Sociedade Brasileira de Química (SBQ)
Caracterização de uma nova oxidorredutase isolada do microorganismo Bacillus safensis
1,3
1
1
Francine Souza A. da Fonseca (PG) , Célio Fernando F. Angolini (PG) , Francisco A. M. Reis (PQ) ,
2
1
Anete P. Souza (PQ) , e Anita J. Marsaioli (PQ) *.
*e-mail:[email protected]
1
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Caixa Postal 6154, CEP: 13083-970, Campinas-SP.
Universidade Estadual de Campinas, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG).
3
Universidade Federal de Minas Geral, Instituo de Ciências Agrárias (ICA- Campus Montes Claros, MG).
2
Palavras Chave: Oxidorredutase, Bacillus safensis, Petróleo.
Introdução
O micro-organismo Bacillus safensis é uma bactéria
Gram-positiva capaz de suportar condições
1
extremas de temperatura e radiação ultra-violeta . O
primeiro relato científico dessa bactéria foi em 2006
refere-se à identificação de uma cepa desse microorganismo isolado da sala asséptica da NASA, onde
permanecem as sondas espaciais enviadas ao
2
planeta Marte. Em trabalhos anteriores do grupo de
Pesquisa da Profa. Anita J. Marsaioli (IQUNICAMP), cepas de B. safensis foram isoladas de
amostras de petróleo biodegradado. Ensaios de
biocatálise verificaram que esse micro-organismo
3
catalisava oxidação de metilenos ativados. O
objetivo desse trabalho foi purificar e identificar a
proteína responsável pela atividade de oxidação.
Resultados e Discussão
A purificação das proteínas presente no extrato
solúvel de B. safensis foi realizada por
cromatografia (FPLC) utilizando resinas de troca
iônica. A fim de revelar as atividades enzimáticas
presente nas frações, sondas fluorogênicas
derivadas de umbeliferona foram utilizadas. Frações
provenientes da troca catiônica revelou atividade de
oxirredutase dependente de NAD/NADH. A fração
foi separada em gel de SDS-PAGE apresentando
uma banda de 18 a 25 kDa (Figura 1). A massa
exata foi obtida por ESI(+)-QTOF/MS o que revelou
uma proteína de 21 kDa. A proteína foi extraída do
gel SDS-PAGE, tripsinizada e submetida à análise
por LC-MS/MS utilizando um LTQ-XL orbitrap da
Thermo Scientific. Os espectros dos fragmentos da
tripsinização foram analisados pelo programa de
identificação Sequest através do Proteomic discover
utilizando o banco de dados do NCBI e SwissProt
para obter a sequencia primaria da proteína de
interesse. Comparação com as proteínas análogas
existentes na literatura revelou que a mesma era
inédita provavelmente devido à ausência de
informações sobre o B. safensis. O sequenciamento
“De Novo” através do programa Peaks, permitiul
obter uma cobertura de 83% de similaridade com
36a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química
uma proteína de B. pumilus de atividade
desconhecida, porém no presente caso foi de
oxirredutase.
Figura 1. Gel SDS-PAGE contendo, a proteína isolada nas
frações (7 a 12) da troca catiônica.
Outras frações foram analisadas seguindo o
mesmo protocolo revelando a presença de três
proteínas adicionais uma catalase, uma enolase e
uma flagelina já relatadas em B. pumilus.
Confirmamos a atividade da catalase através da
adição de peróxido de hidrogênio à fração que
continha a proteína identificada.
Conclusões
Este trabalho permitiu o isolamento de uma proteína
inédita do micro-organismo Bacillus safensis. Essa
proteína tem 21 kDa, e apresenta atividade de
oxirredutase. Os cofatores desta oxirredutase serão
investigados e a expressão da mesma está em
andamento pela Profa Anete Pereira de Souza a
qual depositou na GOLD o sequenciamento do
genoma do B. safensis junto com Valeria Maia de
Oliveira e Anita J. Marsaioli.
Agradecimentos
Prof. Eduardo Pilau. As agências financiadoras: ANPPetrobrás, CAPES, CNPQ, FAPESP e UFMG.
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1
Probst, A.; Facius, R.; Wirth, R.;Wolf, M.; Moissl-Eichinger, C. Appl.
Envirol. Microbiol. 2011, 1628-1637.
2
Satomi, M.; La Duc, M. T.; Venkateswaran, K. Internation. J. System.
Evolution. Microbiol. 2006,1735-1740.
3
Angolini, C.F.F. Tese de mestrado. IQ-UNICAMP. 2010.