Complementos de Química I - Módulo de cromatografia
Luís H. Melo de Carvalho
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
CLASSIFICAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
EM COLUNA
Classificação geral
Amostra
Fase móvel
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Luís H. Melo de Carvalho
Método
específico
Fase estacionária
Tipo de equilíbrio
Cromatografia líquida
Líquido-líquido
Líquido adsorvido
Partição entre líquidos
(LC)
ou partição
num sólido
imiscíveis
Líquido-fase
Espécies
Partição
ligada
orgânicas ligadas
líquido/superfície ligada
(fase móvel: líquido)
A+B
a uma superfície
sólida
B
A
Líquido-sólido ou
Sólido
Adsorção
Resina de troca
Troca iónica
adsorção
Troca iónica
iónica
B
A
Exclusão por
Líquido nos
tamanho
interstícios de um
Partição/peneiragem
sólido polimérico
Cromatografia gasosa
B
Sinal do detector
t1
t2
Detector
B
A
t0
Gás-líquido
(GC)
(fase móvel: gás)
t4
B
t2
Tempo
t3
Partição gás/superfície
orgânicas ligadas
ligada
sólida
Gás-sólido
t1
Espécies
a uma superfície
A
t0
Partição gás/líquido
num sólido
Gás-fase ligada
t3
Líquido adsorvido
t4
Sólido
Adsorção
Cromatografia de
Partição fluido
fluido supercrítico
supercrítico/superfície
(SFC)
ligada
(fase móvel: fluido
supercrítico)
1
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Complementos de Química I - Módulo de cromatografia
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
TEORIA DA CROMATOGRAFIA
t1
Fase móvel
Concentração
A
Fase estacionária
K=
B
t2
CS
CM
A
B
Distância migrada
ALARGAMENTO DE BANDA
MELHORANDO A SEPARAÇÃO
Cromatograma original
Sinal do detector
Resposta do detector
Comportamento ideal
Tempo
Aumento da separação
das bandas
Comportamento real
Diminuição do
alargamento das bandas
Tempo
Tempo
2
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ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES
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QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA)
Tempo de retenção (Tr)
Tr= Testacionária + Tmóvel
Sinal do detector
Tr
Tm
Tempo morto (Tm)
T’r
W1/2
Tempo de retenção ajustado (Tr’)
Tr’= Tr - Tm
0
Factor de retenção (k’)
Tempo
Tm= tempo morto
Tr = tempo de retenção total
T’r = tempo de retenção ajustado (ou líquido)
W1/2 = largura do pico a meia altura
medida de retenção na fase estacionária
k' =
Tempo que o analito passa na f ase estacionária
=
Tempo que o analito passa na f ase móvel
T − Tm Tr '
= r
=
Tm
Tm
Coeficiente de separação ou selectividade (α)
medida de retenção na fase estacionária
(T ) − T
k'
a= 2 = r 2 m
k'1 (Tr )1 − Tm
3
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PROCESSOS CINÉTICOS QUE CONTRIBUEM
PARA O ALARGAMENTO DOS PICOS
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO
Nº de moléculas
H=
Processo
Termo na equação
Relação com as propriedades da
L
(L-1σ)
coluna e do analito
(L+1σ)
Difusão longitudinal
B 2k D DM
=
u
u
B
u
Transferência de massa
CS u
CS u =
(fase estacionária líquida*)
Distância migrada
Transferência de massa
Enchimento
Introdução
da amostra
B
+ CS u + C M u
u
DETERMINAÇÃO DE H E N
CS u
(1 + k' ) 2 DS
CS u =
(fase estacionária sólida**)
2t d k' u
( 1 + k' ) 2
Detector
Transferência de massa
CM u
CM u =
(fase móvel)
Sinal do detector
qk' d f2u
Tr
f ( d p2 , d c2 ,u )
DM
u
f: “função de”; kD, q : constantes; td tempo médio de dessorção do analito da
superfície; dc: diâmetro da coluna; B: coeficiente de difusão longitudinal; CS e
CM: coeficientes de transferência de massa nas fases estacionária e móvel,
respectivamente.
* a fase estacionária é um líquido imiscível imobilizado
** a fase estacionária é uma superfície sólida onde ocorre adsorção.
Tm
Variável
Símbolo Unidades
u
Velocidade linear da fase móvel
W
cm .s-1
Coeficiente de difusão na fase estacionária
DS
cm .s
Coeficiente de capacidade
k’
-
Diâmetro de partícula do enchimento
dp
cm
Espessura do revestimento líquido na fase estacionária
df
cm
(a)
Tempo
-1
cm.s
DM
Coeficiente de difusão na fase móvel
(a)
(a)
2
2
-1
Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui
4
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Contribuição para H, cm
EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER
H=
B
+ CS u + CM u
u
ALARGAMENTO DE BANDAS
H
Efeito de percursos múltiplos
Largura de banda inicial
CSu
1
2
CMu
B/u
Largura de banda final
Velocidade linear de fluxo, cm/s
glc
2
4
6
8
10
8
0.8
GLC
6
H, mm
Fase móvel “estagnada”
0.6
Fluxo de fase móvel
0.4
4
LC
0.2
2
1.0
Grau de alargamento
de banda
2.0
Velocidade linear de fluxo, cm/s
lc
5
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SEPARAÇÃO E RESOLUÇÃO
LARGURA DE PICO NA BASE (W) E A MEIA
ALTURA (W1/2)
RS=0.75
B
Sinal do detector
RS=1.0
A
B
(Tr)B
Tm
RS=1.5
∆Z
(Tr)A
A
B
WA/2
WA
WB/2
Resposta do detector
A
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W1/2= 2.35σ
h
h
2
W = 4σ
Tempo
WB
Tempo
6
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TÉCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUÇÃO
Objectivo:
Separações eficientes em tempos de análise curtos.
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EFEITO DO COMPRIMENTO DA COLUNA
NA RESOLUÇÃO E NO TEMPO DE RETENÇÃO
1. Aumentar a distância entre os picos, ∆Tr=T2-T1
(a) Aumentar o comprimento da coluna, L
(b) Aumentar a quantidade de fase estacionária, VS ou VL
(c) Usar um coeficiente de selectividade melhor, α=T2’/T1’
•
Diminuir a temperatura
•
Escolher uma fase estacionária diferente
•
Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida)
2. Diminuir a largura da banda, W
(a) Usar um enchimento mais uniforme
•
Encher mais cuidadosamente
•
Usar partículas mais pequenas
(b) Aumentar a área de interface entre as fases
(c) Optimizar a velocidade de fluxo
(d) Reduzir o tamanho da amostra
(e) Reduzir o espaço morto no sistema
(f) Reduzir a constante de tempo do detector
(g) Diminuir o diâmetro da coluna
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EFEITO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E H
EFEITO DA TEMPERATURA NA CG
Isotérmica a 45ºC
1
0.2
H, cm
4
2
0.6 – 0.8 mm
3
0.4 – 0.6 mm
0.3 – 0.4 mm
5
0.1
x4
0.25 – 0.3 mm
Isotérmica a 145ºC
5
0.1 – 0.15 mm
6
5
10
15
20
7
Velocidade linear, cm/s
8
EFEITOS DO FACTOR DE CAPACIDADE
Programada de 30ºC a 180ºC
Resolução, RS
RS/Q ou (Tr)B/Q’
4
Tempo de eluição, (Tr)B
1 2
5
3
10
0
5.0
10.0
Coeficiente de capacidade, k’B
15.0
30º
60º
7
6
Tempo (min)
90º
9
8
20
120º
30
150º
180º
Temperatura (ºC)
8
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EFEITO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL
NA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
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PARÂMETROS USADOS NAS TÉCNICAS
DE OPTIMIZAÇÃO
Variação de N
70% metanol,
30% água
Alteração do comprimento da coluna
60% metanol,
40% água
50% metanol,
50% água
40% metanol,
60% água
Variação de H
Alteração da velocidade do fluxo da fase móvel
Alteração do tamanho de partícula do enchimento
Alteração da espessura do filme líquido que serve de fase estacionária (LC)
Alteração do diâmetro da coluna
Alteração da viscosidade da fase móvel (e assim DM ou DS)
Alteração da temperatura da coluna (GC)
Variação de k’ e de α
Tempo de retenção, min
1 → 9,10-antraquinona
2 → 2-metil-9,10-antraquinona
3 → 2-etil-9,10-antraquinona
4 → 1,4-dimetil-9,10-antraquinona
5 → 2-t-butil-9,10-antraquinona
Alteração da temperatura
Alteração da composição da fase móvel
Alteração do enchimento da coluna
Utilização de efeitos químicos especiais
9
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Luís H. Melo de Carvalho
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EFEITOS DE α E N NA RESOLUÇÃO DE PICOS
VARIAÇÃO DA RESOLUÇÃO
Tm
Inicial
Factor de separação bom
N pequeno
Factor de separação fraco
N elevado
Factor de separação bom
N elevado
aumentar k’
Variação de k’
Aumento de N
Resposta do detector
diminuir k’
Factor de separação fraco
N pequeno
Aumento de α
Tempo
10
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O PROBLEMA GERAL DA ELUIÇÃO
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Razão de altura dos picos = 1:1
RS = 0.4
0.5
0.6
Sinal do detector
0.8
1.0
0.7
1.25
Razão de altura dos picos = 8:1
RS = 0.4
0.5
0.6
0.7
Tempo
0.8
1.0
1.25
11
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Luís Herculano Melo de Carvalho
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SOBREPOSIÇÃO DE PICOS
SOBREPOSIÇÃO DE PICOS
1) Localização
Posição aparente
Erro na quantificação por área de pico
Rs = 1
1:1
4:1
100%
96%
Posição verdadeira
8:1
16:1
2) Medição de áreas
93%
88%
% erro na área do pico menor = (% indicada -100 %)
% erro na área do pico maior = - (1/x) % erro na área do pico menor
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EXPRESSÕES E QUANTIDADES IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA
QUANTIDADES EXPERIMENTAIS IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA
Nome
Velocidade linear da fase
Nome
Tempo morto
Tempos de retenção (de A e de B)
Tempo de retenção ajustado (de A e de B)
Símbolo
Tm
Determinada a partir de:
Cromatograma
u=
móvel
Volume da fase móvel
(T’r)B
k' =
Coeficiente de capacidade
WA e WB
L
Comprimento do enchimento da coluna
Velocidade média das moléculas da fase
móvel
Volume da fase estacionária
Concentração de analito nas fases móvel e
estacionária
u
K=
Cromatograma
Medição directa
α =
Factor de selectividade
Medição directa
RS =
Resolução
VS
CM e CS
(Tr
(T’r)A= (Tr)A - Tm
Coeficiente de partição
Largura de picos (de A e de B)
Dados da preparação do
enchimento
Análise e dados da preparação
L
Tm
− Tm )
Tm
k' =
KVS
VM
k' VM
VS
K=
CS
CM
(Tr )B − Tm
(Tr )A − Tm
2[(Tr )B − (Tr ) A ]
W A + WB
T 
N = 16 r 
W 
Nº de pratos
H=
Altura de prato
Tempo de retenção
quantidades
VM = Tm F
(Tr)A e (Tr)B Cromatograma
(T’r)A e
Relação com outras
Expressão
(Tr )B
2
α=
RS =
k' B K B
=
k' A K A
N  α − 1  k' B 



4  α  1 + k' B 
 α   1 + k' B 

N = 16RS2 
 
 α − 1   k' B 
2
2
L
N
16RS2 H  α  (1 + k' B )3


u  α − 1  (k' B )2
2
=
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COMPONENTES FUNDAMENTAIS DE UM SISTEMA DE GC
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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA
Detector
Injector
Tipo de coluna
Capilar
Característica
Comprimento (m)
Enchimento
(WCOT)
10 - 100
1-6
Diâmetro interno (mm)
0.25 – 0.75
2-4
Eficiência (pratos/m)
1000 - 4000
500 - 1000
Gás de arraste
Quantidade de amostra (ng)
Forno
Coluna
Gás
de arraste
Pressão relativa
Tratamento
de dados
Velocidade relativa
3
10 - 10
10 - 106
Baixa
Alta
Rápida
Lenta
INJECTOR DIRECTO
COLUNA TUBULAR ABERTA ( ou COLUNA CAPILAR)
Septo
Coluna
Seringa
Agulha da
seringa
Purga do septo
Câmara de
vaporização
Gás de arraste
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EFICIÊNCIA DE COLUNAS
CAPILARES E EMPACOTADAS
GASES DE ARRASTE
106
N2
1.2
)
OT
(WC
s
e
ilar
Cap
N
10
104
1.0
H (mm)
5
adas
acot
Emp
103
0.8
He
0.6
H2
0.4
102
10
103
104
0.2
Tempo (s)
20
40
60
80
2.0
H (mm)
Velocidade linear média (cm/s)
s
da
ota
c
pa
Em
1.5
1.0
(WCOT)
Capilares
0.5
20
40
60
Velocidade linear média (cm/s)
15
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DETECTOR DE EMISSÃO ATÓMICA
DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA
Bateria de
díodos
Colector
Rede de
difracção
170 nm
250 nm
480 nm
ar
Chama ar-H2
656 nm
Bico de queima
690 nm
748 nm
777 nm
Plasma
H2
Parede do forno
Coluna
Gás de complemento
Coluna
Amostra duma gasolina
Monitoração
da linha do C
Fluxo de saída
Sinal do detector
DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA
0
20
30
Monitoração
da linha do O
0
Fluxo de entrada
10
1
2
3
4
5
Tempo (min)
16
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SISTEMA DE INJECÇÃO DA AMOSTRA
COMPONENTES PRINCIPAIS DE UM SISTEMA DE HPLC
2) Injecção da amostra
1) Carregamento da amostra
“loop”
“loop”
Unidade de
injecção
Para a coluna
Para a coluna
Coluna
Da bomba
Solventes
Da bomba
Detector
Saída
Saída
DETECTOR DE UV PARA HPLC
Da coluna
Bomba + sistema de
gradiente
Janelas
de quartzo
Aquisição e processamento
de dados
Fonte de UV
Detector
Para o esgoto
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EFEITO DA ELUIÇÃO EM GRADIENTE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Mistura de clorobenzenos
Eluição em gradiente
Polaridades dos solutos: A > B > C
Inicio: 40:60 (v/v) MeOH/H2O
Eluição isocrática
MeOH ä 8%/min
50:50 (v/v) MeOH/H2O
Fase normal
Fase reversa
Fase móvel de polaridade baixa
Fase móvel de polaridade alta
C
B
A
Tempo
A
B
C
0
5
Tempo
10 15 20
Tempo (min)
25
30
0
5
10 15 20
Tempo (min)
25
30
BOMBA RECÍPROCA PARA HPLC
Fase móvel de polaridade média
Fase móvel de polaridade média
Coluna
Junta selada
C B A
Tempo
A B C
Motor
Amortecedor
de pulsações
Válvulas
de esfera
Tempo
Pistão de
vaivém
Solvente
18
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APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA IÓNICA
Eluente:
Eluente:
NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M
Fenilenodiamina.2HCl 0.025M / HCl 0.0025M
Volume de amostra: 50 µL
Volume de amostra: 100 µL
19