Reações de Nitrosilação
(e de Nitrosação
também)
Marcelo G. de Oliveira
Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP
Células endoteliais
vasodilatação
Fat. mitogênicos
agregação
Fat. anticoagulantes
antiagregação
Hemácias
Fat. trombogênicos
Inib. crescimento
Vaso
sanguíneo
Vasoconstrição
Células
musculares
lisas
Vasodilatação produzida pelo NO endógeno
Células endoteliais
O2
+
L-Arginina
Células musculares lisas
NO
+
L-Citrulina
NO
GC
e-NOS
GTP
Ca
Ach
cGMP
Ca2+
+
Relaxamento
1987 - Ignarro et al. - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 9265  EDRF = NO
1998 - Furchgot, Ignarro and Murad – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina
Funções bioquímicas do NO
SISTEMA MUSCULAR
Regula o tônus muscular
Vasodilatação localizada
SISTEMA CIRCULATÓRIO
Vasodilatação de veias e artérias
Controle da pressão sanguínea
Liberação de O2 a partir da HbO2
Controle do fluxo sanguíneo nos rins
NO
SISTEMA NERVOSO
SISTEMA IMUNOLÓGICO
Neurotransmissor
Inibição da contração da musculatura lisa
Plasticidade neuronal
Memória de longo prazo
Agente bactericida
Inibe a replicação de vírus
Destoi células tumorais
SISTEMA DIGESTIVO
Promove a dilatação estomacal
Ativa os movimentos peristálticos
Oxido Nítrico
N
O
N O
N a to m ic o r b ita l
O a t o m ic o r b it a l
s*z
p * zy
2p
s zb
2p
p bxy
s s*
2s
2s
s sb
Diagrama de Orbitais Moleculares do NO
Scientists discover a reason to lick your wounds
By: Steven Hunt, June 18, 1997
By: Steven Hunt, June 18, 1997
You've just cut your finger on the edge of a piece of paper. In a flash, you stick your finger in your mouth, thinking
that will make it better. Well…your hunch is not that far off. In fact, licking your wounds is one of those instinctive
things most people don't think about much, but according to researchers in Britain, it's not only instinctive. It has
healing properties to boot.In the same way that dogs and other animals are often seen licking their wounds,
humans too, it's been found, can do better by licking their injuries than by leaving them alone. Dr. Nigel Benjamin,
a clinical pharmacologist with St. Bartholomew's and the London School of Medicine and Dentistry, has discovered
that it all comes down to how saliva reacts with skin."We'd been looking at nitrite in saliva for some time,"
Benjamin states, "mainly because we'd been interested in nitric oxide and its effects in disease processes." That's
because nitric oxide - the compound that results when saliva interacts with the skin - has for several years been
known to play a role in the body's fight against germs. But Benjamin and his London colleagues were
interested in finding out whether licking your wounds had any real effect on the healing process."We looked at the
comparison of what happens when you use saliva to wet your skin compared to just normal saline," Benjamin
explains. "And we found that the saliva produces loads of nitric oxide." With nearly 10 times the amount of nitric
oxide on licked skin compared to non-licked skin, Benjamin says, "there is a definite function for this nitric
oxide in order to protect us when we wound ourselves from contamination by unwanted bacteria."
Ações do NO no Sistema Imunológico
Macrófagos
Neutrófilos
2NO + O2 = 2 NO2 = N2O3
NO3-
N2O3 + H2O = 2 HNO2 = 2 NO2-- + 2 H+
NO em excesso  choque séptico
AÇÃO CITOTÓXICA DO NO CONTRA BACTÉRIAS
VÍRUS E CÉLULAS TUMORAIS
NO
Reação com:
Oxidação de
-Centros Fe-S
(Fe4S4)
membranas
- RSH
- R-tirosila
Inativação de enzimas:
-do ciclo de Krebs
-da síntese de DNA
-de funções mitocondriais
APOPTOSE
NECROSE
Desaminação
do DNA
Fe - NO (NITROSILAÇÃO)
NO + Fe(II) ou Fe(III)
NO = ligante nitrosila
CO = ligante carbonila
NO + R-SH
NO + R-NH2
O2/Cu2+/O2.O2/Cu2+/O2.-
R-SNO
R-NNO
-SNO = NITROSOTIOL
-NNO = NITROSAMINA
(NITROSAÇÃO)
NO, Superóxido e Peroxinitrito
NO
O2.-
NO + O2.-  ONOO-
Oh NO !!
ONOO- + H+  NO2. + OH.
ONOO- em excesso  choque séptico
Ativação da Guanilato Ciclase solúvel:
Uma reação de NITROSILAÇÃO
Hipertensão
DISFUNÇÃO
Vasoespasmo
ENDOTELIAL
Oclusão arterial
ATEROSCLEROSE
Falha na regulação da produção endógena
de Óxido Nítrico (NO)
Doadores exógenos de NO
Células Endoteliais
NO2
NO2
O
O
CH2
CH2
CH
Células musculares lisas
Relaxamento
NO
O
GTP
cGMP
NO2
Nitratos de
NO
GC
GC
Isosorbida
GTP
[Fe(CN)5
cGMP
NO]2NO
Relaxamento
Nitroprussiato de sódio
Shishido, SM, de Oliveira MG, Prog. React. Kinetic Mech. 26, 239, 2001
e+
II
NPS + cisteina (pH 7.4)
Variação espectral no IV
72
NO NPS red
% Transmitância
68
64
60
56
CN NPS
52
2200
2150
CN
NPS red
2089
2100
[FeII(CN)5H2O]32038
NO NPS
2050
2000
Número de onda / cm
1950
-1
-1
1900
1850
[FeII (CN)5H2O]3- + NO + 1/2 RSSR
(Aquoferrocianeto)
2038 cm-1
[FeII (CN)5NO+]2- + RS[FeI (CN)5NO+]3- + 1/2 RSSR
(NPS reduzido)
2089 cm-1
NPS + cisteina (pH 10)
Variação espectral (UV/VIS)
[FeII(CN)5H2O]3338
Absorbância
0,3
Espécie
transiente
521
0,2
0,1
300
400
500
600
Comprimento de onda / nm
700
800
ADUTO INTERMEDIÁRIO NO
ATAQUE NUCLEOFÍLICO
DO ÂNION TIOLATO AO NO DO NPS
O
SR
N
N
NC
NC
Fe
CN
3
O
CN
NC
CN
NC
Fe
CN
SR
CN
CN
MODELO ANIMAL
RATOS WISTAR: - Normotensos
- Agudamente hipertensos (L-NAME)
Pressão arterial Média (MAP) (Artéria femural)
Infusões intravenosas de:
NPS
NAC
+
QUEDA DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (MAP)
APÓS A INFUSÃO DE NPS e (NPS + NAC)
0
SNP
SNP +NAC
SNP
SNP+NAC
-5
 MAP (mmHg)
-10
-15
-20
-25
Normotensos
-30
-35
-40
Normotensive rats
Hypertensive rats
*
hipertensos
-45
Ricardo, KF, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biology and
Chemistry: 7, 57, 2002
H2O
-S•- -----------H+
NO
S-NITROSOTIOIS
(RSNOs)
C
S
N
O
181 Å3
S-nitroso-L-cisteina
Sintetizando S-nitrosotiois
NOgás Solução de tiól
N ÃO ACONTECE NADA!!!
Oxido Nítrico
N
O
N O
N a to m ic o r b ita l
O a t o m ic o r b it a l
s*z
p * zy
2p
s zb
NO + RSH  RSNO + H+ + ep bxy
s s*
2s
2s
s sb
Diagrama de Orbitais Moleculares do NO
2p
S-NITROSAÇÃO DE TIOIS
2 NO + O2
2 NO2
N2O4
NO
N2O3
O2N-NO
O2N- NO+ + RS- H+
O2N- NO+
RS-NO + H+ NO2-
S-NITROSAÇÃO DE TIOIS
EM SOLUÇÃO AQUOSA
N2O3 + H2O
2 HNO2
2 HO- ••• N O+
HO-••• NO+ + RS-•••H+ 
2H+ + 2NO2-
RS-NO + H2O
4NO + O2 + 4 RSH  4RSNO + 2 H2O
Sistema de nitrosação
PATENTE REQUERIDA (INPI, 2001)
S-nitrosotiois: Transições eletrônicas
C
S
N
O
p
nN* (a)
nO* (a)
nN (s)
nO (s)
p
N atomic orbitals
O atomic orbitals
0.8
0.5
0.7
pp*
nNp*
0.4
(Anti)
0.3
0.5
0.4
0.3
0.2
0.2
nNp*
0.1
(Syn)
0.0
250
0.1
300
350
400
450
Wavelength (nm)
500
0.0
550
600
Wavelength (nm)
Absorbance
Absorbance
0.6
Controle da síntese de S-nitrosotiois por
borbulhamento
Abs. em =545 nm
2.5
Absorbância
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1.0
0
50
100
Tempo/ s
0.5
0.0
300
400
500
600
Comprimento de onda / nm
Estruturas dos S-nitrosotiois sintetizados
S-nitrosoglutationa
S-nitroso-N-acetilcisteina
(GSNO)
(SNAC)
S-nitrosocisteina
(CisNO)
Dose-resposta da PAM na administração de
SNAC em ratos
NORMOTENSOS
AGUDAMENTE
HIPERTENSOS (L-NAME)
Dose (x10-2 mol/kg body wt)
0
2.8 11
26
34
43
-2
Dose (x10 mol/kg body wt)
51 107 214 428 571 714 854
0
11
26
51
-10
 MAP (mmHg)
 MAP (mmHg)
-10
2.8
-20
-30
-40
-20
-30
-40
-50
-50
-60
Hypertensive rats
Normotensive rats
-60
107
214
428
POTÊNCIA E DURAÇÃO DO EFEITO HIPOTENSOR DA SNAC E DO NPS EM
MAP (mmHg)
RATOS WISTAR NORMOTENSOS
Potência
-30 (A)
*
PBS infusion
PBS+MB infusion
-20
-10
0
Time (min)
Azul de Met.
SNP SNAC
SNP SNAC
2 (B)
Duração do efeito
4
6
SNP
SNAC
8
10
Ricardo, K F, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biol.and Chem.
7, 57 (2002)
RS-NO
R-S H
- H+
SNO
SS
Proteína
NO
MODELO ANIMAL
Efeito da administração de GSNO na nitrosação
do receptor de insulina
(Modelo de Resistência à Insulina)
Ratos Wistar
- Diabéticos (ob/ob)
- Nocaute iNOS (C57BL/6)
(controle + Dieta hipercolesterolêmica –24 semanas)
DIABETES TIPO 2
RESISTÊNCIA
HIPERTENSÃO
À iNSULINA
DISLIPIDEMIA
ATEROSCLEROSE
AUMENTO NA PRODUÇÃO DE iNOs
Ligação da Insulina ao Receptor de insulina trans-membrana
Insulina
Receptor de insulina
Membrana plasmática
Autofosforilação dos resíduos de tirosina do receptor de Insulina
Membrana plasmática
Cadeia A da Insulina
Cadeia B da Insulina
Monômero da Insulina
Nitrosação da subunidade  do Receptor de Insulina
RS-NO
RS-H
-RSH
-RS-NO
S
S
Detecção da nitrosação do receptor de insulina pelo
Método fluorimétrico DAN/NAT
2 (Receptor - S-NO)
HgCl2
(Receptor- S – S - Receptor) + 2 NO
2 NO2-
2 NO + O2
NO
+ H2O
30 min, 37C
H2O
H
NH2
+
NO2
HNO
2
2 HNO2
N
N NO
pH 1-2
H+
NH2
NH2
NH2
- H2O
2,3 Diaminonaftaleno (DAN)
N
N
excit = 375 nm
N
N
pH 11-12
NH2
N
H
2,3naftotriazola
naftotriazol (NAT)
2,3
(NAT)
N+
Intermediário I
OH2+
Espectro de emissão do Naftotriazol
e curva de calibração com NO2-
Intensidade de fluorescência
800
600
300
400
200
200
100
0
0
400
440
480
520
Comprimento de onda / nm
0
100 200 300 400
[NaNO2] / nmolL
-1
Limite de detecção: < 5 nmol L-1
Intensidade de fluorescência em  = 407 nm
(A) (B)
400
Detecção da nitrosação dos substratos de receptores de
Insulina (IRS1) em imunoprecipitados (ratos ob/ob)
Intensidade de fluorescência
100
Adiposo
Hepático
Muscular
80
HC
HC
HC
60
40
Ctr
Ctr
Ctr
20
0
420
480
540 420 480 540 420
Comprimento de onda / nm
480
540
Carvalho-Filho, M.A., Ueno, M., Seabra, A.B., Carvalheira, B.C., de Oliveira, M.G., Veloso, L.ª,
Curi, R., Saad, M.J.ª, J. Biol Chem. 2004 - Submetido
Efeitos da GSNO na: atividade da tirosina-quinase,
captação de glicose e síntese de glicogênio
COLABORAÇÕES
FCM/UNICAMP
Prof. Mário Saad
IB/UNICAMP
Profa. Marta H. Krieger
INCOR/USP
FM/USP
Prof. Francisco R.M. Laurindo
Profa. Claudia P.M.S de Oliveira
ICB/USP
UNIV.
EDINBURGO
Profa. Sílvia R.B.Uliana
Prof. Richard Weller