Universidade Federal do Ceará
Departamento de Análises clínicas- FFOE
Laboratório de Cultivo Celular
ESTUDO DA NEFROTOXICIDADE DE
VENENOS DE SERPENTES
BOTRÓPICAS DO NORDESTE DO
BRASIL
Gdayllon Cavalcante Meneses
INTRODUÇÃO
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O Brasil é um país com características climáticas
e geográficas muito variadas, possuindo assim
uma ampla diversidade biológica.
Pesquisas com toxinas de origem animal
apresentam-se como potencial fonte de futuros
agentes terapêuticos e têm contribuído muito na
compreensão de mecanismos fisiopatológicos de
doenças (Mortari et al.2007).
SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA
Espécies
Peçonhentas
Elapidae
Micrurus
Viperidae
Bothrops
Bothrops
erythromelas
Crotalus
Bothrops
insularis
Lachesis
COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES
VENENO
Componentes
Protéicos
Propriedades
enzimáticas
Não
enzimáticas
Componentes
Não Protéicos
Orgânicos
Não orgânicos
FOSFOLIPASES A2
CLASSIFICAÇÃO:
PLA2
Intracelulares
ou citosólicas
Independentes
de Ca+2
(Ownby, 1999;
Lomonte, 2003).
Extracelulares
ou secretórias
Tipo I
Tipo II
Tipo III
(Asp-49
PLA2s)
(Lys-49 PLA2s)
(Ser-49 PLA2s)
ENVENENAMENTOS POR SERPENTES
BOTRÓPICAS
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As características importantes são sério dano
muscular, hemorragia e coagulopatia;
A insuficiência renal, insuficiência respiratória e
choque podem ocorrer nos casos mais graves
(Bjarnason; Fox, 1994; Kamiguti et al., 1996; Gutiérrez, 2002;
White, 2005);
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A etiopatogenia da lesão renal tem sido atribuída
à nefrotoxicidade direta da peçonha, miólise,
hemólise,
hipotensão,
coagulação
capilar
glomerular, ação tóxica vascular e até mesmo
reações de hipersensibilidade à toxina ou ao soro
antiofídico (Pinho et al., 2000).
JUSTIFICATIVA
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Os acidentes ofídicos representam um sério
problema de saúde pública nos países tropicais,
pela frequência com que ocorrem e pela
morbimortalidade que ocasionam (Pinho et al., 2000);
O gênero Bothrops possui ampla distribuição e
corresponde ao grupo de serpentes peçonhentas
mais importantes em número de espécies e
densidade populacional (Queiroz et al., 2008);
A importância fisiológica do rim e a patogênese
da IRA;
JUSTIFICATIVA
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Quanto a linhagem de células MDCK e mesangiais;
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A resposta a injúrias de células tubulares renais;
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Qual a importância
apoptótico?
do
estudo
do
mecanismo
OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos dos venenos das serpentes B.
erythromelas, Bothrops insularis e suas frações
fosfolipase A2 sobre linhagens de células renais,
podendo contribuir para a descoberta de
ferramentas farmacológicas e/ou elucidar os
mecanismos de nefrotoxicidade.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
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Estudar o efeito dos venenos e frações das
serpentes Bothrops erythromelas, Bothrops
insularis e suas frações fosfolipase A2 em células
mesangiais e tubulares renais;
Determinar o efeito dos venenos e frações sobre a
viabilidade e proliferação das linhagens celulares
em estudo;
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

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Avaliar o potencial apoptótico do veneno e suas
frações;
Investigar a expressão das proteínas próapoptóticas (FAS, Bax e caspase 3) e antiapoptóticas (BclxL) em células renais;
Investigar os possíveis mediadores envolvidos no
efeito renal.
METODOLOGIA
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CULTIVO CELULAR (MDCK):

Meio de cultura RPMI 1640 + 10% de SBF;


100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de
estreptomicina;
Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em
estufa contendo 5% de CO2 .
METODOLOGIA
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


CULTIVO CELULAR (Mesangiais):
Meio de cultura RPMI 1640 + 20% de SBF + 2%
de glicose;
100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de
estreptomicina;
Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em
estufa contendo 5% de CO2 .
METODOLOGIA

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Armazenar em meio sem SBF por 24h para a
obtenção de células na fase G0 do ciclo celular;
Retirar as células
tripsina-EDTA;
das
garrafas
utilizando
As células serão então quantificadas em câmara
de Neubauer e subcultivadas (1-2x105céls/ml)
permitindo o crescimento confluente por 24h.
METODOLOGIA
Ensaios de Viabilidade e Proliferação
Celulares

MTT;

Lactato Desidrogenase;
MTT
Leitura em
espectrofotômetro
LACTATO DESIDROGENASE
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Avaliar a integridade de membrana no processo
de morte celular;
Análise da liberação da enzima LDH, através da
sua atividade enzimática.
AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR
APOPTOSE
1)
Detecção da Externalização de Fosfatidilserina;
2)
Determinação do potencial transmembrânico
mitocondrial;
3)
Isolamento de RNA total;
4)
Reação de Transcriptase reversa;
5)
Reação em cadeia de polimerase (PCR);
6)
Eletroforese em gel de agarose.
DETECÇÃO DA EXTERNALIZAÇÃO DE
FOSFATIDILSERINA

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Novas descobertas do processo apoptótico estão
surgindo com a descoberta de novos parâmetros,
Um deles é a dosagem de fosfatidilserina (PS);
Mudanças na estrutura da membrana plasmática
como forma de sinalização;
A Anexina V é uma proteína de ligação para
fosfolipídeos que pertence a família das Anexinas.
Na presença de íons de cálcio ela exibe alta
afinidade
para
a
ligação
seletiva
a
fosfatidilserina.
DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL
TRANSMEMBRÂNICO MITOCONDRIAL
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
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Rodamina é um nome genérico para uma família
de compostos orgânicos, corantes chamados
fluoronas;
A rodamina-123 (Rh-123) é um fluorocromo
específico para a marcação mitocondrial em
células vivas;
Alterações ao nível da integridade mitocondrial
podem ser detectadas através do aumento da
fluorescência verde citosólica, indiciando uma
difusão da Rh-123 da mitocôndria para o citosol
(Johnson et al., 1980).
ISOLAMENTO DE RNA TOTAL

Serão isolados utilizando o reagente Trizol
(Invitrogen) seguindo o protocolo descrito pelo
fabricante:
SEPARAÇÃO
PRECIPITAÇÃO
ANÁLISE EM
ESPECTROFOTÔMETRO
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
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Extração do RNA Total feita para a formação do cDNA
na reação de Transcriptase Reversa;
É feita então a ampificação do cDNA;
Analisar a expressão gênica dos diversos mediadores
celulares pró-apoptóticos (FAS, Bax e caspase 3) e
anti-apoptóticos (BclxL) .
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
DETERMINAÇÃO DE MEDIADORES EM
CULTURA DE CÉLULAS RENAIS
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Determinação de nitrito;
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Determinação de TNF-α;
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Qual a importância da determinação desses
mediadores?
ANÁLISE ESTATÍSTICA


Serão
realizados
três
experimentos
independentes, em triplicata, para cada ensaio.
As médias obtidas em cada experimento serão
comparadas utilizando o teste t ou ANOVA,
seguido do teste de Bonferroni, quando
apropriado, usando o software Prism GraphPad
versão 5.0. Valores de p < 0,05 serão considerados
para a análise.
OBRIGADO!