PAPEL DA DIPEPTIDIL PEPTIDASE
IV NA REABSORÇÃO DE SAIS E
ÁGUA EM TÚBULO RENAL
Adriana Castello Costa Girardi
Sequência da Aula
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
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
Visão Geral da Função Renal
Isoforma 3 do Trocador Na/H (NHE3)
Dipeptidil Peptidase IV (DPPIV)
Modulação do NHE3 pela DPPIV
DPPIV e Função Renal
Novas linhas de investigação
Principais Funções dos Rins no Organismo
 Regulação da osmolaridade e do volume dos fluidos
corporais;
 Regulação do balanço eletrolítico;
 Regulação do balanço ácido-base;
 Excreção dos produtos metabólicos e substâncias
exógenas;
 Produção e secreção de hormônios.
A Unidade Funcional dos Rins é o Néfron.
Túbulo Proximal
1,5 L/dia
Modelo Proposto NHEs
NHE3
Filtrado Glomerular
Célula de túbulo
proximal
3Na+
2K+
Na+
NHE3
H+
HCO3HCO3-
+
Na+
H2CO3
H+
H2O + CO2
a.c.
a.c.
3 HCO3-
NaCl
NaHCO3
CO2 + H2O
Cl-
Na+
H2O
3Na+
NHE3
HÂnion
Capilar peritubular
2K+
H+
Hânion
Ânion
Cl-
Cl-
Cl-
+
Circulação
sistêmica
NHE3 – knockout mice
Hipovolemia
Hipotensão
Acidose Metabólica
Schultheis PJ et al Nature Genetics, 1998.
Modulação Pós-Tradução do Trocador
NHE3
 Fosforilação direta do trocador NHE3 por
PKA (S552 e S605);
 Translocação entre os sub-compartimentos da
membrana apical;
 Interação com outras proteínas formando um
complexo funcional.
Atividade NHE3-OKP
WB Fosforilação NHE3-OKP
Translocação do NHE3 entre os subcompartimentos da membrana apical
Leong PK et al, AJP Renal 2006.
MET-LYS-THR-PRO-X-LYS-VAL-LEU-LEU-GLY
Dipeptidil Peptidase IV (CD26)
…
NH2
Pro
Ala
 Peptídeos envolvidos na homeostase da
glicose:
 Peptídeo glucagon like 1 (GLP-1),
 Peptídeo glucagon like 2 (GLP-2),
 Peptídeo insulinotrópico dependente de
glicose (GIP)
 Peptídeos pancreáticos:
 Peptídeo YY
 Neuropeptídeo Y;
 Substância P;
 Quimiocinas.
Protease Extracelular mCAP1 Aumenta
Probabilidade de Abertura do ENaC
Effect of mCAP on INa in oocytes. Oocytes were injected with Xenopus
(left), rat (middle), and human (right) ENaC subunits in the presence of
mCAP1 (filled bars) or water (open bars). (Vuagniaux et al., JASN 2000)
Estudos in vivo: Objetivos
 Avaliar se a DPPIV, em virtude de sua associação
física com o trocador NHE3, modula a atividade deste
transportador túbulo proximal de rato;
 Avaliar as possíveis conseqüências fisiológicas desta
modulação, ou seja alterações do balanço ácido-base
e/ou da homeostase do NaCl.
Modelo Experimental
 Ratos Wistar machos (190-230g) receberam injeção
intraperitoneal de 60 mg/kg/dia de Lys[Z(NO2)]pyrrolidide (I40) durante 7 dias.
 Grupo controle: Ratos Wistar machos (190-230g)
receberam injeção injeções i.p. contendo um análogo
inativo do inibidor I40, Lys[Z(NO2)]-OH.
Medida da atividade catalítica da enzima dipeptidil
peptidase IV (DPPIV) e da (gama-GTP) em tecido renal
de ratos
mU/mg protein
400
300
200
100
*
0
CTRL
DPPIV
I40
CTRL
I40
gamma-GTP
Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do
trocador NHE3 em preparação de vesículas de membranas
microvilares de túbulos proximais (MMV)
Na uptake
(pmol/mg/15s)
2500
2000
1500
*
1000
500
EI
PA
I4
0
+
I4
0
C
TR
L
+
C
TR
EI
PA
L
0
Em comparação com o grupo controle, a atividade de NHE3 encontrase significativamente diminuída (~45%) em ratos que receberam I40
por sete dias.
Na dependent PO 4 uptake
(pmol/mg/10s)
Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do
co-transportador Na/Pi, NaPi-2, em preparação de
vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais
1000
800
600
400
200
0
CTRL
I40
Relative Abundance of NHE3
(Arbitrary Units)
Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão
de NHE3 em preparação de vesículas de membranas
microvilares de túbulos proximais (MMV)
Animais
tratados
com
inibidores
da
DPPIV
demonstraram uma redução
de (~48)% na expressão
relativa de NHE3 em MMV
em comparação com animais
controle.
500
400
300
*
200
100
0
CTRL
I40
Relative Abundance of NHE3
(Arbitrary Units)
Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão
total de NHE3 em membranas de córtex renal
200
*
150
100
50
0
CTRL
I40
I40 causa ~13% de
diminuição de NHE3
total.
Inibidor da DPPIV (I40) provoca translocação do
trocador NHE3 de membranas microvilares para o
domínio intermicrovilar
AP-2
Vilina
3
4
5 6
IMV
7
500
DV-NHE3 Abundance
(Arbitrary Units)
1 2
MMV
*
400
300
200
100
0
CTRL
I40
Sumário
 A inibição da atividade catalítica da DPPIV está
associada com a inibição da atividade do trocador
NHE3 em túbulos proximais renais de ratos.
 Esta inibição ocorre principalmente em decorrência da
redução na abundância de NHE3 em membrana apical;
 Mecanismo: translocação do NHE3 da superfície
microvilar da membrana apical para o domínio
intermicrovilar das vesículas revestidas de clatrina.
Peso Corporal, Consumo de Ração e Água e
Concentração de Eletrólitos no Plasma
CTRL
I40
P value
(n = 20)
(n = 20)
Initial Body Weight (g)
218.5 ± 7.8
221.9 ± 7.8
0.7592
Final Body Weight (g)
235.5 ± 7.4
225.2 ± 7.5
0.2308
Weight Gain (%)
8.0 ± 0.9
3.0 ± 0.8*
< 0.0001
Food Intake (g/ day)
20.3 ± 1.3
18.8 ± 1.6
0.4986
Water Intake
(mL/day)
40.5 ± 4.0
44.91 ± 4.0
0.4487
Plasma Na+ (mM)
147.7 ± 2.3
145.3 ± 2.4
0.4870
Plasma K+ (mM)
4.37 ± 0.09
4.21 ± 0.15
0.3741
Plasma Creatinine
(mg/dL)
0.38 ± 0.03
0.44 ± 0.02
0.1243
Efeito da inibição da atividade catalítica da DPPIV
sobre o fluxo urinário
Urine Output
mL/24 hours kg-1
60
*
50
40
30
20
10
0
CTRL
I40
52% Aumento do Fluxo Urinário I40 vs. CTRL, n = 20.
Creatinine Clearance
mL min-1 kg-1
1.5
1.0
RFG: 16% I40 vs. CTRL, n =
20, P = 0.1029.
0.5
0.0
CTRL
I40
FE Na+ (%)
1.0
*
0.5
52% I40 vs. CTRL, n = 8.
0.0
CTRL
I40
Observa-se uma tendência à queda da PAS (5%) e PAD (6%) em ratos
tratados com I40, porém esta redução não é significativa.
Efeito do Inibidor da DPPIV sobre o Balanço
Ácido-Base
CTRL
I40
P value
(n = 16)
(n = 16)
Plasma pH
7.35 ± 0.01
7.32 ± 0.01
0.0530
Plasma HCO3- (mM)
22.20 ± 0.51
20.46 ± 0.67
0.0627
Plasma pCO2 (mm
Hg)
43.14 ± 1.93
39.50 ± 1.09
0.1457
Urine pH
5.66 ± 0.05
6.36 ± 0.10*
< 0.0001
Urine HCO3- (mM)
0.33 ± 0.21
5.33 ± 0.74*
0.0001
FE HCO3- (%)
0.06 ± 0.03
0.85 ± 0.14*
0.0004
Sumário
 Inibição da atividade catalítica da DPPIV causa diurese e
natriurese em ratos.
 Não há variação significativa do RFG em ratos tratados com I40
vs. controle.
 Ratos tratados com I40 podem apresentar acidose metabólica
moderada.
 Ocorre uma tendência à redução da MAP em ratos normotensos
tratados com I40, mas esta redução não é significativa.
 O menor ganho de peso em animais tratados com I40 em relação
ao grupo controle pode ser em parte devido a maior eliminação
de sódio e água ocasionada pela inibição da atividade da DPPIV.
Bases Moleculares: Modulação de NHE3
por DPPIV
 Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV
inibem a atividade de NHE3?
 Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor
de NHE3.
 Qual a identidade deste peptídeo?
 Será que este inibidor age diretamente ou por meio
de segundos mensageiros?
Bases Moleculares: Modulação de NHE3
por DPPIV
 Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV
inibem a atividade de NHE3?
 Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor
de NHE3.
 Qual a identidade deste peptídeo?
 Será que este inibidor age diretamente ou por meio
de segundos mensageiros?
Bases Moleculares: Modulação de NHE3
por DPPIV
 Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV
inibem a atividade de NHE3?
 Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor
de NHE3.
 Qual a identidade deste peptídeo?
 Será que este inibidor age diretamente ou por meio
de segundos mensageiros?
Correlação entre os aspectos estruturais e funcionais do
complexo NHE3-DPPIV: Identificação das proteínas acessórias
que fazem parte deste complexo protéico em túbulo proximal
renal.
220
116
Identificação MaldiTOF:
97
45
Miosina IIa
GST fpDPPIV fpNHE3 fpNHE3
(295-491) (702-756) (757-829)
Modelo Proposto: Modulação de NHE3 por
DPPIV
GLP1
GLP1
DPPIV
GLP1R
NHE3
MIIa
Daniel Biemesderfer
Florence J. Wu
Gerhard Malnic
Lívia E. Fukuda
Luciana V. Rossoni
Lisete C. Michelini
Luciene R. C. Lacroix
Nancy A. Rebouças
Peter S. Aronson
Robert B. Thomson