Universidade de São Paulo Instituto de Ciências Biomédicas Depto. de Fisiologia e Biofísica Doutorado em Fisiologia Humana Análise de Canais para Na+ Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado Antônio Carlos Cassola – orientador Setembro de 2006 São Paulo – Brasil Potencial de ação voltagem (mV) +30 mV 0 Nav -70 Kir/Twik 0 1 tempo (ms) Kv Kv Kir/Twik Superfamília de Canais Ativados por Voltagem Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+ Nav 1.1 Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.4 Nav 1.5 Nav 1.6 Nav 1.6 Nav 1.5 Nav 1.7 Nav 1.8 Nav 1.8 Nav 1.9 Nav 1.9 75 80 85 90 95 100 % de identidade na seqüência de aminoácidos Estrutura terciária de canais iônicos 6 TM Kv 2 TM Kcsa Doyle et al, 1998 Filtro de seletividade em solução no filtro Doyle et al, 1998 Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem Kv1.2 MacKinnon et al, 2005 Ativação e inativação dos canais para Na+ Kcsa Farmacologia dos Nav Farmacologia dos Nav Bloqueio do poro Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por efeito alostérico Sítios em segmentos transmembrana batrachotoxin, ciguatoxin Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana Sítios em alças extracelulares a-scorpion toxins b-scorpion toxins sea-anemone toxins spider toxins Farmacologia dos Nav Anestésicos locais Expressão de canais para Na+ ativados por voltagem em células de mamíferos Expressão de canais para Na+ em mamíferos Neurônios Células não neuronais Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD) Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.6 Nav 1.5 Nav 1.8 Nav 1.9 75 80 85 90 % de identidade 95 100 TTX-S TTX-R Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela técnica de “voltage clamp” Im = Vm fixa x Gm Fixação de voltagem “Voltage clamping” tradicional Vm i Vc célula 10mm Fixação de voltagem “Voltage clamping” / “Patch Clamping” Rf Vc Rf Cm Ic Ra Cp Icp Ip Im Rm Vc Hamill et al, 1981 INa+ ativadas por voltagem 2 20 1 -110 mV 15 Vm (mV) 0 -80 -40 5 nA 40 5 ms 0 10 80 Vr 5 Vm (mV) -1 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 100 -5 -2 -3 Y/Ymáx 0 Extracelular - banho NaCl 50 mM Cloreto de colina 82 CaCl2 1,8 CoCl2 1 KCl 4 Hepes 10 Glicose 5 pH 7,4 (NaOH) Im (nA) +80 mV Vm-Vr -10 GNav -15 INav -20 INav = (Vm-Vr) x GNav Sol. Intracelular - pipeta NaCl 10 mM CsF 150 TEA 10 EGTA 9 Hepes 10 ATP 2 pH 7,4 (CsOH) -25 ENa= +41,5 mV Im Gmax Vm Vr V Vm 1 exp 1 / 2 k Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas 10 8 6 Ipico (nA) RELAÇÃO I-V 4 2 -80 -60 -40 Vm (mV) 0 -20 20 40 60 -2 -4 -6 -8 -10 Im Gmax Vm Vr V Vm 1 exp 1 / 2 k Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para se ajustar à relação IV Im Gmax 1 Vm Vr V1 / 2 1 Vm 1 exp k1 Gmax 2 V 2 Vm 1 exp 1 / 2 k2 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas 8 8 Componente 1 Componente 2 6 6 soma 4 60 4 2 2 Vm (mV) 0 -90 -70 -50 -30 -80 -60 -40 -20 -10 0-2 -2 -4 10 30 20 40 50 Vm (mV) 60 40 30 20 10 -4 -6 -6 -8 -8 -10 -10 LV conductance HV conductance Gaussian fitting of data 50 number of cells 10 Ipico (nA) 10 INa - pico (nA) RELAÇÃO I-V 0 n=200 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 5 V1/2 classes (mV) Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA 0 mV -5 mV -110 mV -160 mV -15000 Pico de corrente (pA) 0 2 nA 1 ms -10000 dado 1 equação -5000 Gm 0 -180 -160 -140 -120 -100 -80 Vpré-pulso (mV) -60 -40 -20 0 Gmax V Vm 1 exp 1 / 2 k Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar à curva de inativação estacionária Gm Gmax 1 V 1 Vm 1 exp 1 / 2 k1 Gmax 2 V1 / 2 2 Vm 1 exp k2 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA total -15000 Pico de corrente (pA) componente 1 INa (pA) -18000 -16000 -14000 -12000 -10000 -10000 -8000 dado 1 equação 2 equações -5000 0 -6000 componente 2 -4000 -2000 Vprépulso (m V) -180 -160 -140 -120 -100 -80 Vpré-pulso (mV) -60 -40 -20 0 0 -180 -130 -80 -30 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO dado 1 equação 0 mV -110 mV 20 nS 0 5 ms 1 nA 1 ms Im Gm Vm Vr Gt Gmax t 1 exp m 3 t exp th Hodgkin and Huxley, 1952c Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são necessários para se ajustar à curva de ativação e inativação da condutância no tempo 3 t Gt Gmax 1 1 exp m1 3 t t Gmax 2 1 exp exp h1 m 2 t exp h 2 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO 1,2 dado 1 equação 2 equações componente 1 20 nS 5 ms fração de condutância 1 componente 2 total 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -5 5 15 tempo (ms) 25 35 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO fração de corrente recuperada da inativação 1,0 0 mV 0,8 -110 mV 0 0,6 1 nA 20 ms 0,4 t Yt A exp 0,2 C 0,0 0 20 40 60 80 intervalo entre pulsos (ms) 100 120 Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à cinética de recuperação da inativação das condutâncias ativadas por voltagem t t Yt A1 exp A2 exp C 1 2 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO CONTROLE 1,0 da recuperada fração de corrente fração inativação da inativação recuperada 1,0 0,8 0,9 0,8 0,6 0,7 0,6 0,5 0,4 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,0 0,0 dado 1 equação 2 equações EXP1 EXP2 SOMA 0 0 20 20 40 40 60 60 80 80 tempo intervalo entre pulsos (ms) 100 100 120 120 Conclusões Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades biofísicas. Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de canais. Agradecimentos Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola FIM f(x) 5 4 3 2 1 -5 -4 -3 -2 -1 x 0 f(x) = mx + b m= 1,3 0 b= -1,3 2 f(x) = 1,3x – 1,3
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