UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
Pró – Reitoria de Pesquisa e de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação Stricto sensu
Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos
LUIZ GUSTAVO LACERDA
USO DE TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS NA CARACTERIZAÇÃO DA
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA PARCIAL DE AMIDOS DE MATÉRIASPRIMAS TROPICAIS
PONTA GROSSA
2006
LUIZ GUSTAVO LACERDA
Uso de técnicas termoanalíticas na caracterização da hidrólise enzimática
parcial de amidos de matérias-primas tropicais.
Dissertação apresentada como um dos
requisitos para a obtenção do título de
mestre em Ciência e tecnologia de
alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Egon Schnitzler
Co-orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio da
Silva Carvalho Filho
PONTA GROSSA
2006
LUIZ GUSTAVO LACERDA
USO DE TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS NA CARACTERIZAÇÃO DA
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA PARCIAL DE AMIDOS DE MATÉRIASPRIMAS TROPICAIS.
Dissertação apresentada como um dos requisitos para a obtenção do título de mestre em
Ciência e tecnologia de alimentos.
Ponta Grossa, 09 de Fevereiro de 2006.
Prof. Dr. Massao Ionashiro- UNESP ( Araraquara)
Prof. Dr. Egon Schnitzler – UEPG
(Orientador)
Prof. Dr. Marco Aurélio da Silva Carvalho Filho- UnicenP
(Co-orientador)
Profa. Dra. Neiva Deliberali Rosso – UEPG
(Membro)
PONTA GROSSA
2006
À minha namorada Renata pela
demonstração de amor e aos
Professores
Marco
Aurélio
(Nérso) e Egon pelo exemplo de
vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me acompanhado nesta jornada e por ter me amparado nos momentos mais
difíceis.
Ao Professor Doutor Marco Aurélio da Silva Carvalho Filho, quem eu considero um pai.
Ao Professor Doutor Egon Schnitzler pelo apoio irrestrito nestes últimos três anos, ao
Professor Doutor Gilvan Wosiacki e Professor Doutor Ivo Mottin Demiate pelo exemplo a
ser seguido.
Ao Centro Universitário Positivo - UnicenP que possibilitou a execução deste trabalho.
Ao Professor Doutor Carlos Ricardo Soccol e Professora Doutora Luciana Vandenberghe da
Universidade Federal do Paraná pela confiança e oportunidade de poder continuar
aprendendo.
Ao Professor Dr. Alan Riga (Cleveland State University).
Ao extinto Alltech Alcohol Institute (Lexington, Ky) e à Tammy Geyer.
Ao Professor Doutor Sayiavit Varavinit (Mahidol University - Tailândia) pela ajuda na
pesquisa em análise térmica e Professor Doutor Thava Vasanthan (Canadá) pelos
esclarecimentos sobre enzimas
À Engenheira de alimentos Priscila Porto que nunca mediu esforços para esclarecer minhas
dúvidas relacionadas aos cereais.
À Unesp de Araraquara, ao Professor Doutor Massao Ionashiro e ao Doutorando Gilbert
Bannach pelas análises de difração por raios-X.
À Unesp de São José do Rio Preto e à Professora Doutora Célia Maria Landi Franco pelo
apoio incondicional na análise térmica e à Professora Doutora Marney Cereda pela ajuda.
Aos colegas de mestrado,especialmente à minha querida amiga Luciana Matsuguma.
Aos Professores Doutorandos Pedro Vicente Michelotto Jr. e Jayme Azevedo pelo incentivo
a pesquisa.
À, minha mãe, meu pai e Nina que por toda vida me apoiaram.
À CAPES pelo suporte financeiro.
A todos que, de alguma forma, contribuíram de alguma forma para a realização deste
trabalho.
Especialmente aos escritores Eduardo Galeano, Aldous Huxley, Isaac Asimov que há muito
me ensinam a sonhar e lutar para um mundo melhor.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
12
2
OBJETIVOS
14
2.1
OBJETIVOS GERAIS
14
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
14
3
REVISÃO
15
3.1
AMIDO
15
3.2
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO AMIDO.
16
3.2.1
Amilose
17
3.2.2
Amilopectina.
18
3.2.3
Outros constituintes
19
3.2.4
Estrutura granular
20
3.3
AMIDO DE MILHO
20
3.4
AMIDO DE MANDIOCA
21
3.5
USO DE AMIDOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
22
3.6
GELATINIZAÇÃO
22
3.7
HIDRÓLISE DE AMIDOS
23
3.8
ENZIMAS
23
3.8.1
Enzima α-amilase.
24
3.9
PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE.
25
3.9.1
Hidrólise do amido granular
26
3.9.1.1
Determinação de açúcares redutores
26
3.9.1.2
Determinação de glicose
27
3.9.2
Microscopia
27
3.9.3
3.9.4
Difratometria de Raios X
Técnicas termoanalíticas
27
29
3.9.4.1
Termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG)
30
3.9.4.2
Análise térmica diferencial (DTA) e Calorimetria exploratória diferencial
(DSC)
34
4
MATERIAL E MÉTODOS.
36
4.1
MATERIAL.
36
4.1.1
Matéria-prima
36
4.2
MÉTODOS
36
4.2.1
Hidrólise parcial enzimática
36
4.2.2
Hidrólise do amido granular
39
4.2.2.1
Determinação de glicose
39
4.2.2.2
Determinação de açúcares redutores
39
4.3
MICROSCOPIA
39
4.4
DIFRATOMETRIA POR RAIOS X
40
4.5
TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS
40
4.5.1
Calibração do equipamento TG 60
40
4.5.2
Calibração do equipamento DSC 60
42
4.5.3
Termogravimetria
43
4.5.4
Calorimetria Exploratória Diferencial
43
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
44
5.1
PRODUTOS DA HIDRÓLISE GRANULAR
44
5.2
MICROSCOPIA..
46
5.3
DIFRATOMETRIA DE RAIOS X
49
5.4
TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS.
56
5.4.1
Termogravimetria
56
5.4.2
Calorimetria Exploratória Diferencial
64
6
CONCLUSÃO
71
REFERÊNCIAS
73
LISTA DE ILUSTRAÇOES
Figura 1
Estrutura química da amilose
17
Figura 2
Representação da estrutura helicoidal da amilose.
18
Figura 3
Estrutura química da amilopectina, ilustrando as ligações α-1,4 e α-1,6 e a
19
estrutura geral da molécula
Figura 4
Representação de uma curva termogravimétrica
31
Figura 5
Representação das curvas TG-DTG
32
Figura 6
Diagrama de bloco de uma termobalança
33
Figura 7
Fluxograma representativo do preparo das amostras para a hidrólise parcial
enzimática e respectivas análises
38
Figura 8
Percentuais de glicose e açúcar redutor pós-hidrólise (■) 1 hora, (■) 2
horas e (■) 3 horas.
45
Figura 9
Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amido de
46
milho nativo em aumentos de (a) 400 e (b) 1000X
Figura 10
Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amido de
mandioca nativo em aumentos de (a) 400 e (b)1000X
47
Figura 11
Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amido de
mandioca nativo em aumentos de (a) 400 e (b)1000X.
48
Figura 12
Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amidos
de (a) milho e (b) mandioca hidrolisados durante 3 horas em aumentos de
1000X
48
Figura 13
Curva de difração de raios X do amido de milho nativo
50
Figura 14
Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por uma hora
50
Figura 15
Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por duas horas 51
Figura 16
Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por três horas
52
Figura 17
Curva de difração de raios X do amido de mandioca nativo
53
Figura 18
Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por uma
hora
53
Figura 19
Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por duas
horas
54
Figura 20
Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por três
horas
55
Figura 21
Comportamento térmico do amido nativo de milho (-) TG e (...) DTA
Figura 22
Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por uma hora (-)
TG e (...) DTA
58
Figura 23
Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por duas horas (-)
TG e (...) DTA
58
Figura 24
Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por três horas (-)
TG e (...) DTA
59
Figura 25
Comportamento térmico do amido de mandioca nativo (-) TG e (...) DTA
Figura 26
Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por uma hora
(-) TG e (...) DTA
60
Figura 27
Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por duas horas
(-) TG e (...) DTA
61
Figura 28
Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por três horas
(-) TG e (...) DTA
61
Figura 29
Curvas de termogravimetria derivada para o amido de milho (─) nativo,
hidrolisado por: (─) 1hora, (─) 2 horas e (─) 3 horas
63
Figura 30
Curvas de termogravimetria derivada para o amido de mandioca (─)
64
nativo, hidrolisado por: (─) 1hora, (─) 2 horas e (─) 3 horas
Figura 27
Curva de gelatinização do amido de milho nativo
66
Figura 28
Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por 1 hora
66
Figura 29
Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por 2 horas
67
Figura 30
Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por 3 horas
67
Figura 31
Curva de gelatinização do amido de mandioca nativo
68
Figura 32
Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 1 hora
68
Figura 33
Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 2 horas
69
Figura 34
Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 3 horas
69
57
60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Percentuais de glicose e açúcar redutor durante a hidrólise
45
Tabela 2
Avaliações das curvas termogravimétricas do amido de milho nativo e
durante a hidrólise.
57
Tabela 3
Avaliações das curvas termogravimétricas do amido de mandioca nativo
e durante a hidrólise.
59
Tabela 4
Temperatura do início do processo, pico e valores de entalpia para
amidos de milho (a) e mandioca (b)
65
RESUMO
As propriedades dos grânulos de amido milho e mandioca parcialmente hidrolisados por α-amilase
fúngica foram investigadas utilizando-se de técnicas termoanalíticas (TG, DTG, DTA e DSC) os
produtos de hidrólise, microscopia e difratometria de raios X. Durante a avaliação dos resultados
das técnicas empregadas, foram observadas alterações estruturais através do tempo de ação
enzimática, especialmente na comparação do estado nativo ao estado final da hidrólise. Os
resultados obtidos mostram particularidades da origem botânica do amido e de suas mudanças
físico-químicas devidas ao tratamento. Observou-se um aumento progressivo dos produtos de
hidrólise (açúcares redutores e glicose). Os resultados da difratometria de raios X sofreram
alteração em função da atuação enzimática. Os resultados da análise térmica mostraram a
higroscopicidade, a estabilidade térmica característica dos amidos e caracterizaram a gelatinização
durante o processo de hidrólise. O teor de amilose, a proporção das cadeias laterais da amilopectina
e a morfologia de cada fonte vegetal foram fundamentais para justificar os resultados obtidos.
Palavras-chave: amido, enzima, hidrólise, análise-térmica.
ABSTRACT
Corn and cassava starches partially hydrolyzed by fungal α-amylase were investigated using
thermal analysis (TG, DTG, DTA, DSC) hydrolysis products, microscopy and X ray diffratometry.
During the results evaluation of techniques used, structural changes were observed during enzyme
action, specially when compared starch native state and final state of hydrolysis. It had been
observed a progressive rise of hydrolysis products (reduction sugars and glucose) values. X ray
diffraction results suffered modifications due to the enzyme action. Os resultados da Thermal
analysis results showed hirgroscopicity, starch thermal stability and characterization of
gelatinization during the process. The results obtained showed starch source particularities and their
physico-chemical changes due to the treatment. Amylose contents, amylopectin branched chains
proportionalities and the starch morphology of the starches were fundamentals for justifying
obtained results.
Key-words: starch, enzyme, hydrolysis, thermal-analysis.
1 INTRODUÇÃO
As colheitas à base de amidos formam um importante constituinte na dieta humana
e um grande número de alimentos consumidos pela população mundial originam deles. O
amido é utilizado diretamente ou processado por meios químicos ou enzimáticos para
originar vários produtos desta transformação. Dependendo da fonte botânica e da
natureza, pode ser usado para fornecer textura, servir como espessante, proteger os
alimentos durante o processamento, entre outras funções. Assim, sua aplicação está
diretamente ligada às suas propriedades físico-químicas pertinentes à sua fonte botânica
(SMITH, 1982; VAN DER MAAREL et al., 2002). A produção de plantas amiláceas supre
aproximadamente 4/5 da demanda mundial de alimentos em termos de calorias
(EDUARDO, 2002).
Apesar de haver um grande número de plantas hábeis a serem fontes de amidos,
apenas poucas têm importância industrial: o milho, a mandioca, a batata e o trigo. O
amido de milho, por exemplo, é responsável por mais de 80% do mercado mundial de
amidos e a maior produção se encontra nos Estados Unidos (JOBLING, 2004).
O Brasil é um país essencialmente agrícola onde a biotecnologia torna-se um
potencial não apenas no tratamento residual de agro-indústrias, mas também no valor
agregado dos cultivos (SOCCOL;VANDENBERGHE, 2002). No Brasil, os amidos mais
isolados industrialmente são os amidos de milho e mandioca (KARAM, 2003).
De acordo com Contiero;Novy (1993), sendo de ampla utilização na indústria, o
amido apresenta a necessidade de definição de suas propriedades tecnológicas, pois seu
emprego é função das mesmas.
O conhecimento da estrutura dos grânulos deste polímero é importante para o
entendimento de suas propriedades físico-químicas, as quais determinam o seu
comportamento nos mais diversos processos industriais (PERONI, 2003).
Desde meados do século XX, a indústria tem se empenhado em processar amidos
em larga escala. A descoberta de preparações enzimáticas capazes de decompor o
amido em glicose, incentivou a substituição da hidrólise ácida para a hidrólise enzimática
(ENZIMAS, 2004; VAN DER MAAREL et al., 2002). De acordo com Kandra (2003) a
hidrólise enzimática de amidos, tem ocupado lugar da hidrólise ácida em mais de 75%
dos processos devido a várias vantagens incluindo seu alto rendimento.
O mercado mais expressivo para a α-amilase converge a produção de amidos
hidrolisados como a glicose e a frutose. O amido é convertido em xarope de glicose e
frutose. Por sua propriedade adoçante, é utilizado em grande quantidade em indústrias de
bebidas na produção de refrigerantes. A utilização de enzimas na hidrólise de amidos está
sendo amplamente pesquisada (GUPTA et al. 2003).
A indústria de panificação, por exemplo, é uma grande consumidora tanto de
amidos quanto de enzimas transformadoras de amidos. A enzima α-amilase gera
compostos fermentáveis, elevando o poder fermentativo, melhora cor, também exerce um
efeito de preservação, estendendo a vida de prateleira além de incrementar a maciez de
produtos panificados. Nos EUA, por exemplo, anualmente há um prejuízo de mais de U$
1 Bilhão com pães envelhecidos (GUPTA et al., 2003; VAN DER MAAREL et al., 2002).
Este trabalho objetivou caracterizar e acompanhar, através de técnicas
termoanalíticas e outras, a hidrólise enzimática parcial de amidos de milho e mandioca.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo deste trabalho foi caracterizar a hidrólise parcial enzimática utilizando-se
de α-amilase fúngica purificada produzida por fermentação submersa de uma cepa
selecionada de Aspergillus oryzae em amidos de milho e mandioca comerciais, tendo
como complemento, técnicas que possam auxiliar no entendimento da alteração estrutural
dos grânulos, durante a atuação da enzima.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Especificamente, o trabalho objetivou:
- A verificação e quantificação de açúcares redutores e glicose.
- Confirmar, por microscopia, a morfologia característica e a atuação enzimática nos
grânulos de amido e mandioca.
- Através de técnicas termoanalíticas, quantificar a energia proporcional envolvida na
gelatinização dos amidos durante a hidrólise, além de fornecer dados de sua estabilidade
térmica e decomposição.
3 REVISÃO
3.1 AMIDO
É a substância de reserva para a maioria das plantas superiores e constitui fonte
de energia essencial para muitos organismos, especialmente o homem. O amido é a
substância que proporciona de 70 a 80% das calorias consumidas pelos seres humanos.
As mais importantes fontes potenciais do amido são os grãos de cereais (40 a 90% do
seu peso seco), legumes (30 a 70% do seu peso seco) e os tubérculos (65 a 85% do seu
peso seco). O amido, na natureza, se encontra como grânulos ou grãos. Estes são
relativamente densos ou insolúveis e se hidratam deficientemente em água fria. Apesar
disso,
ao
aquecer
uma
suspensão
com
5%
de
amido
não-modificado
até
aproximadamente 80 °C, com agitação, se produz uma alta viscosidade (FENNEMA,
2000).
No Brasil, estes polissacarídeos de reserva são comumente designados como
féculas e amidos. Esta distinção foi adotada para identificar onde o material é encontrado
na natureza. Assim, as féculas são provenientes de partes subterrâneas das plantas
(mandioca, batata, etc.) enquanto que os amidos, são obtidos das partes aéreas (milho,
trigo, sorgo, etc.). Em relação às propriedades gerais, utiliza-se amido indistintamente
(CIACCO; CRUZ, 1982; KARAM, 2003).
O amido apresenta características físico-químicas e qualidade nutricional
superiores quando comparado a outros carboidratos (PERONI, 2003). Uma característica
marcante do amido quando utilizado na indústria alimentícia é sua versatilidade: é
possível transformar o material para que se obtenham propriedades específicas para
conferir funcionalidade desejável ao alimento. O grão de amido pode ser facilmente
isolado através de procedimentos físicos e devido à sua abundância, o que possibilitou o
desenvolvimento de unidades de processamento industrial de grande capacidade
(PASSOS, 2002).
3.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO AMIDO
Cada amido possui identidade própria e tendo isso reconhecido, a pesquisa e
desenvolvimento de novos produtos têm caminhos abertos. A composição do amido
influencia diretamente em suas propriedades funcionais. Devido às diferenças estruturais
dos diversos tipos de amidos, não se pode generalizar nada sobre propriedades e
comportamentos dos amidos de diferentes fontes botânicas (VIEIRA, 2004). O amido,
que se apresenta na forma de grânulos, é essencialmente composto por dois tipos de
polímeros de glicose. De acordo com Freitas (2004) a glicose, é composta de uma cadeia
de 6 átomos de carbono ligados a 6 átomos de oxigênio e a 12 átomos de hidrogênio. A
fórmula química que representa esta molécula é C6H12O6, que juntamente com a frutose
representam os principais monossacarídeos encontrados em sua forma livre nos
alimentos.
As duas principais entidades químicas formadoras do amido são conhecidas por
amilose e amilopectina. Estas estruturas são responsáveis por aproximadamente 98% do
amido em peso seco, sendo que o teor de cada polissacarídeo depende da fonte botânica
em questão (TESTER; KARKALAS; QI, 2004). A disposição destas identidades químicas
dentro do grânulo de amido ainda não é completamente compreendida, no entanto, o
empacotamento de ambas é muito bem organizado. Além disso, o conteúdo destes
polissacarídeos afeta a arquitetura do grânulo, as propriedades térmicas, podendo afetar
sua aplicação em alimentos industrializados.
3.2.1 Amilose
A amilose é um polímero consistindo de mais de 6000 unidades de D-glicose com
α- 1,4 ligações glicosídicas (Figura 1).
Figura 1 - Estrutura química da amilose.
(Fonte: JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999).
Apesar da consideração que a amilose é essencialmente linear, atualmente é
evidenciado que a amilose não assume completamente esta característica (KARIM,
NORIZAH, SEOW; 2000). BULEÓN et al. (1998) comentam que a presença de
ramificações não alterou o comportamento em solução das cadeias de amilose,
permanecendo idêntico ao comportamento das cadeias completamente lineares. O teor
médio de amilose que o amido contém pode variar de quase zero a aproximadamente
75%. No entanto, o valor típico fica entre 20 e 25%.
Na forma cristalina, a molécula de amilose tem uma conformação helicoidal (Figura 2)
Esta hélice, devido à conformação das unidades de glicose, tem um interior hidrofóbico.
Esta estrutura helicoidal propicia a formação de um complexo de cor azulada com o iodo,
desde que a cadeia seja suficientemente longa, com pelo menos 40 unidades de glicose.
Isto ocorre devido à inserção de uma cadeia linear de iodo-iodeto no interior da hélice. Na
presença de cadeias menores de amilose, o complexo se apresenta na cor vermelha,
amarela ou marrom (BIOQUIMICA, 2001; CIACCO; CRUZ, 1982; GUPTA et al., 2003).
Figura 2 – Representação da estrutura helicoidal da amilose.
(Fonte: CEREDA; VILPOUX, 2003- Adaptado)
3.2.2 Amilopectina
A amilopectina é uma macromolécula altamente ramificada (Figura 3) e consiste
em cadeias lineares mais curtas de ligações α-1,4 contendo 10 a 60 unidades de glicose
e cadeias laterais de ligação α-1,6 com 15 a 45 unidades de glicose (VAN DER MAAREL
et al., 2002).
Esquematicamente, como pode ser observado na estrutura geral da molécula
(Figura 3), a amilopectina consiste de uma cadeia principal que possui o grupo redutor e
numerosas cadeias ramificadas. As ramificações ocorrem por conta das ligações
glicosídicas α-1,6.
FIGURA 3 - Estrutura química da amilopectina, ilustrando as ligações α-1,4 e α-1,6 e a estrutura geral da
molécula.
(Fonte: JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999).
3.2.3 Outros constituintes
Além da amilose e amilopectina, o grânulo de amido apresenta compostos
nitrogenados, lipídeos e minerais como o fósforo. Apesar de estarem presentes em menor
percentual, podem ter influências marcantes nas propriedades do amido (CEREDA,
1996).
Os lipídeos, que representam em média 0,6% da composição de amidos de
cereais, e são considerados a fração mais importante associada, podem complexar com
amilose, alterando as propriedades reológicas do amido. Outros componentes como
proteínas e várias substâncias inorgânicas, podem ser consideradas impurezas, uma vez
que não estão ligadas covalentemente com os polissacarídeos formadores do grânulo
(CIACCO; CRUZ, 1982; ELLIS et al., 1998; HOSENEY, 1991; PERONI, 2003)
3.2.4 Estrutura granular
O grânulo de amido é birrefringente e sob a luz polarizada, apresenta uma típica
cruz de malta. No entanto, a birrefringência não necessariamente implica em uma forma
cristalina e sim, num alto grau de organização molecular nos grânulos. Admite-se que os
grânulos de amido são estruturas semi-cristalinas compostas de macromoléculas
arranjadas na direção radial (AGGARWALL; DOLLIMORE, 1998; BILIADERIS, 1991).
De acordo com Biliaderis (1991) são as áreas cristalinas do amido que mantêm a
estrutura do grânulo, controlam seu comportamento na presença de água e controlam a
resistência aos ataques enzimáticos ou químicos. A fase gel ou amorfa dos grânulos é a
região menos densa e mais suscetível ao ataque enzimático e ainda absorve mais água
em temperaturas abaixo da temperatura de gelatinização. Não existe uma demarcação
específica entre as regiões cristalinas e amorfas.
3.3 AMIDO DE MILHO
Esta fonte vegetal contém de 60 a 68% de amido (JACQUES; LYONS; KELSALL,
1999). De acordo com Brambilla (2001) o milho (Zea maiz) é um cereal de grande
utilização industrial, seja para indústrias processadoras de ração animal ou para o
consumo humano. É largamente utilizado para diversos tipos de modificações gerando
assim, produtos de diversas aplicações. O milho se presta bem ao transporte e à
armazenagem, o que leva a um grande mercado tanto nos países produtores, quanto nos
países importadores. A conversão do amido em xaropes de glicose, maltose frutose e
outros derivados como a maltodextrina é amplamente utilizada.
3.4 AMIDO DE MANDIOCA
De acordo com Hoover (2001) as culturas tuberosas recebem diversas
denominações populares conforme o país em questão. Com relação às propriedades
agronômicas já existe grande documentação acerca destas culturas, no entanto, quanto
às propriedades físico-químicas ainda há muito a ser estudado. Por ser a mandioca rica
em amido, este é o principal produto obtido a partir dela, pois dele obtém-se o maior
número de aplicações e sub-produtos. A matéria-prima contém de 25 a 30 % de amido
em sua constituição (JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999). Segundo Passos (2002) a
mandioca (Manihot esculenta) representa um alimento energético para mais de 400
milhões de pessoas no mundo, sobretudo nos países em desenvolvimento. A mandioca
apresenta uma série de vantagens em relação a outros cultivos como: fácil propagação,
elevada tolerância a longas estiagens, além de outras. Ainda, apresenta um alto teor de
amido nas raízes.
O amido de mandioca tem algumas vantagens em comparação a outros tipos de
amidos como, por exemplo, a facilidade de hidrólise (AYERNOR; HAMMOND;
GRAFFHAM, 2002).
Industrialmente, seu processamento gera uma série de produtos e subprodutos
para a alimentação humana, animal ou outros usos industriais (DEMIATE; CEREDA,
2000). Outro fato que torna a mandioca promissora como fonte de amido para a produção
de hidrolisados, é a possibilidade da redução de custos de produção de raiz ainda ser
muito grande, por conta do emprego de tecnologia e do aumento de produtividade em
algumas regiões, sem contar com o melhoramento genético para desenvolver variedades
mais produtivas e adequadas ao seu processo industrial (PASSOS, 2002).
3.5 USO DE AMIDOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
De acordo com Franco et al. (2001), o amido tem sido tradicionalmente utilizado na
indústria de alimentos como ingrediente ao mesmo tempo de valor calórico e responsável
por melhorar as propriedades funcionais como facilitar o processamento, fornecer textura,
servir como espessante, proteção entre outros.
Os produtos de hidrólise como os xaropes de glicose ou maltose, maltodextrinas
são utilizados nas indústrias de balas, doces, chocolates, bolos, biscoitos, assim como
nas indústrias de geléias e de sobremesas como anti-cristalizante, adoçante e por sua
higroscopicidade. Este polissacarídeo desempenha um importante papel no controle de
características de um grande número de alimentos processados.
3.6 GELATINIZAÇÃO
O fenômeno denominado gelatinização é extremamente importante para vários
sistemas alimentícios. Trata-se de uma propriedade pertinente a todos os tipos de amido.
Em uma dada temperatura, no processo de aquecimento, a energia cinética do sistema
água - amido, é suficiente para enfraquecer as ligações hidrogênio no interior do grânulo,
resultando na desorganização granular e hidratação dos polímeros naturais (LELIÈVRE,
LIU, 1994).
O amido de cada espécie vegetal apresenta morfologia e propriedades físicoquímicas próprias (EDUARDO, 2002). A gelatinização de amidos verificada por técnicas
termoanalíticas é muito importante uma vez que define proporcionalmente a energia
requerida para o cozimento (VARAVINIT, 2004). Em escala industrial, principalmente, o
gasto energético do processo deve ser cuidadosamente controlado.
As técnicas termoanalíticas normalmente são utilizadas na análise de transições
que ocorrem quando polímeros sintéticos são aquecidos. Assim, não é surpresa que tais
métodos são amplamente utilizados no estudo da gelatinização (LELIÈVRE, LIU, 1994).
3.7 HIDRÓLISE DE AMIDOS
A hidrólise de amidos, comumente, é realizada por duas vias: enzimática e ácida
(PASSOS, 2000). A quebra do amido por meio de enzimas exige uma série de condições
distintas e muito específicas é mais onerosa e ainda não amplamente utilizada no Brasil.
Apesar disso, a atuação das enzimas mostra alta especificidade, possibilitando a
obtenção de produtos de propriedades físico-químicas bem definidas além do que o
processo ocorre em reações mais brandas (EDUARDO, 2002). A hidrólise enzimática é o
procedimento industrialmente utilizado quando o objetivo é um produto mais refinado
como a glicose ou xarope concentrado de maltose. Este procedimento é muito usual na
indústria Norte-americana e também na Europa (BRAMBILLA, 2001; LEHNINGER;
NELSON; COX, 1995; PASSOS, 2002).
3.8 ENZIMAS
A enzimologia industrial é um importante ramo da biotecnologia. As enzimas
permitem às indústrias usarem processos mais econômicos, diminuindo o consumo de
energia; são mais confiáveis e poluem menos, comparativamente ao emprego de ácidos.
Sua especificidade evita resultados indesejáveis. Atualmente, as enzimas podem
substituir muitos desses produtos químicos e permitir uma produtividade segura e
ambientalmente amigável (DESCOBRINDO..., 2004).
Os ensaios enzimáticos têm sido utilizados para demonstrar a existência de
ligações associativas no interior dos grânulos de amido. As enzimas para serem utilizadas
para este fim, devem ser concentradas e purificadas (FRANCO et al., 2001).
No processo completo de hidrólise, o amido é convertido em uma mistura de vários
oligossacarídeos e dextrinas diferentes pelo uso da α-amilase. Essas maltodextrinas,
ligeiramente doces, são submetidas a mais uma conversão pela adição de outras enzimas
promotoras do desdobramento total das moléculas de amilose ou amilopectina que ao se
romperem transformam-se em dextrinas cada vez mais simples e finalmente em glicose
(ENZIMAS, 2004; JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999).
3.8.1 Enzima α-amilase
As amilases têm diferentes aplicações industriais, como em alimentos, detergentes,
têxteis e indústria de papéis. As amilases têm tomado lugar de ácidos no processamento
industrial de hidrolisados de amido. As amilases representam a maior parte do mercado
de enzimas no mundo. A maior aplicação para a α-amilase está na produção de
hidrolisados de amidos (GUPTA et al., 2003).
Amilases fúngicas normalmente obtidas a partir de: Aspergillus oryzae, Aspergillus
niger, Aspergillus awamori ou espécies de Rhizophus têm sido utilizadas como
suplemento na atividade amilolítica. Enzimas desta origem têm como finalidade o
aumento dos níveis de monossacarídeos e dissacarídeos fermentáveis, promovendo uma
melhor condição ao fermento (NAGODAWITHANA; REED, 1993).
A atuação da α-amilase tem por objetivo a quebra das ligações glicosídicas α, 1-4
em cadeias mais curtas, no entanto, as ligações α, 1-6 não são quebradas pela ação
desta enzima. Na produção de glicose, esta etapa tem como finalidade a quebra das
moléculas de amido para redução da viscosidade e auxiliar a ação enzimática
(JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999).
A ação da α-amilase sobre a amilose se dá em duas etapas. A primeira consiste no
ataque aleatório e rápido do substrato, resultando maltose e maltotriose, enquanto que a
segunda, bem mais lenta, permite a formação de glicose e maltose.
A hidrólise da amilopectina pela α-amilase fornece como produtos finais glicose, maltose e
as α-dextrinas limite (oligossacarídeos contendo quatro ou mais unidades de glicose
unidas por ligações do tipo α-1,6)(AQUARONE et al., 2001).
As amilases, de uma maneira geral, agem na superfície do grânulo de amido
provavelmente em uma imperfeição estrutural ou fissura, depois estendem-se
lateralmente formando cavidades cônicas. A ação contínua da α-amilase causa erosão
nos grânulos que podem vir a ser dissolvidos completamente.
Os produtos hidrolisados de amido têm numerosas aplicações como xaropes de
diferentes qualidades compostos por: maltodextrinas (oligômeros), glicose, maltose e
frutose, amplamente usados na indústria de alimentos como adoçantes e como substratos
para fermentação (SWEETENER..., 1999).
3.9 PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE
Os métodos de análise térmica medem variações de um determinado parâmetro
ocorridas como uma função da temperatura (aquecimento ou resfriamento) ou como uma
função do tempo a uma temperatura constante (modo isotérmico). As técnicas
termoanalíticas fornecem resultados na forma de curvas, as quais contêm as informações
a respeito da variação do parâmetro medido (LUCAS;SOARES;MONTEIRO, 2001).
A hidrólise parcial resulta na despolimerização do amido e é possível monitorar o
evento por técnicas complementares como: produtos da hidrólise do amido granular,
microscopia e outras.
3.9.1 Hidrólise do amido granular
3.9.1.1 Determinação de açúcares redutores
Nos fluídos biológicos, o açúcar que normalmente encontra-se em quantidades
mensuráveis é a glicose; assim, ela é a quem usualmente determina-se. Os açúcares
redutores vêm de carboidratos redutores que possuem radicais aldeídos ou cetonas.
Estes grupos funcionais aparecem nas moléculas de carboidratos proporcionando um
sítio ativo para reações. A identificação ou determinação dos radicais redutores é feita por
indicadores, sendo o mais conhecido e utilizado, o cobre. Soluções de cobre podem
mudar de cor se estiverem na forma reduzida ou oxidada (CEREDA;VILPOUX, 2003) .
A determinação de carboidratos redutores pode ser feita baseada no método de
Somogyi –Nelson (FREITAS, 2002; NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945). Esta metodologia
tem como princípio, o fato de que a glicose ou outro açúcar redutor, reduz o reativo cuproalcalino produzindo óxido cuproso. Este, em presença do reativo arsenomolíbdico de
Nelson, forma um complexo de óxido de molibdênio de coloração azul estável, cuja
intensidade pode ser medida em fotocolorímetro (PLUMMER, 1971).
3.9.1.2 Determinação de glicose
Esta análise trata da determinação da glicose por teste enzimático colorimétrico
para uso diagnóstico in vitro.
O método é baseado no princípio de que o Peróxido de hidrogênio, em presença
da peroxidase (POD) reage com a aminoantipirina e fenol, formando um cromógeno
vermelho cereja cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose
(BIOCLIN, 2002; DAHLQUIST, 1961).
3.9.2 Microscopia
O exame microscópico dos grânulos fornece informações sobre a origem dos
amidos contribuindo para sua caracterização. (ELLIS et al., 1998; FREITAS et al., 2002).
Para Aggarwal; Dollimore (1998), a análise por meio de microscopia pode ser
utilizada para examinar os grânulos resultantes do processo de hidrólise parcial.
A
degradação pode não ocorrer de maneira uniforme. Este método é utilizado para um
melhor entendimento dos efeitos da hidrólise parcial dos amidos com a ação enzimática.
3.9.3 Difratometria de Raios X
Os raios X produzidos a partir do bombeamento do ânodo por elétrons do
cátodo acelerados por alta tensão, são radiações eletromagnéticas que como tais, podem
ser polarizadas, refratadas e refletidas. Em difratometria utiliza-se raios X “moles” onde o
comprimento de onda é relativamente grande e raios X “duros” empregados em
microrradiografias.
De acordo com Carvalho Filho ( 2000), as radiações mais utilizadas são os Kα com
comprimentos de onda compreendidos entre 0,56 e 2,29 Å. Ë indispensável que a
radiação seja monocromática e, como normalmente as linhas (Kα e Kβ) são emitidas
simultaneamente, há necessidade de se filtrar o feixe para eliminar a radiação
indesejável. A difração de raios X pelos cristais resulta de um processo em que os raios X
são dispersos pelos elétrons dos átomos sem mudança do comprimento de onda
(dispersão de Bragg). Um elétron de um átomo é influenciado pelos raios X é excitado em
campo flutuante, tornando-se uma fonte de ondas eletromagnéticas de mesma freqüência
e comprimento de onda que os raios incidentes. Desta forma, o elétron do átomo dispersa
o feixe incidente, combinando-se para difratar a radiação X.
A intensidade da dispersão depende de como os elétrons estão distribuídos em
todo o volume atômico. No entanto, em termos de geometria de difração, o átomo é
considerado uma fonte puntual de dispersão.
Em se tratando de um conjunto de átomos, estes difratam os raios X em duas
direções principais. Essas direções correspondem respectivamente ao prolongamento do
feixe incidente e a reflexão pelo plano. Qualquer plano do cristal correspondente a uma
face pode ser considerado e o arranjo completo seria um conjunto de planos paralelos ao
primeiro.
A posição das reflexões e as intensidades relativas, dependentes respectivamente
da célula unitária e do arranjo dos átomos, são características da estrutura cristalina do
material. A difração resultante
de um cristal compreendendo posições e intensidades
das linhas de difração é uma propriedade física fundamental da substância e que pode
não apenas servir na identificação mas também como análise de sua estrutura (
JEFFREY et al., 1992).
É sabido que em química de coordenação, a determinação da estrutura molecular
de um composto é feita pela difração de raios X em monocristal. Porém, a dificuldade da
obtenção do mesmo leva a opção do emprego do método do pó, do qual se obtém
informações que podem, conduzir a verificação de cristalinidade, comparação aos
padrões catalogados e verificação de isomorfismo dentro de uma série de compostos.
Com base nesses resultados, é possível obter conclusões a respeito da estrutura
cristalina dos compostos (CARVALHO FILHO 2000).
No estudo da cristalinidade de amidos, difração de raios X é usualmente realizada
em materiais hidratados. A hidratação consiste em manter a umidade relativa dentro de
um dessecador. A hidratação é um fator que interfere na análise, uma vez que mantém a
ordem estrutural e aumenta a resolução dos resultados.
Durante o processo de hidrólise enzimática, pode-se observar a alteração de
cristalinidade do amido (AGGARWAL; DOLLIMORE, 1998).
3.9.4 Técnicas termoanalíticas
Os primeiros métodos termoanalíticos a rigor, iniciaram-se quando o homem
observou a ação do fogo sobre os materiais. A evolução da técnica se deu lentamente e
os trabalhos iniciais resultaram de esforços isolados de alguns pesquisadores,
empregando instrumentos rudimentares (CARVALHO FILHO, 2000).
Posteriormente, a instrumentação termoanalítica atingiu um elevadíssimo grau de
sofisticação em virtude dos progressos da ciência e tecnologia. Aliado a esses fatores,
deve ser considerado a redescoberta das potencialidades de suas aplicações nos mais
variados setores científicos e tecnológicos (IONASHIRO, 2005).
No Brasil, os estudos relacionados à análise térmica foram inicialmente
desenvolvidos nos laboratórios da Universidade de São Paulo no início da década de 70
pelas mão do Prof. Dr. Ivo Giolito. Desde o início, o Prof. Giolito objetivou a divulgação e
disseminação da técnica no país. Em apenas pouco mais de 30 anos de história no Brasil,
as técnicas termoanalíticas se popularizaram de tal modo pela sua versatilidade de
aplicação em várias áreas, que se tornaram indispensáveis em qualquer centro de
pesquisa. Desse modo, em curto período de tempo, o prof. Giolito cumpriu sua meta e
seu nome tornou-se sinônimo de análise térmica em nosso país (CARVALHO FILHO,
2000).
De acordo com Ionashiro (2005), por definição, a análise térmica é o termo
aplicado a um grupo de técnicas, nas quais uma propriedade física de uma substância
e/ou de seus produtos de reação é medida em função da temperatura ou tempo,
enquanto a mesma é submetida a uma programação controlada de temperatura.
Destas
técnicas,
as
mais
amplamente
difundidas
utilizadas
são
a
termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), a análise térmica diferencial (DTA)
e a calorimetria exploratória diferencial (DSC). Segundo Schnitzler et al.( 2004), os
métodos térmicos em análises estão sendo atualmente muito utilizados nas investigações
científicas.
3.9.4.1 Termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG)
No início do século passado, foi apresentado um sistema capaz de medir
continuamente a massa de um material enquanto este era submetido a uma programação
controlada de temperatura. Este sistema descrito em 1915, foi denominado por Kôtaro
Honda como termobalança e fez surgir a técnica termoanalítica e a termogravimetria (TG).
O registro obtido é a curva termogravimétrica ou a curva TG (Figura 4), onde Ti é a
temperatura inicial, ou seja, a temperatura em que a mudança de massa alcança uma
magnitude que a termobalança possa detectar e Tf, a temperatura final onde a massa
alcança o seu valor máximo correspondendo a reação completa (CARVALHO FILHO,
2000; IONASHIRO, GIOLITO, 1982).
Modificações da estrutura molecular ocorrem quando os grânulos são submetidos
ao aquecimento (AGGARWAL; DOLLIMORE, 1998). Tal informação é de extrema
importância no sentido de avaliar a decomposição de diferentes produtos (KARAM;
NORZIAH; SEOW, 2000; SOLIMAN; EL-SHINNAWY; MORABAK, 1997).
FIGURA 4 – Representação de uma curva termogravimétrica.
Fonte: (CARVALHO FILHO, 2000).
Enquanto a curva TG fornece graficamente degraus correspondentes às variações
de massa em função do tempo e/ou temperatura, na curva DTG, técnica que fornece a
derivada primeira da curva TG em função do tempo ou temperatura. O registro é a curva
termogravimétrica derivada ou DTG (Figura 5). Neste método, os degraus observados nas
curvas TG são correspondidos por picos que delimitam áreas proporcionais às alterações
de massa com aquecimento da amostra. Os resultados de variação de massa (Δm), a
partir da DTG aparecem de uma forma visualmente mais acessível, uma vez que as
inflexões sutis da TG são enfatizadas e possibilitam a separação das reações
sobrepostas e a determinação com maior exatidão das temperaturas correspondentes ao
início e quando os processos de decomposição térmica atingirem sua velocidade máxima.
Figura 5 – Representação das curvas TG-DTG
(Fonte: CARVALHO FILHO, 2000).
A termogravimetria permite conhecer detalhadamente as alterações que o
aquecimento pode causar na massa das substâncias e ainda estabelecer a faixa de
temperatura em que as mesmas adquirem composição química definida, ou sofrem
processos de decomposição. Curvas TG, podem ser classificadas em: isotérmicas,
quase-isotérmicas e dinâmicas. Na TG isotérmica, a massa da amostra é registrada como
função do tempo, a uma temperatura constante. Na TG quase-isotérmica, a amostra é
aquecida até massa constante e na TG dinâmica, há um acompanhamento das variações
de massa sofridas pela amostra em função da temperatura quando esta é submetida a
um aquecimento ou resfriamento linear (CARVALHO FILHO, 2000).
Os experimentos onde avaliam-se as variações de massa de um material em
função da temperatura são realizados em uma termobalança, cujo diagrama de bloco
encontra-se na (Figura 6). Este equipamento permite a pesagem contínua de uma
amostra em função da temperatura, à medida em que esta é aquecida ou resfriada. As
curvas TG permitem obter conclusões sobre a estabilidade térmica da amostra, sobre a
composição, estabilidade dos compostos intermediários e sobre a composição do resíduo,
sendo entre as técnicas termoanalíticas, a mais utilizada.
A termogravimetria é um método basicamente quantitativo, uma vez que a variação
de massa pode ser exatamente determinada. Porém, o intervalo de temperatura onde
esta variação de massa ocorre, é qualitativo, tendo em vista que este parâmetro depende
de fatores instrumentais e características da amostra.
Figura 6 – Diagrama de bloco de uma termobalança.
(Fonte: Carvalho Filho, 2000).
3.9.4.2 Análise térmica diferencial (DTA) e Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
De acordo com Ionashiro (2005), as técnicas de Análise Térmica Diferencial (DTA)
e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) têm o mesmo princípio, sendo consideradas
semelhantes e complementares. Ambas permitem avaliar as varições entálpicas que
ocorrem com uma dada substância durante um processo de aquecimento ou
resfriamento. O termo ”diferencial” dá ênfase àquelas medidas que envolvem tanto a
própria substância como um material termicamente estável.
Assim, a análise térmica diferencial é a técnica na qual a diferença de temperatura
entre a amostra e a referência são submetidos a uma programação controlada de
temperatura (CARVALHO FILHO, 2000).
O DSC é uma técnica procedente do DTA, na qual mede-se a diferença de energia
fornecida à substância e a um material de referência em função da temperatura enquanto
estas são submetidas a uma programação controlada de temperatura.
De acordo com o método de medição utilizado, tem-se o DSC com compensação
de potência, desenvolvido pela Perkin Elmer e o DSC com fluxo de calor, desenvolvido
por outras empresas. No DSC com compensação de potência a amostra e a referência
são aquecidas ou resfriadas em compartimentos separados, individualmente. Isto torna
possível manter a amostra e a referência em condições isotérmicas, ao contrário da
técnica DTA. Assim, se a amostra sofre alteração de temperatura devido a um evento
endo ou exotérmico em função do aquecimento ou resfriamento a que é submetida,
ocorre uma modificação na potência da entrada do forno correspondente de modo a
anular esta diferença. Isto consiste no “balanço nulo de temperatura”(CARVALHO FILHO,
2000).
Segundo Carvalho Filho (2000), o DSC com fluxo de calor tem desempenho
equivalente ao DSC com compensação de potência e foi desenvolvido a partir do DTA
para contornar a patente do DSC com compensação de potência da Perkin Elmer. A
principal diferença em relação ao DTA, consiste na execução de medidas quantitativas,
uma vez que o DSC com fluxo de calor possui uma resistência térmica bem-definida.
Nesse sistema DSC, a amostra e a referência são colocados sobre um disco termoelétrico
de constantan e aquecidos por uma única fonte de calor. O calor é transferido através do
disco para a amostra e a referência e o fluxo de calor diferencial entre os dois é
controlado por termopares conectados abaixo do cadinho.
O que vem diferenciar os dois métodos é principalmente a maneira na qual os
resultados se apresentam.
No DSC com compensação de potência, adotou-se a
convenção termodinâmica, onde um evento endotérmico é caracterizado por um pico
ascendente a partir da linha-base, enquanto que no DSC com fluxo de calor, este mesmo
evento é apresentado num pico descendente. Atualmente, os dispositivos permitem ao
usuário determinar a representação de um evento endo ou exotérmico em uma curva
DSC.
De acordo com Carvalho Filho (2000), qualquer fenômeno físico ou químico que
por ocasião de sua ocorrência provoque variações de entalpia pode ser detectado através
desta técnica e à medida que a sensibilidade dos instrumentos foi sendo aumentada, a
aplicabilidade do método foi também sendo consideravelmente ampliada.
De uma maneira prática, a maior diferença entre as técnicas DSC e DTA consiste
no sinal do instrumento. No DTA, o sinal fornecido é proporcional a diferença de
temperatura entre a amostra e um material de referência termicamente estável, enquanto
que no DSC, o sinal é dado pela potência térmica diferencial ( IONASHIRO, 2005).
Nos últimos anos, a calorimetria exploratória diferencial vem sendo amplamente
utilizada para o estudo do comportamento térmico de amidos. O estudo de propriedades
térmicas pode auxiliar nos caminhos do processamento de amidos e também na
exploração e entendimento da estrutura granular. A análise por DSC permite verificar e
monitorar propriedades térmicas e transições de fase dos amidos (AGGARWAL;
DOLLIMORE, 1998; JI;SEETHARAMAN;WHITE, 2004; ZHONG, SUN, 2005).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
4.1.1 Matéria-prima
Amido de milho comercial e amido de mandioca (polvilho doce) comercial. Ambos
para utilização em processos alimentícios adquiridos em estabelecimento comercial de
Curitiba-PR.
Enzima α-amilase fúngica denominada SPRING ALFA 4000 SKB (GRANOTEC)
gentilmente doada por um usuário.
Algumas amostras de amido utilizadas no estudo, foram gentilmente fornecidas
pelo Professor Doutor Ivo Mottin Demiate (UEPG).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Hidrólise parcial enzimática
Para o processo de hidrólise (Figura 7), foram necessários 6 erlenmeyers divididos
em 2 grupos: 3 frascos para amido de milho e 3 para amido de mandioca, sendo que para
cada grupo, a identificação no frasco citava origem botânica e o tempo de hidrólise em
que iria ser submetido (de 1 a 3 horas).
Para cada erlenmeyer, foram pesados aproximadamente 3 g de amidos comerciais
de mandioca e milho separadamente em uma balança analítica SHIMADZU AY 220.
Durante a pesagem, os materiais foram acondicionados em dois grupos de 3 erlenmeyer
de 250 mL préviamente tarados. Em seguida, para cada recipiente foram adicionados
8,00 mL de água destilada, formando uma mistura de aproximadamente 3:8 (amido:água
destilada) em massa e então acertado o pH para 5,0 com adição de HCl 0,1 mol/L.
Em seguida, todos os frascos foram inseridos a um BANHO DUBNOFF TECNAL
com agitação e mantidos a uma temperatura de 40 °C (GRANOTEC).
Então, foi adicionado a cada erlenmeyer 0,0150g de enzima α-amilase fúngica segundo a
recomendação da ficha técnica da mesma (GRANOTEC), considerando a massa de
amido.
Após cada intervalo de hora, eram retirados do sistema de aquecimento e agitação
os frascos identificados para o tempo de hidrólise pré-determinado. Para parar a ação
enzimática, o pH foi acertado para 2 com adição de HCl 0,2 mol/L (AGGARWAL,
DOLLIMORE, 1998).
Na seqüência, todos os frascos foram submetidos à centrifugação em um
equipamento COMBAT CELM a 3200 rpm durante 6 minutos (BIOQUÍMICA). O
sobrenadante de cada amostra foi separado, e acondicionado em tubo de ensaio e selado
por filme de PVC para ser armazenado em geladeira para análises posteriores.
O material precipitado de cada amostra foi retirado e secado em estufa vácuo
durante 24 horas em temperatura ambiente e em seguida acondicionado em dessecador
para ser analisado posteriormente.
AMIDOS DE MILHO e MANDIOCA
EM CADA ERLENMEYER:
3 g DE AMIDO;
8 mL DE ÁGUA DESTILADA;
0,015 g DE ENZIMA;
AJUSTE: TEMPERATURA 40 ºC e pH 5,0;
TEMPO DE HIDRÓLISE (ATÉ 3 HORAS).
PH
AJUSTADO PARA 2
CENTRIFUGAÇÃO
-MATERIAL PRECIPITADO;
SOBRENADANTE:
-AMIDOS NATIVOS:
SECAGEM À TEMPERATURA
AMBIENTE;
ANÁLISE TÉRMICA;
(PRODUTOS DA HIDRÓLISE)
DETERMINAÇÃO DE GLICOSE;
AÇÚCARES REDUTORES.
MICROSCOPIA;
RAIO X.
FIGURA 7 - Fluxograma representativo do preparo das amostras para a hidrólise parcial enzimática e respectivas
análises.
4.2.2 Hidrólise do amido granular
4.2.2.1 Determinação de glicose
A determinação de glicose descrita para determinar quantidade de glicose no sangue foi
utlizada segundo descrito por Dhalquist (1961), com auxílio do Kit (BIOCLIN).
4.2.3.2 Determinação de açúcares redutores
Com os reativos de Somogyi–Nelson preparados, cada situação de tempo de
hidrólise e fonte de amido fora marcada em tubos de ensaio: Amostra (A) e branco (B).
Em seguida, adicionou-se respectivamente 1mL do sobrenadante e 1mL de água
destilada.
Adicionou-se aos tubos A e B, 1 mL do reativo de Somogyi, agitou-se, e submeteuse ao banho–maria fervente por 10 minutos (os tubos foram cobertos com papel alumínio
para evitar evaporação). Após resfriamento, foram adicionados aos tubos 1 mL do reativo
de Nelson, para em seguida completar o volume de cada tubo para 10 mL com água
destilada. O espectrofotômetro foi calibrado com o conteúdo do tubo B e determinou-se a
absorbância do tubo que continha amostra (A) em 535 nm (BIOQUIMICA, 2001).
4.3 MICROSCOPIA:
Todas as amostras de amido de milho e mandioca foram observadas numa lupa
estereoscópica (OLYMPUS modelo SZX9), dotada de filtro polarizador e fotografadas
com o captador de imagens (MEDIA CYBERNETICS) modelo COOL SNAP PRO
COLOR). As fotografias foram identificadas e dotadas de escala com o programa IMAGE
PRO PLUS.
Cada amostra foi disposta em uma lâmina de vidro, e imersa em água destilada.
Em seguida, foram feitas as observações dos grânulos a um aumento de 400X e também
no aumento de 1000X com auxílio de um óleo de imersão. Todas os registros foram
dotados de escala e identificação.
4.4 DIFRATOMETRIA POR RAIOS X
Com o intuito de caracterizar a cristalinidade dos grânulos de amido de milho e
mandioca nativos e hidrolisados, cada amostra foi disposta sobre uma lâmina de vidro
tratada com HF. Cada material foi colocado em um porta amostra e analisado por um
difratômetro Siemens Mod. D-500 operando com radiação CuKα (comprimento de onda de
1.542 Å) a um tempo de varredura de 0.5º min-1 na geometria Bragg-Brentano de
10<θ<70. Todas as determinações foram realizadas usando um gerador de tensão de 40
kV e uma corrente emissora de 30 mA.
4.5 TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS:
4.5.1 Calibração do equipamento TG 60
Com a finalidade de obter resultados precisos em técnicas termoanalíticas, deve-se
inicialmente executar a calibração do equipamento. Para tanto, deve-se recorrer a
materiais-padrão de composição conhecida e que reproduzam as perdas de massa
referentes à sua decomposição em temperaturas bem determinadas, ou uso de materiais
que apresentem transições magnéticas que possam ser observadas em uma curva
termogravimétrica, podendo-se assim, efetuar a calibração de temperatura do forno.
Um dos métodos mais eficazes para a calibração é obtido quando um material
com característica ferromagnética é submetido a um aumento de temperatura sob a
atuação de um campo magnético. Ao alcançar a temperatura referente ao ponto Curie do
material,
observa-se
uma
aparente
perda
de
massa
registrada
pela
curva
termogravimétrica. Para este tipo de calibração, o aquecimento deve iniciar à temperatura
ambiente até a temperatura na qual as amostras serão analisadas, utilizando-se de vários
materiais simultaneamente (CARVALHO FILHO, 2000).
Os resultados obtidos no presente estudo, foram obtidos a partir de um sistema
dotado de um programa de software TA 60, que permite uma calibração do equipamento
de forma eficiente, através de correções matemáticas dos resultados com determinados
padrões. Após corrigidos, estes valores são arquivados no sistema e utilizados como fator
de correção de amostras analisadas.
A calibração da balança foi realizada obtendo-se duas curvas termoanalíticas em
condições semelhantes às utilizadas para os compostos. A primeira curva foi realizada
com um peso padrão fornecido pelo fabricante e a segunda com o suporte da amostra
vazio. Os dados de ambas as curvas foram analisados e corrigidos, fornecendo o fator de
correção de massa.
A linha de base foi calibrada aquecendo-se continuamente o forno com uma
razão de aquecimento pré-determinada. Utilizando-se a curva DTA pôde-se medir as
variações de temperatura que ocorreram no forno vazio criando-se assim um fator de
correção que permaneceu arquivado e foi utilizado pelo sistema durante a execução das
análises
De acordo com Carvalho Filho (2000), a calibração efetuada para a temperatura
baseia-se na observação do pico endotérmico referente ao processo de fusão de um
material puro. O valor obtido é comparado ao fornecido pela literatura. A diferença entre
os resultados é transformada em um fator de calibração de temperatura que será
armazenado e utilizado posteriormente.
No caso particular do equipamento utilizado neste estudo, a calibração da
temperatura segue a equação:
( temperatura calibrada) = ( temperatura não-calibrada) + ΔT
ΔT é um termo dependente da temperatura e segue:
ΔT(tm) = A + B x Tm, onde:
ΔT(tm) é o valor de correção na temperatura Tm;
A e B são coeficientes de calibração de ordem zero e primeira ordem obtidos na
literatura. No caso da utilização de um material-padrão como referência, utiliza-se apenas
um coeficiente. No caso do uso de dois materiais, dois coeficientes e assim por diante.
4.5.2 Calibração do equipamento DSC 60
Por ser utilizado tanto em medidas qualitativas e também quantitativas, a
calibração da célula DSC deve ser realizada periodicamente e a cada mudança de
condição experimental, como atmosfera, vazão de gás de arraste e razão de
aquecimento.
Os parâmetros calibrados foram: linha de base do equipamento, constante da
célula e temperatura. A linha de base foi calibrada empregando-se dois micro-cadinhos
vazios e aquecimento da célula até 600ºC.
A calibração da constante da célula e da temperatura baseou-se na
determinação do ponto de fusão de um material padrão como o Índio por meio de uma
curva DSC e comparação do valor obtido com valor descrito na literatura. A correção de
temperatura
feita pelo programa TA 60 (SHIMADZU) segue o mesmo procedimento
matemático descrito na calibração do equipamento TG 60.
4.5.3 Termogravimetria
As curvas termogravimétricas foram obtidas em um TG 60 SHIMADZU.
Cada
amostra (amostras de amidos nativos e hidrolisados) foi retirada do dessecador e
previamente pesada numa balança analítica AY 220 SHIMADZU para que se obtivesse o
valor aproximado da massa a ser analisado. Todas as amostras foram pesadas e
acondicionadas em micro-cadinhos de alfa-alumina pré-tarados na termobalança.
As condições de análise foram as seguintes (AGGARWAL; DOLLIMORE, 1998):
Massa de amostra: 5,0 mg;
Atmosfera: ar sintético;
Vazão: 100mL/min.;
Razão de aquecimento: 10 °C/min.;
Temperatura inicial: 30 °C;
Temperatura final: 600 °C.
Para a obtenção dos valores de observação das curvas, foi utilizado o programa TA
60 (SHIMADZU).
4.5.4 Calorimetria Exploratória Diferencial
As curvas DSC foram obtidas em um equipamento DSC 60 SHIMADZU calibrado
com padrão de índio puro (99,99%).
Cada amostra foi retirada do dessecador e
previamente pesada numa balança analítica SHIMADZU AY 220 para que se obtivesse o
valor aproximado da massa a ser analisado.
Foram feitas misturas de amostras e água na razão aproximada de 1:4
(amido:água) para cada amostra. As misturas ficaram em repouso por pelo menos duas
horas para que
houvesse homogenização da mistura. Com auxílio de micro-pipeta
LABMATE, foram retirados 10 μL da mistura e inserido a um micro-cadinho de alumínio
selável (SHIMADZU). Antes de iniciar o processo, é acondicionado no calorímetro um
micro-cadinho vazio, idêntico ao da amostra que foi utilizado como referência
(AGGARWAL; DOLLIMORE, 1998; YU; CHRISTIE, 2001).
As condições de análise foram as seguintes:
Massa de amostra: aproximadamente 10 mg;
Atmosfera: ar sintético;
Vazão: 100mL/min.;
Razão de aquecimento: 5 °C/min.;
Temperatura inicial: 30 °C;
Temperatura final: 80°C.
Para a obter os valores de observados nas curvas, foi utilizado o programa TA 60
SHIMADZU.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PRODUTOS DA HIDRÓLISE GRANULAR
De acordo com Biliaderis (1991) a funcionalidade dos amidos está diretamente
relacionada à amilose e à amilopectina e também a organização física das mesmas
dentro da estrutura granular. No estado nativo, existe um número mínimo de
açúcares redutores mas quando ocorre a quebra das cadeias de amilose pela
enzima (mesmo que seja aleatória) ocorre por sua vez a formação de um maior
número correspondente de terminais redutores, ou seja de açúcares redutores.
Como representado (Tabela 1 e Figura 8), percebe-se aumento gradativo de
açúcares redutores, conforme o aumento do tempo de ação da enzima, o que
paralelamente explica-se a determinação de glicose, pois com a quebra das
ligações ocorre o aparecimento de glicose.
TABELA 1 – Percentuais de glicose e açúcar redutor durante a hidrólise.
Glicose(%)
______
Milho
Açúcares Redutores (%)
Mandioca
Milho Mandioca____
1 HORA:
3,05
2,22
8,26
6,47_______
2 HORAS:
3,75
3,55
12,44
9,09_______
3 HORAS:
5,14
4,21
21,34
13,33______
25
20
15
10
5
0
MILHO
MANDIOCA
GLICOSE
MILHO
MANDIOCA
AÇÚCAR REDUTOR
FIGURA 8 – Percentuais de glicose e açúcar redutor pós-hidrólise (■)uma hora, (■) duas horas e (■)
três horas.
Verifica-se uma correlação entre as análises uma vez que ambas são dependentes
da ação enzimática. Foi possível verificar, através de metodologias clássicas, que a ação
enzimática realiza a quebra na cadeia dos polímeros de glicose, transformando-os em
estruturas menos complexas.
5.2 MICROSCOPIA
Os grânulos de amido de milho nativos (Figura 9) observados na análise diferiram
na forma e tamanho. O amido de milho apresentou forma poliédrica irregular que pode ser
melhor observada no aumento de 1000X. Seu tamanho varia entre aproximadamente 5 e
20 μm, confirmando a análise previamente realizada por AGGARWAL;DOLLIMORE
(1998) e KARAM (2003).
Já os grânulos de mandioca nativos (Figura 10) não apresentaram arestas e sim
uma morfologia mais arredondada e na média, um pouco maiores que os grânulos de
amido de milho. Como já observado por Hoover (2001), os grânulos deste amido se
apresentam tanto na forma solta, quanto agregados. Estes resultados confirmam
CIACCO; CRUZ (1982) e KARAM (2003).
(a)
(b)
FIGURA 9 - Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amido de milho nativo em
aumentos de (a) 400 e (b) 1000X.
(a)
(b)
FIGURA 10 - Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amido de mandioca nativo em
aumentos de (a) 400 e (b)1000X.
Durante o tempo de ação enzimática, progressivamente os grânulos foram
sofrendo alterações morfológicas. O estudo microscópico da alteração estrutural do
grânulo foi feito com amiloglucosidase em diferentes amidos por AGGARWAL;
DOLLIMORE (1998). Este fenômeno foi também observado por SARIKAYA et al. (2000)
quando tratamento enzimático de α- e β- amilases em grânulos nativos de diferentes
fontes botânicas.
LI et al. (2004) por sua vez, realizaram tal estudo em amidos de cevada utilizando
diferentes α- amilases e amiloglucosidase. Pode-se observar a ação enzimática pela αamilase fúngica durante uma e duas horas de hidrólise (Figura 11).
(a)
(b)
FIGURA 11 - Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amidos de (a) milho e (b)
mandioca hidrolisados durante uma e duas horas em aumentos de 1000X.
Ao final de três horas (Figura 12) foi possível observar, em comparação ao estado
inicial, que os grânulos haviam sido consideravelmente degradados pela ação enzimática,
confirmando os resultados da análise de atividade enzimática.
(a)
(b)
FIGURA 12 - Micrografias em microscopia ótica da morfologia de grânulos de amidos de (a) milho e (b)
mandioca hidrolisados durante três horas em aumentos de 1000X.
5.3 DIFRATOMETRIA DE RAIOS X
De acordo com Karim et al. (2000), o grânulo de amido normalmente consiste de
camadas concêntricas que contêm micelas cristalinas agrupadas. Os grânulos, por serem
parcialmente cristalinos, fornecem resultados particulares de difração de raios X. Esta
análise permite a identificação da natureza botânica de amidos. O padrão A aparece em
amidos de cereais como milho, arroz e trigo, enquanto que o padrão B aparece em fontes
tuberosas como mandioca, batata; frutas e milho com alto teor de amilose. O padrão C
refere-se a um comportamento intermediário entre os padrões A e B, observado em
amidos de legumes.
De acordo com Cereda (2001) alguns picos de intensidade de refração são mais
intensos nos diferentes tipos característicos de cristalinidade. Para o padrão A, estes
picos acontecem predominantemente como um dubleto em 2θ igual a 18º e um único pico
ocorrendo em torno de 2θ igual a 23º, além de um aumento na intensidade relativa da
banda em 2θ igual a 15º. Amidos de tubérculos ou do padrão B, são reconhecidos pela
intensidade da banda correspondente a um dubleto em 2θ igual a 5 e 6º, dois singletos
em 15 e 17º e um dubleto em 2θ igual a 22 e 24º (CEREDA, 2001).
A curva de difração por raios X do milho nativo (Figura 13), mostra um padrão de
cristalinidade típico de cereais como observado e descrito por Franco e Ciacco (1995).
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 13 – Curva de difração de raios X do amido de milho nativo.
Observa-se, no entanto que ocorrem alterações nos picos durante o andamento da ação
enzimática (Figura 14 e Figura 15).
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 14 - Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por uma hora.
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 15 - Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por duas horas.
Essas alterações, como já observadas por Aggarwall, Dollimore (1998), não
interferem na característica cristalina da fonte botânica durante a hidrólise, ou seja, os
picos principais observados inicialmente não desapareceram ou foram deslocados, no
entanto, ocorreram alterações em suas intensidades. No estudo da oxidação de diferentes
amidos realizado por Kuakpetoon e Wang (2001), observou-se que a característica de
padrão de amido também não era alterada concluindo que a modificação ocorria
principalmente na região amorfa do grânulo.
A (Figura 16) ilustra cristalinidade do amido de milho após três horas sob ação da
enzima e pode-se observar que a evidência da cristalinidade está bem mais definida, uma
vez que a separação dos picos em 18 graus está mais definida e o pico em 23 graus se
encontra mais agudo. Todos os picos característicos desta fonte botânica estão mais
intensos em comparação ao estado nativo deste amido. Apesar de ter utilizado uma outra
enzima, Aggarwall e Dollimore (1998), também observaram que a cristalinidade do amido
se encontrou mais evidenciado após a ação de uma enzima que tem amido como
substrato.
250
Intensity
200
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 16 - Curva de difração de raios X do amido de milho hidrolisado por três horas.
A curva de difração por raios-X do amido de mandioca nativo (Figura 17),
apresenta uma característica cristalina aproximada tipo A De acordo com Biliaderis (1991)
e contradizendo Cereda (2001); Aggarwall; Dollimore (1998), o padrão A está relacionado
a tubérculo, frutas e milho com alto teor de amilose. Enquanto que o padrão B está
associado a cereais. Em sua pesquisa, Karam (2003) citou divergências nos padrões
encontrados e os relacionados em literatura.
Neste estudo o padrão encontrado para o amido nativo de mandioca converge aos
resultados obtidos por Franco e Ciacco (1995), Karam (2003) e citado por
Biliaderis(1991).
250
Intensity
200
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 17 - Curva de difração de raios X do amido de mandioca nativo.
Durante a hidrólise observa-se que, assim como ocorreu com o amido de milho, os
picos mais evidentes foram alterados em sua intensidade (Figura 18 e Figura 19). Neste
caso, porém, com o passar da ação enzimática e o pico encontrado em 23º passa a ser
um dublete cada vez mais caracterizado.
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 18 - Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por uma hora.
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 theta
FIGURA 19 - Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por duas horas.
A (Figura 20) referente à curva da última etapa da hidrólise mostra que o dublete
em 23º já está bem caracterizado e o padrão citado nestas condições por alguns autores
é o B.
De acordo com Cereda (2001), alguns pesquisadores observaram a mudança na
cristalinidade do amido de batata, que possui o padrão B pertinente às tuberosas, para o
padrão A durante um tratamento hidrotérmico. Sugere-se que tal tratamento promove uma
recristalização na fécula, tornando-a parecida com o amido de milho.
250
200
Intensity
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
2 Theta
FIGURA 20 - Curva de difração de raios X do amido de mandioca hidrolisado por três horas.
De acordo com Biliaderis (1992) e Franco (2001) a região onde se encontra uma
maior concentração de amilopectina é também onde se encontra maior cristalinidade. Por
sua característica, é onde se encontra maior dificuldade de entrada de água e enzimas,
sendo mais resistente ao processo de hidrólise. Esta observação pode explicar o fato de
que durante a hidrólise, não foram observadas grandes alterações de cristalinidade uma
vez que a enzima utilizada atua especialmente na região amorfa dos grânulos.
Em seu estudo, Gallant et al.( 1997) sugeriram que as camadas cristalinas e
amorfas da amilopectina são organizadas dentro de estruturas maiores mais ou menos
esféricas chamadas bloquetes. O diâmetro destes bloquetes seria de 20 a 500 nm,
dependendo do tipo de amido. A localização destes, segundo os autores, seria fator
importante na maior ou menor resistência dos amidos à ação enzimática.
Desta forma, a amilopectina estaria localizada em regiões cristalinas e semicristalinas, sendo que nesta última, os bloquetes seriam menores e a cristalinidade da
amilopectina seria reduzida, especialmente devido ao seu maior envolvimento com a
amilose. A dimensão do bloquete parece ser fator importante na resistência no grânulo de
amido, no entanto, outros fatores devem ser considerados como teor de amilose,
localização e interação com amilopectina por sua relevância.
Em seu trabalho, Aggarwall e Dollimore (1998), estudaram a cristalinidade de
vários tipos de amidos, frente à ação de amiloglucosidade. No entanto, fora omitido na
situação o amido de mandioca. Para todos os outros estudados, a cristalinidade após a
atuação enzimática, ficou mais evidenciada.
5.4 TÉCNICAS TERMOANALÍTICAS
5.4.1 Termogravimetria
Segundo Agarwall e Dollimore (1998), o tratamento térmico em amidos
normalmente leva à sua despolimerização quando a temperatura aplicada excede os 300
ºC. O amido passa por uma série de alterações irreversíveis: num primeiro momento a
alteração estrutural leva o polímero a formação de pirodextrinas. Em temperaturas mais
elevadas ainda, a despolimerização das macromoléculas levam à formação de
levoluglucosana, furfural, produtos de baixo peso molecular e voláteis, enfim, produtos
carbonáceos (cinzas).
Como representado, as (Tabela 2 e Tabela 3) fornecem dados referentes ao
comportamento do amido de milho e mandioca respectivamente, durante o aumento
gradativo de temperatura a que foi submetido.
TABELA 2 – Avaliações das curvas termogravimétricas do amido de milho nativo e durante a hidrólise.
Amido de Milho:
Nativo
Após 1H
Após 2 H
Após 3 H
Umidade (%):
10,78
8,68
8,56
10,14__
Perda total de massa(%):
96,40
97,30
97,69
97,82__
On-Set (ºC):
297,10
292,25
292,80
282,84_
PICO DTG (ºC):
312,26
310,18
310,96
309,72_
As (Figura 21 e Figura 25) ilustram as perdas de massa dos amidos de milho e
mandioca nativos e as (Figura 22, Figura 23 , Figura 24, Figura 26, Figura 27 e Figura 28)
as sucessivas observações da hidrólise, bem como a diferença de temperatura entre a
amostra e a referência (DTA).
FIGURA 21 - Comportamento térmico do amido nativo de milho (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 22 - Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por uma hora (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 23 - Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por duas horas (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 24 - Comportamento térmico do amido de milho hidrolisado por três horas (-) TG e (...) DTA.
TABELA 3 – Avaliações das curvas termogravimétricas do amido de mandioca nativo e durante a
hidrólise.
Amido de Mandioca:
Umidade (%):
Nativo
9,88
Após 1H
11,03
Perda total de massa(%):
97,33
98,63
97,86
98,23
300,68
297,60
295,76
311,76
300,82
On-Set (ºC):
PICO DTG (ºC):
300,55
317,65
314,08
Após 2 H
8,55
Após 3 H
10,89
FIGURA 25 - Comportamento térmico do amido de mandioca nativo (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 26 - Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por uma hora (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 27 - Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por duas horas (-) TG e (...) DTA.
FIGURA 28 - Comportamento térmico do amido de mandioca hidrolisado por três horas (-) TG e (...) DTA.
Este estudo permite avaliar com precisão a umidade contida na amostra e foi
realizado assim como Soliman, El-Shinnawy e Morabak (1996) que utilizaram o limite de
temperatura de 150 ºC para tal avaliação. Observa-se que a perda de umidade e a perda
posterior de massa das amostras atingiram uma variação de aproximadamente 2 %. As
análises referentes ao amido de mandioca, ilustram resultados muito semelhantes de
perda de umidade quando comparados ao amido de milho.
De acordo com Aggarwall e Dollimore (1998), as fontes amiláceas possuem
resistividade térmica até aproximadamente 300 ºC, resultado que é confirmado pelo
presente estudo.
A temperatura de início de degradação, obtida pela união das tangentes de linha
base (Ionashiro, 2005), indicam que do estado nativo para o final da avaliação da
hidrólise, houve uma diferença de 14,26 ºC e 4,79 ºC para os amidos de milho e
mandioca respectivamente. Durante o experimento, foram utilizadas massas constantes,
descartando a possibilidade de se ter uma notável alteração nestes valores devido a este
fato.
Segundo Dollimore e Aggarwall (1998) durante a hidrólise enzimática, os grânulos
sofrem alterações estruturais de modo a disponibilizar uma maior área para a ação do
calor e conseqüentemente facilitando a degradação térmica. Estudando a modificação
estrutural de amidos por oxidação, Soliman, El-Shinnawy e Morabak (1996) também
observaram tal comportamento.
Estudando a degradação térmica de amidos e outros produtos, Aggarwall e
Dollimore (1997), observaram pela curva DTA que durante a perda de massa, ocorre
inicialmente uma combustão gasosa, sendo os gases liberados num amplo evento
exotérmico. A segunda perda corresponderia à ignição dos resíduos sólidos carbonáceos.
Os dados de termogravimetria derivada (DTG) são ilustrados nas (Figura 29 e
Figura 30) e segundo as (Tabela 2 e Tabela 3) onde são indicados os respectivos picos,
observa-se uma diferença de 2,54 ºC e 16,83 ºC do estado nativo ao final da observação
para os amidos de milho e mandioca respectivamente.
FIGURA 29 - Curvas de termogravimetria derivada para o amido de milho (─) nativo, hidrolisado por: (─)
uma hora, (─) duas horas e (─) três horas.
DrTGA
mg/min
DTA
uV
TGA
%
50.0
0.00
-0.50
0.0
-1.00
-50.0
-1.50
250.00
300.00
Temp
350.00
[C]
FIGURA 30 - Curvas de termogravimetria derivada para o amido de mandioca (─) nativo, hidrolisado por:
(─) uma hora, (─) duas horas e (─) três horas.
Em seu estudo, Dollimore e Aggarwall também obtiveram diferença em tal
resultado que, no entanto, foi mais expressivo por utilizarem outra enzima e com maior
tempo de hidrólise.
As curvas de termogravimetria derivada indicam com exatidão, as temperaturas
correspondentes ao início e ao instante em que a velocidade de ração é máxima
(Ionashiro, 2005).
5.4.2 Calorimetria Exploratória Diferencial
A energia requerida para a quebra da ordem molecular difere entre os grânulos de
amido de uma mesma fonte botânica, assim, a gelatinização (Figura 31, Figura 32, Figura
33, Figura 34, Figura 35, Figura 36, Figura 37 e Figura 38), ocorre em uma faixa de
temperatura (CEREDA, 2001). Conforme resultados fornecidos por DSC (Tabela 4), a
faixa de temperatura de gelatinização teve uma variação de menos de um grau Celsius
entre as amostras de mesma origem botânica.
TABELA 4 – Temperatura do início do processo, pico e valores de entalpia para amidos de milho (a) e
mandioca (b).
(a) Amido de Milho:
On-set (ºC):
Pico (ºC):
ΔH (J/G):
__
ΔH = entalpia de gelatinização.
Nativo
Após 1H
Após 2 H
59,85
65,65
9,90
58,94
65,12
10,75
59,75
65,40
14,75
Após 3 H
59,22
65,31
29,50
(b) Amido de Mandioca:
On-set (ºC):
Pico (ºC):
ΔH (J/g):
Nativo
Após 1H
57,92
63,43
12,89
Após 2 H
56,81
62,84
13,44
ΔH = entalpia de gelatinização.
FIGURA 31 - Curva de gelatinização do amido de milho nativo.
FIGURA 32 - Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por uma hora.
Após 3 H
56,97
62,67
13,18
58,84
62,64
23,62
FIGURA 33 - Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por 2 horas.
FIGURA 34 - Curva de gelatinização do amido de milho hidrolisado por 3 horas.
FIGURA 35 - Curva de gelatinização do amido de mandioca nativo.
FIGURA 36 - Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 1 hora.
FIGURA 37 - Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 2 horas.
FIGURA 38 - Curva de gelatinização do amido de mandioca hidrolisado por 3 horas.
Em seu estudo, Biliaderis et al. (1986) citam que o evento de gelatinização
depende da quantidade de água no sistema, sendo a curva mais definida e a uma
temperatura menor numa maior quantidade desta. O presente estudo confirma os picos
do evento encontrados por outros pesquisadores dentro de uma faixa citada (Franco et al,
1991; JACQUES; LYONS; KELSALL, 1999).
Jane et al. (1999) encontraram 69,4 ºC e 68,3 ºC para temperatura de pico de
gelatinização de milho e mandioca nativos respectivamente. Resultados que divergem
dos obtidos por Karam (2003) que obteve valores correspondentes a 72,4 ºC e 70,0 ºC.
Os resultados indicam que possivelmente as pastas de amido sofrem entumescimento do
grânulo em momentos diferentes quando aquecidos com excesso de água.
Além do mais, não se podem descartar fatores pertinentes aos resultados da
análise térmica que são: razão de aquecimento; natureza do suporte de amostras;
profundidade do raio do orifício de suporte no qual é colocada a amostra;
localização, natureza e dimensões dos termopares diferenciais; natureza da
substância inerte utilizada como referência; compactação da amostra; utilização de
tampa sobre o orifício da amostra e influência da atmosfera do forno (IONASHIRO,
2005).
Os resultados obtidos por Aggarwaal, Dollimore (1998), que utilizaram diferentes
tipos de amidos sujeitos à ação da amiloglucosidase, a diferenças de picos de
gelatinização foram de aproximadamente até 1 ºC entre os amidos nativos e hidrolisados
do mesmo tipo.
Levando-se em consideração alguns fatores como as diferentes origens dos
amidos, mesmo sendo eles da mesma fonte botânica, a utilização de diferentes
equipamentos, o que implica pelo menos numa geometria diferenciada do forno e outros,
não desconsiderar nenhum dos resultados obtidos, uma vez que a temperatura de
gelatinização do amido de milho, neste estudo, foi sempre mais elevada quando
comparada ao amido de mandioca.
5 CONCLUSÃO
No presente trabalho foram investigadas características estruturais dos amidos de
milho e mandioca, utilizando-se de técnicas termoanalíticas e outras complementares,
onde foram obtidas as seguintes conclusões:
● Através da ação enzimática, houve a produção de glicose e açúcares redutores a partir
dos amidos de milho e mandioca. Os resultados confirmam que a enzima atuou durante
as três horas de observação, uma vez que os valores obtidos para ambos os parâmetros
foram crescentes para as duas fontes vegetais.
● A microscopia mostrou que os grânulos de amido de milho e mandioca nativos
analisados, possuem morfologia
descrita na literatura. A técnica também auxiliou a
entender os resultados obtidos na atividade enzimática, uma vez que pelas micrografias
observou-se que a enzima atua sobre os grânulos inicialmente na superfície e
especialmente nas irregularidades dos mesmos.
● A análise da
cristalinidade dos grânulos obtida através de difração por raios X,
confirmou que no amido de milho, além do padrão do estado nativo não ter sido alterado,
seus picos mais evidentes aumentaram de intensidade e mostraram características mais
cristalinas ao final da observação. No acaso do amido de mandioca, a análise mostrou
mudanças especialmente no surgimento de um dublete em 23º, o que é característico de
seu padrão segundo alguns autores. As alterações provavelmente se devem ao fato de
que especialmente a região amorfa, associada à amilose, os grânulos é preferivelmente
convertida pela atividade enzimática.
● A termogravimetria mostrou que os amidos possuem higroscopicidade particulares,
ainda, que a sua estabilidade térmica é de aproximadamente 300 ºC confirmando o
resultado encontrado por outros autores. Os resultados também evidenciaram que com o
progresso da atividade enzimática, os grânulos acabam disponibilizando uma maior área
para a atuação do calor, assim, a sua degradação cada vez ocorre a temperaturas mais
baixas.
● Análises de DSC ilustraram com precisão um evento particular aos amidos de grande
importância para a indústria: a gelatinização. Os resultados mostram que os picos
praticamente não sofreram deslocamento na comparação do estado nativo com o avanço
da hidrólise. No entanto, a observação do aumento de entalpia requerida ao processo,
evidencia que uma crescente proporcionalidade de material com característica cristalina
encontrado a cada observação. A cristalinidade do amido, é associada à presença de
amilopectina, que provavelmente não sofreu a intensidade do ataque enzimático como
ocorreu na região amorfa.
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