Fabrício Freitas
Maria do Carmo
Thiago Malardo
Leishmaniasis
 Leishmaniasis is caused by protozoan parasites
belonging to the genus Leishmania. The parasites are
transmitted by the bite of an insect vector, the
phlebotomine sandfly.
 Leishmaniasis threatens about 350 million men, women
and children in 88 countries around the world.
 As many as 12 million people are believed to be
currently infected, with about 1–2 million estimated new
cases occurring every year.
Parasite's life cycle
Forms of leishmaniasis
– Cutaneous leishmaniasis - is the most common form. It usually
produces ulcers on the exposed parts of the body, such as the
face, arms and legs;
– Diffuse (disseminated) cutaneous leishmaniasis - is
characterized by the presence of a large (>10) number of
lesions at several anatomic sites (head, limbs, and trunk);
– Mucocutaneous leishmaniasis - the lesions can lead to partial
or total destruction of the mucous membranes of the nose,
mouth and throat cavities and surrounding tissues;
– Visceral leishmaniasis - is the most severe form, in which
vital organs of the body are affected.
Global distribution of leishmaniasis
BMJ VOLUME 326 15 FEBRUARY 2003
Geographical distribution
• 90% of cutaneous leishmaniasis cases occur in
Afghanistan, Brazil, Iran, Peru, Saudi Arabia
and Syria;
• 90% of mucocutaneous leishmaniasis occurs in
Bolivia, Brazil and Peru;
• 90% of all visceral leishmaniasis cases occur
in Bangladesh, Brazil, India, Nepal and Sudan.
Geographical distribution of cutaneous and
mucocutaneous leishmaniasis in the New World
www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps
The main Leishmania species
Treatment regimens
Immune response against Leishmania
TLR and MyD88 pathway in Leishmania
infection
TLR signaling pathway
K. Takeda, S. Akira / Seminars in Immunology 16 (2004) 3–9
Events that lead to susceptibility
Events that lead to resistance
Resistance and susceptibility in leishmaniasis
Suppressor of cytokine signalling (SOCS)
NATURE REVIEWS / IMMUNOLOGY / VOLUME 2 / NOVEMBER 2002
Thiago Malardo
Why some strains of Leishmania
cause more severe injuries than
others
Parasitized parasite
• Entamoeba histolytica (1960);
• Giardia lamblia (1986);
• Trichomonas vaginalis (1986);
• Most recently in Leishmania (1988).
Leishmania infected by virus
• Virus - Double-stranded RNA (dsRNA);
• Viruses of Leishmania have been identified in
13 strains of L. braziliensis or L. guyanensis;
• Are designated Leishmania RNA virus 1 (LRV1;
Totiviridae).
Levels of RNA virus within the parasite
affect the host`s immune response
Cutaneous leishmaniasis
Mucocutaneous leishmaniasis
Fabrício Freitas
Objetivo
Analisar o papel do TLR 2 e MyD88 na ativação
de células dentríticas durante a infecção por
Leishmania braziliensis
A produção de citocinas e ativação das MyD88-/DC estão prejudicadas após a infecção por
Leishmania braziliensis ?
BMDC WT
MyD88-/-
Infecção 8:1
24 horas
Citometria
de fluxo
ELISA
L. braziliensis (Lb)
L. amazonensis (La)
A produção de citocinas e ativação das MyD88-/DC estão prejudicadas após a infecção por
Leishmania braziliensis ?
Produção de IL-12p40 e ativação da DC foi prejudicada na
ausência de MyD88.
Camundongos MyD88-/- são mais susceptíveis à
infecção por Leishmania braziliensis ?
semanalmente
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
Lesão
WT ou MyD88-/-
Camundongos MyD88-/- são mais susceptíveis a infecção
por L. braziliensis
Qual o mecanismo do MyD88 na susceptibilidade à
infecção por Leishmania braziliensis ?
4 e 8 semanas
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
WT ou MyD88-/-
Linfonodo drenante
6h
CD4+
1x106 cels.
Citometria
(IFN-γ, IL-17 e IL-10)
O mecanismo do MyD88 é mediar a produção de céls. TCD4+
produtoras de IFN-γ e IL-17, sendo necessário para uma efetiva
resposta imune contra L.braziliensis.
Toll 2
molécula chave na intereção
hospedeiro-Leishmania.
Toll 2 está envolvido no reconhecimento da
Leishmania braziliensis ?
BMDC WT
Toll 2-/-
Infecção 8:1
24 horas
Citometria
de fluxo
ELISA
L. braziliensis (Lb)
L. amazonensis (La)
Toll 2 está envolvido no reconhecimento da
Leishmania braziliensis ?
Na ausência de Toll2, DC são mais ativadas e produzem
maiores quantidades de IFN-γ.
O aumento da ativação de toll 2-/- DC está associada
com a expressão de SOCS após a infecção por
Leishmania braziliensis ?
BMDC WT
Toll 2-/-
Infecção 10:1
L. braziliensis (Lb)
L. amazonensis (La)
4 horas
Real-Time
PCR
O aumento da ativação de toll 2-/- DC está associada
com a expressão de SOCS após a infecção por
Leishmania braziliensis ?
Na ausência de Toll2, DC expressaram maiores níveis de
SOCS 1 e 3.
Regulação positiva independente de toll 2.
Toll 2-/- DC infectadas com Leishmania braziliensis
podem ativar células T CD4+produtoras de IFN-γ ?
BMDC WT
Toll 2-/-
CD4+ baço 2x106
Infecção 8:1
24 horas
Co-cultura
4 dias
L. braziliensis (Lb)
L. amazonensis (La)
Proliferação
ELISA
Toll 2-/- DC infectadas com Leishmania braziliensis
podem ativar células T CD4+produtoras de IFN-γ ?
A deficiência de toll 2 promove ativação da céls. T
CD4+e a produção de IFN-γ.
Camundongos Toll 2-/- são mais resistentes à
infecção por Leishmania braziliensis ?
semanalmente
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
Lesão
WT ou Toll 2-/-
Camundongos Toll 2-/- são
mais susceptíveis a
infecção por L. braziliensis.
Como estaria a carga parasitária em camundongos Toll
2-/- infectados com Leishmania braziliensis ?
4 e 8 semanas
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
Carga
parasitária
WT ou MyD88-/-
No grupo WT e K.O, houve
semelhante carga parasitária
na quarta e oitava semana.
A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com o
aumento de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ?
4 e 8 semanas
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
WT ou MyD88-/-
Linfonodo drenante
6h
1x106 cels.
Citometria
CD4+ (IFN-γ, IL-17 e IL-10)
A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com o
aumento de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ?
A proteção está associada com um aumento da
população de céls. T CD4+ produtoras de IFN-γ
A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com a alta
produção de IFN-γ pelas céls. T CD4+ ?
4 e 8 semanas
2x106
Pata posterior
L. braziliensis
WT ou MyD88-/-
Linfonodo drenante
3 dias
1x106 cels.
SLA
Elisa
(IFN-γ e IL-10)
A proteção em animais toll 2-/- estaria associada com a alta
produção de IFN-γ pelas céls. T CD4+ ?
A proteção está associada com a alta produção de
IFN-γ pelas céls. T CD4+
Conclusão
2
PAPEL REGULADOR
A falta do MyD88 prejudica a imunidade protetora no combate à
infecção por Leishmania braziliensis.
Elevada ativação e produção de IL-12 e aumento na população de
células T CD4+ produtoras de IFN-γ.
Objetivo: Verificar a modulação da resposta imune por diferentes linhagens de
Leishmania guyanensis e o envolvimento do LRV1 nesta modulação.
As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam
diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?
L.g.M+
L.g.MM5313
BMMΦ
(BALB/c)
6h
DNA microarrays – expressão de genes (RI)
As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam
diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?
L.g.M+
L.g.MM5313
L.Major LV39
BMMΦ
(BALB/c ou C57BL/6)
6h
ELISA
Linhagens isoladas CL e CLM também modulam
diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro?
L.g. h-CL (Lg1881)
L.g. h-MCL (Lg1398)
BMMΦ
(BALB/c ou C57BL/6)
6h
ELISA
L.g.M+
M5313
L.g. h-MCL (Lg1398)
L.g.ML.g. h-CL (Lg1881)
Metastáticas
CXCL10, CCL5, TNF-α e IL-6
Nãometastáticas
CXCL10, CCL5, TNF-α e IL-6
Os elevados níveis de citocinas e quimiocinas, depois da infecção, estão
associados com as linhagens de parasitas metastáticos.
A entrada do parasita e a formação de fagolisossomo são
necessários para o desenvolvimento desta resposta?
L.g.M+
L.g.MM5313
BMMΦ (C57BL/6)
Cloroquina ou Citocalasina D
6h
ELISA
Existe envolvimento dos TLRs endossomais (TLR3, 7 e 9)
nesta resposta?
L.g.M+
L.g.MM5313
BMMΦ
C57BL/6
TLR3-/TLR7-/TLR9-/-
6h
ELISA
TLR3 é o receptor responsável pelo reconhecimento do
parasita?
L.g.M+
L.g.MM5313
BMMΦ
C57BL/6
TLR3-/TRIF-/MyD88-/-
6h
ELISA
(IFN-β)
A via dependente de TRL3-TRIF foi essencial para o aumento da
expressão dos mediadores proinflamatórios
Os MΦ reconhecem dsRNA das linhagens metastaticas?
Ácidos nucléicos
L.m.LV39
M5313
L.g.M+
L.g.M-
ssRNAse ou
DNAse/ssRNAse
BMMΦ
BALB/c
6h
ELISA
L.g.M5313 (M+)
L. guyanensis
Isolados de MCL humana
L. braziliensis
dsRNA Leishmania
RNA virus 1 (LRV1)
O LRV1 esta presente nas linhagens metastaticas?
Ácidos nucléicos
L.g.ML.g.M+
M5313
L.g. h-CL (Lg1881)
L.g. h-MCL (Lg1398)
L.m.LV39
ssRNAse
DNAse
ou não
RNA total
Real Time PCR
A
B
O LRV1 é o responsável pelo aumento de citocinas e
quimiocinas na infecção com linhagens metastáticas?
dsRNA LRV1
BMMΦ
C57BL/6
TLR3-/-
Real Time PCR
Estes resultados são similares para linhagens isogênicas?
L.g.M4147-LRVhigh
L.g.M4147-LRVneg
BMMΦ
C57BL/6
TLR3-/-
Real Time PCR
TLR3 e LRV1 desenvolvem o mesmo papel na
leishmaniose in vivo?
L.g.M+
L.g.M-
Camundongos
C57BL/6
TLR3-/TLR7-/-
Footpad swelling
A
Carga parasitária
(qRT-PCR)
B
Conclusão