1(2)
8(14)
0,358
8(14)
5(9)
6(11)
1
6(11)
18(32) 28(49)
11(19)
0,489
1(2)
0,232
39(68)
10(18) 33(58) 17(30) 39(68) 11(19)
6(11)
7(12)
0,742
34(60)
-
p
+
3(5)
0,342
14(25)
34(60) 12(21) 35(61) 11(19) 40(70)
0,365
-
12(21)
0,084
p
-
NOS2
12(21)
8 (14)
p
+
CD34
3 (5)
12(21) 34(60)
3 (5)
-
CerbB2
n(%) n(%) n(%) n(%) n(%) n(%) n(%) n(%) n(%)
1
p
ki67
EGFR
0,517
0,689
EGFR=epidermal growth factor receptor: NOS=óxido nítrico sintase
DISCUSSÃO
Discussão
4
75
DISCUSSÃO
O objetivo do presente trabalho foi estudar fatores clínicos e
histopatológicos relacionados à sobrevida livre de recidiva local, sobrevida
livre de metástases e sobrevida doença específica em sarcomas sinoviais de
extremidades, assim como a relação destes com a expressão imunohistoquímica da proteína p53, índice de proliferação celular, expressão dos
receptores de membrana EGFR e c-erb-B2, índice de neovascularização e
sintases de óxido nítrico. Além disso, nos propusemos a estudar a
associação dos fatores clínicos e moleculares entre si, buscando uma maior
compreensão do comportamento e do mecanismo de progressão tumoral
neste tipo de neoplasia.
A idade mediana da população em estudo foi 26 anos. Isto confirma a
impressão de estudos prévios de que este é um tumor de adultos jovens
(Pack e Ariel, 1950; Spillane et al., 2000; Weiss e Goldblum, 2001; Trassard
et al., 2001). Houve uma leve predileção pelo sexo masculino nesta
casuística, coincidente com descrições clássicas (Weiss e Goldblum, 2001).
Tentativas de associação da idade ou sexo do paciente com prognóstico são
conflitantes. Parece haver uma tendência ao melhor prognóstico em
paciente jovens (< 20-25 anos) (Mullen e Zagars, 1994; Bergh et al., 1999;
Paulino, 2004; de Silva et al., 2004) e do sexo feminino (Wright et al., 1982;
Trassard et al., 2001), mas este dado não se confirmou em análise
multivariada de um estudo com casuística mais consistente (Lewis et al.,
Discussão
76
2000). Nosso estudo é concordante com este último dado, não mostrando
relação de sexo ou idade com prognóstico.
O sarcoma sinovial tem sido descrito como mais freqüente, próximo a
grandes articulações, principalmente joelho (Weiss e Goldblum, 2001). A
localização mais freqüente em nosso estudo foi a proximal do membro
inferior (43,2%), sendo que de 25 tumores, 23 eram em coxa e 2 em
proximidade ao joelho. Isso é coincidente com referência a sarcomas em
geral, mas seria de se esperar que as lesões próximas ao joelho fossem
mais comuns, em se tratando de sarcomas sinoviais. Levando-se em conta
que o conceito de que o sarcoma sinovial se origina de tecido sinovial
articular é errôneo, este resultado não surpreende (Haagenson e Stout,
1944). Outro autor já chamou a atenção a este fato, mostrando a
inconsistência desta afirmação (Spillane et al., 2000). Alguns estudos fazem
menção de que tumores proximais teriam pior prognóstico que tumores
distais pela sua tendência a serem maiores e pela maior dificuldade de
obtenção de margens livres (Moberger et al., 1968; Oda et al., 1993). Esta
afirmativa não tem consenso na literatura (Mandard et al., 1989; de Silva et
al., 2004). Em nossa casuística, tumores proximais tiveram associação
significativa com margem inadequada, enfatizando este aspecto. Em relação
a prognóstico, não houve diferença entre tumores proximais e distais.
A sintomatologia de presença isolada de tumor e de tumor associado
à dor foram as mais comuns e são coincidentes com referências prévias
(Pack e Ariel, 1950; Meis-Kindblom e Enzinger, 1996; Bergh et al., 1999;
Weiss e Goldblum, 2001; Paulino, 2004). Aparentemente, a dor associada
Discussão
77
ao tumor é mais freqüente em sarcomas sinoviais do que em outros tipos de
sarcoma (Meis-Kindblom e Enzinger, 1996). O tempo mediano entre o
aparecimento de sintomas e a apresentação foi de 8 meses, o que reflete o
crescimento lento do tumor apesar de o mesmo ser de alto grau. O período
mais longo nesta série foi de 144 meses. Este período é variável na literatura
e também existem relatos de pacientes que apresentaram após períodos tão
longos quanto vários anos após o início de sintomas (Weiss e Goldblum,
2001). A relação com trauma foi referida por 8 pacientes (13,7%). Outros
estudos já tentaram mostrar esta correlação sem sucesso (Scully et al.,
1999; Deshmukh et al., 2004). Aparentemente, o trauma só chama a
atenção para um tumor já existente no local.
A maior parte dos tumores nesta série já haviam sofrido manipulação
prévia e ou já eram recidivados. Isto parece ser um fator de mau prognóstico
(Bergh et al., 1999; Deshmukh et al., 2004), embora alguns autores
discordem desta opinião (Evans, 1993; Ueda et al., 1997). O fato é que
incisões de biópsia mal posicionadas, tentativas de exérese sem diagnóstico
prévio com margens inadequadas, violação de planos anatômicos entre
outras falhas de técnica, se não pioram o prognóstico, com certeza dificultam
o trabalho do cirurgião que recebe o caso em um centro de referência. Neste
estudo, a apresentação como tumor recidivado teve impacto tanto na
sobrevida livre de recidiva local como na sobrevida livre de metástases. Isso
pode ser explicado pela possibilidade de desdiferenciação tumoral após
recidivas, processo já descrito em literatura (Popov et al., 2001). A
ocorrência de óbito por tumor não foi influenciada por este fator,
Discussão
78
possivelmente por alguns pacientes com metástases a distância ainda
encontrarem-se vivos e em seguimento nesta série.
O tamanho do tumor parece ser o fator prognóstico mais consistente
na maior parte das séries (Mullen e Zagars, 1994; Singer et al., 1996; Bergh
et al., 1999; Lewis et al., 2000; Deshmukh et al., 2004; Paulino, 2004; de
Silva et al., 2004). Tumores maiores que 5cm possuem pior prognóstico, e
permanecem como variável independentemente de prognóstico após análise
multivariada. Nesta casuística, a maior parte dos tumores avaliáveis eram
maiores que 5cm (T2), e quase metade dos tumores T2 eram maiores que
10cm. Isso é condizente com o período longo entre o início de sintomas e a
apresentação. Apesar dos grandes tamanhos tumorais neste estudo, a
sobrevida doença específica é comparável à de séries com menores
tumores (Bergh et al., 1999; Spillane et al., 2000). O tamanho do tumor
influenciou a sobrevida doença específica em nossa análise, permanecendo
como único fator significativo após análise multivariada. Isso corrobora os
dados de literatura. Outro estudo mostrou prognóstico adverso em tumores
pequenos, indicando que não só o tamanho é importante na determinação
da agressividade tumoral (Spillane et al., 2000).
O comprometimento linfonodal ao diagnóstico estava presente em
apenas 3 pacientes. No sistema de estadiamento TNM, a presença de
linfonodos comprometidos já é considerada como estadio IV. Nos sarcomas
sinoviais, metástases linfonodais são consideradas mais freqüentes que em
outros tipos de sarcoma, entre 3 a 7% (Brodsky et al., 1992; Spillane et al.,
2000; Trassard et al., 2001; Behranwala et al., 2004; Riad et al., 2004).
Discussão
79
Destes 3 pacientes, 2 vieram a falecer após 2 e 9 anos de seguimento.
Apesar destes números não permitirem maior análise, parecem corroborar a
impressão da literatura que linfonodos comprometidos são marcadores de
doença a distância.
A simples ressecção de sarcomas de partes moles resultou no
passado em índices inaceitáveis de recidiva, tão altos quanto 65% (Abbas et
al., 1981). Tentativas de melhora destes resultados passaram por
amputações e compartimentectomias, mas ainda com falha local em 20 a
30% dos pacientes (Simon e Enneking, 1976). Nas últimas 2 décadas,
avanços no uso de terapia multimodal resultou em índices de controle local
de 95% e amputações em menos de 10% dos casos (Karakousis et al.,
1995). Além disso, a sobrevida entre pacientes amputados versus
preservação de membros não difere (Rooser et al., 1989; Lewis et al., 2000;
de Silva et al., 2004). Neste estudo, 17 (29,3%) pacientes foram submetidos
à amputação, 7 deles após tentativa de redução do tumor com
neoadjuvância. Isso reflete a alta incidência de tumores T2 volumosos em
nossa casuística, além da inclusão de casos pré-era de tratamento
multimodal. Em contrapartida, a preservação foi possível em 12 pacientes
que no passado teriam sido amputados. O tipo de cirugia não influenciou
prognóstico em nossa série, corroborando achados de estudos prévios.
Apesar disso, nível próximo de significância foi atingido para sobrevida livre
de recidiva local.
A maior parte dos pacientes não necessitou transfusão sangüínea,
embora
tenha
havido
uma
associação
significativa
entre
uso
de
Discussão
80
neoadjuvância e uso de hemoderivados. Isso possivelmente se deve a
alterações locais de vascularização e fibrose, dificultando dissecção
adequada, levando a um maior sangramento. Alguns estudos sugerem que a
transfusão de hemoderivados é um fator de mau prognóstico, não estando
claro se por motivos imunológicos ou como reflexo de grandes volumes
tumorais, necessitanto cirurgias mais alargadas com conseqüente perda
sangüínea maior (Rosenberg et al., 1985; Heslin et al., 1994). Em nossa
casuística, não se observou diferença em sobrevida em pacientes
transfundidos.
Outros fatores de mau prognóstico consistentes na literatura são a
presença de margem microscópica comprometida e invasão de feixe
neurovascular ou estrutura óssea (Singer et al., 1996; Trassard et al., 2001).
Estes fatores, como o tamanho tumoral, permanecem significativos, mesmo
após análise multivariada nestas séries. A proximidade a estruturas
neurovasculares ou ósseas não é incomum: 16 de nossos pacientes
estavam nesta situação, 3 dos quais não foi possível a obtenção de margem
livre. Dos 13 com margem exígua, 4 recidivaram e, dos 3, com margem
comprometida, 2 tiveram recidivas locais. Isto corrobora a importância da
margem no controle local da doença mesmo com o uso de tratamento
multimodal. A presença de margem comprometida não afetou prognóstico
em nossa série, possivelmente pelo pequeno número de casos. Ainda
assim, valor de p próximo à significância foi atingido para sobrevida livre de
recidiva local.
Discussão
81
O subtipo histológico tem sido amplamente avaliado como fator
prognóstico na literatura. Embora existam descrições de que o tipo
monofásico seria mais agressivo (Zito, 1984; Cagle et al., 1987; Paulino,
2004), a maioria dos autores discorda deste fato e não vê diferença entre
eles (Mullen e Zagars, 1994; Moberger et al., 1968; Bergh et al., 1999; Lewis
et al., 2000). Em nossa casuística, cada subtipo representou metade da
série. O número de recidivas locais e a distância encontrava-se igualmente
distribuído entre os subtipos. Não houve relação do subtipo histológico com
prognóstico em nosso estudo. Houve uma associação significativa entre o
subtipo e o local no membro, tumores bifásicos possuindo localização
predominantemente proximal e monofásicos distal. O subtipo monofásico
também associou-se a maiores índices de amputação.
As complicações de ferida operatória aconteceram em 22,4% dos
pacientes. Destes, 61,5% receberam alguma forma de neoadjuvância.
Complicações de ferida são mais freqüentes em pacientes recebendo
radioterapia pré-operatória. O’Sullivan et al. (2002) descrevem uma
freqüência de 35% de complicações locais quando utilizada radioterapia préoperatória comparado com 17% quando a radioterapia é pós-operatória.
Eilber et al., (1988) descrevem um índice de complicação local de 26% com
o uso de quimioterapia e radioterapia associadas no período pré-operatório.
Nosso índice de complicações é compatível com tais estudos.
A terapia adjuvante foi utilizada em 56,9% dos pacientes. Embora a
radioterapia pós-operatória tenha um papel bem definido no controle local da
doença (Habrand e Pechoux, 2004) e a quimioterapia neoadjuvante venha
Discussão
82
ganhando mais adeptos (Eilber et al., 1988; Henshaw et al., 2001; Ottaiano
et al., 2002) o uso da quimioterapia adjuvante é mais controverso. Vários
estudos não conseguiram mostrar benefício em seu uso nos sarcomas
sinoviais, mas aparentemente quando utilizada em um subgrupo de
pacientes com tumores maiores do que 5cm e em pacientes com mais de 20
anos pode haver ganho de sobrevida (Tierney, 1997). Pelo menos 1 estudo
mostra potencial para neoadjuvância/adjuvância em sarcomas sinoviais,
embora apenas em 14 pacientes (Kampe et al., 1993). Nosso critério de
seleção para o uso de quimioterapia foi variável, dependendo do protocolo
institucional da época, o que torna difícil a análise de tais fatores. O uso de
neoadjuvância ou adjuvância não mostrou relação com prognóstico em
nosso estudo.
Apesar do controle local dos sarcomas de partes moles ter melhorado
após o advento da terapia multimodal (Rosenberg et al., 1982; Lewis e
Brennan, 1996), infelizmente a cirurgia inicial inadequada é ainda freqüente
antes do encaminhamento a centros de referência. Isso resulta em altos
índices de recidiva local, em torno de 50-60%. Mesmo após uma operação
radical, a recorrência local ocorre em 5 a 10% dos pacientes (Abbas et al.,
1981). O impacto disto na sobrevida permanece incerto. Alguns autores
indicam a recidiva como um grave fator prognóstico; outros não concordam
(Evans, 1993; Ueda et al., 1997; de Silva et al., 2004). Evans (1993) destaca
a diferença entre persistência de doença e recidiva local verdadeira. Dessa
forma, a persistência de doença seria um evento inocente quando tratada
com nova ressecção adequada. A recidiva local aconteceu em 27,6% dos
Discussão
83
pacientes de nossa série e a sobrevida livre de recidiva local em 5 anos foi
de 62,28%. O resgate cirúrgico foi possível em 87,5%, 56,2% dos quais com
amputação. Stojadinovic et al. (2001) descrevem em uma série de 1178
pacientes, com vários tipos histológicos de sarcomas, um índice de recidiva
local de 17%, 9% necessitando amputação para resgate, índices bem mais
baixos que os nossos. No entanto, esta série não incluiu tumores de dígitos,
pés e mãos e pacientes que já se apresentavam como recidiva. Isto explica
a diferença. Concluindo, acreditamos que a recidiva representa um marcador
de agressividade, mas que raramente é o responsável pelo óbito do
paciente.
Metástases a distância aconteceram em 58,6% e a sobrevida livre de
metástases em 5 anos foi de 46,56%. Em mais da metade as metástases
foram
exclusivamente
pulmonares,
57,8%
sendo
submetidos
a
metastasectomia cirúrgica. Outros estudos mostram índices de metástases a
distância entre 40 e 50%, principalmente para pulmões, tendo como fatores
preditivos o tamanho do tumor e invasão de estrutura óssea ou
neurovascular (Lewis et al., 2000; Trassard et al., 2001; Deshmukh et al.,
2004; Paulino, 2004; de Silva et al., 2004). A maioria de nossos pacientes
possuíam grandes tumores e os com invasão óssea ou neurovascular
fizeram parte do grupo amputados. Dos pacientes com tumores maiores que
8cm, 25% apresentaram metástases, assim como 65% dos amputados.
Embora existam evidências de que os sarcomas sinoviais tenham melhor
resposta à quimioterapia que outros tipos histológicos (Rosen et al., 1994),
sobrevida a longo termo em pacientes com estadio IV só é possível em
Discussão
84
casos selecionados de ressecção completa de metástases pulmonares
exclusivas (Billingsley et al., 1999). Apenas 1 de nossos 11 pacientes com
ressecção pulmonar de metástases permanece livre sem doença.
Desde o artigo clássico publicado em 1944 por Haagenson e Stout,
descrevendo uma série de 104 casos de sarcoma sinovial com sobrevida de
apenas 3 pacientes em 5 anos, vários outros estudos foram publicados com
melhoras progressivas neste índice. Hadju et al. (1977) obtiveram 40% de
sobrevida em 5 anos, Brodsky et al., (1992) obtiveram 56% e, Singer et al.,
atingiram 60% em 1996, exemplificando esta evolução. O aprimoramento na
técnica cirúrgica associado ao uso de tratamento multimodal provavelmente
teve participação na melhora dos resultados. Outro possível motivo é a
inclusão em algumas séries de tumores como sarcomas epitelióides ou de
células claras, que possuem pior prognóstico e, na realidade, não são
sarcomas sinoviais (Pack e Ariel, 1950; Hadju et al., 1977; Brodsky et al.,
1992). O estabelecimento de critérios diagnósticos mais específicos permitiu
que isso fosse corrigido em publicações mais recentes (Preasant et al.,
1986). A presente série reflete uma experiência de mais de 30 anos no
tratamento desta doença em nossa instituição, com todos os casos
incluídos, preenchendo critérios atuais de diagnóstico de sarcoma sinovial. A
sobrevida doença-específica em 5 anos atingida foi a de 56,78%. Este índice
é comparável aos obtidos atualmente em centros de referência para
tratamento de sarcoma, que infelizmente não tem melhorado (Bergh et al.,
1999; Spillane et al., 2000; Trassard et al., 2001). Apesar de existirem séries
com melhores resultados, isto ocorreu pela inclusão apenas de pacientes
Discussão
85
intactos e com tumores menores (Lewis et al., 2000). Nosso estudo ilustra
uma série de pacientes com sarcoma sinovial tratados em um longo período
e enfatiza a agressividade de tais tumores, sua forma de apresentação,
tratamento, padrões de recorrência e sobrevida. É importante ressaltar a
necessidade de tratamento em centros especializados e dedicados ao
tratamento desta rara doença, para que, assim, melhores resultados possam
ser obtidos em termos de preservação de membros, recidiva local e
sobrevida. A inclusão de pacientes de alto risco em protocolos de
quimioterapia adjuvante deve ser encorajada. Nosso estudo buscou, por
meio de fatores moleculares relacionados ao tumor melhor selecionar estes
pacientes.
O gene p53 localizado no cromossomo humano 17p13 codifica uma
fosfoproteína nuclear envolvida na regulação transcricional, controle
translacional, reparo de DNA, controle do ciclo celular, diferenciação celular
e apoptose (Levine, 1999). A maior parte das mutações de p53 são
mutações missense que produzem uma proteína alterada (Finlay et al.,
1988). A proteína p53 mutada não somente perde o efeito supressor de
tumor da proteína wild type, mas também parece agir como um oncogene
(Levine, 1999). Devido ao seu efeito na apoptose e reparo de DNA, o p53
também pode estar envolvido em mecanismos de resistência a drogas
antineoplásicas (Levine, 1999). O gene p53 é o gene mais freqüentemente
mutado em tumores sólidos (Nigro et al., 1989) e tem sido estudado
extensivamente em sarcomas (Drobnjak et al., 1994; Hieken e Das Gupta,
1996; Taubert et al., 1996; Nakanishi et al., 1997). Mutação ou inativação
Discussão
86
funcional do gene p53 foi relatada em vários tipos de sarcomas de partes
moles e parece correlacionar-se com pior prognóstico em alguns subtipos
histológicos (Hieken e Das Gupta, 1996; Taubert et al., 1996). Corroborando
este fato, a restauração da proteína wild type mediante terapia gênica pode
retardar o crescimento tumoral em sarcomas (Milas et al., 2000). Quando
alterada, a proteína tem sua meia vida aumentada e acumula-se no núcleo,
podendo ser detectada imuno-histoquimicamente (Finlay et al., 1988).
Estudos especificamente em sarcoma sinovial também foram feitos (Oda et
al., 2000; Antonescu et al., 2000; Barbashina et al., 2002). O percentual de
expressão alterada da proteína variou de 16-24%. Um dos estudos mostrou
expressão em 67%, destoando dos outros dois. A relação com prognóstico
foi controversa, sendo positiva em dois e, negativa, em outro estudo.
Associação entre proteína p53 wild type e supressão de angiogenese
também foi descrita (Zhang et al., 2000), assim como a associação de
expressão nuclear imuno-histoquímica da proteína p53 e tamanho do tumor
(Antonescu et al., 2000). Em nosso estudo, a expressão nuclear da proteína
foi alta, em 73% dos casos. Não houve relação com prognóstico e não
encontramos associação entre a expressão nuclear de p53, tamanho do
tumor
ou
neovascularização.
Em
contrapartida,
encontramos
uma
associação significativa entre a expressão nuclear da proteína p53 e o
subtipo histológico bifásico, sugerindo diferentes vias de progressão tumoral
entre os dois subtipos.
O Ki67 é um antígeno nuclear presente durante a maior parte do
ciclo celular e é usado como um marcador de proliferação, mostrando ter
Discussão
87
valor prognóstico em vários tipos tumorais (Gerdes, 1990). Apesar de uma
melhor compreensão de sua estrutura, localização e valor diagnóstico e
prognóstico, pouco avanço foi feito com relação ao esclarecimento de sua
função na última década (Brown e Gatter, 2002). Muitos estudos
investigaram o seu papel em sarcomas (Choong et al., 1994; Drobnjak et al.,
1994; Choong et al., 1995; Heslin et al., 1998; Lopes et al., 1998; Huuhtanen
et al., 1999). A sua alta expressão correlacionou-se com outros marcadores
diretos ou indiretos de alta proliferação, como a fração de células na fase S,
tamanho, grau e necrose tumorais (Choong et al., 1994; Drobnjak et al.,
1994; Huuhtanen et al., 1999). Quando levados estes fatores em
consideração, o seu papel prognóstico perde potência estatística. Ainda
assim, em um estudo somente com sarcomas de alto grau, Heslin et al.,
(1998) demonstraram um risco aumentado para metástase e óbito por tumor
que persistiu após análise multivariada. Tanto a expressão aumentada como
o papel prognóstico foi dependente do subtipo histológico em alguns destes
estudos (Drobnjak et al., 1994; Choong et al., 1995). A expressão em
sarcoma sinovial é variável nos trabalhos publicados na literatura, um estudo
mostrando ser este o tipo que mais expressa e, outro, mostrando o oposto
(Drobnjak et al., 1994; Heslin et al., 1998). O seu valor prognóstico em
sarcoma sinovial também foi descrito previamente e nosso estudo confirma
este fato (Skytting et al., 1999). Este estudo é concordante com o de Heslin
et al., (1998), mostrando ser possível estratificar populações de baixo e alto
risco em um grupo de sarcomas de alto grau.
Discussão
88
O receptor de fator de crescimento epidermal tem sido um alvo
bastante investigado para terapia anticâncer devido à sua expressão em
altos níveis, em uma variedade de tumores sólidos e por ele estar
relacionado ao controle de processos-chave na progressão tumoral, como a
proliferação, a diferenciação e a migração celular e angiogênese (Ciardiello
e Tortora, 2003; Menard et al., 2004; Roskoski, 2004). Apesar do fato que a
expressão destes receptores pode estar associada a pior prognóstico em
alguns tumores como os de mama e cabeça e pescoço, isto nem sempre é o
caso (Ciardiello e Tortora, 2003). Da mesma forma, o inibidor de tirosinaquinase comercialmente disponível que bloqueia a ação deste receptor, o
gefitinib, não funciona para todos os tumores que expressam o receptor. Isto
também é verdade para o anticorpo monoclonal que bloqueia seu domínio
externo, o IMC-C225 ou Erbitux. Estas drogas, no momento, encontram-se
aprovadas para uso clínico em câncer de pulmão não-pequenas células e
câncer colorretal, exemplificando este fato (Roskoski, 2004). Sua expressão
em sarcomas já foi descrita e aparentemente é mais expresso em sarcomas
com diferenciação epitelial, como o sarcoma epitelióide e o sarcoma sinovial
(Barbashina et al., 2003; Potti et al., 2004). Em dois estudos de sarcomas
sinovias com 19 e 38 pacientes, a expressão foi de 68 e 55,3%
respectivamente. Apenas o primeiro estudo investigou a relação com
prognóstico, que foi negativa. Nossa série mostrou positividade para este
receptor em 32% dos casos e nenhuma relação com prognóstico.
Interessantemente, a presença do receptor associou-se significativamente
com cirurgia preservadora de membros.
Discussão
89
O receptor de membrana c-erbB2 codificado pelo gene HER2/neu,
localizado no cromossomo 17 é da mesma família de receptores que o
EGFR, exercendo função semelhante ao mesmo (Menard et al., 2004).
Embora alterações em seu funcionamento estejam implicadas no processo
de progressão tumoral de vários tipos de neoplasias sólidas, o receptor
ganhou notoriedade por ter se tornado um alvo terapêutico eficaz em
pacientes portadoras de câncer de mama (Baselga et al., 1996). Apesar de
representar um fator de mau prognóstico neste tipo de neoplasia, o uso de
um anticorpo monoclonal comercialmente disponível capaz de bloquear o
receptor, o trastuzumab, tem efeito antineoplásico (Baselga et al., 1996;
Slamon et al., 1987). Infelizmente, nem sempre isso é verdade para outros
tipos tumorais. A expressão deste receptor em sarcomas é descrita e a
relação com prognóstico não é muito clara: um dos estudos mostra nenhuma
relação, enquanto o outro, refere-se a um pior prognóstico (Foster et al.,
2003; Sato et al., 2003). Levando-se em conta apenas os sarcomas
sinoviais, isto é ainda mais controverso. Barbashina et al. (2002) mostraram
expressão em 52% de seus e nenhuma relação com prognóstico. Nuciforo et
al. (2003) mostraram expressão alterada em 23% dos casos, relacionada a
menor índice de recidiva. Nenhum de seus pacientes que expressaram
c-erbB2, desenvolveram metástases. No entanto, ambas as séries possuem
um número muito pequeno de pacientes. Em uma série um pouco maior,
Thomas et al. (2005) mostraram 52,6% de expressão do receptor
exclusivamente em pacientes portadores da translocação SYT/SSX1, com
nenhum caso mostrando amplificação. A associação entre a expressão de
Discussão
90
EGFR e de c-erbB2 aconteceu em 34,2% dos casos. Em nossa casuística, a
expressão de c-erbB2 aconteceu em 21% dos pacientes e a associação com
EGFR aconteceu em 9% dos casos (p=0,489). Nenhum de nossos pacientes
mostrou amplificação. Confirmando impressão prévia de Nuciforo et al.,
(2003) nossos pacientes expressando c-erbB2 tiveram uma melhor
sobrevida, livre de metástase tanto na análise univariada como na
multivariada. Ao contrário de pacientes com câncer de mama, a presença do
receptor é um fator de bom prognóstico e isso provavelmente invalida o seu
uso como alvo terapêutico. Houve uma associação significativa entre
expressão de c-erbB2 e tumores bifásicos, mostrando que a biologia dos 2
subtipos é diferente.
A angiogênese é um fator essencial para que ocorra progressão
neoplásica, facilitando os processos de crescimento tumoral, invasão e
metástases (Folkman, 1990; Weidner et al., 1991; Hanahan et al., 1996;
Skobe et al., 1997; Jain, 2000; Fox et al., 2001). O aumento da
neovascularização tumoral mostrou correlacionar-se com mau prognóstico
em tumores sólidos (Weidner e Folkman, 1996). A angiogênese tumoral, ou
formação de novos vasos sangüíneos, é regulada por um balanço entre
fatores proangiogênicos, como o fator de crescimento vascular endotelial
(VEGF) e fatores antiangiogênicos, como a endostatina (Fox et al., 2001).
Um estudo em sarcomas de partes moles mostrou uma correlação entre
níveis séricos de VEGF e tamanho tumoral, assim como de níveis altos de
endostatina com menor prevalência de metástases (Yoon et al., 2004). Em
contrapartida, a contagem de microvasos em outro estudo não mostrou
Discussão
91
correlação com prognóstico (Saenz et al., 1998). No caso do sarcoma
sinovial, um estudo em 54 pacientes também não foi capaz de correlacionar
densidade de microvasos e prognóstico, ou relação entre expressão imunohistoquímica de VEGF e densidade de microavasos (Kawauchi et al., 1999).
Em nosso estudo, a área vascular tumoral ≥15% não teve relação com os
desfechos de sobrevida avaliados. Também não houve associação com a
expressão de outros marcadores estudados. Aparentemente, se o processo
de neoangiogênese faz parte do processo de progressão tumoral no
sarcoma sinovial, este não pode ser avaliado pela contagem de microvasos.
Interessantemente, nosso estudo mostrou que tumores com localização
distal tendem a ser mais vascularizados.
Durante a última década, o papel do óxido nítrico (NO) em vários
processos fisiológicos e patológicos se tornou aparente, embora muitos
deles não tenham sido completamente compreendidos (Wink et al., 1998).
Este radical livre parece ser crítico em muitas funções, como vasodilatação,
neurotransmissão e imunidade mediada por macrófagos (Xu et al., 2002). A
família dos óxido nítrico sintases (NOS) compreende a NOS induzível (i-NOS
ou NOS 2), a NOS endotelial (e-NOS ou 3) e a NOS neuronal (n-NOS ou 1)
(Wolf, 1997). Seu papel na biologia tumoral recentemente tem sido
extensivamente estudado, mas ainda não completamente elucidado
(Brennan et al., 1999; Lala e Chakraborti, 2001). Vários estudos mostram
que as 3 isoformas podem participar da promoção ou inibição de processos
neoplásicos (Xu et al., 2002). O óxido nítrico parece ter efeitos promotores
ou inibidores da progressão tumoral de acordo com a sua concentração
Discussão
92
dentro do tumor (Brennan e Moncada, 2002). Altos níveis de expressão de
NOS (como os produzidos por macrófagos ativados) parecem ser
citostáticos ou citotóxicos para células neoplásicas por meio de dano direto
ou apoptose, enquanto níveis baixos têm o efeito oposto e promovem
crescimento tumoral (Xu et al., 2002). O papel do óxido nítrico na
tumorigênese é multifatorial. Ele pode participar desde fases precoces,
provocando dano em DNA como mais tardiamente pela promoção de
angiogênese pela seleção de células p53 mutantes e aumento da produção
de VEGF (Tamir et al., 1996; Garcia-Cardena e Folkman, 1998). A atividade
das NOS foi detectada em células tumorais de várias origens histológicas e
tem sido associada a grau tumoral e a índice de proliferativo (Thomsen et al.,
1994; Thomsen et al., 1995; Cobbs et al., 1995; Duenas-Gonzales et al.,
1997; Fujimoto et al., 1997; Klotz et al., 1998; Gallo et al., 1998). Poucos
estudos foram realizados em sarcomas, mostrando que evidências da
expressão das NOS neste tipo tumoral são controversas. Um deles mostrou
que a i-NOS pode ser ativada em células de sarcoma osteogênico em
cultura pelo estímulo com citocinas (Tachibana et al., 2000). Outro estudo
mostrou que em sarcomas de Kaposi a presença das NOS relaciona-se com
vasos sangüíneos e macrófagos teciduais, mas não com as células
estromais tumorais (Weninger et al., 1998). Com relação à função do óxido
nítrico nos sarcomas, um estudo mostrou que a citotoxidade mediada por
macrófagos em células de sarcoma em cultura ocorre por apoptose
(Sveinbjornsson et al., 1996). Em outro estudo, usando um modelo
experimental de metástases hepáticas de sarcoma, a ativação da i-NOS nas
Discussão
93
células tumorais pelo uso de lipossomos contendo lipopeptideo CGP 31362
foi capaz de induzir regressão destas (Xie et al., 1995a). Estes estudos
mostram novamente o papel controverso da ação desta molécula no
processo de progressão tumoral também em sarcomas. Em nossa série, foi
possível demonstrar a expressão das 3 isoformas das sintases de óxido
nítrico em sarcomas sinoviais. Enquanto as NOS 1 e 3 foram uniformemente
expressas, a NOS 2 ou induzível foi expressa em 60% dos tumores, mas
sem relação com prognóstico. Isto aparentemente também invalida o uso
desta molécula como alvo terapêutico neste tipo de tumor. Também não foi
possível mostrar associação de sua expressão com a expressão de p53 ou
aumento da porcentagem de área vascular tumoral, sugerindo que estes
processos não sejam mediados pelo óxido nítrico no sarcoma sinovial. Outra
hipótese, já que a mensuração da presença de óxido nítrico no tumor foi feita
indiretamente pela expressão de suas sintases, é a de que talvez o método
utilizado não reflita a real presença da molécula. Houve uma associação
entre cirurgia preservadora de membros e tumores monofásicos e expressão
de NOS2. Apesar deste subtipo histológico ser descrito como mais
agressivo, isso não parece ser em decorrência da expressão desta enzima.
Com o número crescente de estudos na literatura sobre sarcomas
sinoviais, não só analisando fatores clínicos mas também moleculares, uma
melhor compreensão da biologia deste tumor vem sendo atingida. Embora
isto ainda não tenha sido traduzido em aplicação clínica direta, acreditamos
que esta meta esteja próxima. A seleção de pacientes para protocolos de
adjuvância é um processo muitas vezes difícil. O perfil de toxicidade das
Discussão
94
drogas, atualmente disponíveis para tratamento de sarcomas sinoviais, não
é baixo. A busca de alterações moleculares que possam servir como alvo
terapêutico ou como marcadores de agressividade é cada vez mais descrita
na literatura. Apesar de não termos identificado nenhum possível alvo
terapêutico, acreditamos ter melhorado o conhecimento existente sobre a
biologia dos sarcomas sinoviais. A expressão das sintases do óxido nítrico
por este tumor não havia sido descrita. O papel prognóstico da expressão do
Ki67, embora descrito, não havia mostrado correlação com a maior
possibilidade de recidiva local. O papel do c-erb-B2 na agressividade deste
tumor era ambíguo nos poucos e pequenos estudos existentes, e ganhou
maior clarificação com nosso estudo. Corroboramos os achados de outros
autores com relação ao EGFR e neovascularização e mostramos que
correlações entre alterações moleculares descritas in vitro nem sempre se
comprovam em tecidos de arquivo. Associações entre expressão de p53 e
c-erbB2 com o subtipo bifásico e da expressão da NOS 2 com o subtipo
monofásico
mostra
que
os
mesmos
possuem
diferentes
vias
de
transformação. Do ponto de vista clínico, acreditamos que o Ki67 e o
c-erbB2 somam valor prognóstico aos critérios clínicos já conhecidos e
possam ser utilizados na melhor seleção de pacientes para neoadjuvância
ou adjuvância.
CONCLUSÕES
Conclusões
5
96
CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo, podemos concluir que em
relação aos sarcomas sinoviais:
1. a apresentação do tumor como recidiva e a expressão nuclear de
Ki67 ≥5% são fatores prognósticos independentes para recidiva local;
2. a expressão nuclear de Ki67 ≥5% e a positividade para o receptor de
membrana c-erbB2 são fatores prognósticos independentes para
metástases a distância;
3. o tamanho do tumor >8cm é fator prognóstico independente para
morte por tumor;
4. a localização proximal do tumor associou-se com preservação de
membro e subtipo bifásico. Os tumores distais associaram-se com
amputação e subtipo monofásico. O uso de neoadjuvância associouse com necessidade de transfusão e subtipo bifásico;
5. os tumores distais associaram-se à área vascular do tumor ≥ 15%; a
cirurgia preservadora de membros associou-se à expressão positiva
de EGFR e NOS 2; os tumores bifásicos associaram-se à expressão
positiva de p53 e c-erb-B2 e os tumores monofásicos à expressão
positiva de NOS 2;
6. entre as variáveis moleculares estudadas entre si, não houve
associação significativa.
ANEXO
7 ANEXO - Planilha utilizada para a realização da análise estatística
v_idade
26
31
71
26
19
24
27
16
27
49
21
53
62
17
28
15
26
19
26
26
42
21
28
23
16
26
41
27
28
21
44
14
30
31
18
20
15
19
35
11
73
43
22
35
15
27
19
37
43
56
34
60
4
24
71
14
21
c_idade
2
2
2
2
1
1
2
1
2
2
1
2
2
1
2
1
2
1
2
2
2
1
2
1
1
2
2
2
2
1
2
1
2
2
1
1
1
1
2
1
2
2
1
2
1
2
1
2
2
2
2
2
1
1
2
1
1
local
2
1
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
2
1
1
1
2
1
2
1
1
2
1
2
2
1
2
1
1
1
2
1
2
2
1
1
2
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
2
2
1
2
2
1
2
1
1
1=masculino v.conínua 1<25 anos 1=proximal
2=feminino
2>25 anos 2=distal
v_tamanho c-tamanho c_sts local
15
2
1
1
2
15
2
1
15
2
1
2
2
24
2
1
2
20
2
1
2
2
15
2
1
5
1
1
2
12
2
1
2
2
40
2
1
2
15
2
1
7
1
2
10
2
1
7
1
2
2
20
2
1
1
9
2
1
5
1
1
8
1
1
10
2
1
5
1
1
16
2
1
2
2
2
6
1
1
5
1
1
3
1
2
6
1
1
2
8
1
1
2
1
1
11
2
1
8
1
1
1
1
2
2
2
7
1
2
7,5
1
1
1
15
2
1
2,5
1
1
2
1
v.conínua
1≤ 8cm
2>8cm
1=primário
2=recidivado
cirurgia
2
1
1
1
1
2
1
2
1
1
2
2
2
2
1
2
1
1
1
2
1
1
2
1
2
2
1
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
1
2
1
1
1=preservação
2=amputação
c_transfusão linfonodo
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0=não
1=sim
c_tipo
2
2
1
1
1
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
1
1
2
2
2
2
1
2
1
2
2
1
1
1
1
1
2
1
2
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
2
margem
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0=negativo 1=bifásico
1=livre
1=positivo 2=monofásico 2=comprometida
neoadjuvância adjuvância
v_p53
0
0
62,31732777
1
0
0
0
0
31,30333592
1
1
23,39261286
0
0
13,632287
0
1
0
1
0
62,00294551
1
0
0
0
0
15,92442645
0
1
84,68468468
1
0
64,15384615
0
1
28,32394976
1
0
38,35920177
1
0
32,50773994
0
1
12,89712557
1
1
54,63659148
1
1
88,60103627
1
1
35,2238806
0
0
28
0
1
36,2764884
1
0
0
0
1
45,40295119
1
1
81,32322536
1
0
10,06060606
0
0
0
1
1
87,54464286
0
1
40,23332336
0
1
0
1
1
77
1
0
47,78046812
0
1
44,19448476
1
0
0
0
1
40,91370558
0
0
46,01487779
1
1
67,11281071
0
1
22,37026648
1
1
23,05574673
0
1
63,63040629
0
0
0
1
1
55,07152146
0
0
0
1
1
60,12345679
0
1
31,63841808
1
1
71,6953317
1
0
33,11802701
0
1
48,80239521
0
0
0
1
1
0
0
1
74,86772487
1
0
24,94736842
0
1
25,57193696
0
1
31
0
1
0
1
0
61,77836762
0
0
8,113879004
0
1
80,71833648
0
1
0
0=não
1=sim
0=não
1=sim
Anexo 98
sexo
1
2
1
1
1
1
1
1
2
1
2
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
1
2
2
1
2
2
1
1
2
1
2
2
2
2
2
2
1
1
2
1
2
2
2
2
1
1
2
1
1
2
1
1
2
v.conínua
continua
v_ki67
0
10,2
0,03
7,53
0,61
7,5
1,71
0
0,91
0
0
9,67
20,2
19,14
10,2
0,61
0,25
6,75
4,92
0
0,81
1,15
1,25
0
0
0
20,2
0
0
0,91
0,03
2,5
0
0,25
1,25
0,27
1,51
0,11
9,92
0,61
0,98
0,7
1,68
1,71
0
5,6
2,8
0
0,8
1,15
1,1
0
0,27
0
0
3,87
0
c_Ki67
0
1
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
1
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
EGFR
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
_cerb
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
0
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
v_CD34
31,9
9,7
6
0
2,4
25,2
7,4
4,6
9,4
5,7
0
1,7
4,5
8,7
9,4
4,6
3,2
7,6
3
1,6
3,5
2,6
4,2
18,6
8,5
20,6
9,4
2,9
3,1
3,3
3,5
20,2
3,2
3,5
2,8
1,5
5,7
16,9
4,3
9
0
6,8
3,9
3
2,1
5
10,6
9,8
7,7
7,3
5,2
16,3
4,7
11,8
5,5
7,1
1,1
c_CD34
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
c_NOS2
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
0
INT_metástase
0,666666667
0,733333333
1,066666667
1,133333333
1,166666667
2,233333333
2,933333333
2,966666667
3,6
3,8
4,066666667
4,166666667
4,166666667
5,166666667
5,366666667
6,266666667
7,133333333
8,1
9,7
9,9
10,63333333
14,3
15,73333333
16,1
19,16666667
19,76666667
24,3
25,7
25,8
29,13333333
29,8
29,9
30,06666667
31,96666667
32,63333333
33,13333333
38,96666667
49,86666667
53,13333333
54,76666667
56,3
59,13333333
60,83333333
64,6
65,53333333
65,8
65,86666667
67,73333333
72,53333333
85,03333333
97,73333333
107,3666667
109,8666667
141,8
183,5333333
320,2333333
334,0666667
INT_recidiva local
20,4
16,36666667
1,066666667
49,43333333
1,166666667
2,233333333
26,4
2,966666667
3,6
42,1
18,16666667
12,06666667
38,6
7,133333333
5,366666667
12,6
10,16666667
9,533333333
9,7
18,06666667
21,7
29,16666667
15,73333333
23,13333333
30,26666667
88,4
15,63333333
25,7
25,8
29,13333333
27,06666667
96,36666667
30,06666667
34,46666667
21,9
101,2
38,96666667
50,66666667
9,466666667
54,76666667
31,53333333
59,13333333
48
64,6
16,8
65,46666667
70,73333333
68
17,7
87
97,73333333
107,3666667
109,8666667
141,8
183,5333333
56,4
334,0666667
intervalo em meses
entre cirurgia e evento
intervalo em meses
entre cirurgia e evento
OUT_metástase OUT_morte por câncer OUT_recidiva local
1
1
0
1
1
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0
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0
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0
1
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0
0
0
desfecho
1=metástase
desfecho
1=morte por câncer
desfecho
1=recidiva local
99
0=negativo v.conínua 0=negativo 0=negativo 0=negativo v.conínua 0=negativo 0=negativo intervalo em meses
1=positivo
1=positivo 1=positivo 1=positivo
1=positivo 1=positivo entre cirurgia e evento
INT_morte por câncer
20,4
16,36666667
1,066666667
62,06666667
1,166666667
14,33333333
36,36666667
2,966666667
3,6
42,1
18,16666667
12,06666667
38,6
7,133333333
31,7
12,6
10,16666667
9,533333333
9,7
18,06666667
21,7
29,16666667
15,73333333
23,13333333
30,26666667
88,4
26
25,7
25,8
29,13333333
34,26666667
96,36666667
30,06666667
34,46666667
58,83333333
101,2
38,96666667
56,83333333
82,23333333
54,76666667
81,76666667
59,13333333
109,5
64,6
66,46666667
78,23333333
65,86666667
137,1333333
72,6
87
97,73333333
107,3666667
109,8666667
141,8
183,5333333
322,7333333
334,0666667
Anexo
c_p53
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
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1
1
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1
1
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1
1
1
1
0
0
1
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1
0
1
0
1
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