UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
CURSO DE FISIOTERAPIA
DANIELA BOAROLI
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA FONOFORESE NA CICATRIZAÇÃO
EPITELIAL ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO
CRICIÚMA, JULHO DE 2009
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DANIELA BOAROLI
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA FONOFORESE NA CICATRIZAÇÃO
EPITELIAL ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO
Trabalho de Conclusão do Curso, apresentado
para obtenção do grau de Fisioterapeuta no
Curso de Fisioterapia da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. MSc Tiago Petrucci de Freitas
Co-orientador: Dr. Emilio L. Streck
CRICIÚMA, JULHO DE 2009
3
4
Dedico este trabalho aos meus pais,
Sonia e Sidnei, pelo apoio, incentivo
e oportunidades oferecidas durante
este trajeto.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida, por ter me ajudado a chegar até
aqui, dando força necessária para superar todos os obstáculos.
À minha família, especialmente meus pais, Sidnei e Sonia, por ter me auxiliado na
minha formação tanto profissional quanto educacional. Investindo para que eu
pudesse ter uma boa profissão.
Ao meu namorado André, pela paciência, apoio e auxílio para realizar este trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Mestre Tiago Petrucci de Freitas, pelos ensinamentos,
dedicação e participação na execução desse trabalho.
À Profª. Bárbara Coelho, pela sua disponibilidade e dedicação.
Aos meus colegas e amigos, que estiveram presentes nestes cinco anos de
caminhada e encerram comigo mais esta jornada, obrigada pela amizade,
companheirismo e auxílio na execução de algumas tarefas.
Aos colegas do Laboratório de Fisiopatologia Experimental e Laboratório de
Fisiologia e Bioquímica do Exercício pela ajuda nos experimentos, em especial ao
Prof. Dr. Emílio Streck, por abrir as portas do laboratório e permitir que este
trabalho fosse realizado.
Aos membros da banca, por aceitarem o convite e se mostrarem dispostos a me
avaliar.
Enfim, a todos que de alguma forma, colaboraram para a conclusão deste trabalho.
Muito obrigada!
6
“O primeiro passo para chegar a
qualquer lugar é decidir que não
vais permanecer onde estás.”
J. Morgan
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RESUMO
A pele sendo o órgão mais extenso do corpo humano, protege o mesmo do
ambiente externo e tem diversas funções. Em resposta a uma lesão tecidual, há o
desencadeamento de um complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e
bioquímicos. O processo de cicatrização ocorre para restaurar a integridade
anatômica e funcional do tecido lesado, ocorrendo em três fases. O Ultrassom
terapêutico é muito utilizado no tratamento de lesões de tecidos moles, promovendo
o reparo tecidual. Na fisioterapia a fonoforese vem sendo amplamente utilizada,
associada a vários agentes antiinflamatórios. No presente estudo destacamos a
utilização do gel extrato glicolítico de Mikania laevigata associado ao Ultrassom
terapêutico no processo de evolução cicatricial epitelial em dorso de ratos Wistar.
Foi analisada a evolução cicatricial através do tamanho da ferida, medida de
espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, medida de grupos carbonil e grupos
sulfidrila. Metodologia: Foram utilizados 15 ratos Wistar submetidos à lesão epitelial
localizadas no dorso do animal. Os ratos foram divididos em três grupos, grupo
carbopol com Ultrassom, e os animais foram tratados com Ultrassom terapêutico
pulsado, com dose de 0,8 w/cm 2 durante 3 minutos. Grupo de extrato glicolítico e
grupo de extrato glicolítico associado ao Ultrassom, utilizando também o Ultrassom
terapêutico pulsado, com dose de 0,8 w/cm 2 durante 3 minutos. Os animais foram
tratados diariamente durante 10 dias, sendo que logo após o tratamento, os mesmos
foram decapitados e o tecido irradiado ao redor da ferida foi removido cirurgicamente
para posterior análise bioquímica. No primeiro, quinto e décimo dia também foi
mensurado o tamanho da ferida através de um paquímetro. Resultados: quanto ao
tamanho da ferida não houve diferença significativa entre os três grupos. Em relação
ao TBARS houve diferença significativa no grupo extrato glicólico com Ultrassom em
relação ao grupo carbopol com Ultrassom. Com relação à proteína carbonil, houve
uma diferença significativa no grupo extrato glicólico com Ultrassom em relação ao
grupo carbopol com Ultrassom. No grupo sulfidrila, houve diferença significativa no
grupo extrato glicólico com e sem Ultrassom, quando comparados ao grupo carbopol
com Ultrassom. Conclusão: O Ultrassom pulsado associado ao extrato glicólico de
Mikania laevigata exerce influência significativa no processo de cicatrização de
feridas cutâneas induzidas em ratos.
Palavras-chave: cicatrização epitelial. Ultrassom terapêutico. Extrato glicolítico de
Mikania laevigata.
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ABSTRACT
The skin is the largest organ of the human body, it protects the external environment
and has several functions. In response to tissue injury, there is a trigger for a
complex set of vascular events, cellular and biochemical. The process of healing is to
restore anatomical and functional integrity of damaged tissue, occurring in three
phases. The therapeutic ultrasound is widely used in the treatment of injuries of soft
tissue, promoting tissue repair. In the fonoforese therapy has been used extensively,
together with several anti-inflammatory. In this study highlight the use of gel extract of
Mikania laevigata glycolytic associated with therapeutic ultrasound in the process of
evolution in epithelial healing back of rats. Was analyzed through the evolution of
healing the wound size, extent of thiobarbituric acid reactive species, extent of
carbonyl groups and sulfhydryl groups. Methodology: We used 15 Wistar rats
underwent epithelial lesion located in the back of the animal. The rats were divided
into three groups, group carbopol with ultrasound, and the animals were treated with
therapeutic ultrasound pulse with a dose of 0.8 w / cm² for 3 minutes. Group extract
glycolytic and glycolytic extract group associated with the ultrasound, also using the
pulsed ultrasound treatment, with dose of 0.8 w / cm² for 3 minutes. The animals
were treated daily for 10 days, whereas after the treatment, they were beheaded and
irradiated tissue around the wound was surgically removed for further biochemical
analysis. In the first, fifth and tenth day was also measured the size of the wound
using a caliper. Results: about the size of the wound there was no significant
difference between the three groups. In relation to TBARS significant difference in
the glycolic extract with ultrasound in the ultrasound group with carbopol. Regarding
the protein carbonyl, a significant difference in the group with glycolic extract
ultrasound in the group with ultrasound carbopol. In sulfhydryl group, significant
difference in the glycolic extract with and without ultrasound, when compared to the
group with ultrasound carbopol. Conclusion: The ultrasonic pulse associated with
glycolic extract of Mikania laevigata exerts significant influence in the process of
healing of skin wounds in rats induced.
Keywords: epithelial healing. Therapeutic ultrasound. Glycolytic extract of Mikania
laevigata.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do tecido epitelial........................................17
Figura 2 - Detalhe das folhas da Mikania Laevigata..................................................25
Figura 3 - Estresse Oxidativo.....................................................................................28
Figura 4 - Caixa de ratos............................................................................................31
Figura 5 - Modelo de lesão epitelial............................................................................32
Figura 6 - Tamanha da Ferida (cm)............................................................................37
Figura 7 - Efeitos do ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre as
espécies reativas de ácido tiobarbitúrico....................................................................38
Figura 8 - Efeitos do ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata sobre o
carbonil.......................................................................................................................39
Figura 9 - Efeitos do ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata em
relação a sulfidrila.......................................................................................................40
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm – Micrometro
cm – Centímetros
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
FISIOPAT – Laboratório de Fisiopatologia Experimental
MHz – Mega Hertz
pH – Potencial Hidrogênio-Iônico
SPSS – Statistical Package for the Social Sciences
TBARS – Espécies Reativas de Ácido Tiobarbitúrico
UNESC – Universidade do Extremo Sul Catarinense
US – Ultrassom
UST – Ultrassom Terapêutico
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................12
2 REFERENCIAL TEÓRICO......................................................................................16
2.1 Tecido epitelial....................................................................................................16
2.2 Lesão e cicatrização epitelial............................................................................18
2.3 Ultrassom............................................................................................................20
2.3.1 Aspectos gerais.............................................................................................20
2.3.2 Efeitos do ultrassom.......................................................................................21
2.3.3 Terapia ultrassônica e a lesão epitelial.........................................................22
2.3.4 Fonoforese.......................................................................................................23
2.4 Etnofarmacologia...............................................................................................24
2.4.1 Mikania laevigata.............................................................................................25
2.5 Espécies reativas de oxigênio..........................................................................26
2.5.1 Definição..........................................................................................................26
2.5.2 Estresse oxidativo...........................................................................................28
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................30
3.1 Caracterização da pesquisa..............................................................................30
3.2 Caracterização das amostras............................................................................30
3.3 Instrumentos.......................................................................................................31
3.4 Procedimentos para coleta de dados...............................................................32
3.4.1 Preparação do Extrato glicólico de Mikania Laevigata..............................34
3.4.2 Descrição da técnica de maceração............................................................34
3.5 Procedimentos para análise de dados.............................................................35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................36
5 CONCLUSÃO.........................................................................................................42
6. PERSPECTIVAS....................................................................................................43
REFERENCIAS..........................................................................................................44
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1 INTRODUÇÃO
A pele constitui o mais extenso órgão sensorial do corpo (GUIRRO e
GUIRRO, 2002). Tem como função evitar a perda de líquidos corporais, sintetizar
vitamina D, auxiliar na regulação da temperatura corporal, função como órgão
excretor e sensorial (MOFFAT e HARRIS, 2007). A pele é constituída por duas
camadas: epiderme e derme, abaixo está a hipoderme, que embora tenha a mesma
origem e morfologia da derme não faz parte da pele (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Quando ocorre uma lesão tecidual, há o desencadeamento de um
complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e bioquímicos que tem como
objetivo substituir as células mortas ou imperfeitas por células saudáveis, ocorrendo
o processo de reparação tecidual (THOMAZ, et al., 1996). O processo de
cicatrização ocorre para restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido
lesado, ocorrendo fundamentalmente em três fases: inflamatória, de regeneração e
remodelamento (KISNER e COLBY, 2005).
O ultrassom terapêutico (UST) é um dos recursos mais utilizados na
Fisioterapia (KARNES e BURTON, 2002). É amplamente usado no tratamento de
lesões de tecidos moles agindo nas fases do mecanismo fisiológico da lesão. A
terapia ultrassônica somente pode ser segura se o terapeuta dispõe de um amplo
conhecimento do processo envolvido (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas, mastócitos,
macrófagos e neutrófilos envolvidos na fase inflamatória do processo de
regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização (KITCHEN e BAZIN,
2001; LOW e REED, 2001). O Ultrassom na cicatrização de tecidos promove ainda
um aumento na síntese de colágeno, uma maior resistência, maior capacidade de
absorver energia, aumento do fluxo sanguíneo e a facilitação na proliferação de
fibroblastos e a síntese de proteínas (JACKSON et al., 1991).
A utilização da energia ultrassônica associada a um fármaco é chamada
de fonoforese, que tem como finalidade liberar substâncias medicamentosas na
corrente sanguínea, fazendo penetrar mais profundamente no tecido inflamado o
fármaco utilizado (STARKEY, 2001). A fonoforese aumenta a temperatura e
hidratação do tecido, pressão da onda de radiação, aumenta a energia cinética da
droga, e altera os potenciais de membrana (BARE et al., 1996). Na fisioterapia a
13
fonoforese vem sendo amplamente utilizada, associada a vários agentes
antiinflamatórios (MITRAGOTRI, 2000), mas ainda levanta duvidas quanto à
confiabilidade de seus efeitos positivos, necessitando de novas investigações
(PARIZOTTO, 2003).
Aliada ou não à fonoforese, o uso de plantas medicinais vem crescendo a
cada dia. Está sendo amplamente utilizada por grande parte da população mundial
como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996). Pode-se destacar a
Mikania laevigata, uma espécie vegetal nativa do sul do Brasil (SIMÕES et al.,
1998), pertencente à família Asteraceae, conhecida popularmente por Guaco
(REITZ, 1989).
O gênero Mikania já era utilizado na medicina popular para o tratamento
de
diversas
enfermidades,
devido
às
suas
propriedades
antimicrobianas,
antiinflamatórias e analgésicas (FERRO, 1991). A cumarina é o principal
componente químico da Mikania, ocorre em abundância nas folhas do guaco
(EVANS, 1996).
Onde temos um processo cicatricial, esta envolvida uma cascata de
acontecimentos, nesta o Estresse Oxidativo aumenta após iniciada a lesão, isso
ocorre devido à presença de neutrófilos e macrófagos nesse local. A produção de
radicais livres causa dano nas membranas lipídicas e produz necrose nas células
(TOUMI e BEST, 2006; TOUMI et al., 2006).
Frente às condicionantes expostas anteriormente, apresentam-se a
seguinte questão problema: O ultrassom terapêutico associado ao gel de extrato
glicólico de Mikania Laevigata acelera o processo cicatricial induzido por dano
epitelial em ratos?
Baseando-se na questão problema, definiram-se as seguintes questões a
investigar:
1) O ultrassom acelera o processo cicatricial com o uso do antiinflamatório
em forma de gel de Mikania Laevigata?
Alguns autores têm demonstrado que o ultrassom aumenta a penetração
em relação à quantidade e profundidade de algumas drogas através da pele,
portanto essa combinação de ultrassom com o uso do antiinflamatório (Mikania
laevigata) em gel tem grandes chances de ter um resultado positivo em relação ao
processo cicatricial.
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2) A utilização do ultrassom terapêutico com o uso do extrato glicólico de
Mikania laevigata diminui o estresse oxidativo, provocado pelo processo de reparo?
Um fator considerável para o sucesso das ondas ultrassônicas na cicatriz
epitelial é a de favorecer a migração de fibroblastos e a síntese de colágeno ao local
lesado na fase de inflamação e de proliferação, diminuindo o extresse oxidativo,
segundo estudos do nosso grupo de pesquisa. Com o uso do extrato sob a forma
glicólica, com ou sem o ultrassom, sabemos apenas que possui excelente atividade
antiinflamatória, mas quanto ao dano oxidativo não se tem relatos.
3) Qual a técnica ideal para o reparo do tecido epitelial?
Ainda não se tem um estudo com o uso da fonoforese (guaco) como fator
de condução aparelho-animal, mas acredita-se que o uso das propriedades
medicinais do guaco poderá levar a uma cicatrização mais rápida ao uso comum da
técnica ultrassom-lesão, comumente usado na fisioterapia.
Esta pesquisa tem como objetivo geral analisar o processo de evolução
cicatricial epitelial com o uso do ultrassom terapêutico com gel carbopol em relação
ao uso do ultrassom terapêutico associado ao gel de extrato glicólico de Mikania
laevigata. Objetiva ainda verificar o efeito do tratamento de ultrassom terapêutico
com extrato glicólico de Mikania Laevigata sob lesões epiteliais de ratos através dos
seguintes parâmetros: medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS), um marcador de lipoperoxidação; analisar a medida de grupos carbonil,
medida de dano oxidativo em proteínas; e analisar a medida de grupos sulfidrila,
marcadores de oxidação de proteínas.
A pele é um órgão do corpo humano que protege do ambiente externo,
em especial das bactérias. Em resposta a um traumatismo tecidual, podem ocorrer
infecções, comprometimento do sistema imunológico, invasões por células
carcinogênicas, perda de fluídos, hipotermia, entre outros.
Uma forma comum de lesão epitelial é a úlcera de pressão, onde alguns
pacientes evoluem para óbito. É de grande importância que a recuperação dessas
lesões seja rápida, onde muitas vezes acaba sendo um desafio para os profissionais
da saúde.
Tratamentos para aumentar o processo normal de reparo e regeneração
do tecido, são muito importantes para esses pacientes. O ultrassom terapêutico tem
sido utilizado para promover o reparo tecidual, especialmente para aumentar a
proliferação de células e a síntese protéica.
15
A possibilidade de acelerar a cicatrização e o fechamento de lesões
cutâneas, através de recursos químico-medicamentosos ou físicos, tem sido objeto
de investigação de inúmeros pesquisadores.
Com a utilização do ultrassom associado ao gel glicolítico de Mikania
laevigata, na recuperação dessas lesões, há possibilidades de acelerar o processo
de cicatrização no tecido lesado, pois essa planta medicinal possui grandes
propriedades antiinflamatórias, podendo levar a uma regeneração mais rápida do
tecido lesado. É uma espécie com grande quantidade de cumarina, sendo o principal
componente químico e provavelmente tendo um efeito biológico importante.
O guaco, como é conhecido popularmente, é um produto de baixo custo
comercial, sendo bem acessível. Além disso, poucos estudos foram realizados com
a Mikania Laevigata.
O presente estudo encontra-se dividido em cinco blocos temáticos, sendo
o primeiro, a introdução, 2° referencial teórico, 3° materiais e métodos, 4° análise e
discussão de dados e 5° conclusão, seguido das referencias bibliográficas e
apêndices.
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2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Tecido epitelial
A pele constitui o mais extenso órgão sensorial do corpo (GUIRRO e
GUIRRO, 2002). É um sistema de camadas composto pela epiderme, derme e o
tecido subcutâneo (MOFFAT e HARRIS, 2007). Outro autor cita que a pele é
constituída por duas camadas, epiderme e derme, abaixo está à hipoderme, que
embora tenha a mesma origem e morfologia da derme não faz parte da pele
(GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A epiderme que é a camada mais externa da pele, sendo composta pelo
estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinhoso e estrato basal
(GUIRRO e GUIRRO, 2002), tem aproximadamente 15 µm de espessura
(MITRAGOTRI, 2000). O estrato córneo é constituído de ceratinócitos que se
alongaram e perderam seus núcleos, atua como uma barreira para ameaças
externas. Os ceratinócitos são responsáveis pela produção de ceratina, essas
células evitam a perda de água e formam uma proteção contra microorganismos e
agentes irritantes. Danos no estrato córneo aumentam o pH da pele, e assim, sua
suceptibilidade a infecção por bactérias (MOFFAT e HARRIS, 2007).
Segundo o mesmo autor, a camada seguinte é o estrato lúcido, abaixo do
estrato lúcido é encontrado o estrato granuloso, ambas compostas por ceratinócitos
achatados. Abaixo, está o estrato espinhoso, contendo ceratinócitos maduros. A
última camada que é o estrato basal é constituída de uma camada celular de
ceratinócitos que estão em divisão celular contínua, migrando para a superfície da
pele e formando as camadas funcionais mais externas da epiderme.
A segunda camada da pele é a derme, com espessura média de dois (2)
milímetros (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A derme contém vários tipos diferentes de
células, incluindo fibroblastos e fibrócitos, macrófagos, mastócitos e leucócitos
sangüíneos,
particularmente
neutrófilos,
eosinófilos,
linfócitos
e
monócitos
(ARNOLD, et al., 1994). É diferenciada em camada papilar, mais superficial, e
camada reticular, mais profunda (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
17
A camada papilar é constituída por tecido conjuntivo frouxo, tendo como
função aumentar a zona de contato derme-epiderme, trazendo maior resistência à
pele. Apresenta um suprimento sanguíneo bastante rico (GUIRRO e GUIRRO,
2002). A derme reticular é constituída por tecido conjuntivo denso, com fibroblastos
que secretam colágeno e elastina (MOFFAT e HARRIS, 2007). Na camada reticular
os capilares são raros (GUIRRO e GUIRRO, 2002). Estas estruturas são importantes
para a regeneração da pele após a lesão (MOFFAT e HARRIS, 2007). Na presença
de uma lesão, ocorrem diferentes alterações nas fibras elásticas e colágenas, na
substância fundamental amorfa e nos fibroblastos (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Abaixo está a hipoderme, também conhecida como tecido subcutâneo.
Esta por sua vez, sustenta a derme e a epiderme, sendo constituída de tecido
adiposo, tecido conectivo e tecido elástico (MOFFAT e HARRIS, 2007). A hipoderme
fixa a pele às estruturas subjacentes (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Figura 1: Representação esquemática do tecido epitelial
Fonte: GUIRRO & GUIRRO (2004).
18
2.2 Lesão e cicatrização epitelial
As úlceras de decúbito são formas comuns de lesões epiteliais, que
ocorrem na maioria das vezes em pacientes acamados, devido às forças de
compressão e atrito quando da imobilidade do mesmo, sendo necessária uma
cicatrização rápida dessas feridas (DINI et al., 2006).
Com a perda da integridade da pele, poderá levar a um aumento da perda
de fluídos, infecções, comprometimento do sistema imunológico, invasões por
células carcinogênicas e hipotermia (WYSOCKI, 1999).
Em resposta a uma lesão tecidual, há o desencadeamento de um
complicado conjunto de eventos vasculares, celulares e bioquímicos que tem como
objetivo substituir as células mortas ou imperfeitas por células saudáveis, ocorrendo
o processo de reparação tecidual (THOMAZ, et al., 1996). O processo de
cicatrização ocorre fundamentalmente em três fases: inflamatória, de regeneração e
remodelamento (KISNER e COLBY, 2005).
A fase inflamatória ocorre nas primeiras doze horas após a lesão
(GUIRRO e GUIRRO, 2002), envolve respostas celulares, vasculares e químicas do
tecido. Há processos fisiológicos nessa fase que servem como mecanismo de
proteção, estímulo para subseqüente regeneração e reparo que são: formação de
novos capilares, atividade fibroblástica inicial, fagocitose, neutralização dos irritantes
químicos (KISNER e COLBY, 2005).
Os neutrófilos são os primeiros a ingressar no leito da ferida (GUIRRO e
GUIRRO, 2002), a marginação neutrofílica é observada à medida que os leucócitos
começam a aderir ao epitélio lesionado (MOFFAT e HARRIS, 2007). Tendo como
função eliminar do local com lesão as partículas estranhas, como exemplo as
bactérias e debris teciduais lesionados (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Os macrófagos ingressam logo em seguida aos neutrófilos (GUIRRO e
GUIRRO, 2002). Os macrófagos e fibroblastos são ativados produzindo um sinal
quimiotático adicional para células inflamatórias circulantes, por isso, a inflamação
aguda é considerada a proteção do corpo em resposta ao tecido lesado. (TIDBALL,
1995; JÄRVINEN et al., 2005; TOUMI et al., 2006). Os macrófagos auxiliam na
regulação da resposta inflamatória assim como na descontaminação (MOFFAT &
HARRIS, 2007).
19
Logo após três dias da lesão, inicia-se a fase proliferativa (GUIRRO e
GUIRRO, 2002), a inflamação começa a diminuir, é iniciada então a segunda fase
de cicatrização da ferida, o reparo do local da lesão e resolução do coágulo. O
que caracteriza esse estágio são a síntese e a deposição de colágeno. Há o
crescimento de capilares nessa área, aumento da atividade fibroblástica, que
produzem novo colágeno e desenvolvimento do tecido de granulação (KISNER e
COLBY, 2005).
É importante ressaltar a atividade dos fibroblastos, por sintetizarem o
colágeno, que é a substância responsável pela força tênsil e integridade do tecido,
que sustenta uma recente e frágil rede de capilares e mantém a base para a
formação do tecido de granulação (MODOLIN e KAMAKURA, 1981).
Por volta do quinto dia começa a atividade miofibroblástica, causando a
contração da cicatriz (KISNER e COLBY, 2005). O fechamento da ferida ocorre
como resultado da granulação, da contração e eventual epitelialização a partir da
periferia da lesão (MOFFAT e HARRIS, 2007). Nessa fase o tecido conjuntivo ainda
é fino e desorganizado (KISNER e COLBY, 2005).
A terceira e última fase é a de maturação ou remodelagem, na qual o
tecido de granulação é substituído pelo fibroso, há uma predominância de
fibroblastos facilmente remodelados, tentando adaptar-se à orientação e função
do tecido
original. Esta fase pode continuar por meses ou até anos após a
ocorrência da fase proliferativa do reparo (KITCHEN e BAZIN, 2001; STARKEY,
2002; LOW e REED, 2003; ZAMMIT et al., 2006). A reorganização do colágeno
inclui redução e diminuição da espessura do colágeno depositado (MOFFAT e
HARRIS, 2007).
Alguns fatores podem afetar o processo de reparação tissular, dentre eles
estão: a localização anatômica da ferida, a presença de infecção, tecido
desvitalizado, a idade, a imobilidade, o estado nutricional, doenças associadas e o
uso de medicamentos contínuos (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
20
2.3 Ultrassom
2.3.1 Aspectos gerais
O ultrassom terapêutico (UST) é um dos recursos mais utilizados na
Fisioterapia (KARNES e BURTON, 2002). As ondas ultrassônicas são geradas por
um dispositivo chamado de transdutor, que contém uma pastilha de material
piezoelétrico. A piezoeletricidade é um fenômeno natural, encontrado em certos
cristais, que têm a capacidade de transformar energia mecânica em elétrica e viceversa (KANH, 1991).
A terapia ultrassônica na Fisioterapia é definida pelas oscilações de
ondas cinéticas ou mecânicas produzidas pelo transdutor vibratório, que aplicado
sobre a pele atravessa e penetra no organismo em diferentes profundidades,
dependendo da freqüência, que varia de 0,75 a 3,0 MHz, sendo utilizado no
tratamento de pequenas lesões, acelerando o processo de cicatrização muscular e
epitelial (HAAR, 2007; ROBERTSON e WARD, 1997).
É amplamente utilizado no tratamento de lesões de tecidos moles agindo
nas fases do mecanismo fisiológico da lesão. A terapia ultrassônica somente pode
ser segura se o terapeuta dispõe de um amplo conhecimento do processo envolvido
(GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Os agentes de acoplamento são usados nas aplicações do ultrassom
terapêutico em virtude deste não se propagar no ar, fazendo com que quase toda a
intensidade incidente seja transmitida (GUIRRO e SANTOS, 1997).
O gel é o meio que melhor transmite a onda ultrassônica, sendo, portanto,
o agente de acoplamento de US mais indicado. Para a fonoforese, com formulações
farmacológicas com fins terapêuticos para tratamentos específicos, a base dessa
formulação deve ser preferencialmente o gel (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
21
2.3.2 Efeitos do Ultrassom
Uma série de fatores será considerado após as ondas ultrassônicas
atingir uma determinada região, tais como: intensidade, freqüência, tempo de
aplicação, área do transdutor, regime do pulso, agente de acoplamento. Quanto
maior a freqüência utilizada, maior será a absorção nos tecidos superficiais e menor
será a profundidade de penetração, por isso as freqüências mais elevadas são
utilizadas nos tratamentos de tecidos superficiais (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
São classificados como térmico e não térmico os mecanismos físicos
envolvidos na terapêutica do ultrassom que induzem respostas clinicamente
significantes sobre as células, tecidos, órgãos e organismos. Os efeitos físicos
desejáveis causam o aumento da permeabilidade celular, da síntese protéica,
do
fluxo
de
íons de
cálcio e
da
passagem
de metabólitos
através
da
membrana celular, o que contribui de forma positiva na reparação tecidual (DYSON,
1987).
As ondas ultrassônicas podem ser aplicadas por dois métodos
conhecidos como contínuo e pulsado (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A diferença entre
os modos está na interrupção da propagação das ondas, sendo que prevalece o
efeito térmico com o feixe contínuo. A intensidade da radiação ultrassônica é fator
essencial para o sucesso de qualquer terapia (GUIRRO e SANTOS, 1997).
No mecanismo térmico, o tecido biológico é aquecido ao absorver parte
da energia ultrassônica, quando o mesmo atravessa esse tecido. O aumento da
temperatura provoca ação analgésica, antiinflamatória ou antiespasmódica na zona
tratada. Melhora a circulação do local e regional, promovendo uma leve hiperemia
(KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2001; MACHADO, 1991).
No mecanismo não térmico ou mecânico do ultrassom, os efeitos físicos
são produzidos pela cavitação, correntes acústicas, ondas estacionárias e cavitação
(LOW e REED, 2001). Destaca-se a cavitação, que são oscilações provocadas pelo
feixe ultrassônico que atravessa os tecidos. Acelerando a velocidade de difusão de
íons através da membrana celular e o intercâmbio de fluidos, favorecendo o
processo de difusão e melhorando o metabolismo celular. O potencial da membrana
é alterado, produzindo a sua despolarização. Além disso, regula o desequilíbrio,
auxilia a liberação de aderências, pela separação das fibras colágenas. A cavitação,
22
devido ao efeito mecânico (vibrações sônicas) que o US provoca, gera calor por
fricção (SILVA, 1987; MACHADO, 1991)
As mudanças biológicas do mecanismo não térmico do ultrassom seriam
o aumento da permeabilidade das membranas e difusão celular; aumento do
transporte dos íons de cálcio através das membranas das células, de granulação e
de mastócitos; liberação de histaminas e agentes quimiotáxicos, aumento da taxa de
sínteses de proteínas, aumento da síntese de colágeno, aumento da elasticidade do
colágeno, aumento da atividade enzimática nas células, diminuição da atividade
elétrica dos tecidos, promoção da oscilação dos tecidos, do movimento dos fluídos e
da circulação nos vasos sanguíneos expostos a ondas estáveis (FUIRINI e LONGO,
1996).
Com relação aos efeitos térmicos há o aumento da taxa metabólica dos
tecidos,
promoção
de
mudanças
vasculares
concomitantes,
aumento
da
extensibilidade do colágeno, aumento das propriedades viscoelásticas dos tecidos
conjuntivos, diminuição de espasmos musculares, aumento da taxa de atividade
enzimática (FUIRINI e LONGO, 1996).
2.3.3 Terapia ultrassônica e a lesão epitelial
O ultrassom na cicatrização de tecidos promove um aumento na síntese
de colágeno, na velocidade de cicatrização, uma maior resistência, maior
capacidade de absorver energia, aumento do fluxo sanguíneo e a facilitação na
proliferação de fibroblastos e a síntese de proteínas (JACKSON et al., 1991).
Na fase inflamatória, a terapia por US influência a atividade das células,
plaquetas, mastócitos, macrófagos e neutrófilos envolvidos nesta fase do processo
de regeneração
tecidual, acelerando o
processo de cicatrização.
As forças
geradas pelas correntes acústicas alteram a permeabilidade da membrana e das
plaquetas, levando à liberação de serotonina. Em resposta ao aumento dos níveis
de cálcio intracelular, os mastócitos terão rompimento de sua membrana, liberando
histamina (AGNE, 2005; LOW e REED, 2001; SALGADO, 1999; KITCHEN e BASIN,
2001).
23
O ultrassom tem o potencial de acelerar a resolução normal da inflamação
desde que o estímulo inflamatório seja removido. Essa aceleração pode também
dever-se à suave agitação do líquido dos tecidos que pode aumentar a taxa de
fagocitose e o movimento das partículas e células (AGNE, 2005; LOW e REED,
2003; KITCHEN e BASIN, 2001).
Na fase proliferativa, os fibroblastos são estimulados a produzir mais
colágeno, parece ocorrer devido ao aumento na permeabilidade da membrana
celular, causado pelo ultrassom, permitindo entrada de íons de cálcio que controlam
a atividade celular. Ainda nessa fase, outro efeito está relacionado ao aumento da
velocidade de angiogênese e aumento na secreção de colágeno presentes nesta
fase (LOW e REED, 2001).
O período de remodelamento é um processo que pode levar meses ou
anos, a remodelação continua até que o novo tecido atinja características
semelhantes às do tecido anterior à lesão, onde o colágeno do tipo III é substituído
por colágeno do tipo I (GUIRRO e GUIRRO, 2002). O tratamento com ultrassom é
realizado desde o processo inflamatório até a fase de remodelagem, é ofertado
melhor resistência tênsil e elasticidade de colágeno maduro (KITCHEN e BAZIN,
2001; LOW e REED, 2001).
2.3.4 Fonoforese
Na fisioterapia a fonoforese vem sendo amplamente utilizada, associada a
vários agentes antiinflamatórios (MITRAGOTRI, 2000), mas ainda levanta duvidas
quanto à confiabilidade de seus efeitos positivos, necessitando de novas
investigações (PARIZOTTO, 2003).
A fonoforese, conhecida também como Sonoforese, é uma forma de
acoplamento direto que realiza o transporte transdérmico através do ultrassom para
facilitar a penetração dos medicamentos aplicados topicamente. O ultrassom
terapêutico (UST) aumenta a penetração transcutânea por pressão somática,
podendo chegar em média a atingir entre 4-5cm de profundidade (AGNE, 2005,
MACHADO, 2001), tendo como
vantagem à
utilização do fármaco sem que o
24
mesmo passe pelo fígado, diminuindo os efeitos sistêmicos da medicação
(STARKEY, 2002).
Há propostas para o mecanismo fisiológico pelo qual a fonoforese age,
mas ainda não é bem conhecido. Dentre eles, a fonoforese aumenta a temperatura e
hidratação do tecido, pressão da onda de radiação, aumenta a energia cinética da
droga, e altera os potenciais de membrana (BARE et al, 1996).
A cavitação ultrassônica é responsável pela permeabilização de células e
tecidos.
O ultrassom promove o
aumento da
permeabilidade da
sendo o fator que torna possível a maior penetração
membrana,
de fármacos no organismo
(GUIRRO e GUIRRO, 2002). O fenômeno da cavitação resulta na formação de
microbolhas gasosas na camada externa da pele (estrato córneo) que podem
romper-se violentamente, e possivelmente permitir a passagem da droga (MILLER,
2000).
Deve ser tomado certo cuidado durante a aplicação da fonoforese, pois
esta pode acentuar a penetração transdérmica do fármaco, enquanto promove o
efeito terapêutico do ultrassom e, com isto, poderá aumentar os benefícios ou
malefícios clínicos promovidos pelo medicamento no organismo (CAMERON e
MONROE, 1992).
2.4 Etnofarmacologia
O uso de plantas medicinais é uma prática milenar, ultrapassou todas as
barreiras e obstáculos durante o processo de evolução tecnológica, chegando até os
dias atuais. Está sendo amplamente utilizada por grande parte da população
mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz. Em laboratórios é transformado o
extrato medicinal em comprimidos, pomadas conservando seu princípio ativo (DI
STASI, 1996).
A fitoterapia é a utilização de produtos de origem vegetal para o
tratamento de diversas patologias (SONAGLIO, 2001). Devido ao custo financeiro
ser mais acessível, tanto para a população quanto para o desenvolvimento
tecnológico dos laboratórios em transformar a matéria prima em um excelente
fármaco, a fitoterapia vem crescendo no Brasil (LADEIRA, 2002). No presente
25
estudo pode-se destacar a Mikania laevigata, conhecida popularmente como guaco,
e utilizada pela população para o tratamento de doenças respiratórias.
2.4.1 Mikania Laevigata
A Mikania laevigata é uma espécie vegetal nativa do sul do Brasil,
encontrada em São Paulo e se estende até o Rio Grande do Sul. É popularmente
conhecida como guaco, e utilizada pela maioria da população para problemas
respiratórios (SIMÕES et al., 1998). Sua espécie vegetal pertence à família
Asteraceae, sendo uma espécie de Guaco largamente utilizada em nosso país
(REITZ, 1989). A época de floração da Mikania laevigata é no mês de setembro
(MORAES, 1997).
As folhas da Mikania laevigata são simples, opostas, ovadas e oblongolanceoladas, de base obtusa e ápice agudo, de até 15 (quinze) centímetros de
comprimento e 7 (sete) centímetros de largura. Possui três nervuras bem evidentes,
pecioladas, verde-brilhante na face superior e mais pálida no interior. Suas flores
são hermafroditas, de cor branco-creme (SIMÕES et al., 1998).
Figura 2: Detalhe das folhas da Mikania Laevigata
Fonte: SILVA JÚNIOR (2006).
26
O gênero Mikania já era utilizado na medicina popular para o tratamento
de
diversas
enfermidades,
devido
as
suas
propriedades
antimicrobianas,
antiinflamatórias e analgésicas (FERRO, 1991). A cumarina ocorre em abundância
nas folhas de guaco, sendo considerado o principal componente
químico da
Mikania. Sua presença caracteriza o odor fragrante e aromático dessa planta
medicinal (EVANS, 1996). A cumarina está presente em cerca de 2,6 % das folhas
secas da Mikania laevigata. Ao gênero Mikania pode-se atribuir a ação
antiinflamatória,
analgésica,
espasmódica,
vasodilatadora,
broncodilatadora,
antiulcerogênica, antimicrobiana, antialérgica, antiestresse, depressora do SNC
(FERRO, 1991).
Em um estudo realizado no sentido de avaliar a ação antiinflamatória da
Mikania laevigata, alguns autores demonstraram uma ação antiinflamatória sobre o
edema em patas de ratos, diminuindo significativamente a migração dos leucócitos
no local da lesão (SUYENAGA et al., 2002).
Em outro estudo, com relação à ação antiinflamatória, analgésicas e
antimicrobianas da Mikania laevigata, concluiu que a administração do extrato
hidroalcoólico de Mikania laevigata mostrou-se efetivo na prevenção do dano
oxidativo pulmonar causado pelo carvão mineral (FREITAS, 2006).
2.5 Espécies reativas de oxigênio
2.5.1 Definição
German e Gilbert em 1954 propuseram que alguns efeitos tóxicos do
oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. Dentre os
radicais livres existem dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as
espécies reativas de nitrogênio (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
As EROs podem ser geradas nos processos inflamatórios, na
metabolização de gordura pela β-oxidação, na degradação da xantina à ácido úrico
e na auto-oxidação de catecolaminas. São produzidas na cadeia respiratória, onde
27
90-95% do oxigênio consumido é reduzido à água (HALLIWELL e GUTTERIDGE,
1999).
A molécula de oxigênio pode aceitar um total de quatro elétrons para a
sua redução a duas moléculas de água, mas esta redução pode acontecer com
apenas um elétron por vez, ocasionando a produção de espécies reativas de
oxigênio, e por conseqüência a produção de radicais livres de oxigênio (MATSUO e
KANEKO, 2001).
A invasão e ativação de neutrófilos no local da lesão, em adição a
fagocitose, pode conduzir a liberação de radicais livres de oxigênio e proteases
como potencial causa de lesão. Neutrófilos contêm mais de quarenta enzimas
hidrolíticas e moléculas tóxicas em seus grânulos e podem gerar vários oxidantes,
tais como, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipoclorídrico (TOUMI
e BEST, 2006).
Os radicais exercem funções importantes no organismo, participando da
fagocitose, processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e
regulação de algumas proteínas, em condições fisiológicas. O problema constitui-se
quando a produção dos níveis totais de ERO for maior que a capacidade de defesa,
podendo ocasionar danos celulares (BONDY e LE BEL, 1993).
Ocorre em três fases a produção das espécies reativas de oxigênio. Na
primeira fase ocorre a inicialização onde duas moléculas se fundem e formam um
radical, após temos a progressão, fase em que o radical se liga a outra molécula
qualquer, gerando um radical livre e finalmente o término quando a geração de
radical termina (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
Os radicais livres são gerados conforme as fases descritas acima, sendo
o primeiro radical livre o ânion superóxido. Ocorre a formação de ânion superóxido,
pois na cadeia respiratória mitocondrial, 5% do oxigênio utilizado não é
completamente reduzido à água (CADENAS e DAVIES, 2000; HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 1999).
28
2.5.2 Estresse Oxidativo
Os radicais livres são formados no metabolismo celular. As defesas
antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas
espécies e são responsáveis pela homeostase entre a eliminação e a produção de
radicais livres. Em condições extremas ocorre o aumento da produção de radicais
livres, que são responsáveis por ultrapassar a capacidade antioxidante normal
presente no organismo humano ou ocasionar um déficit das defesas antioxidantes
no organismo, favorecendo o aumento do estresse oxidativo (BONDY e LE BEL,
1993; CADENAS e DAVIES, 2000).
Figura 3: Estresse Oxidativo
Fonte: Adaptado de MARKS et al., (1996).
O estresse oxidativo pode provocar perda da função celular por causar
alterações no metabolismo das células (TOUMI e BEST, 2006). O estresse
oxidativo (EO) pode aumentar após iniciada a lesão, isso ocorre devido à presença
de neutrófilos e macrófagos nesse local. A produção de radicais livres causa dano
nas membranas lipídicas e produz necrose nas células (TOUMI e BEST, 2006;
TOUMI et al., 2006).
29
Muitos compostos de plantas possuem atividade antioxidante e podem
ajudar a proteger o organismo de danos oxidativos causados por radicais livres. A
Mikania laevigata possui a cumarina e alguns flavonóides como componentes
principais, e quando da administração do extrato das folhas de modo periódico,
agem como antioxidantes (LEE et al., 2003).
30
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização da pesquisa
O presente estudo é caracterizado como sendo de natureza experimental.
Em relação ao problema é caracterizada como quali/quantitativa e em relação aos
objetivos é de natureza descritiva. Por fim, a pesquisa ainda é caracterizada em
relação aos procedimentos como de levantamento de dados (LUCIANO, 2001).
Tendo como objetivo analisar o processo de cicatrização epitelial em ratos
Wistar, e seus possíveis danos oxidativos, através da utilização do ultrassom
terapêutico e do extrato glicólico de Mikania laevigata.
3.2 Caracterização das amostras
Foram utilizados 15 (quinze) ratos Wistar (200-250g). Os animais foram
agrupados em gaiolas específicas, temperatura ambiente controlada em 22oC, ciclo
claro-escuro 12:12h e com livre acesso à água e à comida.
31
Figura 4: Caixa de ratos
Fonte: dados da pesquisadora (2009).
3.3 Instrumentos
Os instrumentos utilizados foram: máquina de cortar pêlos da marca
general eletric para realizar a tricotomia dos animais posteriormente, uma tesoura
cirúrgica para a incisão cirúrgica do animal, juntamente com um bisturi para
separação da peça a ser analisada; espectrofotômetro para análise das amostras;
ultrassom marca Medicir, gel carbopol e gel de extrato glicólico de Mikania laevigata;
freezer à –80°C para acondicionamento das amostras; kits Bioquímicos para análise
da marca Biotest; Tubos de Ensaio; Máquina fotográfica marca SONY, 7.2 Mega
Pixels e paquímetro marca Cardiomed.
32
3.4 Procedimentos para coleta de dados
O estudo foi realizado no Laboratório de FisioPatologia – FISIOPAT,
localizado na UNESC e vinculado ao programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde desta instituição. Preliminarmente, o projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética desta universidade (CEP), sob o parecer de número 620/07.
Laceração epitelial: todos os animais foram anestesiados com Cetamina
(80mg/kg peso corporal, i.p.) após a sedação foi realizada uma única incisão
circular, com bisturi cirúrgico, medindo aproximadamente 2 (dois) centímetros na
porção medial do dorso de cada animal, conforme modelo proposto por (PESSOA et
al., 2004).
Figura 5: Modelo de lesão epitelial
Fonte: adaptado de PESSOA et al., (2004).
O ultrassom utilizado foi de 1 MHz, no modo pulsado e com dose de 0,8
w/cm2.
Após
o
procedimento
de
lesão
os
animais
foram
divididos
randomicamente em 3 (três) grupos:
Grupo 1 (n=5): foram tratados com ultrassom pulsado terapêutico, com
gel carbopol, por três minutos consecutivos, durante 10 (dez) dias.
33
Grupo 2 (n=5): foram tratados com ultrassom pulsado terapêutico e gel
de extrato glicólico de Mikania Laevigata, por três minutos consecutivos, durante 10
(dez) dias.
Grupo 3 (n=5): tratados apenas com o extrato glicólico de Mikania
Laevigata, o qual foi aplicado sobre o dorso dos animais em movimentos circulares
reproduzindo a aplicação do ultrassom por três minutos consecutivos, durante 10
(dez) dias.
Observação: Antes do processo de tratamento os animais foram
anestesiados com Cetamina (80mg/kg de peso corporal, i.p.).
Todos os animais foram acompanhados diariamente com registros
fotográfico, e mensuração do tamanho da ferida, com o auxílio de um paquímetro,
para análise da evolução cicatricial.
Logo após a última aplicação de cada grupo os animais foram
decapitados e o tecido irradiado ao redor da ferida foi removido cirurgicamente.
Parte do tecido foi imediatamente congelado a –80 C para
posterior análise bioquímica.
Ensaios Bioquímicos:
A) Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS): Como índice de
peroxidação de lipídeos foi verificado a formação de substâncias reativas ao
aquecimento do Ácido Tiobarbitúrico medido espectrofotometricamente (532nm),
conforme descrito por DRAPER e HADLEY (1990).
B) Os danos oxidativos em proteínas foram mensurados pela determinação de
grupos carbonil baseados na reação com dinitrofenilhidrazina como previamente
descrito por Levine et al. (1990).
O conteúdo de carbonil foi determinado
espectrofotometricamente em 370nm usando um coeficiente 22.0000 Molar.
C) Medida de grupos sulfidrila: o ensaio é baseado na redução de 5,5'-dithio-bis (2nitrobenzoic acid) pelos tióis, que se tornam por sua vez oxidados, gerando um
34
derivado amarelo cuja absorção foi medida por espectrofotômetro em 412 mm
(AKSENOV e MARKESBERY, 2001).
Determinação da Proteína: a quantidade de proteína nos ensaios
bioquímicos foram mensurados usando a técnica de LOWRY et al., (1951).
3.4.1 Preparação do Extrato glicólico de Mikania Laevigata
Para o preparo de 100 ml do extrato glicólico foi utilizado como solvente
uma mistura de 50ml de água destilada mais 50 ml de propilenoglicol e 50g de
farmacógeno seco (partes aéreas), na proporção de 1:2. A técnica de extração
utilizada foi maceração por um período de 21 dias. O rendimento em teor de
extrativos (sólidos totais = extrativos sólidos) deste extrato foi de 0,82%.
3.4.2 Descrição da técnica de maceração
- Macerar em recipiente fechado o farmacógeno seco, na proporção indicada
(farmacógeno previamente pesado e verter sobre o farmacógeno o solvente
indicado)
- Em temperatura ambiente
- Durante 7 a 10 dias (ou mais)
- Coando, espremendo fortemente
- Filtre, se necessário complete o volume conforme a proporção indicada.
Após a finalização do extrato o mesmo foi incorporado em uma base (gel
carbobol) na concentração de 6%, (6 ml de extrato glicólico mais 94 gramas de gel
carbopol) sendo que agora, em 100 gramas de gel se tem um teor de extrativos
sólidos de 0,05 gramas e conseqüentemente cada grama de gel terá 0,0005g de
teor de extrativos.
35
3.5 Procedimentos para análise de dados
Tratamento Estatístico: Os dados foram expressos em média e erro padrão
médio e analisados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) two-way,
seguido pelo teste post hoc Tukey. O nível de significância estabelecido para o teste
estatístico será de p<0,05. Foi utilizado o SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) versão 12.0 como pacote estatístico.
36
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ultrassom provavelmente é o recurso físico mais utilizado no tratamento
de lesões de tecidos moles, podendo acelerar a reparação tecidual nos seus
diferentes aspectos (YOUNG e DYSON, 1990). Com a irradiação ultrassônica é
possível aumentar tanto a velocidade da cicatrização, quanto a qualidade do tecido
cicatricial (BAKER et al., 2001; KITCHEN e BAZIN, 2001), além de diminuir o
estresse oxidativo tão presente na fase inflamatória. Entretanto, alguns achados vêm
se opondo a este desenho de estudo, devido a pesquisadores não acreditarem que
as lesões possam ser reparadas prematuramente através de ondas ultrassônicas.
(NUSSBAUM et al., 1994; CAMBIER e VANDERSTRAETEN, 1997).
Reforçando a idéia, vários estudos realizados de forma errônea, mal
controlados e com protocolos obscuros, onde a eficácia do ultrassom desaparece.
Muitas pesquisas creditam como mecanismo de cicatrização o efeito mecânico, em
oposição ao efeito térmico (KARNES e BURTON, 2002; DINNO et al., 1999). O
micromassageamento (cavitação) do tecido epitelial produz uma mudança na
permeabilidade da membrana e estimula o segundo mensageiro, o cálcio, através da
célula (KARNES e BURTON, 2002; MORITMER e DYSON, 1988). E com a
proliferação das células se tem o aumento da mioglobina (DINNO et al.,1999).
O efeito antiinflamatório do ultrassom é demonstrado em alguns outros
estudos. Este mecanismo é explicado pela diminuição do número de macrófagos.
No estudo de YOUNG e DYSON (1990), o número de macrófagos foi reduzido
significativamente após a presença da terapia ultrassônica. No mesmo estudo foi
demonstrado também que a terapia ultrassônica estimulou de modo eficaz a
presença dos fibroblastos (YOUNG e DYSON, 1990).
No presente estudo os ratos tiveram o tecido epitelial submetido ao
ultrassom terapêutico de 1 megahertz, com intensidade de energia de 0,8 w/cm² de
forma pulsada. Estes ratos foram divididos em três grupos, onde o primeiro grupo
recebeu a terapia ultrassônica de forma pulsada com gel de carbopol, o segundo
grupo recebeu gel de extrato glicolítico de Mikania Laevigata sem a utilização do
ultrassom terapêutico e o último grupo recebeu gel de extrato glicolítico de Mikania
Laevigata associado ao ultrassom terapêutico também de forma pulsada.
37
Todos os grupos tiveram um tempo de dose de três minutos cada. Como
meio de condução cabeçote/animal, foi utilizado papel filme. E quando não utilizouse o ultrassom, o contato com o animal foi manual e de forma circular, tendo
duração de três minutos também, para reprodução dos movimentos ultrassônicos.
Toda a ferida epitelial foi previamente limpa com água destilada, para que pudesse
retirar possíveis restos de palha das caixas dos animais ali contidas.
Figura 6 - Tamanho da Ferida (cm)
3,5
3
cm
2,5
Carbopol c/US
2
Glicólico s/US
1,5
Glicólico c/ US
1
0,5
0
Lesão
5 dias
10 dias
A figura acima demonstra a média das feridas cutâneas no primeiro,
quinto e décimo dias, onde foram, conforme a legenda, os animais tratados com gel
carbopol com a utilização de ultrassom, gel de extrato glicólico de Mikania laevigata
e gel de extrato glicólico de Mikania laevigata com a utilização de ultrassom,
consecutivos.
Como se pode verificar não houve diferença significativa entre os dias
e a forma de tratamento, levando apenas a uma pequena tendência para a
diminuição da ferida cirúrgica no grupo extrato glicólico com a adição de ultrassom e
no grupo de carbopol com ultrassom. O que leva a crer que o extrato glicólico usado
de maneira isolada não apresenta resultado para a diminuição da ferida, porém com
38
a presença do ultrassom poderá obter uma diminuição significativa se a terapia for
realizada por mais de dez dias.
Estes resultados mostraram semelhança ao encontrado no trabalho
realizado por (SCHWENTKER et al., 1998) em que o período de cicatrização epitelial
sem o efeito da radiação ultrassônica, produz menos fibroblastos e ocasiona uma
necrose epitelial sobre a célula lesada, precipitando uma atrofia microvascular.
Outros estudos reforçam o trabalho realizado por SCHWENTKER (1998),
pois os investigadores demonstraram que a aplicação do ultrassom reduz a fase
inflamatória do reparo, e pode auxiliar o início da fase proliferativa, e desta forma
uma fase de remodelamento com a ausência de cicatriz hipertrófica (YOUNG, 1990;
TASKAN et al., 1997; BYL et al., 1993).
Figura 7 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata
sobre as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico
A figura 7 demonstra os níveis de TBARs em relação às feridas cutâneas
no décimo dia, onde os animais foram tratados com gel de carbopol com a utilização
de ultrassom, gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata e extrato glicolítico de
Mikania laevigata associado ao ultrassom.
Como se pode verificar na figura, o ácido tiobarbitúrico (TBARS), um
marcador de lipoperoxidação, demonstrou uma diferença significativa no grupo
39
extrato glicólico associado ao ultrassom em relação ao grupo carbopol com
ultrassom.
Estes resultados indicam a probabilidade de que o extrato glicolítico em
associação ao ultrassom diminui a lipoperoxidação pela diminuição do processo
inflamatório e assim a liberação de espécies reativas de oxigênio.
Atualmente sabe-se que o oxigênio livre é um inibidor e em excesso pode
causar destruição tecidual e falha no processo cicatricial (OLSWER, 1999). Esse
radical apresenta uma grande afinidade por lipídios e proteínas da membrana
celular, o que provoca uma
reação em
cadeia com alto poder
de destruição
celular que se refletirá em um aumento dos níveis de TBARS (VALLYATHAN et al.,
1998).
Figura 8 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata
sobre o carbonil
A figura 8 demonstra os níveis de grupo carbonil em relação às feridas
cutâneas no décimo dia, onde os animais foram tratados com gel de carbopol com a
utilização de ultrassom, uso tópico do gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata e
gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata com a utilização de ultrassom.
40
Como pode-se verificar na figura, a proteína carbonil, medida de dano
oxidativo em proteína, demonstrou uma diminuição significativa no grupo de extrato
glicólico com ultrassom em relação ao grupo carbopol com ultrassom.
O extrato glicólico associado ao ultrassom reduziu as reações
secundárias de cadeias laterais de alguns aminoácidos com produtos de oxidação
lipídica, açúcares reduzidos ou seus produtos de oxidação (DALLE-DONNE et al,
2003).
Figura 9 - Efeitos do Ultrassom e do extrato glicólico de Mikania Laevigata em
relação à sulfidrila
A figura 9 demonstra os níveis de sulfidrila em relação às feridas cutâneas
no décimo dia, onde os animais foram tratados com gel de carbopol com a utilização
de ultrassom, uso tópico do gel de extrato glicolítico de Mikania laevigata e extrato
glicolítico de Mikania laevigata com a utilização de Ultrassom.
Como pode-se verificar na figura, a sulfidrila, um marcador de oxidação
de proteína, demonstrou uma diferença significativa no grupo extrato glicólico com e
sem ultrassom, quando comparados ao grupo carbopol com ultrassom.
Através da analise destes resultados o extrato glicólico de Mikania
laevigata não ocasionou a modificação da estrutura da proteína da qual ela pertence
e assim manteve a estrutura da proteína e suas propriedades biológicas (EATON,
41
2006). E a utilização do ultrassom concomitante ao extrato teve uma leve tendência
à proteção da proteína, o que poderá estar mais evidente se o tempo de tratamento
persistir por mais dias.
42
5. CONCLUSÃO
Os resultados encontrados nesta pesquisa em relação ao tamanho da
ferida, demonstraram que o ultrassom pulsado associado ao gel de extrato glicólico
de Mikania Laevigata não acelerou de maneira significativa o processo de
cicatrização epitelial, apenas foi constatado um aumento da cicatrização epitelial,
levando a sugerir que o prosseguimento da terapia poderá refletir em um resultado
de forma significativa.
Em relação à diminuição do dano oxidativo ficou evidenciado que o
extrato glicólico de Mikania laevigata associado ao ultrassom, reduziu os níveis de
TBARs e de proteína carbonil. Em relação à sulfidrila, tanto o uso do ultrassom
terapêutico com o extrato de Mikania laevigata e o uso tópico do extrato de Mikania
reduziram a liberação do estresse oxidativo.
A técnica ideal para o reparo do tecido epitelial é a utilização da
fonoforese, através do extrato glicólico de guaco, onde obteve-se uma menor
liberação das espécies reativas de oxigênio.
Assim, após a realização desta pesquisa pode-se perceber que o objetivo
inicial traçado foi alcançado, mostrando que o ultrassom pulsado associado ao gel
de extrato glicólico de Mikania Laevigata exerce influência significativa no processo
de cicatrização de feridas cutâneas, induzidas em ratos.
É importante salientar que o presente estudo tratou de um modelo
experimental, não sendo indicados a pacientes portadores de lesões epiteliais
infectadas ou com neoplasias. Nossos resultados foram realizados em modelo
animal de lesão, mas considerando a relativa semelhança no processo cicatricial de
ratos e humanos. Devemos considerar as peculiaridades de cada um, como
quantidade de gordura adiposa, grau de desnutrição, idade e cor da pele, fatores
estes que influenciam nas doses ideais de ultrassom, no tratamento em seres
humanos.
.
43
6. PERSPECTIVAS
As perspectivas propostas estarão sendo realizadas, na especialização,
com um modelo de estudo semelhante, no laboratório de Fisiopatologia
Experimental da UNESC (FISIOPAT).
•
Teste cometa, marcador de dano ao DNA;
•
A atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e
glutationa peroxidase;
•
A atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial;
•
A atividade da citrato sintase, isocitrato desidrogenase e malato desidrogenase,
enzimas reguladoras do ciclo de Krebs;
•
Medida de hidroxiprolina, para avaliar a quantidade de colágeno;
44
REFERÊNCIAS
AGNE, J.E. Eletrotermoterapia teoria e prática, Editora Oriun, Santa Maria, 2005.
AKSENOV, M.Y., MARKESBERY, W.R. Change in thiol content and expression of
glutathione redox system gene in the hippocampus and cerebellum in Alzheimer’s
disease. Neuroscience Letters 302, 141–145, 2001.
ARNOLD J.R.H.L, ODOM R.B., JAMES W.D. A pele: estrutura básica e função.
Doenças básicas da pele de Andrews: Dermatologia clínica, p.1-14, 1994.
BAKER, K. G., ROBERTSON, V. J., DUCK, F. A. A review of therapeutic ultrasound:
biophysical effects. Phys. Ther., Albany, v. 81, p. 1351-1358, 2001.
BARE, A.C. ; McANAW, M.B. ; PRITCHARD, A.E., et al. Phonophoretic delivery of
10% hydrocortisone through the epidermis of humans as determined by serum
cortisol concentrations. Phys Thher., 76:738-749, 1996.
BONDY S.C.; LE BEL C.P. The relationship between excitotoxicity and oxidative
stress in the central nervous system. Free Radicals in Biology and Medicine 14:
633-642. 1993.
BYL N.N, MCKENZIE A., WONG T., WEST J., HUNT T.K. Incisional wound healing:
a controlled study of low and high dose ultrasound. J. Orthop Sports Phys Ther.
18:619-28, 1993.
CADENAS E.; DAVIES K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress,
and aging. Free Radicals in Biology and Medicine 29: 222-230. 2000.
CAMBIER D.C., VANDERSTRAETEN G.G. Failure of therapeutic ultrasound in
healing burn injuries. Burns. 23:248–49, 1997.
CAMERON, M.H.; MONROE L.G. Relative transmission os ultrasound by media
customarily used for phonophoresis. Physical Therapy, [S.l], ano 72, n. 2, p. 142148, 1992.
DALLE-DONNE, I.; GIUSTARINI, D.; COLOMBO, R.; ROSSI, R. MILZANI, A Protein
carbonylation in human diseases. Mol. Med. v.9 n.4, 2003.
DI STASI, D. L. C. Plantas Medicinais Arte e Ciência: um guia de estudo
interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996.
45
DINI, V.; BETORNE, M.S..; ROMANELLI, M. Prevention and management of
pressure ulcers. Dermatol. Ther. v.19, p.356-64, 2006.
DINNO M.A.; DYSON M.; YOUNG S.R.; MORTIMER A.J.; HART J.; CUM L. The
significance of membrane changes in the safe and effective use of therapeutic and
diagnostic ultrasound. Physical Medicine Biology 34: 1543-1552, 1989.
DYSON M. Mecanisms Involved in therapeutic ultra sound. Physioterapy 73(3):
116-130. 1987.
DRAPER, H.H., HADLEY, M. Malondialdehyde determination as index of lipid
peroxidation. Methods in Enzymology 186, 421–431, 1990.
EATON, P. Protein thiol oxidation in health and disease: Techniques for measuring
disulfides and related modifications in complex protein mixtures. Free Rad. Biol.
Med., 40: p. 1889–1899, 2006.
EVANS, W.C. Trease and Evans´ Pharmacognosy. 14° ed., London: WB
Sanders, 1996.
FERRO V.O. Aspectos Farmacognósticos de Mikania smilacina DC. Curso de
Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, Tese
de Doutorado, 1991.
FREITAS, T.P. Avaliação dos Efeitos da Mikania glomerata e da Mikania
laevigata no Processo Inflamatório Induzido pela Exposição Aguda ao Carvão
Mineral. Programa de Pós Graduação em Ciências Ambientais, UNESC.
Dissertação de Mestrado, 2006.
FUIRINI N. J.; LONGO, G.J. Ultra-som. Amparo: KLD – Biossistemas equipamentos
eletrônicos Ltda, 1996.
GUIRRO, E.C.O.; GUIRRO, R. Fisioterapia dermato-funcional: fundamentosrecursos-patologias. 3. ed São Paulo: Manole, 2002.
GUIRRO, E.C.O; GUIRRO, R. Fisioterapia dermato-funcional: fundamentos,
recursos e patologias. 3. ed. São Paulo: Manole, 2004.
GUIRRO, R.; SANTOS, S.C.B. A realidade da potência acústica emitida pelos
equipamentos de ultrassom terapêutico: uma revisão. Revista de Fisioterapia da
Universidade de São Paulo, v.4, n.2, p.76-82, 1997.
HAAR, T.G. Therapeutic applications of ultrasound. Biophysics & Molecular
Biology 93: 111–129, 2007.
46
HALLIWELL B.; GUTTERIDGE J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine.
Claredon Press, Oxford, NY. 1999.
JACKSON, B.A., SCHWANE, J.A., STARCHER, B.C. Effect of ultrasound therapy on
repair of Achilles’ tendon injuries in rats. Medicine and Science Sports Exercise. v.
23, n. 2, p. 171-176, 1991.
JÄRVINEN T.A.H.; JÄRVINEN T.L.N.; KÄÄRIAINEN M.; KALIMO H.; JÄRVINEN M.
Muscle injuries biology and treatment. The American Journal of Sports Medicine
33: 745-764. 2005.
KANH, J. Ultrassom in principles and pratice of electrotherapy. New York Churchill
Livingstone, Cap. 4, p. 51-70. 1991.
KARNES J.L.; BURTON H.W. Continuous therapeutic ultrasound accelerates repair
of contraction-induced skeletal muscle demage in rats. Archive Physiotherapy
Medicine Rehabilitation 83: 1-4. 2002.
KISNER, C.; COLBY, L.A. Exercícios terapêuticos. Editora Manole, 4ª edição, São
Paulo, 2005.
KITCHEN, S.; BAZIN, S. Eletroterapia de Clayton. Editora Manole, 10ª edição, São
Paulo, 2001.
LADEIRA, A. M. Plantas Medicinais com óleos essenciais. São Paulo: Instituto de
Botânica, 2002.
LEE, S.E; HWANG H.J.; JEONG H.S.; KIM J.H. Screening of medicinal plant extracts
for antioxidant activity. Life Sci. 73, p. 167-179, 2003.
LEVINE, R.L., GARLAND, D., OLIVER, C.N., AMICI, A., CLIMENT, I., LENZ, A.G.,
AHN, B.W., STADTMAN. E.R. Determination of carbonyl content in oxidatively
modified proteins. Methods in Enzymology 186, 464–478, 1990.
LOW J.; REED A. Eletroterapia Explicada: princípios e prática. Ed. Manole, São
Paulo, pp. 187-228. 2003.
LOWRY, O.H., ROSEBOUGH, N.G., FARR, A.L., RANDALL, R.J. Protein
measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193,
265–275, 1951.
MACHADO, C.M. Eletroterapia prática, Pancast Editorial, 2ª edição, São Paulo,
1991.
47
MARKS DB; MARKS AD; SMITH CM. Basic Medical Biochemistry Baltimore,
Lippincott Williams & Wilkins, pp. 201-202. 1996.
MATSUO W.; KANECO T. The chemistry of reactive oxygen species and related free
radicals. In Radák Z, editor. Free Radicals in Exercise and Aging Champaign:
Human Kinetics. 2001.
MILLER, M.W. Gene Transfection and Drug Delivery. Ultrassound in Med. & Biol,
v. 26, n. 1, p. 59-62, 2000.
MITRAGOTRI S. Synergistic effect of enhancers for transdermal drug delivery.
Pharm Res 17(11): 1354-59, 2000.
MODOLIN, M.; KAMAKURA, L. Aspectos gerais da cicatrização das feridas. In:
SUCENA, R. C: Contribuição para o ensino da especialidade. São Paulo: Fundo
editorial da sociedade brasileira de cirurgia plástica, cap. 9, p. 91-02, 1981.
MOFFAT, M.; HARRIS, K.B. Fisioterapia do sistema tegumentar: melhores
práticas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan: Ed. LAB, 2007.
MORITMER A.J.; DYSON M. Effect of therapeutic ultrasound on calcium uptake in
fibroblasts. Ultrasound Med Biol. 14:499–506, 1988.
NUSSBAUM E., BIEMANN I., MUSTARD B. Comparison of ultrasound/ ultraviolet-C
and laser for treatment of pressure ulcers in patient with spinal cord injury. Phys
Ther. 79:812–23, 1994.
OLSWER, E. Radicais Livres e patologia pulmonar. In: EDITORES DO LIVRO
(Eds.), Radicais Livres em Medicina. São Paulo: Fundo Editorial BYK, p. 136-141,
1995.
PARIZOTTO N.A., KOEKE P.U., MORENO B.G.D., LOURENCIN F.T.C. Utilização
da fonoforese em desordens músculo-esqueléticas: uma meta-análise. Rev. Bras.
Fisioter. 7(1): 9-15, 2003.
REITZ, R. As plantas compostas: Tribo Eupatorieae. Flora ilustrada catarinense.
Itajaí: EMPASC, 1986.
ROBERTSON V.J.; WARD AR. Longwave Ultrasound Reviewed and Reconsidered.
Physiotherapy 83: 123–130. 1997.
SALGADO, A.S.I. Eletroterapia, Editora Midiograf, 1ª edição, Londrina, 1999.
48
SCHWENTKER A., EVANS S.M., PARTINGTON M., JOHNSON B.L., KOCH C.J.,
THOM S.R. A model of wound healing in chronically radiationdamaged rat skin.
Cancer Lett. 128:71-8, 1998.
SILVA JÚNIOR, A.A. Essencia herba – plantas bioativas. Florianópolis: Epagri, v.
2, p. 634, 2006.
SIMÕES, C.M. O.; SCHENKEL, E.P.; BAUER, L. LANGELOH, A. Pharmacological
investigations on Achyrocline satuereoide. J. Pharm. v.22, n.3, p.281-293, 1988.
SONAGLIO, D. J. Ethnopharm. 82, p. 207-215, 2001.
STARKEY, C. Recursos terapêuticos em fisioterapia. 2. ed São Paulo: Manole,
2001.
SUYENAGA, E. S.; RECHE, E.; FARIAS, F.M.; SCHAPOVAL, E.E.S.; CHAVES, C.
G; HENRIQUES, M.A.T. Antiinflammatory Investigation of Some Species of
Mikania. Phytotherapy Research. 16, p. 519–523, 2002.
TASKAN I., OZYAZGAN I., TERCAN M., KARDAS Y., BALKANLI S., SARAYMEN
R., et al. A comparative study of the effect of ultrasound and electrostimulation on
wound healing in rats. Plast Reconstr Surg. 100:966-72, 1997.
THOMAZ, J.B.; HERDY, C.D.C; OLIVEIRA, J.C.P et al. Fundamentos da
Cicatrização das Feridas. Arquivos Brasileiros de Medicina, v. 70, p. 65-72, 1996.
TIDBALL J.G. Inflammatory processes in muscle injury and repair. American
Journal Physiology 288: 345-353. 1995.
TOUMI H.; BEST T.M. The inflammatory reponse: friend or enemy for muscle injury?
British Journal Sport Medicine 284-286. 2006.
TOUMI H.; F’GUYER S.; BEST T.M. The role of neutrophils in injury and repais
following muscle stretch. Journal Anatomy 208: 459-470. 2006.
VALLYATHAN V.; GOINS M.; LEROY N.R.; PACK D.; LEONARD S.; SHI X.;
CASTRANOVA V.; Am Changes in Bronchoalveolar Lavage Indices. J. Respir. Crit.
Care Med. v. 162, p. 958–965, 2000.
WYSOCKI, A.B. Skin Anatomy, Phisiology and Pathophysiology. Wound Care
Management, v. 34, p. 777-196, 1999.
YOUNG S.R., DYSON M. Macrophage responsiveness to therapeutic ultrasound.
Ultrasound Med Biol.16:809-16, 1990.
49
YOUNG S.R, DYSON M. The effect of therapeutic ultrasound on angiogenesis.
Ultrasound Med Biol. 16:261-69, 1990.
ZAMMIT P.S.; PARTRIDGE T.A.; YABLONKA-REUVENI Z. The skeletal muscle
satellite cell: the stem cell that came in from the cold. Journal of Histochemistry &
Cytochemistry 54(11): 1177-1191. 2006.