Como a Filogenia pode nos ajudar!!!! Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho [email protected] Considerações importantes Regiões amplificadas sãs as regiões adequadas á pergunda em questão? O PCR esta adequado para a realização de uma reação de sequenciamento? Qualidade da sequência genômica - Ambiguidades (polimorfismos) - “N” nas sequências Qualidade do alinhamento - “gaps”no alinhamento Melhor trabalhar com nucleotideos ou aminoácidos (a região é codificante?)? Análise filogenética - Método - modelo Que sequencias controle usar nas análises !!!!! Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Sempre teremos uma árvore filogenética Mas o resultado é consistente????? Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho objetivos Verificar a transmissão do HIV por transfusão de sangue utilizando análise filogenética de sequencias de DNA do HIV do doador e receptor de sangue de um banco de sangue brasileiro Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos O que levou a estes estudo!!! Em 2009 surgiu a suspeita que uma paciente que havia recebido componentes de sangue numa cirurgia de retirada de cisto de ovário, tivesse recebido algum desses componentes contaminados com HIV A suspeita surgiu quando a paciente reportou, aproximadamente uma semana após a cirurgia, febre, linfoadenopatias e alterações hematológicas Nesta ocasião iniciou-se então a investigação retrospectiva do doador e do seu parceiro... Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Testes realizados - EIA = enzima imunoensaio - WB = wetern Blot - CHHia =Quimioluminescência (prisma) - RT PCR = Real time PCR Nested PCR - envelope = ED5/ED12 e ED31/ED33 - polimerase = DP10/MMRT6 e DP16/MMRT5 Reação de sequenciamento Análises filogenéticas - Distância (Mega4)/ tamura Nei / 1000 réplicas de bootstrap - ML(PHY ML)/ Kimura / 1000 réplicas de bootstrap Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho conclusão Foi observada alta similaridade entre as sequencias genomicas do doador e receptor (Menos de 1% de divergência entre as sequencia nucleotideas) Foi observada maior similaridade entre as sequencias do região pol quando comparado com as sequencias do envelope. Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho objetivos Avaliar a transmissão do HIV entre casais numa: coorte de casais HIV positivos (concordantes), residentes em Dakar no Senegal Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos De maio de 2005 até fevereiro de 2009, pacientes das consultas do ambulatório de HIV do Centro Hospitalar Universitário Fann, em Dakar no Senegal foram convidados a participar do estudo com o seu Parceiro Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados 34 casais – as sequencias agruparam com bootstrap acima de 80% e distância abaixo do cut off (0,04) Estas sequências foram consideradas geneticamente relacionadas 6 casais – as sequencias agruparam mas com bootstrap abaixo de 80% e distância abaixo ou acima do cut off Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas 6 casais – as sequências não agruparam e a distância acima do cut off Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho conclusão A maioria dos casais (concordantes) HIV positivos em Dakar no Senegal mostrou sequencias geneticamente relacionadas Dados epidemiológicos indicam o marido como o provável caso indice, estes dados enfatizam o risco de mulheres casadas em contrair HIV como resultado de relações sexuais ocasionais de seus maridos Compreender as origens e dinâmicas da infecção HIV-1 em casais na África será crucial para o planejamento futuro e sucesso de programas de prevenção do HIV Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho objetivos Acompanhar o padrão de evolução de HIV-1 na Ásia durante o período de 17 anos A actividade biológica e patogenicidade de um dos mais prevalentes subtipos do HIV (subtipo B) na Ásia foi determinada com base nas sequências de HIV-1 do período de 1990 -2007 disponíveis no banco de dados de Los Alamos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Os data sets foram divididos em 4 grupos Grupo I: 1990 – 1994 Grupo II: 1995 – 1999 Gupo III: 2000 – 2004 Grupo IV: 2005 – 2007 Foram realizados dois tipos de análises da proteina do envelope e da alça V3 das sequencias retiradas do banco de Los Alamos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Análises filogenéticas baseadas na proteína do envelope Predição de sitios de glicosilação na proteína do envelope Alinhamento do dominio V3 Análise do “Motif” GPGX Determinação de regiões conservadas da região V3 Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Os clusters B, C, D e E apresentaram divergência e taxas de mutação altas Os clusters A e F exibem forte seleção e permanecem menos divergentes durante estes período Foi observado um aumento de heterogeneidade nas sequencias de envelope na população infectada durante este periodo Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados 60% dos sitios da V3 permanecem conservados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho conclusão A patogenicidade e infectividade do subtipo B do HIV-1 está aumentada e mostrou uma rápida evolução e um mecanismo de modulação Os dados analisados também fornecem informações úteis sobre a vigilância da infecção do HIV-1 na Ásia e destaca o padrão evolutivo de populações de vírus que possam estar sob pressões variadas de seleção durante os diferentes períodos de tempo Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho objetivos Analisar as relações filogenéticas de diferentes regiões do genoma do VHC de amostras de casais portadores crônicos Comparar as sequências genômicas dos casais portadores de VHC com sequências de portadores crônicos, não relacionados, atendidos no mesmo ambulatório Avaliar o grau de similaridade entre as sequências genômicas do VHC dos casais e dos portadores não relacionados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Amostra (Soro) Extração RNA-VHC (QIAamp) Síntese de cDNA com Random Primers 1º e 2º PCR NS5B NS3 1ª estratégia Neg Pos NS3 2ª estratégia Pos Reação de sequenciamento Neg Excluído das análises Excluídos desta análise de NS3 Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Reação de sequenciamento Alinhamento das seqüências da região NS5B com seqüências do GenBank e seqüências controle Alinhamento das seqüências da região NS3 com seqüências do GenBank e seqüências controle Purificação após reação de sequenciamento Gel de sequenciamento Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5B com seqüências do GenBank e seqüências controle Seqüências da região NS5B e NS3 Validação das seqüências Montagem da seqüência consenso (Phred-Phrap- Consed) Alinhamento das seqüências de cada região com seqüências do GenBank e seqüências controle (Clustal X) Genotipagem e Subtipagem Análise do Sinal Filogenético Construção das topologias das árvores filogenéticas das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Tabela 1 - Características dos pacientes (casais) selecionados (dados obtidos de prontuário) Casal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade** Risco Prof. Tatoo Acupuntura F 3 28/8/1963 Sim Não Não Não Não Não M 3 4/1/1960 Não Não Não Não Não Sim F 3 30/7/1971 Não Não Não Não Não Não M 3 22/11/1952 Sim Não Não Não Sim Não F 1 6/7/1942 Não Sim/1975 Não Não Não Sim M 1 S/Inf* Não Não Não Não Não Sim F 1 15/8/1958 Não Não Não Não Não Não M 1 4/6/1955 Sim Não Sim Não Não Não F 1 16/6/1954 Não Não Não Não Não Não M 1 29/5/1945 Não Não Não Sim Não Não F 1 19/6/1957 Não Sim/1984 Não Não Não Sim M 1 13/2/1949 Não Não Não Não Não Sim F 3 5/8/1962 Não Não Não Sim Sim Não M 3 29/12/1963 Não Não Não Sim Não Não F 1 S/Inf* Não Não Não Não Sim Não M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Sim Não F 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* M 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Tabela 2 – Características pacientes controle (dados obtidos de prontuário) Controle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof. Tatoo Acupuntura 6947 M 1 1981 Não Sim/1981 Não 6681 F 1 1962 Não Não Não Não Sim Não Não Não 8090 F 1 1944 Não Não Não Não Não Não 6625 M 1 1957 Não Não Não Não Não Não 7152 M 1 1951 Sim Não Não Sim Sim Sim Não 10248 F 1 1963 8217 M 1 1966 Não Sim/1986 Não Não Não Sim Não Sim/várias Não Sim Não Não 7954 M 1 1961 7017 M 1 1954 Não Não Não Não Não Não Não Sim/1978 Não Não Não 9089 M 1 Não 1967 Sim Não Sim Não Sim 8399 F Sim 1 1963 Não Sim/1988 Não Não Não Não 10402 8432 F 1 1941 Não Sim/1975 Sim Não Não Não F 1 1968 Não Não Não Não Não Não 10355 M 1 1956 Não Não Sim Não Sim Não 7322 F 1 1952 Não Não Não Não Não Não 7879 F 1 1936 Não Sim/1971 Não Não Não Não 7918 F 1 1940 Não Não Não Sim Não Não 7910 M 1 1972 Não Não Não Sim Não Não 6887 7733 F M 1 1 1931 1952 Não Não Sim/1983 Sim/1974 Não Não Não Não Não Não Não Não 10187 M 1 1955 Não Sim/1976 Sim Não Não Não 6611 M 1 1934 Não Não Não Não Não Não 10323 M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Não Não 6874 M 1 1956 Não Sim/1975 Não Não Não Não 5772 M 1 1949 Não Não Sim Não Não Não 6602 F 1 1977 Não Não Não Não Não Não 10371 M 1 1943 Não Sim/1966 Não Sim Não Não 7692 M 1 1975 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Material & Métodos Tabela 2 - Características dos pacientes controle (dados obtidos de prontuário) (continuação) Controle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof. Tatoo Acupuntura 10180 M 1943 Sim Sim/1980 Não Não Não Não 7647 M 1939 Não Sim/1978 Sim Não Não Não 7826 F 1938 Não Sim/1992 Não Não Não Não 10654 F 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1952 Não Não Não Não Não Não 1930 Não Não Não Não Não Não 1958 Não Sim/1978 Não Não Não Não 1954 Não Sim/1963 Não Não Não Não 1961 Não Sim/1981 Não Não Não Não 1964 Não Sim/1990 Não Não Sim Não 1968 Não Não Não Não Não Não 1951 Não Sim/1975 Não Não Não Não 10831 F 7185 M 8319 M 8487 M 7244 M 7748 M 10709 F 10749 F 10698 M 10173 F 1939 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* 1960 Não Não Não Não Sim Não S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Análise do sinál filogenético A B NS5B 199nt (77 seq) NS5B 344nt (77 seq) C NS3 619nt (72 seq) D NS3/NS5B 960nt (72 seq) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Variabilidade nucleotidica Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos casais Região NS5B entre 78,2% e 99,1% (média de 95,45%) Região NS3 entre 94,7% e 99,2% (média de 97,24%) Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos controles locais e sequências do Genbank Região NS5B entre 53,9% e 98% (média de 72,9%) Região NS3 entre 61% e 98,2% (média de 74,8%) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Análise filigenética das regiões NS3/NS5B A NS3/NS5B MV TBR TrN+I+G (Bootstrap=1000 réplicas) A B B C C Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Análise filigenética das regiões NS3/NS5B (Com controles) A NS3/NS5B MV TBR A B TrN+I+G (Bootstrap = réplicas) C B C Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Análise filigenética da regiãoNS5B (Com controles) A B A C B NS5B MV TBR TrNef+I+G C (Bootstrap = 1000 réplicas) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Resumo das análises das árvores filogenéticas (sem controle) Análises sem controles Familiares NS5b Similaridade NS3 Bootstrap*** Distância MV NS3/NS5b Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? ? ** MO MO CF02 97,4% ** ? MO 99,2% ** ? ? ** MO MO CF03 97,1% ** ? ? 94,7% ** ? ? 99 MO MO CF04 97,7% 98 MO MO NR NR NR NR NR NR NR CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO CF06 97,7% 72 ? MO 97,0% 100 MO MO 100 MO MO CF07 97,7% 73 MO MO 97,4% ** MO MO 81 MO MO CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 94 MO MO 100 MO MO CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70) MV = Máxima Verossimilhança ? = Não apresentam ramo monofilético NR = Não Realizado ** = Sem bootstrap significativo (<70) *** = Valores acima de 70 Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Resultados Resumo das análises das árvores filogenéticas (com controle) Análises com controles Familiares NS5b NS3 NS3/NS5b Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? MO ** ? MO CF02 97,4% ** ? MO 99,2% 79 ? MO ** ? MO CF03 97,1% ** ? ? 94,7% 88 MO MO 94 MO MO CF04 97,7% 89 MO MO NR NR NR NR NR NR NR CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO CF06 97,7% ** ? MO 97,0% 99 MO MO 99 MO MO CF07 97,7% ** MO MO 97,4% ** MO MO 73 MO MO CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 91 MO MO 98 MO MO CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70) MV = Máxima Verossimilhança ? = Não apresentam ramo monofilético NR = Não Realizado ** = Sem bootstrap significativo (<70) *** = Valores acima de 70 Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho conclusão A escolha da região genômica e do método de análise filogenética a ser utilizado são importantes para a precisão dos resultados Os dados de prontuário juntamente com as análises moleculares indicam que a origem dos vírus dos casais 8, 7, 6, 3 e 4 seja a mesma, dando suporte à hipótese de transmissão intrafamiliar Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho conclusão A inclusão dos controles nas análises mostrou-se relevante para a confirmação dos resultados Dados como similaridade de sequências não são suficientes para inferir mesma fonte de transmissão Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho