Como eu Monitoro e
Diagnostico Poliomavirus
Marilda Mazzali
Disciplina de Nefrologia- FCM UNICAMP
Infecção pelo Poliomavirus: Diagnóstico
Viscount et al, Transplantation 2007
Algoritmo para investigação de Infecção pelo
Poliomavirus “Mundo Ideal” – Wiseman et al, AJKD 2009.
Disfunção inexplicada do enxerto
Screening para pacientes assintomáticos
Checar PCR BKV sangue*
Se prevalência > 2%*
Pesquisa em urina
PCR, mRNA, citologia
M1,3,6,12
PCR qualitativo BKV
M1,3,6,12
PCR em sangue > 10.000 cópias-ml
Biopsia renal com imunohistoquimica
Considerar redução empirica de imunossupressão se função renal estável
Sem evidencia de PVAN
Presumida
Reduzir IMSS
BKV + rejeição vascular
IVIg + redução de IMSS
Considerar leflunomide
BKV + tubulite
BKV com ou sem rejeição
redução de IMSS
Pulso x leflunomide
Continuar acompanhamento a cada 2-4 semanas até negativo
Considerar redução adicional de imunossupressão
PCR em sangue negativo:
Monitorar para risco de recorrencia de BKV, biopsiar para disfunção inexplicada
SCREENING PARA INFECÇÃO ATIVA PELO
POLIOMAVIRUS EM RECEPTORES DE
TRANSPLANTE RENAL
Protocolo I – padronização de técnicas diagnósticas
Protocolo II- Estudo Prospectivo
LABNEF - FCM Unicamp
Protocolo I - Screening Poliomavirus
OBJETIVO
Padronização de testes para detecção de infecção ativa pelo
Poliomavirus tipo BK em receptores de transplante renal
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
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Receptores de Tx renal com doador entre set/99 a julho/2001
Idade > 18 anos
Rim funcionante, em acompanhamento ambulatorial
Função renal estável ( creatinina < 15%)
Ausência de rejeição aguda
TCLE assinado
Protocolo I - Screening Poliomavirus
MATERIAL & MÉTODOS
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Acompanhamento ambulatorial mínimo de 6 meses
Período de coleta: janeiro a dezembro de 2002
Mínimo de 3 amostras/paciente
Análise de citologia urinária: 3 pesquisadores, cego
Imunocitoquímica para todas as citologias positivas
PCR em sangue em:
– todas as amostras correspondentes às citologias positivas
– primeira amostra dos pacientes com citologia
persistentemente negativa
Protocolo I - Screening Poliomavirus
Citologia urinária
Cél decoy +
Negativa
Imunocitoquímica
Positiva
Negativa
PCR sangue
Positiva
Negativa
Biopsia renal
+ Imunohistoquímica
Diagnóstico - Citologia Urinária
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Amostra isolada de urina 1:1 em 100% ETOH
Lâminas de citologia em triplicata
Coloração de Papanicolaou modificada
Microscopia óptica x 400/imersão s/n
Presença de células decoy:
–
–
–
–
núcleo basófilo
aumento de volume nuclear
cromatina condensada
nucléolos evidentes
LABNEF - FCM Unicamp
Diagnóstico - Imunocitoquímica urinária
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Lâminas de citologia conservadas em freezer -20C
Ac primário monoclonal mouse anti BK/JC humano
Ac secundário peroxidase anti mouse IgG
cromógeno: diaminobenzidina
contracoloração: hematoxilina de Harris
Análise por microscopia óptica
– células positivas: marrom
– células negativas: azul
LABNEF - FCM Unicamp
Diagnóstico - PCR qualitativo
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DNA extraído a partir de PMN sangue periférico
40 ciclos de amplificação
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Probe HPSF 1 : 5´AAG TCT TTA GGG TCT TCT AC3´
Probe HPSF 2: 5´GTC CCA ACC TAT GGA ACA GA 3´
– 94C 1min, 54C 2min, 72C 1min
176pb
LABNEF - FCM Unicamp
Protocolo I- Resultados
• 105 pacientes randomizados
• 80 pacientes com material adequado para análise
– 240 amostras analisadas
• 25 casos descartados (citologia com material inadequado)
• Divididos em 4 grupos, de acordo com citologia:
–
–
–
–
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo
I: Citologia persistentemente negativa (n= 37)
II: Citologia persistentemente positiva (n= 24)
III: Negativação da citologia na evolução (n= 9)
IV: Positivação da citologia na evolução (n=10)
LABNEF- FCM Unicamp
Protocolo I- Resultados
• Primeira coleta 13  5 meses
• Todas citologias + com imunocitoquímica positiva
para BKV
• PCR qualitativo em sangue:
–
–
–
–
Citologia negativa (grupo 1) = 100% PCR negativo
Citologia positiva (grupo 2) = 58% PCR positivo
Positivação de citologia (n=9)- cito + precedeu PCR +
Negativação de citologia (n=10) = 25% PCR positivo inicial,
100% PCR negativo final.
Protocolo I- Resultados
• Nenhum caso de Nefropatia pelo Poliomavirus no
período de acompanhamento**
• Sem diferenças entre grupos positivo/negativo em
relação a:
–
–
–
–
–
Imunossupressão
Tipo de doador
Doença renal primária
Incidência de rejeição aguda
Creatinina sérica na ocasião da coleta das amostras
Protocolo I- Resultados
• Após 5 anos de acompanhamento:
– Perda de enxerto – comparável entre os grupos positivo x
negativo
– O grupo com histórico de citologias positivas (pelo menos 1
caso), apresentou pior função renal (creatinina sérica) ao
final de 5 anos de follow up (1.5mg% vs. 2.6 mg%,
p<0.05).
Protocolo II- Prospectivo
•
Início - abril de 2004
•
380 pacientes com pelo menos 1 ano de
acompanhamento
•
Amostras sequenciais:
–
–
–
–
–
–
–
–
Mês 1
Mês 3
Mês 6
Mês 9
Mês 12
Trimestral anos 2 e 3
Semestral após ano 3.
*citologia positiva- intervalo menor
LABNEF - FCM Unicamp
Algoritmo para investigação de Infecção pelo Poliomavirus
“Mundo Real” – Unicamp, a partir de 2004.
Citologia urinária
Negativa
Coleta de rotina
Observação
Citologia urinária
Intervalos curtos
decoy +
Ajuste de IMSS
Decoy +
PCR sangue
Positiva
Ajuste de IMSS
Citologias de acompanhamento
LABNEF- FCM Unicamp
Biopsia renal
Imunohistoquímica
– Virúria
• Redução do ICN
• Manutenção antiproliferativo
• 380 pacientes
Screening
– Nefropatia estabelecida
• Metilprednisolona se rejeição associada
• Manutenção de corticóide
• Interrupção de tacrolimus/mmf
Follow up
• 92 virúria persistente
• 60 negativos com ajuste
de IMSS
• Sirolimus se possível (nível~8 ng/dl)
• Ou Azatioprina/ciclosporina dose baixa.
– Outras drogas?
• Ciprofloxacin profilático.
PVAN
• 32 indicações de bíopsia
renal
• 27 nefropatias
diagnosticadas
• 2 uropatias obstrutivas
Suspeita
PVAN
• 14 meses pós transplante, citologia persistente positiva
• Creatinina sérica 1,4 ± 0,6 mg%
• 3 citologias positivas
• Tacrolimus sanguíneo: 8,0 ng/d
Biopsia
• 22 meses pós transplante
• Creatinina sérica: 2,6 ± 0,8 mg%
• Tacrolimus sanguíneo: 6,8 ng/d
5 anos
FUP
• 37% perda de enxerto
• (creatinina inicial 1,7 ± 0,7 vs. 1,4 ± 0,5mg%, P<0.05)
• (creatinina na biopsia: 3,1 ± 0,6 vs. 2,3 ± 0,7 mg%, p<0.05)
• 17 enxertos funcionantes: IMSS com mTOR e corticóide,
clareamento de virúria me média 16 semanas.
• Creatinina atual: 2,0 ± 0,5 mg%, 70 meses de acompanhamento