EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO
PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT
José Eduardo Levi
Depto. De Biologia Molecular
Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo
07/06/2013
Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP
25
20.3
% de Descarte - Média
20
17,25
18.12
17,62
14.94
15.77
15
12.96
10
19.63
11.8
9.93
9.79 9.19
6,35
5
4.47
5.45
2,61
3.27
2,48
2.72
2,36
2.75
2.39
0
1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica;
2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL;
2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV
Porcentagem de Descarte - HIV
Teste em uso e critério:
ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%)
CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%)
Obs.:
2004 ELISA Ag + Ac
2011 NAT
Porcentagem de Descarte - HCV
Teste em uso e critério:
ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%)
Obs.:
2008 ELISA Ag + Ac
2011 NAT
FPS 2010
ANTI-HCV= 0.32%
ANTI-HIV= 0.18%
HIV descarte teste
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Teste 1 + Teste 2
Teste 1
Teste 2
Marcadores sorológicos e moleculares
na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático
Anticorpos anti-HIV
DT = 21.5 hrs
2nd gen
“blip” viremia
0
11
10
16
20
1nd gen
Antígeno p24
3rd gen
22
30
Infectividade teórica
RNA viral
Antígeno p24
Anticorpos anti-HIV
40
50
Dia 0
Dia 11
Dia 16
Dia 22
60
70
80
90
100
11.3/MILHÃO = 1:88.500
“Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue”
“Eu doo sangue para ter meus resultados”
Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!
Marcadores sorológicos e moleculares
na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático
Anticorpos anti-HIV
DT = 21.5 hrs
2nd gen
“blip” viremia
0
11
10
16
20
1nd gen
Antígeno p24
3rd gen
22
30
Infectividade teórica
RNA viral
Antígeno p24
Anticorpos anti-HIV
40
50
Dia 0
Dia 11
Dia 16
Dia 22
60
70
80
90
100
Teste de Ácido Nucléico (NAT)
Portarias do Brasil
Port. 262 M.S. 02/2002 - introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por
estado “pool” de 8 amostras
Port. 1407 M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste.
Incapacidade de organizar todos laboratórios
Port. 79 01/2003 - adiada por 1 ano
Port. 112 01/2004 - Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede
Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos
nucléicos (NAT), para HIV e HCV.
Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional,
da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos
(NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.
Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos
–
–
–
–
Plataforma multiplex para HCV e HIV;
Pool de 6 amostras;
2008 - estudos-piloto - SC
2010 - Estudos multicêntricos (outros hemocentros
brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação
e logística.
– Registro em 12/2010
– 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE,
RJ e SP
– 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA).
blood units/day
(based on the # of serology tests)
30 ¬ 100

100 ¬ 200

200 ¬ 400
Belém, 349
Fortaleza, 646

Manaus, 376
 Recife, 942
400 ¬ 800

800 ¬ 1000
Brasília, 773
Campo Grande, 629
1000 ¬ 1500

Salvador, 438

B.Horizonte, 
1192
São Paulo
1923



Rio de Janeiro, 1083
Curitiba, 769
 Florianópolis, 1115
BUT …
São Paulo State –
1500 ¬ 2000
due to size and complexity …
will be addressed further !
How to?
Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on:


Easiness for primary tube logistics and report return within platelet saving time (<24h)
Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already
established for serology tests.
Manual Operacional NAT
•
Sítio Testador (SIT)
– 24 horas para resultado após o recebimento
– Encaminhar tubo para coleta
– Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos
•
Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da
sorologia
– Relatório para o SIT
– Distribuição dos tubos para UCA
– Coleta e centrifuga amostra
– Conservar em geladeira
•
Unidade Coletora de Amostra (UCA)
– Relatório para a URA
– Coleta e centrifuga amostra
– Conservar em geladeira
Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos
Pooling – 2h
Extração – 2h
e 30min
30 min - 20ºC
30 min + 22ºC
Tempo total 9h
PCR Setup
–30min
Amplificação–
3h
NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste
Tubo primário - PPT
Pool – 6 amostras
Plataforma automática
Janus Perkin Elmer
Protocolo de rotina
TOTAL
POOL
SINGLE
1
552
552
0
2
522
516
6
3
492
480
12
4
462
444
18
5
432
408
24
6
402
372
30
7
372
336
36
8
342
300
42
9
312
264
48
10
0
0
92
NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste
Adição da partícula calibradora
Extração – Biorobô MDx
(T. lise e protease, temp 65ºC)
Amplificação + Detecção
(HIV, HCV part calibradora) – PCR tempo real Applied Biosystems 7300
NAT FPS Total 532.700 doações
Mês
Oct-10
Nov-10
Dec-10
Jan-11
Feb-11
Mar-11
Apr-11
May-11
Jun-11
Jul-11
Aug-11
Sep-11
Oct-11
Nov-11
Dec-11
Jan-12
Feb-12
Mar-12
Apr-12
May-12
Jun-12
Jul-12
Aug-12
Sep-12
Oct-12
Nov-12
Dec-12
Jan-13
Feb-13
Mar-13
Apr-13
Total
FPS H Santos COLSAN Stella M. UNIFESP Sta C. SP Sta Marcelina Ribeirão
4707
5434
11495
11659
10572
11401
11304
10147
11035
12615
11452
10258
9533
11015
11296
8948
12189
11018
9660
12571
11538
12084
12094
9650
10944
10652
10923
11006
9440
10516
10640
327796
240
531
426
386
421
1253
1674
1355
1692
2071
2411
1971
2231
2544
2480
1904
2634
2115
2464
2634
2151
2268
2350
1805
2718
1886
2386
2625
51626
8538
12736
11224
12499
12644
11185
14103
14121
97050
284
396
359
367
364
374
362
448
2954
820
1898
1853
1572
2170
1906
1890
1873
13982
2221
1664
2874
4134
3680
4714
4169
23456
1664
2652
2703
2599
2849
2859
15326
510
510
Total
4707
5434
11495
11899
11103
11827
11690
10568
12288
14289
12807
11950
11604
13426
13267
11179
14733
13498
11564
15205
13653
14548
14728
21443
30463
29766
32692
35739
31070
36820
37245
532700
Amostra Janela HIV – Retrovigilância
(Soroteca)
- Processada dia 17 de março de 2011
• Amostra em SINGLE
• Ct: 32,54
HCV
Maio de 2011 a Abril de 2013
Total de doações = 379.422 (FPS+HS)
Total de resultados reagentes: 1052
Prevalência = 0.05%
EIA Ac/Ag
Reagente
Não Reagente
NAT Detectável
192
7 (falso positivos NAT)
NAT Não Detectável
853
378.370 Negativo
HIV
Maio de 2011 a Abril de 2013
Total de doações = 379.422 (FPS+HS)
Total de resultados reagentes 1065
Prevalência = 0.04%
Ac/Ag 2 testes EIA + CMIA
Reagente
Não Reagente
NAT Detectável
163
28 (falso positivo NAT)
1 janela em abril de 2013
NAT Não Detectável
1065
378.357
HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT
PF
3804045
coleta
03/12/2010
amostra
04800001938-8
bolsa
104109940
CT
54
194828
2903482
09/12/2010
11/12/2010
0210265394-3
02102651648-0
104164080
104164325
56
44
2986278
2774240
3779751
495641
3808786
3811196
3703095
2570093
3674534
3816361
1508395
3817893
2978849
3573837
13/12/2010
15/12/2010
15/12/2010
15/12/2010
21/12/2010
31/12/2010
02/01/2011
13/01/2011
14/01/2011
19/01/2011
24/01/2011
24/01/2011
26/01/2011
28/01/2011
0502215483-8
0502215520-6
0502219335-3
0502223922-1
0502225709-2
0502218389-7
0502218572-5
0502230082-6
0502229960-7
0502229400-1
0502228984-9
4800002559-0
0502232590-0
0700365782-1
104115054
104169001
104166036
104166736
104144193
104175431
104175181
104177712
104177611
104182658
104177257
104147730
104179994
104185355
58
45
16
48
56
56
45
57
15
35
54
46
51
44
3395295
21/02/2011
0502240019-7
104203382
59
3759227
2736457
20/03/2011
20/03/2011
0502247606-1
0502242568-8
104221526
104221370
59
49
3764909
2147942
1754169
3628109
1909304
2100337
3886339
2026869
118057
09/04/2011
0502247152-3
22/06/2011 4800005590-2
04/07/2011
0502275726-5
07/07/2011 0502276968-9
11/07/2011 0700367705-9
20/07/2011 4800006494-4
17/09/2011 0502297325-1
29/09/2011 0210295405-6
30/09/2011 0502308004-8
104229396
104236830
104248542
104229877
104269449
104237406
104334478
104333646
104327583
24/41/ND
17/53/ND
59
50/52/ND
51/54/ND
47/55/ND
59/50/ND
57/47/ND
53/59/ND
retorno
11/01/2011
11/02/2011
EIA
N
N
WB
NR
NR
NAT
N
N
31/12/2010
05/02/2011
24/02/2011
22/12/2010
01/03/2011
13/12/2011
N
N
N
N
N
N
NR
NR
NR
NR
NR
NR
N
N
N
N
N
N
04/02/2012
15/02/2011
N
N
NR
NR
N
N
15/03/2011
02/03/2012
02/03/2011
23/02/2011
18/04/2011
24/03/2011
15/04/201
N
N
N
N
N
N
N
NR
NR
NR
NR
NR
NR
NR
N
N
N
N
N
N
N
13/04/2011
06/05/2011
09/05/2011
27/07/2011
16/11/2011
10/08/2011
N
N
N
N
N
N
NR
NR
NR
NR
NR
NR
N
N
N
N
N
N
31/08/2011
19/10/2011
21/10/2011
08/02/2012
N
N
N
N
NR
NR
NR
NR
N
N
N
N
envelope
gp120
SOROCONVERSÃO - HIV
gp41
matriz
transcriptase
reversa
RNA
viral
capsídeo
Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP
Última Doação Negativa: 02/08/2011
Sexo: masculino
Idade: 36 anos
CCR5
CD4
CXCR4
Banda controle
p17
p24
Teste de Western Blot:
MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2
Testes :
Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia
BioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”
gp120 gp160
16/04/13
03/05/13
14/05/13
Quimio
(S/CO)
NR
571,990
8,470
ELISA (DO)
NR
3,000
2,784
NAT (CT)
32,0
17,856
22,848
W. BLOT
-
IND
POS
Teste NAT - 17/04/2013
Pool de 6 amostras - CT: 34,6374
Teste NAT - 18/04/2013
Amostra única - CT: 32,8703
Teste NAT - 03/05/2013
Amostra única – CT: 17,856
Teste NAT - 17/05/2013
Amostra única – CT: 22,848
RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP
NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1:238.000
OBSERVADO = 1: 328.000
RENDIMENTO NAT NO BRASIL
N AMOSTRAS
CASOS WP
TAXA
HCV
1.085.548
4
1:271.387
HIV
1.024.755
5
1:204.951
LEVI ET AL., HEMO 2011
RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500
RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:156.000
HIV transfusion transmission despite NAT testing
Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M.
Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo
Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press
Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV
Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro
Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS.
Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual,
sendo todas negativas.
Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou
soroconversão para HIV e NAT+.
HIV transfusion transmission despite NAT testing
Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M.
Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo
Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press
Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS
DATA
28/09/2012
17/12/2012
ANTI-HIV
NEG
POS
NAT
NEG
POS
CARGA VIRAL
INDETECTÁVEL
39,658 cps/mL
HIV transfusion transmission despite NAT testing
Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M.
Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo
Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press
Número de Cobas MPX
réplicas
N+
Pura
Diluida 1:6
Plasma
Negativo
20
5
1
3
0
0
Procleix
N+
Bio-Manguinhos
N+
13
1
0
0
0
0
CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS
Entre 3.7 – 7.5 UI/mL
Marcadores sorológicos e moleculares
na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático
Anticorpos anti-HIV
DT = 21.5 hrs
“blip” viremia
2nd gen
1nd gen
Infecção
11
0
10
16
20
Antígeno p24
3rd gen
22
30
Infectividade teórica
RNA viral
Antígeno p24
Anticorpos anti-HIV
40
50
Dia 0
Dia 11
Dia 16
Dia 22
60
70
80
90
100
[email protected]