UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA Tese de Doutorado Estudo dos reguladores sigma alternativos de Corynebacterium pseudotuberculosis: o fator transcricional sigma C e a resposta ao estresse oxidativo ORIENTADO: Thiago Luiz de Paula Castro ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Azevedo COORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi BELO HORIZONTE Agosto de 2013 1 Thiago Luiz de Paula Castro Estudo dos reguladores sigma alternativos de Corynebacterium pseudotuberculosis: o fator transcricional sigma C e a resposta ao estresse oxidativo Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor pelo programa de Pós-Graduação em Genética, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais. ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Azevedo COORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi BELO HORIZONTE Agosto de 2013 2 AGRADECIMENTOS Aos Prof. Vasco e Anderson, pelo companheirismo, orientação e oportunidades durante todos os anos de LGCM; Aos amigos do LGCM que contribuíram diretamente no desenvolvimento deste trabalho; Ao Prof. Christopher Dowson, por me acolher durante o Doutorado Sanduíche; À Dra. Nubia Seyffert, que tanto me apoiou no desenvolvimento deste trabalho; Ao Prof. Luis Pacheco, por todas as suas contribuições no decorrer da minha trajetória no LGCM, além da amizade e companheirismo; Aos Profs. Artur Silva, Paula Scheneider, Rommel Ramos, Adriana Carneiro, Agenor Valadares, Ana Guaraldi, Adriano Pimenta e Hélida Andrade, que tanto auxiliaram através da infraestrutura de seus laboratórios, materiais ou metodologias necessárias para concretização desta tese; Aos amigos e colegas Rodrigo Dias, Wanderson Marques, Renata Faria, Natayme Tartaglia, Karina Santana, Mariana Santana, Anne Pinto, Fernanda Militão, Bianca Souza, Caroline Dominguetti, Camila Antunes, Rachid Aref, Alfonso Gala-García, Fernanda Dorella, Boutros Sarrouh, Kátia Aparecida, Flávia Rocha, Sintia Almeida, Dayana Ribeiro, Tessália Saraiva, Siomar Soares, Marcela Pacheco, Jamil, Silvanira Barbosa, Rafael Baraúna, Pablo de Sá, Daniel Santos, Cassiana, dentre outros; Às secretárias Fernanda Magalhães, Sheila Magalhães, Márcia Natália e Mary; Aos meus pais Lúcia e Sylvio, que tanto me apoiaram nesta jornada; Aos demais familiares pelo apoio; Às agências de fomento de pesquisa CNPq, FAPEMIG e CAPES. 3 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................. 6 LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. 8 LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................... 10 RESUMO ................................................................................................................................. 15 ABSTRACT ............................................................................................................................. 16 1. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................................ 17 1.1. Corynebacterium pseudotuberculosis e a Linfadenite Caseosa .......................................... 17 1.2. Estresse oxidativo em bactérias e mecanismos de detoxificação celular ............................ 19 1.3. Regulação gênica pelos fatores sigma (σ): envolvimento na virulência e na resposta ao estresse..................................................................................................................................... 22 1.4. Estudo dos fatores sigma de C. pseudotuberculosis .......................................................... 30 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 33 2.1. Artigo de Revisão I ............................................................................................................. 34 2.2. Artigo de Revisão II ............................................................................................................ 34 2.3. Artigo de Revisão III ........................................................................................................... 34 3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 35 3.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 35 3.2. Objetivos específicos .......................................................................................................... 35 4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 36 4.1. Linhagens de C. pseudotuberculosis .................................................................................. 36 4.2. Confecção de oligonucleotídeos iniciadores ....................................................................... 37 4.3. Realização de curvas de crescimento de C. pseudotuberculosis........................................ 38 4.4. Condições de estresse aplicadas às culturas in vitro de C. pseudotuberculosis ................. 40 4.5. PCR em tempo real ............................................................................................................ 41 4.5.1. Obtenção de RNA total de C. pseudotuberculosis ....................................................... 41 4.5.2. Realização dos ensaios de transcrição reversa e PCR quantitativa (qPCR) ................ 42 4.5.3. Análise dos dados obtidos por qPCR ........................................................................... 44 4.5.4. Determinação da especificidade das reações de qPCR e da eficiência de amplificação dos iniciadores utilizados ....................................................................................................... 44 4.6. Análises Proteômicas ......................................................................................................... 44 4.6.1. Extração de proteínas citoplasmáticas das linhagens 1002(wt), 1002(ΔsigC) e 1002(ΔsigH) de C. pseudotuberculosis .................................................................................. 44 4.6.2. Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida .................................................... 45 4.6.2.1. 2D SDS-PAGE ...................................................................................................... 45 4.6.2.2. 2D-DIGE ................................................................................................................ 46 4.6.3. Tripsinólise em gel de poliacrilamida ............................................................................ 46 4.6.4. Identificação das proteínas por Espectrometrias de Massa .......................................... 47 4.6.4.1. Matrix-assisted laser desorption/ionization ............................................................ 47 4.6.4.2. LC-MSE.................................................................................................................. 47 4.7. Análises Transcriptômicas .................................................................................................. 48 4.7.1. Padronização de um protocolo para a depleção do rRNA ............................................ 48 4.7.2. RNA seq das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis ................. 48 4.8. Ensaios experimentais em Caenorhabditis elegans............................................................ 49 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 50 PARTE 1 – Avaliação da resposta de Corynebacterium pseudotuberculosis 1002 (wt) ao estresse oxidativo ................................................................................................................ 50 5.1. Suscetibilidade da linhagem 1002(wt) a agentes geradores de estresse oxidativo ............. 50 5.2. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ao estresse oxidativo em meio BHI ................................ 53 5.3. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(wt) sob estresse oxidativo em MQD ............................................. 55 4 5.4. Análise conjunta dos dados obtidos para a expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma em C. pseudotuberculosis 1002(wt) ............................................................... 58 5.5. Análise de proteínas diferencialmente expressas em C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta à plumbagina ............................................................................................................... 63 PARTE 2 – Caracterização fenotípica de linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para os genes codificadores dos fatores sigma alternativos ........................................... 73 5.6. Suscetibilidade diferencial das linhagens mutantes para os fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo ................................................................................. 73 5.7. Avaliação proteômica diferencial das linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para os fatores sigma σH e σC em relação à parental 1002(wt) .............................................................. 81 5.7.1. Comparação do proteoma entre a linhagem mutante para o fator σH e 1002(wt) ......... 81 5.7.2. Comparação do proteoma entre a linhagem mutante para o fator σC e 1002(wt) ......... 89 5.8. Avaliação transcriptômica diferencial de C. pseudotuberculosis mutante para o fator σC em relação à linhagem 1002(wt) ..................................................................................................... 94 5.9. Avaliação da virulência das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis 103 PARTE 3 – Estudo do papel do fator σC na resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis .......................................................................................................... 105 5.10. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) submetida ao estresse oxidativo.......................................... 105 5.11. Análise de proteínas diferencialmente expressas na linhagem mutante para o fator σC exposta à plumbagina ............................................................................................................. 109 6. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 116 6.1. PARTE I ........................................................................................................................... 116 6.2. PARTE II .......................................................................................................................... 116 6.3. PARTE III ......................................................................................................................... 117 7. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 118 8. REFERÊNCIAS.................................................................................................................. 119 5 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura dos fatores sigma e sua interação com a RNA polimerase e região promotora......................................................................................................................................23 Figura 2. Representação esquemática do envolvimento dos fatores sigma bacterianos na transcrição gênica.........................................................................................................................24 Figura 3. Representação esquemática do evento de recombinação homóloga simples entre o plasmídeo pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen®) contendo o fragmento do gene que codifica o σC e o gene que codifica este fator sigma no cromossomo bacteriano....................................................37 Figura 4. Estruturas moleculares dos compostos químicos empregados neste estudo para a geração de estresse in vitro em culturas de C. pseudotuberculosis.............................................40 Figura 5. Avaliação da suscetibilidade de C. ao pseudotuberculosis peróxido de hidrogênio......................................................................................................................................51 Figura 6. Avaliação da suscetibilidade de C. pseudotuberculosis à plumbagina........................52 Figura 7. Níveis C.pseudotuberculosis de expressão 1002 dos (wt) genes exposta codificadores ao estresse de fatores oxidativo sigma em de meio BHI.................................................................................................................................................54 Figura 8. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002 (wt) exposta a 15µM de plumbagina, em meio MQD..............................................................................................................................................57 Figura 9. Representação em heat map dos níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ao peróxido de hidrogênio 40mM e à plumbagina 15µM..........................................................................................................................59 Figura 10. Resolução das proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não a plumbagina (15µM) através de 2D-DIGE.......................................................................68 Figura 11. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina (15µM)............................................69 Figura 12. Visualização dos vinte e dois spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina (15µM).......................................................................................................................70 Figura 13. Curvas de crescimento em MQD das linhagens 1002(wt) e mutantes para os genes codificadores dos fatores σB, σ C, σ D, σE, σ H, σK e σM de C. pseudotuberculosis........................................................................................................................74 Figura 14. Curvas de crescimento representativas das linhagens 1002(wt) e mutantes para os fatores sigma alternativos sob condição normal e plumbagina a 5µM..........................................77 6 Figura 15. Suscetibilidade das linhagens selvagem e mutantes de C. pseudotuberculosis aos agentes geradores de estresse oxidativo (peróxido de hidrogênio e plumbagina).......................78 Figura 16. Curvas de crescimento para avaliação do efeito causado pelo peróxido de hidrogênio sobre o crescimento das diferentes linhagens de C. pseudotuberculosis.....................................80 Figura 17. Resolução das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) através de 2D-DIGE...............................................................................84 Figura 18. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH).................................................................................85 Figura 19. Visualização dos doze spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH)...................................................................................................................................86 Figura 20. Resolução das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) através de 2D-DIGE...............................................................................91 Figura 21. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC).................................................................................92 Figura 22. Visualização dos cinco spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC)...................................................................................................................................93 Figura 23. Quantidade total de leituras geradas no sequenciamento do RNA (RNA seq) distribuídas de acordo com o tamanho em pares de bases..........................................................98 Figura 24. Classificações funcionais e processuais dos genes mais expressos na linhagem 1002 (wt) de C. pseudotuberculosis.......................................................................................................99 Figura 25. Sobrevivência dos nematódeos após infecção com as linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis.......................................................................................104 Figura 26. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta à plumbagina 15µM, em meio MQD............................................................................................................................................107 Figura 27. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e (ΔsigC) expostas à plumbagina 15µM, em meio MQD..............108 Figura 28. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina (15µM)....................................112 Figura 29. Visualização dos vinte e quatro spots correspondentes as proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina (15µM)..................................................................................................................113 7 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Os fatores sigma de Mycobacterium tuberculosis e as suas funções.............................29 Tabela 2. Fatores sigma identificados em C. pseudotuberculosis e suas principais características..................................................................................................................................32 Tabela 3. Linhagens mutantes para os fatores sigma de C. pseudotuberculosis utilizadas neste trabalho............................................................................................................................................36 Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores selecionados e validados para as reações de qPCR, seus alvos, e tamanhos dos produtos amplificados esperados...............................................................38 Tabela 5. Composição do meio quimicamente definido (MQD) utilizado para o cultivo de C. pseudotuberculosis..........................................................................................................................39 Tabela 6. Condições de estresse testadas in vitro..........................................................................41 Tabela 7. Reagentes e suas quantidades utilizadas nas reações de qPCR...................................43 Tabela 8. Parâmetros configurados no termociclador 7900HT Fast Real-Time PCR System para as reações de qPCR........................................................................................................................43 Tabela 9. Proteínas citoplasmáticas identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MS, após análise de expressão diferencial na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina..........................................................................................................71 Tabela 10. Classificação das proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina, de acordo com funções e processos do Blast2go.....................................................................................................................72 Tabela 11. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) que foram identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS.........................................................................................................................87 Tabela 12. Classificação das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) identificadas por espectrometria de massa, de acordo com funções e processos do Blast2go.....................................................................................................................88 Tabela 13. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) que foram identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS.........................................................................................................................93 Tabela 14. Classificação das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) identificadas por espectrometria de massa, de acordo com funções e processos do Blast2go.....................................................................................................................94 Tabela 15. Genes mais expressos na linhagem 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis e suas respectivas funções e processos biológicos..................................................................................100 8 Tabela 16. Genes mais expressos na linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis e suas respectivas funções e processos biológicos..................................................................................101 Tabela 17. Proteínas citoplasmáticas identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MS, após análise de expressão diferencial na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina........................................................................................................114 Tabela 18. Classificação das proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina, de acordo com funções e processos do Blast2go...................................................................................................................115 9 LISTA DE ABREVIATURAS 2D - Gel bidimensional ACN - Acetonitrila ASC - Área sobre a curva ATP - Trifosfato de adenosina BHI - Brain Heart Infusion BLAST - Basic Local Alignment Search Tool cDNA - DNA complementar CHAPS - 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano sulfonato CMNR - Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia- cm - Rhodococcus Centímetro cm2 - Centímetro quadrado CsdA - Cisteina desulfurase Ct - Cycle threshold Cu - Cobre CXXC - Motivo protéico com dois resíduos de cisteína DIGE - Eletroforese em gel diferencial bidimensional DNA - Ácido desoxirribonucléico dNTPs - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados DMSO - Dimetilsulfóxido DTT - Ditiotreitol DEPC - Dietilpirocarbonato DHPLC - Denaturing high-performance liquid chromatography DO - Densidade óptica 2-ME - 2-mercaptoetanol ECF - Extracitoplasmic function EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 10 Fe - Ferro Fe-S - Ferro-enxofre GND - 6-fosfogluconato desidrogenase G - Grama GSH - Glutationa H - hora HCl - Ácido clorídrico HPI - Catalase monofuncional Hk - Histidina quinase HPII - Catalase peroxidase Hsp - heat shock protein HTH - helix-turn-helix H2O - Água H2O2 - Peróxido de hidrogênio HOCl - Ácido hipocloroso IEF - Focalização Isoelétrica IHF - Integration host factor IFN-g - Interferon-gama IAA - Iodocetamida LM - Lipomanano Kg - Quilograma L - Litro LAN - Lipoarabinomanano LC - Linfadenite Caseosa LC-MSE - Liquid Chromatography–Mass Spectrometry Electrospray LN - Logaritmo natural M - Molar Min - Minuto Mg - Miligrama mL - Mililitros 11 mM - Milimolar MALDI - Matrix-assisted laser desorption/ionization Mn - Manganês MQD - Meio Quimicamente Definido MS - Espectrometria de massa MSH - Micotiol N - Normal ND - Não definido NDK - nucleosídeo difosfato quinase NOX2 - Oxidase fagocítica NaCl - Cloreto de sódio NADP - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NaOH - Hidróxido de sódio NCBI - National Center for Biotechnology Information ng - Nanograma NH4HCO3 - Bicarbonato de amônio NL - não linear nm - Nanômetro NTC - No-template control O2 - Oxigênio O2.- - Superóxido O3 - Ozônio 1 O2 - Oxigênio singlete O2.- - Ânion superóxido OH. - Hidroxila Ohr - Organic hydroperoxide resistance ORF - Open reading frame ºC - Grau Celsius PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida pb - Pares de bases 12 Plb - Plumbagina PCR - Polymerase chain reaction PEG - Polietilenoglicol pH - Potencial hidrogeniônico Pip - Prolinaiminopeptidase Pgk - Fosfogliceratoquinase pM - Picomol PMSR - Redutase de sulfóxido de metionina peptídica qPCR - Quantitative PCR Qsp - Quantidade suficiente para rDNA - DNA codificador do RNA ribossomal ROS - Reactive oxygen species RGMG - Rede Genoma de Minas Gerais Rpm - Revoluções por minuto RNA - Ácido ribonucléico RNAP - RNA polimerase rRNA - RNA ribossomal RT- qPCR - Quantitative reverse transcription-PCR S - segundos SDS - Dodecilsulfato de sódio Sig - Sigma (σ) SOD - Superóxido dismutase Taq - Thermus aquaticus Tat - Twin-arginine translocation TBE - Tris-borato-EDTA TCA - Ácido Tricarboxílico TFA - ácido trifluoracético TCS - Two component system TE - Tris-EDTA TOF - Time Of Flight 13 ufc - Unidade formadora de colônia µg - Micrograma µL - Microlitro µM - Micromolar Zn - Zinco -SH - Grupo tiol V - Volt v - versão v/v - volume por volume vf - Volume final xg - constante gravitacional 14 RESUMO Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva causadora da Linfadenite Caseosa (LC) em caprinos e ovinos. A LC é uma doença infecto-contagiosa crônica que prejudica a produção de carne, leite e lã em vários países, incluindo o Brasil, onde se tornam cada vez mais importantes as atividades de ovino e caprinocultura. Uma vez que o tratamento da doença é muitas vezes inviável e ineficaz, a eliminação dos animais infectados no rebanho tem sido uma das principais medidas de contenção da enfermidade. Vários grupos de pesquisa têm se dedicado ao estudo de C. pseudotuberculosis, visando à identificação de fatores moleculares envolvidos na virulência e patogenicidade durante a infecção. Embora alguns destes componentes já tenham sido descritos, como a fosfolipase D, novos estudos são necessários para que possamos compreender as diversas interações regulatórias que são intrínsecas a esse microrganismo. Assim, nos dedicamos, neste trabalho, à identificação e caracterização dos reguladores transcricionais de C. pseudotuberculosis pertencentes à família dos fatores sigma. Em outras bactérias patogênicas, os fatores sigma têm sido associados a processos relevantes para a infecção, promovendo resistência a diversos tipos de estresse que são encontrados dentro do hospedeiro. Por constituir uma das principais barreiras impostas a patógenos intracelulares como C. pseudotuberculosis, o estresse oxidativo foi a principal condição avaliada no nosso estudo. Com base em ensaios de RT-qPCR e curvas de suscetibilidade para linhagens mutantes, sugerimos que os fatores sigma σC, σH e σK ocupam posição de destaque para a resistência ao estresse oxidativo. Ainda, mostramos que vários dos mecanismos ativados para a resistência a esse estresse se assemelham aos de outras bactérias patogênicas, além de propormos prováveis funções para o fator σH e, principalmente, o fator σC em C. pseudotuberculosis. 15 ABSTRACT Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium which causes Caseous Lymphadenitis (CL) in small ruminants. CL is a chronic infectious disease which impairs meat, whool and milk production in many countries including Brazil, where sheep and goat industries have been increasing in importance. Once the treatment for CL is not efficient, removing affected animals from herds represents one of the major strategies to prevent the disease from spreading. Many research groups have been looking for molecular components in C. pseudotuberculosis that are involved in virulence and infection, among which phospholipase D stands out as the major one described so far. However, new studies are necessary for the understanding of the microorganism’s biology, including its intrinsic regulation mechanisms. In this context, we attempted to characterize the sigma factors family-belonging transcriptional regulators of C. pseudotuberculosis, as these proteins are reportedly related to processes relevant to infection and stress-response in other pathogenic bacteria. As one of the most prominent barriers intracellular pathogens like C. pseudotuberculosis are supposed to transpose, the oxidative stress was the condition elected for most assays presented in this work. Considering our RT-qPCR results plus susceptibility C H testing experiments using mutant strains, we suggest that the K factors σ , σ and σ play important roles for the resistance to oxidative stress. We show also that many of the mechanisms which are responsible for oxidative-stress response in other bacterial pathogens are present in C. pseudotuberculosis. Finally, we indicate probable functions for σH and more remarkably σC in this bacterium. 16 1. INTRODUÇÃO GERAL 1.1. Corynebacterium pseudotuberculosis e a Linfadenite Caseosa Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, pleomórfica e imóvel, que possui fímbrias, mas não é capaz de esporular ou formar cápsula. Embora possa ser encontrada livre no ambiente, C. pseudotuberculosis apresenta grande relevância na medicina veterinária por ser o agente etiológico de diferentes patogenias em diversos animais, como cabras, ovelhas, cavalos, alpacas, lhamas, búfalos, camelos e antílopes (Baird & Fontaine, 2007). No entanto, pelo menos 25 casos de infecção em humanos por C. pseudotuberculosis já foram descritos, sendo que a maior parte deles foi associada principalmente ao contato com animais portadores da bactéria (Liu et al., 2005). Membro da Classe Actinobacteria, C. pseudotuberculosis possui um único cromossomo com alto conteúdo de bases nitrogenadas guanina e citosina. Ao lado de outras espécies do gênero Corynebacterium, considera-se que C. pseudotuberculosis é membro de um grupo parafilético conhecido por CMNR, o qual abrange também espécies dos gêneros Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus. Este grupo de bactérias pertencentes à Sub-ordem Corynebacterineae apresenta como principal caractéristica em comum a parede celular baseada num grande complexo polimérico de peptideoglicano, arabinogalactano e ácido micólico. Ainda, assim como C. pseudotuberculosis, outras espécies do grupo CMNR são patógenos de grande relevância, como Mycobacterium tuberculosis e Corynebacterium diphteriae (causadoras, respectivamente, da tuberculose e da difteria em humanos), além de Arcanobacterium pyogenes e Corynebacterium renale, de interesse veterinário (Moore et al., 2010). O grupo CMNR também engloba espécies de elevado interesse biotecnológico, como Corynebacterium glutamicum e Corynebacterium efficiens, as quais são amplamente empregadas na indústria para a produção de aminoácidos e outros compostos biossintéticos (Ikeda et al., 2003). A enfermidade mais comumente associada à infecção por C. pseudotuberculosis é a Linfadenite Caseosa (LC), a qual acomete os pequenos ruminantes (cabras e ovelhas) e ocasiona expressivas perdas econômicas para a ovinocaprinocultura, principalmete devido à redução da produção de carne, leite e lã. No estágio inicial de manifestação da LC há formação de abscessos e granulomas nos linfonodos superficiais; no entanto, em estágio avançado, a doença também afeta os linfonodos viscerais e compromete o funcionamento dos órgãos internos como pulmões, rins, fígado e baço – podendo até mesmo causar a morte (Baird & Fontaine, 2007, Williamson, 2001). A LC tem ampla distribuição no continente europeu, estando presente, por exemplo, na Inglaterra, França, Holanda e Espanha (Baird & Fontaine, 2007; Ruiz et al., 2007). Casos de LC 17 também já foram descritos na Oceania e Américas do Norte, Central e do Sul, abrangendo a Austrália, os Estados Unidos, Cuba e Venezuela (Baird & Fontaine, 2007; Ruiz et al., 2007). O Brasil tem relatado altos índices de prevalência da LC principalmente na região nordeste, onde se concentra a maior parte dos rebanhos caprinos no país. No entanto, há relatos de que a prevalência da LC pode alcançar 80% das cabras e ovelhas nos criadouros do sudeste brasileiro (Guimarães et al., 2009; Seyffert et al., 2010). A LC é geralmente introduzida em rebanhos sadios por animais adquiridos de rebanhos onde há histórico de infecção por C. pseudotuberculosis. Estudos sugerem que a transmissão da LC ocorra principalmente pela via cutânea, uma vez que procedimentos comuns que geram feridas na pele - como tosa, castração e marcações de animais - parecem contribuir para a disseminação da doença nos rebanhos. A alta incidência de lesões intra-torácicas decorrentes da LC em animais que são mantidos em confinamento pode ser um indício de que a transmissão também ocorre pela via aérea (Kuria et al., 2001; Dorella et al., 2006a). O procedimento mais indicado para o controle da LC nos rebanhos inclui a remoção dos animais infectados e a vacinação dos animais sadios (Guimarães et al. 2009); no entanto, tais medidas apresentam baixa eficácia devido ao diagnóstico tardio da doença (em estágio clínico avançado) e à indisponibilidade de vacinas comerciais capazes de conferir altos índices de proteção (Dorella et al., 2006a; Dorella et al., 2009). C. pseudotuberculosis é sensível a diversos antibióticos in vitro, mas os abscessos de consistência caseosa, que se formam envoltos por cápsulas expessas, protegem as bactérias da ação dos antimicrobianos e dificultam o tratamento da LC (Williamson, 2001). Embora o processo patogênico da LC seja bem entendido, poucos determinantes moleculares de virulência e patogenicidade de C. pseudotuberculosis foram descritos até o momento. Dentre os principais determinantes se destacam os ácidos micólicos de cadeia curta, que compõem a parede celular de C. pseudotuberculosis; a fosfolipase D, que é uma exotoxina com atividade esfingomielinase; e as proteínas codificadas pelo operon fagABC e pelo gene fagD, as quais estão relacionadas à aquisição de ferro pela célula (McKean et al., 2005 e 2007a; Williamson, 2001; Billington et al., 2002). Outros determinantes de virulência já descritos incluem uma sintetase peptídica não-ribossômica e a enzima propionil-CoA-carboxilase, ambas codificadas por genes cuja a expressão é ativada durante a infecção em macrófagos (McKean et al., 2005). Assim como as bactérias de vida livre, C. pseudotuberculosis é capaz de sobreviver fora do organismo hospedeiro e resisitr a diversas situações ambientais que podem prejudicar sua homeostase. Além disso, ao infectar o hospedeiro, essa bactéria é exposta a condições que também são desfavoráveis ao seu estabelecimento, precisando resistir aos mecanismos de defesa do hospedeiro e também aos efeitos da baixa disponibilidade de oxigênio (hipóxia) (McKean et al., 2007a; 2007b). Após serem internalizadas por macrófagos, as bactérias são 18 enclausuradas em fagossomos que se fundem, em seguida, aos lisossomos. É interessante observar que alguns patógenos intracelulares, como M. tuberculosis e Brucella abortus, são capazes de impedir a fusão entre o fagossomo e o lisossomo quando internalizados (Tashjian & Campbell, 1983; Rohde et al., 2007). Os fagolisossomos que se formam no caso de C. pseudotuberculosis proporcionam um ambiente ácido e especialmente rico em proteases, lisozima, espécies reativas de nitrogênio - como o óxido nítrico - e espécies reativas de oxigênio como o ácido hipocloroso (Rohde et al., 2007; Schaible, 2009). Combinados, estes elementos agridem diversas estruturas bacterianas, incluindo o envelope celular, complexos protéicos e os ácidos nucléicos. Neste contexto, as proteínas secretadas pelo patógeno parecem desempenhar papel importante para a neutralização dos mecanismos de ação do hospedeiro, colaborando para a manutenção da homeostase durante a infecção (Bhasvar et al., 2007). Com os objetivos de identificar alvos importantes para o processo infeccioso e padronizar métodos imunoprofiláticos para o controle da LC, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado à caracterização de proteínas secretadas por C. pseudotuberculosis. Ao todo, cento e quatro exoproteínas dessa bactéria já foram identificadas utilizando diferentes metodologias de proteômica (Pacheco et al., 2011; Silva et al., 2013b). Ainda, dezenove destas mostraram ser antigênicas em análises sorológicas do proteoma, dentre as quais se destacam as proteínas ortólogas às de outros microrganismos nos quais são responsáveis pela invasão celular, pelo transporte de nutrientes, e pela adaptação a fatores adversos do meio. Algumas exoproteínas identificadas ainda não possuem funções conhecidas (Seyffert et al., 2011; Seyffert et al., 2013 - artigo em redação). 1.2. Estresse oxidativo em bactérias e mecanismos de detoxificação celular As espécies reativas de oxigênio - ou ROS (do inglês, Reactive Oxygen Species) - são formadas nos organismos aeróbios como subprodutos do metabolismo celular, em decorrência da redução parcial do oxigênio molecular (O2) para ânion superóxido (O2.-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical reativo de hidroxila (OH.) (Merkamm & Guyonvarch, 2001). Em bactérias, a maioria das ROS é gerada pelas enzimas da cadeia respiratória associadas à membrana plasmática, responsáveis pela redução sequencial do oxigênio molecular (Cabiscol et al., 2000, Cash et al., 2007). Foi demonstrado, por exemplo, que a cadeia respiratória é responsável por cerca de 87% da produção total de H2O2 em Escherichia coli (González-flecha & Demple, 1995). As ROS também compreendem outros derivados do oxigênio que não são considerados radicais (embora sejam instáveis), como o ácido hipocloroso, (HOCl), o ozônio (O3) e o oxigênio singlete (1O2) (Berra & Menck et al., 2006). Além das ROS produzidas endogenamente, as bactérias são frequentemente expostas às espécies reativas presentes no ambiente externo. Diversas actinobactérias, por exemplo, são 19 capazes de resistir às ROS presentes no ambiente fagossomal, as quais são produzidas pelos macrófagos como um importante mecanismo de defesa. Quando a quantidade de ROS excede a capacidade fisiológica normal de processamento nas bactérias ocorre o estresse oxidativo. Como diversos componentes celulares são vulneráveis às ROS – como o DNA e as proteínas - a ativação de enzimas e compostos detoxificadores é fundamental para a manutenção da sobrevivência sob tal condição. É importante destacar que a suscetibilidade bacteriana às ROS é bastante diversificada, em parte devido à existência de diferentes mecanismos de tolerância que podem estar presentes ou ausentes dependendo da espécie considerada (Hassett & Cohen, 1989; Hengst & Buttner, 2008). O cromossomo bacteriano apresenta alta suscetibilidade às alterações promovidas pelas ROS, que podem ocorrer mesmo na ausência do estresse oxidativo propriamente dito. As modificações decorrentes da oxidação, se não reparadas, resultam no pareamento incorreto das bases nucleotídicas na fita de DNA, durante o evento de replicação, causando alterações indesejáveis na sequência nucleotídica herdada por uma das células descendentes . Em E. coli, o controle dos mecanismos de reparo do DNA é realizado pela rede SOS regulatória, da qual fazem parte cerca de 20 genes que têm sua expressão reprimida pela proteína LexA. Neste mesmo microrganismo, a formação de cadeias simples de DNA, em decorrência de danos ou da paralisação da replicação, ativa a proteína RecA, que por sua vez promove a inativação de LexA. O reparo do DNA lesionado pode acontecer por eventos de recombinação homóloga ou pelo recrutamento da DNA polimerase promovido pela própria RecA ligada à cadeia simples (Salles & Paleoletti, 1983). O exemplo mais comum de base nitrogenada modificada por ROS é a 8-oxodesoxiguanina, originada a partir da oxidação da guanina. Como a guanina apresenta alta afinidade pela citosina e a 8-oxo-desoxiguanina se liga com maior facilidade à adenina, considerase que a alteração nucleotídica em questão promove a transversão de citosina para adenina durante o evento de replicação. (Neeley & Essigmann, 2006). Em E coli, a eliminação da 8-oxodesoxiguanina depende principalmente de duas glicosilases: MutM, que remove a 8-oxodesoxiguanina ligada à citosina, na fita-dupla de DNA; e MutY, que remove eventuais adeninas ligadas às bases 8-oxo-desoxiguanina. A MutT, enzima cuja atividade hidrolisa 8-oxodGTP livre a 8-oxo-dGMP, também auxilia na prevenção da ocorrência de erros de replicação induzidos pelo estresse oxidativo (Michaels et al., 1991). A oxidação também pode acarretar diversas alterações indesejáveis nas proteínas (Hasset & Cohen, 1989). As células procariotas possuem enzimas capazes de reparar diretamente algumas dessas modificações protéicas, como a metionina sulfóxido redutase - que corrige o sulfóxido de metionina para metionina. Além disso, um sistema simples de proteção, que pode ser considerado a última alternativa de "defesa" da proteína, se baseia na exposição de 20 resíduos de metionina no entorno do sítio ativo. Dessa forma, os resíduos expostos são preferencialmente oxidados e a função da proteína não é prejudicada (Levine et al., 1996). Um mecanismo antioxidante de proteínas bastante difundido entre os organismos vivos baseia-se no sistema tioredoxina, o qual é responsável pela manutenção dos grupos tiol (-SH) de resíduos de cisteína na sua forma reduzida (Holmgren, 1989). Em adição a este sistema, a maior parte dos organismos apresenta compostos tiol de baixo peso molecular que auxiliam na prevenção da formação de pontes dissulfeto em proteínas citoplasmáticas, sendo o mais importante deles o tripeptídeo glutationa (GSH) (Newton et al., 1993). Embora a glutationa não esteja presente nos actinomicetos, estes microrganismos apresentam um outro sistema de função similar, o micotiol (MSH, também conhecido por AcCys-GlcN-Ins) (Newton et al., 2008). Há indícios de que o MSH seja importante para a viruência de M. tuberculosis, sendo que um dos genes responsáveis pela sua biosíntese - o mshD - parece ser essencial para o estabelecimento do patógeno durante a infecção de macrófagos (Rengarajan et al., 2005). Além disso, foi relatado que a MSH tem sua produção aumentada durante a transição da fase exponencial para a fase estacionária de crescimento de M. tuberculosis (Buchmeier et al., 2003). Outro importante mecanismo de detoxificação celular compreende a catalase, que é a enzima responsável pela conversão de peróxido de hidrogênio nas moléculas atóxicas H2O e O2. A bactéria E. coli, por exemplo, é produtora de 2 catalases distintas: uma monofuncional conhecida como hidroperoxidase I (HPI) e codificada pelo gene katG -, e outra com atividade peroxidase - hidroperoxidase II (HPII), variedade que ocorre comumente em bactérias e fungos e que tem sua produção desencadeada pela ação do regulador sigma RpoS. Há evidências de que bactérias patogênicas produzem altos níveis de catalase dentro do compartimento fagossômico durante a infecção em macrófagos, sugerindo que esta enzima é importante para a virulência de patógenos catalase-positivos como M. tuberculosis e Nocardia asteroides (Leblond-Francillard et al., 1989). Em E. coli, a catalase monofuncional HPI tem sua produção ativada pela proteína OxyR, um exemplo clássico de regulador redox nesta espécie. Além de katG, a OxyR ativa um regulon de mais de 20 genes envolvidos em ações antioxidantes, incluindo aqueles que codificam a alquil hidroperóxido redutase (enzima que converte hidroperóxidos orgânicos em álcoois) e a GSH (Hengst & Buttner, 2008). Entretanto, nem todas as actinobactérias apresentam o OxyR - caso de M. tuberculosis - devido à ocorrência de múltiplas mutações e deleções. No entanto, o bacilo da tuberculose produz a proteína FurA, que atua na repressão da catalase HPI, além de regular o processo de aquisição de ferro . Portanto, para as micobactérias desprovidas de OxyR funcional, FurA aparenta ser um importante regulador de mecanismos de resposta ao estresse oxidativo (Zahrt et al. 2001). Outros importantes agentes detoxificadores, as superóxido dismutases são metaloenzimas multiméricas que catalisam a conversão do ânion superóxido para peróxido de hidrogênio. Elas 21 são classificadas em 4 grupos distintos de acordo com o tipo de metal cofator: ferro (Fe-Sod ou SodB), manganês (Mn-Sod ou SodA), níquel (Ni-Sod), e cobre e zinco (Cu/Zn-Sod ou SodC). Enquanto as proteínas SodA e SodB estão presentes no citoplasma da maior parte das bactérias, a SodC se encontra no espaço periplasmático de bactérias patogênicas (Merkamm & Guyonvarch, 2001). O envolvimento de SodC com patogenicidade foi demonstrado para o bacilo Gram-negativo Burkholderia cenopacea. Patógeno oportunista, este microrganismo produz SodC para se proteger dos ânions superóxido de origem exógena, o que parece contribuir para sua sobrevivência durante a infecção de macrófagos (Keith & Valvano, 2007). M. tuberculosis possui 2 genes codificadores de superóxido dismutases: sodA e sodC. Assim como ocorre em B. cenopacea, a SodC de M. tuberculosis apresenta função de envelope celular. A inativação do gene sodC aumenta a suscetibilidade dessa bactéria ao ânion superóxido, ao óxido nítrico (NO) combinado com o ânion superóxido, e à morte por macrófagos murinos peritoneais ativados com interferon gama (IFN-ɣ) (Piddington et al., 2001). Por outro lado, macrófagos selvagens não-ativados e macrófagos ativados por IFN-ɣ, mas deficientes para a enzima Nox2 (NADPH Oxidase 2), não foram capazes de eliminar o mutante para SodC durante a infecção, demonstrando que esta superóxido dismutase contribui para a resistência da bactéria contra espécies reativas de oxigêno no meio intracelular. Em resumo, as modificações no ambiente causadoras do desequilíbrio reducional-oxidativo podem ser deletérias ou até mesmo letais para as células bacterianas. Assim, a sobrevivência desses microrganismos depende diretamente da ativação dos mecanismos voltados para a prevenção da geração de ROS, o impedimento da propagação destas espécies, e o reparo de eventuais danos causados por elas em diferentes componentes celulares (Cabiscol et al., 2000; Lushechak, 2001). Nesse contexto, sendo a regulação dos processos envolvidos na adaptação às condições adversas - como o estresse oxidativo - mediada principalmente através da ativação ou repressão da transcrição gênica nos organismos procariotos, nosso grupo tem pesquisado o papel dos fatores transcricionais pertencentes à família dos fatores sigma em C. pseudotuberculosis. 1.3. Regulação gênica pelos fatores sigma (σ): envolvimento na virulência e na resposta ao estresse A modulação da expressão gênica tem um papel definitivo nas adaptações e modificações necessárias para a sobrevivência às alterações ambientais extremas e rápidas, sendo também crucial para a bactéria realizar uma infecção de sucesso. Assim, a busca por novos determinantes de virulência em patógenos como C. pseudotuberculosis tem levado ao estudo das proteínas ativadoras/reguladoras da transcrição de genes especificamente voltados para a resposta às alterações das condições ambientais (Kazmierczak et al., 2005). 22 Os fatores sigma, comumente representados pela letra grega σ, são proteínas que se ligam ao cerne da RNA polimerase - composto formado por diferentes subunidades protéicas (α2, β, β’ e ω) - de forma a torná-lo uma holoenzima ativa e capaz de transcrever os genes bacterianos (Figura 1). Os fatores sigma permitem à RNA polimerase reconhecer promotores gênicos de maneira específica, uma vez que possuem afinidade diferencial às várias combinações de sequências consenso situadas a montante das regiões codificadoras gênicas. Dessa maneira, cada um dos fatores sigma presentes na bactéria assegura a ativação coordenada da expressão de um determinado conjunto de genes (ou regulon) fisiologicamente ou desenvolvimentalmente relacionados, os quais podem estar envolvidos na adaptação requerida durante o curso de infecção em bactérias patogênicas (Nesvera & Pátek, 2008). A participação dos fatores sigma no processo transcricional está demonstrada na Figura 2. Traduzido e Adaptado: Paget & Helmann, 2003; Pátek & Nesvera, 2011. Figura 1. Estrutura dos fatores sigma e sua interação com a RNA polimerase e região promotora. A) A RNA polimerase ligada ao fator sigma origina uma holoenzima capaz de reconhecer as seqüencias consenso dos promotores gênicos. B) Regiões e domínios conservados dos fatores sigma da família σ70. As setas verticais indicam a interação dos domínios de ligação ao DNA com os motivos conservados -10 e -35 dos promotores. Tais domínios se localizam nas subregiões 2.4 e 4.2, respectivamente. A interação entre a subregião 3.0 e a região -10 extendida (dímero TG) também ocorre em algumas bactérias. A seta dobrada indica o ponto de início da transcrição (+1) e a direção desta. 23 Traduzido e Adaptado: http://amolecularmatter.tumblr.com/post/21213985951/transcription-in-prokaryotes Figura 2. Representação esquemática do envolvimento dos fatores sigma bacterianos na transcrição gênica. Diferentes etapas da transcrição gênica são mostradas: (1-3) a holoenzima da RNA polimerase se liga ao promotor formando o complexo fechado, e então mudanças conformacionais abrem o complexo e permitem o reconhecimento específico das regiões promotoras -10 e -35; (3-4) a RNA polimerase inicia a produção de pequenas moléculas de RNA, de2 a 12 pares de bases, originando o complexo ternário; (4-7) o alongamento dos transcritos de RNA acontece após a liberação do fator sigma do cerne da RNA polimerase. 24 As eubactérias possuem pelo menos um fator sigma considerado principal (ou primário), pertencente à família σ70, o qual é ativador da transcrição da maioria dos genes essenciais ao crescimento exponencial sob condições ótimas de cultivo , também denominados housekeeping (Halgasova et al., 2002). Como exemplos de fatores sigma essenciais descritos na literatura, citamos o σA de Bacillus subtilis e o σ70 codificado pelo gene rpoD em E. coli. Na ocorrência de estímulos ambientais diversos, fatores sigma alternativos - que são considerados não-essenciais à viabilidade do organismo - podem substituir o sigma primário que está ligado ao cerne da RNA polimerase e permitir a ativação da expressão de conjuntos gênicos necessários à resposta adaptativa requerida (Helman, 2002; Kazmierczak et al., 2005). Considerando-se suas características estruturais e funcionais, um fator sigma alternativo pode ser classificado como pertencente a uma das seguintes famílias: σ54 ou σ70. Os fatores sigma da família σ54 permitem à holoenzima da RNA polimerase reconhecer regiões promotoras 12 e -24, iniciando a transcrição gênica geralmente quando uma proteína ativadora se liga à sequência acentuadora (ou enhancer) presente a montante do promotor. Em alguns casos, a transcrição gênica pela RNA polimerase ligada ao fator σ 54 pode requerer um fator de integração responsável por flexionar a dupla-fita de DNA, de modo a permitir a interação entre a holoenzima e a proteína ativadora ligada ao enhancer. Um exemplo conhecido de fator σ54 é o σN de Pseudomonas aeruginosa, controlador da transcrição de alguns dos genes responsáveis pela síntese do exopolissacarídeo alginato (um dos principais fatores de virulência dessa bactéria) e de genes relacionados ao desenvolvimento de flagelos e fímbrias (Wösten, 1998; Kazmierczak et al., 2005). Embora possam ativar a expressão de genes envolvidos na virulência bacteriana, os fatores σ54 não estão presentes em todas as bactérias. As bactérias do gênero Corynebacterium, por exemplo, apresentam apenas fatores sigma pertencentes à família σ 70, de estrutura protéica homóloga à do fator σ70 de E. coli. Como anteriormente mencionado, os fatores sigma classificados como σ70 conferem à holoenzima da RNA polimerase a capacidade de reconhecer as sequências consenso -10 e -35 dos promotores gênicos, além de frequentemente permitirem a iniciação da transcrição na ausência de proteínas ativadoras, diferentemente do que ocorre com os membros da família σ54 (Wösten, 1998). De forma geral, os fatores sigma alternativos relacionados à família σ70 podem ser agrupados em três classes distintas, de acordo com a função que desempenham na célula: (i) a dos sigmas ativadores de mecanismos gerais de resposta ao estresse, os quais apresentam a maior similaridade estrutural com os fatores sigma primários; (ii) a dos sigmas envolvidos nas alterações morfológicas do organismo, como formação de estruturas flagelares e esporulação; (iii) a dos fatores σECF (do inglês, Extracytoplasmic Function), os quais estão principalmente envolvidos na ativação de mecanismos de resposta às alterações do ambiente extracelular (Kazmierczak et al., 2005; Potvin et al., 2008). 25 Um dos primeiros fatores σ alternativos identificados, o σ B de B. Subtilis pertence à família σ70 e apresenta domínios protéicos altamente similares aos fatores σ primários. Em C. glutamicum, a avaliação da expressão gênica global de linhagens deficientes e proficientes para o σB, pelo emprego da técnica de microarranjo de DNA, revelou que os genes mais fortemente ativados por este fator apresentam seqüencias promotoras -10 idênticas às de genes considerados housekeeping (Pátek et al., 2003; Nesvera & Pátek, 2008). Assim, é muito provável que o σB funcione como uma proteína reguladora reserva, uma vez que é capaz de ativar a transcrição de genes cujos promotores são similares aos reconhecidos por σA. Além disso, foi demonstrado que o gene sigB de C. glutamicum é expresso em maiores níveis durante a transição das culturas da fase de crescimento exponencial para a fase estacionária, enquanto ocorre simultaneamente a redução da expresão de sigA (Larish et al., 2007; Nesvera & Pátek, 2008). Ainda, vários estudos apontam que o fator σB está relacionado à ativação de mecanismos gerais de resposta ao estresse. O σB de B. subtillis é responsável pela regulação da transcrição de pelo menos 127 genes envolvidos em funções variadas, dentre as quais se destacam a resistência ao etanol e às condições de alta temperatura (heat shock) e acidez. (Kazmierczak et al., 2005). Também há evidêncas do envolvimento de σB de C. glutamicum na resposta aos estresses ácido, osmótico, alcoólico e de temperatura, sendo que a expressão do gene sigB (que codifica o fator σB) é provavelmente ativada por um fator sigma alternativo de função extracitoplasmática (σECF) (Nesvera & Pátek, 2008). Foi demonstrado ainda que o σB responde a condições de estresse nas bactérias patogênicas Listeria monocitogenes e B. anthracis, agentes etiológicos da listeriose e do antraz, respectivamente. Em L. monocytogenes, especificamente, o σB integra a rede regulatória dos genes de internalinas (proteínas que contribuem para a invasão de células de mamíferos) e de outros genes envolvidos em virulência (McGann et al., 2007). Os σECF se destacam dentre os fatores alternativos da família σ 70 por compreenderem proteínas relativamente compactas que frequentemente controlam os mecanismos de secreção, a síntese de exopolissacarídeos e a produção de proteases extracelulares (Helmann, 2002). Diversos estudos têm relatado que a transcrição de vários genes codificadores de σECF pode ser auto-regulada, sendo o fator sigma produzido indutor do aumento da expressão de seu próprio gene codificador. Em muitos casos, os fatores sigma são cotranscritos com proteínas anti-sigma, as quais possuem afinidade pelos sigmas cognatos e, assim, atuam como reguladores negativos destes. Um fator anti-sigma se desliga do seu respectivo fator sigma geralmente na presença de sinais específicos de origem extracelular (Nesvera & Pátek, 2008). Análises comparativas entre seqüencias genômicas bacterianas disponíveis em bancos de dados revelaram uma ampla variação no número de genes codificadores de fatores σECF em diversos microrganismos: dois em E. coli, sete em B. subtilis, dez em M. tuberculosis, e cinquenta em Streptomyces coelicolor (Helmann, 2002). É interessante destacarmos um trabalho que buscou avaliar se há um conjunto mínimo de fatores σ ECF necessário ao crescimento in vitro de B. 26 subtilis. Os sete genes codificadores de fatores σECF puderam ser mutados no genoma de uma mesma linhagem de B. subtilis, a qual demonstrou ser viável apenas na ausência de estresses. Ainda, esta linhagem mostrou ser capaz de esporular como a bactéria selvagem (Asai et al., 2008). Um exemplo importante de σECF envolvido na virulência é o fator AlgU, que regula a expressão de alguns dos genes envolvidos na síntese do alginato e também controla a resposta ao estresse oxidativo em Pseudomonas aeruginosa (Potvin et al., 2008). De forma semelhante, o fator σE de Salmonella enterica serovar Typhimurium, que é ortólogo ao AlgU de P. aeruginosa, também regula genes que proporcionam resistência ao estresse oxidativo, auxiliando na sobrevivência da bactéria dentro de macrófagos (Kazmierczak et al., 2005). Esses dois exemplos nos mostram uma clara correlação entre o controle da transcrição gênica exercido pelos fatores σECF a virulência em bactérias patogênicas, e a resistência destas ao estresse oxidativo. Os fatores sigma de M. tuberculosis, que é um actinomiceto de importância médica, apresentam diversas funções relevantes que estão enumeradas na Tabela 1. Dos treze fatores sigma micobacterianos já estudados, os σB, σE, σF, σH e σJ participam da resposta ao estresse oxidativo, enquanto que o σB também está relacionado à resposta geral ao estresse, ao lado do fator σC. Dentre as corinebactérias, C. glutamicum é a espécie mais estudada quanto aos seus fatores sigma até o momento. A exemplo de outras bactérias amplamente estudadas, vários artigos relatam o envolvimento de seus fatores sigma alternativos na adaptação às situações de estresse, como o σB, que foi associado ao aumento da expressão de genes que codificam moléculas com funções antioxidantes e de proteção bacteriana à falta de nutrientes e hipóxia (Halgasova et al., 2002; Larish et al., 2007; Ehira et al., 2008). Nessa mesma espécie, o σH está envolvido na modulação da expressão de genes necessários à sobrevivência em condições de estresse ácido e heat shock (Barriuso-Iglesias et al., 2013; Ehira et al., 2009). Segundo Park et al. (2008), o σE de C. glutamicum está envolvido na resposta a estresses de superfície celular, podendo participar ainda da resistência a vários agentes antimicrobianos. O estudo de uma linhagem de C. glutamicum desprovida de σM revelou que este fator regula a atividade dos genes codificadores das proteínas tioredoxina e SufR, ambas envolvidas na resposta ao estresse decorrente da oxidação de grupos (-SH). Além disso, o σM também ativa a expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse causado por heat shock, como groES, groEL e clpB. Nesta condição, a frequência de formação de proteínas que não atingem sua conformação correta é notória, sendo fundamental a ação das chaperoninas moleculares e das proteases do complexo Clp (Ventura et al., 2006). O estudo de diversas sequências gênicas de C. glutamicum revelou que promotores reconhecidos por σM e σH possuem sequências consenso -10 e -35 muito parecidas entre si (Nesvera & Pátek, 2008). Ainda, resultados interessantes alcançados por Nakunst et al. (2007) 27 mostraram que, após a deleção do gene sigH em C. glutamicum, a indução de choque térmico e da oxidação de grupos tiólicos provoca o aumento da expressão de sigM apenas na linhagem selvagem, o que constitui mais um indício de que este gene é regulado pelo fator σH. Como σM e σH reconhecem promotores estruturalmente similares, é provável que a expressão de sigM seja auto-regulada como ocorre com sigH (Nesvera & Pátek, 2008). Os dados obtidos até então acerca da resposta ao estresse em C. glutamicum apontam para o fato de que essa bactéria se prepara para uma maior ocorrência de ROS ao sofrer heat shock (Nesvera & Pátek, 2008). De maneira geral, os fatores σB, σH, σE e σM de C. glutamicum foram os mais estudados até o momento. Além dos trabalhos já citados, podemos destacar o de Ikeda et al. (2009), no qual foi demonstrado que mutantes de C. glutamicum para o fator σD são mais suscetíveis do que a bactéria selvagem à condição de hipóxia. O único regulador para o qual não há estudos relevantes sobre sua função, tanto nesta espécie quanto nas demais do gênero Corynebacterium, é o fator σC. 28 Tabela 1. Os fatores sigma de Mycobacterium tuberculosis e as suas funções. Fatores Sigma A SigA (σ ) B SigB (σ ) C SigC (σ ) D SigD (σ ) E SigE (σ ) F SigF (σ ) Funções em M. Tuberculosis - Regulons Housekeeping - Essencial para a viabilidade bacteriana - Continuamente expressa, porém variável em certas condições - Modula a expressão de genes de virulência - Resposta geral ao estresse - Crescimento na fase estacionária, em ambientes com escassez de nutrientes - Respostas ao estresse incluindo estresses na superfície celular, heat-shock, oxidativo e exposição aos antibióticos. - Biossíntese de ácidos graxos, fosfolipídios e componentes da parede celular - Metabolismo de energia - Resposta geral ao estresse - Letalidade durante infecção de camundongos -Resposta a falta de nutrientes -Parte do regulon RelA -Virulência - Essencial para a virulência - Estresse na superfície celular - Ambientes de estresse incluindo heat-shock, estresse oxidativo e no macrófago. - Essencial para a virulência - Induzido por hipóxia, antibióticos, estresse oxidativo, fase estacionária, cold-shock e falta de nutrientes. G - Infecção em macrófagos H - Induzido por heat-shock, estresse oxidativo e infecção em macrófagos SigG (σ ) SigH (σ ) I SigI (σ ) J SigJ (σ ) k SigK (σ ) L SigL (σ ) - Fator sigma alternativo - Induzido na fase estacionária e nos macrófagos - Estresse oxidativo - Expressão de proteínas antigênicas - Processos do envelope celular, transporte de ácidos graxos, óxido-redução, proteínas exportadas. - Regula genes necessários para a síntese de moléculas de superfície ou secretadas, incluindo genes que M SigM (σ ) podem ter função nas interações patógeno-hospedeiro. Traduzido e adaptado: Newton-Foot et al., 2013. Referências Manganelli et al., 1999 Gomez et al., 1998 Wu et al., 2004 Wu et al., 2009 Rodrigue et al., 2006 Mukherjee et al., 2005 Manganelli et al., 2004 Abdul-Majid et al., 2008 Raman et al., 2004 Dahl et al., 2003 Manganelli et al., 2001 Manganelli et al., 2004 Graham et al., 1999 Shnapping et al., 2003 DeMaio et al., 1996 Chen et al., 2000 Michele et al, 1999 Cappelli et al., 2006 Raman et al., 2001 Stewart et al., 2001 Micklinghoff et al., 2009 Cappelli et al., 2006 Hu et al., 2004 Hu et al., 2001 Charlet et al., 2005 Dainese et al., 2006 Raman et al., 2006 Agarwal et al., 2007 29 1.4. Estudo dos fatores sigma de C. pseudotuberculosis Como já discutido no item anterior, os fatores sigma da RNA polimerase bacteriana têm papel importante para a ativação da expressão de conjuntos gênicos que podem estar diretamente envolvidos na resposta a estímulos externos e às situações de estresse. Alguns desses reguladores transcricionais também podem estar envolvidos nos mecanismos de virulência e patogenicidade bacterianos, sendo essenciais ao estabelecimento de uma infecção bem sucedida. Muitos desses mecanismos já foram, ao menos em parte, descritos para diferentes espécies patogênicas; e o estudo do papel dos fatores sigma tem contribuído bastante para o entendimento dos processos celulares que dão sustentabilidade a eles. Ainda, o estudo dos fatores sigma pode fornecer pistas para as prováveis funções de componentes celulares que podem ser atuantes na resistência ao estresse tanto in vitro quanto in vivo. Nesse contexto e de forma pioneira, há pelo menos sete anos nosso grupo de pesquisa tem procurado caracterizar os fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis. Inicialmente, Pacheco (2010) procurou isolar os genes codificadores dos fatores sigma ECF σD, σE e σH em C. pseudotuberculosis utilizando iniciadores com posições degeneradas, confeccionados segundo análises de similaridade nas bactérias M tuberculosis, C. diphteriae, C. glutamicum e C. efficiens. Entretanto, neste momento, foi possível a identificação apenas do fator σE, o qual foi então eliminado de C. pseudotuberculosis através da recombinação homóloga simples entre o gene sigE e um vetor comercial contendo parte da região codificadora desse gene. Resultados interessantes foram obtidos com diversas análises fenotípicas envolvendo C. pseudotuberculosis mutante para o gene sigE. Foi mostrado que esta linhagem tem seu crescimento significativamente afetado, em relação à selvagem parental, quando exposta ao estresse ácido e ao estresse de superfície celular causado pela exposição ao dodecil sulfato de sódio (SDS) e à lisozima. Ainda, embora esta linhagem não tenha se mostrado mais suscetível ao peróxido de hidrogênio (estresse oxidativo) do que a selvagem, houve redução significativa de seu crescimento quando foi exposta ao agente nitrosativo óxido nítrico (NO.) e, principalmente, ao peroxinitrito, composto altamente reativo formado pela combinação entre peróxido de hidrogênio e NO.. Além disso, experimentos in vivo revelaram que a linhagem mutante apresenta menor persistência em camundongos C57BL⁄6, mas se mostra muito mais virulenta ao infectar camundongos deficientes para a enzima óxido nítrico sintase indutível (iNOS-/-), os quais são incapazes de produzir NO.. Ainda, o exoproteoma tanto da linhagem mutante quanto da linhagem selvagem foi comparado sob condição normal de crescimento e após a exposição ao NO. in vitro (Pacheco et al., 2012). Paralelamente, outros trabalhos possibilitaram a identificação de outros genes codificadores de fatores sigma no genoma de C. pseudotuberculosis. Um deles se baseou na 30 geração e caracterização de GSSs (ou Genome Survey Sequences) e permitiu a identificação do fator sigma σK (D’Afonseca et al., 2009). Posteriormente, o genoma da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosis foi inteiramente sequenciado pela Rede Genoma de Minas Gerais, o qual foi então anotado e analisado pelo nosso grupo de pesquisa. Com o apoio de diversas ferramentas de bioinformática, como as disponíveis no banco de dados MiST2 (disponível em: http://mistdb.com/), pudemos identificar um total de oito genes codificadores de fatores sigma nessa bactéria, dos quais um é considerado essencial e sete são alternativos (Tabela 2). Desse modo, fomos capazes de gerar linhagens mutantes para todos os genes que codificam fatores sigma alternativos, utilizando a mesma estratégia de recombinação homóloga simples previamente empregada na obtenção do mutante para o fator σE (Domingueti, 2011). Testes fenotípicos preliminares foram feitos para analisarmos os perfis de crescimento e a suscetibilidade dos mutantes para os genes sigC e sigH a várias condições ambientais geradoras de estresse. Os resultados obtidos sugerem que a linhagem 1002(ΔsigH) é mais suscetível ao estresse osmótico que a linhagem parental 1002(wt) (Souza, 2011). Por outro lado, em comparação com 1002(wt), a linhagem 1002(ΔsigC) aparentou ser mais suscetível aos estresses oxidativo, osmótico e térmico (Domingueti, 2011). No presente trabalho, nos dedicamos principalmente ao estudo do envolvimento dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta ao estresse oxidativo, que é uma condição altamente relevante para patógenos intracelulares. Inicialmente, nos propusemos a avaliar quais fatores sigma alternativos seriam os mais relevantes para a resposta ao estresse oxidativo nessa bactéria, após a exposição aos agentes oxidantes peróxido de hidrogênio e plumbagina. Ainda, procuramos identificar as principais proteínas que fazem parte dos mecanismos de resposta ao estresse em questão, além de descrever, mesmo que parcialmente, diferenças fenotípicas entre a linhagem selvagem 1002(wt) e as linhagens mutantes para os fatores sigma alternativos, com ênfase no σC. 31 Tabela 2. Fatores sigma identificados em C. pseudotuberculosis e suas principais características. Fator Classificação ORFs Tamanho Principais identidades (tBLASTx) sigma / (pares de protéico Produto Gene bases) (aminoácidos) gênico “RNAp sigma A σ / 70 σ sigA / primário 1554 517 Organismo C. diphteriae factor” “Sigma 70 C. glutamicum factor” 70 B σ / sigB σ “Sigma 70 / alternativo de resposta a 990 330 estresses factor” “Sigma factor 70 σ / σ sigC ECF / alternativo Brevibacterium flavum SigB” “ECF-family C C. diphteriae 564 188 C. aurimucosum sigma C” “RNAp sigma C. diphteriae factor” “RNAp sigma D 70 σ / σ sigD ECF / alternativo 591 197 C. diphteriae factor” “RNAp sigma C. efficiens factor” “ECF sigma E 70 σ / σ sigE ECF / alternativo 642 214 C. diphteriae factor” “RNAp sigma C. efficiens factor” “Sigma-E H 70 σ / σ sigH ECF / alternativo 672 224 C. diphteriae factor” “Sigma factor C. glutamicum rpoE” “RNAp sigma K 70 σ / σ sigK ECF / alternativo 588 196 C. diphteriae factor” “ECF-family C. jeikeium sigma K” “RNAp sigma M 70 σ / σ sigM ECF / alternativo 669 223 C. efficiens factor” “RNAp sigma C. aurimucosum factor” 32 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA No período de realização da minha tese, o nosso grupo de pesquisa redigiu três artigos de revisão e um capítulo de livro, produções para as quais tive a oportunidade de contribuir ativamente. O Artigo de Revisão I apresenta as características gerais de C. pseudotuberculosis com ênfase na imunopatogênese deste microrganismo. Os dados atuais da literatura sobre a imunidade induzida por C. pseudotuberculosis indicam que a resistência à infecção por esta bactéria se dá através de um processo complexo que envolve tanto a imunidade celular quanto a humoral. Apesar da grande importância da LC e de todo o conhecimento acumulado sobre esta doença, ainda há necessidade de se identificar e caracterizar novos alvos para o desenvolvimento de vacinas capazes de conferir proteção satisfatória aos ovinos e caprinos. Além disso, o artigo sugere que a implementação de um programa de controle que inclua um método de diagnóstico eficaz é crucial para que a LC não seja disseminada dentro de rebanhos. O Artigo de Revisão II foi elaborado com o intuito de descrevermos os avanços do nosso grupo de pesquisa no trabalho com C. pseudotuberculosis, reunindo os dados mais importantes obtidos nos campos da genômica, proteômica e transcriptômica para o estudo dos mecanismos de virulência dessa bactéria. Por último, o Artigo de Revisão III aborda as principais características e funções dos fatores sigma já descritos em bactérias Gram-positivas. Inicialmente, informações relevantes são apresentadas para o microrganismo modelo B. subtilis. Em seguida, é discutida no artigo a regulação da transcrição gênica em algumas das principais espécies do grupo CMNR, tais como M. tuberculosis e C. glutamicum. 33 2.1. Artigo de Revisão I Bastos, B.L.; Portela, R.W.D.; Dorella, F. A.; Ribeiro, D.; Seyffert, N.; Castro, T.L.P.; Miyoshi, A.; Oliveira, S.C.; Meyer, R.; Azevedo, A. Corynebacterium pseudotuberulosis: immunological reponses in animal models and zoonotic potential. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 2012. doi:10.4272/2155-9899.S4-005 (Artigo em anexo). 2.2. Artigo de Revisão II Dorella, F.A.; Gala-Garcia, A.; Pinto, A.C.; Sarrouh, B.; Antunes, C.A.; Ribeiro, D.; Aburjaile, F.F.; Fiaux, K.K.; Guimarães, L.C.; Seyffert, N.; El-Aouar, R.A.; Silva, R.F.; Hassan, S.S., Castro, T.L.P.; Silva, W.M.; Ramos, R.; Carneiro, A.; Silva, A.; Miyoshi, A.; Azevedo, V. Integrating genomic, proteomic, and transcriptomic data to better understand the pathogenicity of Corynebacterium pseudotuberculosis: the Brazilian experience. Computational and Structural Biotechnology Journal (Artigo em anexo). 2.3. Artigo de Revisão III Souza, B.; Castro, T.L.P.; Carvalho, R.D.O.; Seyffert, N.; Silva, A.; Azevedo, V.; Miyoshi, A. Gram- positive bacteria ECF factors: a focus on the CMNR group. Em fase de submissão ao periódico Virulence (Artigo em anexo). 34 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Estudar o papel dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta ao estresse oxidativo e caracterizar a linhagem mutante para o fator σC. 3.2. Objetivos específicos Avaliar a expressão diferencial dos genes codificadores dos fatores sigma alternativos em C. pseudotuberculosis submetida ao estresse oxidativo; Investigar que proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis apresentam papel de destaque na adaptação ao estresse oxidativo, bem como os mecanismos nos quais elas estão envolvidas; Identificar quais linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para os fatores sigma alternativos são mais suscetíveis aos efeitos do estresse oxidativo; Investigar o efeito causado pela mutação dos fatores σH e σC sobre o proteoma citoplasmático de C. pseudotuberculosis; Comparar o perfil transcricional global da linhagem mutante para o fator σ C com o da linhagem selvagem parental de C. pseudotuberculosis; Avaliar a virulência de C. pseudotuberculosis mutante para o fator σC; Investigar o efeito causado pela mutação do fator σC sobre a expressão diferencial dos genes codificadores dos fatores sigma alternativos, bem como sobre o proteoma citoplasmático de C. pseudotuberculosis exposta ao estresse oxidativo. 35 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Linhagens de C. pseudotuberculosis Para o desenvolvimento do presente trabalho foi utilizado como microrganismo modelo a linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis, isolada de caprino naturalmente portador da LC e cedida pela Universidade Federal da Bahia. As linhagens mutantes de C. pseudotuberculosis utilizadas neste trabalho foram obtidas a partir da linhagem 1002(wt), como descrito por Pacheco (2010) e Domingueti (2011) (Tabela 3). Primeiramente, fragmentos internos dos genes codificadores dos fatores sigmas σB, σC, σD, σH, σK e σM foram amplificados por reação de PCR a partir do DNA genômico extraído de C. pseudotuberculosis. Os produtos das amplificações obtidas por PCR foram então inseridos no plasmídeo pCR®2.1-TOPO®, sendo as construções resultantes utilizadas para a transformação na linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis, com o intuito de induzirmos a ocorrência de recombinação homóloga simples no genoma desta bactéria (Figura 3). A seleção dos clones mutantes para os fatores sigma alternativos foi realizada em meio de infusão de cérebro e coração (BHI, do inglês Brain Heart Infusion) contendo o antibiótico canamicina à concentração final de 25 µg/mL. Tabela 3. Linhagens mutantes para os fatores sigma de C. pseudotuberculosis utilizadas neste trabalho. Linhagens bacterianas Antibiótico marcador de seleção Origem CP1002(∆sigB) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 CP1002(∆sigC) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 CP1002(∆sigD) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 CP1002(∆sigE) Canamicina (25ng/µL) Pacheco et al., 2010 CP1002(∆sigH) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 CP1002(∆sigK) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 CP1002(∆sigM) Canamicina (25ng/µL) Domingueti et al., 2011 36 Figura 3. Representação esquemática do evento de recombinação homóloga simples entre o plasmídeo pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen®) contendo o fragmento do gene que codifica o σC e o gene que codifica este fator sigma no cromossomo bacteriano. Os mutantes para os demais sigmas também foram gerados a partir dessa metodologia. Adaptado: Domingueti, 2011 4.2. Confecção de oligonucleotídeos iniciadores O desenho de oligonucleotídeos iniciadores para as reações de PCR quantitativa (qPCR) (Tabela 4) baseou-se nas seqüências únicas de DNA codificante identificadas para os genes de fatores sigma de C. pseudotuberculosis. O software Primer Express v2.0 (Applied BiosystemsTM) foi empregado. A temperatura de anelamento considerada para cada par de iniciadores foi de aproximadamente 60ºC e o tamanho dos amplicons ficou entre 80pb (pares de bases) e 120pb. Probabilidades de formação de grampos, homodímeros e heterodímeros foram avaliadas com o auxílio da ferramenta de bioinformática Oligo Analyzer v3.1 (Integrated DNA Technologies®). 37 Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores selecionados e validados para as reações de qPCR, seus alvos, e tamanhos dos produtos amplificados esperados. Iniciador Par Rt16SF Rt16SR RTsigA_F RTsigA_R 1 RT_sigB2_F RT_sigB2_R RTsigC_F RTsigC_R RT_sigD2_F RT_sigD2_R RTsigE_F RTsigE_R RTsigH_F RTsigH_R RT_sigK2_F RT_sigK2_R RT_sigM2_F RT_sigM2_R 3 2 4 5 6 7 8 9 Gene Amplicon alvo (pb) 5’-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3’ 5’-CTCTCATGAGTCCCCACCAT-3’ 5’-GTGAGCTGCTCCAGGATTTG-3’ 5’-CGCGCATATTGTTGGATCTC-3’ 16s rRNA 16s rRNA sigA sigA 92 5’-TGAAGACTCCGAAGCAACC-3’ 5’-CGTCGCTCAAGTGTATCCAG-3’ 5’-ACCTGGTCCGACTGGATTG-3’ 5’-GAGCACTTGCGTCAGAATGAG-3’ 5’-TTGTGTATGGCATCGCTTC-3’ 5’-CGGTTTCTGGAACGTCTTC-3’ 5’-CTTTCACCCAGCTCAAGCC-3’ 5’-TCGATCCGATACCAGCGTC-3’ 5’-GAATTGGCGTGAGCGAAAC-3’ 5’-GATTCCCAGCGGCTATATCC-3’ 5’-GTCATGCTGGCTTATTTCTCC-3’ 5’-GGTTTTGGCAGTACCAAGG-3’ 5’-AACGACACCGCAACACTATG-3’ 5’-GGTCTTTGAGCGACACAGC-3’ sigB sigB sigC sigC sigD sigD sigE sigE sigH sigH sigK sigK sigM sigM Sequência do oligonucleotídeo 103 93 87 93 85 90 81 108 4.3. Realização de curvas de crescimento de C. pseudotuberculosis As linhagens de C. pseudotuberculosis são regularmente cultivadas em caldo infusão cérebro coração (BHI), a 37°C e sob agitação de 140rpm (rotações por minuto). A armazenagem das linhagens é feita através do congelamento das alíquotas dos cultivos, a -80°C e em glicerol à concentração final de 40%. As curvas de crescimento foram realizadas a partir da diluição em caldo BHI fresco de culturas previamente cultivadas, sendo o recipiente para o cultivo mantido a 37°C e 140rpm durante o período requerido para a medição de densidade ótica e viabilidade celular. Em intervalos regulares de tempo, 500µL da cultura, em triplicatas, foram submetidos à leitura espectrofotométrica no comprimento de onda de 600nm, utilizando o equipamento BioPhotometer Plus (Eppendorf). Para as análises de viabilidade celular, 100µL da cultura foram submetidos a diluições seriadas, das quais 100µL foram retirados em duplicatas para a semeadura em placas de Petri contendo o meio BHI acrescido de ágar bacteriológico a 1,5%. Quando necessário, o antibiótico canamicina foi acrescentado à concentração final de 25µg/mL (Domingueti, 2010). Além do meio BHI, um meio quimicamente definido (MQD) estabelecido por 38 Moura-Costa et al. (2002) também foi utilizado para a realização das curvas de crescimento das linhagens selvagem e mutantes de C. pseudotuberculosis (Tabela 5). Alternativamente, as culturas de C. pseudotuberculosis preparadas para a realização de curvas de crescimento foram dispostas, no volume de 150µL, em poços de placas de cultivo celular de fundo chato para 96 amostras (TPP®), que foram então lacrados com a membrana Breathe-Easy™ (Sigma-Aldrich®) para permitir a troca de gases com o ambiente externo sem permitir a contaminação. As densidades óticas (DO540nm) foram aferidas em intervalos regulares de tempo com o auxílio da leitora de placas iEMS Absorbance PlateReader (Thermo Scientific). Para a análise das curvas de crescimento de todas as condições testadas foi utilizado o software GraphPad Prism v. 5 (GraphPad Software, Inc). Em alguns casos foi realizada a integração das áreas sob as curvas (ASC) utilizando o mesmo software, sendo calculado o índice de crescimento percentual das bactérias tratadas em comparação com as bactérias crescidas sob condições normais, de acordo com a fórmula: GI (%) = (ASCTratado / ASCControle) X 100. Tabela 5. Composição do meio quimicamente definido (MQD) utilizado para o cultivo de C. pseudotuberculosis. Tampão fosfato (g/L) Na2HPO4 12,93 KH2PO4 2,55 NH4Cl 1,00 CaCl2 0,02 MgSO4 0,20 Glicose 12,00 Vitaminas (g/L) Pantotenato de Ca Cloreto de Colina Ácido Fólico Inositol Niacinamida Piridoxal Riboflavina Tiamina HCl 0,0040 0,0040 0,0040 0,0080 0,0040 0,0040 0,0004 0,0040 Aminoácidos (g/L) Arginina 0,0632 Cistina 0,0120 Histidina 0,0210 Isoleucina 0,0263 Leucina 0,0262 Lisina 0,0363 Metionina 0,0076 Fenilalanina 0,0165 Treonina 0,0238 Triptofano 0,0051 Tirosina 0,0180 Valina 0,0234 Alanina 0,0089 Asparagina 0,0132 Ác. Aspártico 0,0133 Ac.Glutâmico 0,0133 Glicina 0,0075 Serina 0.0105 Adaptado: Moura-Costa et al., 2002. 39 4.4. Condições de estresse aplicadas às culturas in vitro de C. pseudotuberculosis Culturas de 16 a 24h da linhagem 1002(wt) e das linhagens mutantes para os fatores sigma de C. pseudotuberculosis (item 4.1) foram reinoculadas ou em caldo BHI ou em MQD, e incubadas por cerca de 6h a 37°C, 140rpm, até atingirem o início da fase exponencial (logarítmica) de crescimento (DO540nm≈0,1; DO600nm≈0,2). Nesta etapa, as culturas foram divididas em diferentes alíquotas, às quais os diferentes agentes geradores de estresse (Tabela 6) ou seus respectivos solventes (para controle experimental) foram adicionados. As culturas foram então reincubadas a 37°C, 140rpm, para o monitoramento dos efeitos causados pelas condições de estresse sobre o crescimento das linhagens (como descrito no item 4.3). Quando necessário, o antibiótico canamicina foi acrescentado à concentração de 25µg/mL nas culturas. Ao todo, duas substâncias distintas foram empregadas para a indução do estresse oxidativo nas culturas de C. pseudotuberculosis: peróxido de hidrogênio e plumbagina (Figura 4). O peróxido de hidrogênio é um composto que também pode ter origem endógena e se destaca como uma das substâncias mais comumente empregadas para a promoção de oxidação in vitro. A plumbagina é uma naftoquinona extraída principalmente das raízes de plantas pertencentes à família Plumbaginaceae (Gujar, 1990). A capacidade de geração de ROS pela plumbagina pode ser explicada por dois motivos distintos: (i) as quinonas são eficientes agentes eletrófilos, capazes de oxidar os grupos tióis dos resíduos de cisteína das proteínas, além do tripeptídeo GSH; (ii) as quinonas podem reagir com as flavoproteínas, originando radicais semiquinona que interferem no mecanismo de respiração celular e induzem à formação de ROS como íons superóxido e peróxido de hidrogênio (Floreani et al., 1996). As concentrações de peróxido de hidrogênio e plumbagina utilizadas neste trabalho estão descritas na Tabela 6. Os trabalhos de Pacheco (2010) e Bhattacharya et al. (2013) dão suporte à escolha das concentrações testadas. Peróxido de hidrogênio Plumbagina Figura 4. Estruturas moleculares dos compostos químicos empregados neste estudo para a geração de estresse in vitro em culturas de C. pseudotuberculosis. Adaptado: Cao et al. 187(9), 2005. 40 Tabela 6. Condições de estresse testadas in vitro. Composto químico utilizado Método para aplicação na cultura de C. pseudotuberculosis Concentrações finais testadas nas culturas de C. pseudotuberculosis H2O2 Adição de solução comercial ® (Sigma-Aldrich ) de H2O2 (30% em H2O) ao meio de cultura, à concentração final desejada. 10mM* Para condição controle: adição de água ultrapura estéril. 40mM* 75mM* 100mM* 150mM Plumbagina Dissolução da plumbagina em pó em solução DMSO 50%, à concentração de 1mM, seguida de diluição à concentração desejada em cultura bacteriana. 15µM* Para condição controle: solução DMSO 50%. 50µM adição de 5µM* 25µM * Concentrações empregadas nos experimentos de avaliação da suscetibilidade diferencial das linhagens mutantes para fatores sigma ao estresse oxidativo. 4.5. PCR em tempo real 4.5.1. Obtenção de RNA total de C. pseudotuberculosis Para a extração do RNA total das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis, os procedimentos adotados foram realizados utilizando materiais dedicados exclusivamente a esta finalidade. Os acessórios vítreos foram previamente submetidos a 250ºC por 4h, em estufa de esterilização, para a inativação de eventuais RNases. Ponteiras plásticas livres de RNase e contendo filtros foram autoclavadas e utilizadas para as pipetagens, e o restante dos materiais plásticos empregados foram tratados por imersão em solução de dietilpirocarbonato (DEPC) 0,01%, a 37ºC e durante 12h. O DEPC, reagente amplamente utilizado para a inativação de RNases, também foi empregado no tratamento da água ultrapura utilizada, sendo posteriormente inativado por 15min de autoclavação a 1,05 kg/cm2. As superfícies das bancadas do laboratório, as micropipetas e os demais equipamentos utilizados foram previamente higienizados com o auxílio da solução em aerosol RNAse Exterminator (BioAgency), conforme recomendado pelo fabricante. A obtenção do RNA total de C. pseudotuberculosis foi feita a partir de frações de 20mL das culturas utilizadas para as curvas de crescimento (itens 4.3 e 4.4), após 15 e 60 minutos de 41 exposição aos agentes geradores de estresse ou aos seus respectivos solventes (Tabela 6). O reagente RNAprotect® Bacteria Reagent” (Qiagen) foi misturado às culturas, nos tempos indicados, para a estabilização da atividade transcricional e conservação da integridade do RNA. Após a incubação à temperatura ambiente por 5min, as amostras foram submetidas à centrifugação a 5.000g durante 10min, e então tiveram seus sobrenadantes descartados. Os precipitados bacterianos estabilizados foram armazenados em freezer -80ºC. As amostras estabilizadas com RNAprotect® Bacteria Reagent foram descongeladas em gelo e os precipitados bacterianos foram ressuspendidos em 500µL de tampão RLT (Qiagen). As amostras foram então transferidas para tubos contendo 250µL de beads VK01 (Bertin Technologies), para a realização da lise mecânica das células no equipamento Prescellys 24 (Bertin Technologies). Após a lise, as amostras foram centrifugadas por 1min e o sobrenadante dos tubos transferido para as colunas RNeasy Mini spin column (Qiagen). Em seguida, as colunas foram processadas como descrito no manual do RNeasy® Mini Kit. Quando indicado, foram acrescentados a cada coluna 80µL de solução DNase I incubation Mix (Qiagen), para a eliminação de DNA genômico residual das amostras. A eluição do RNA purificado foi feita por meio de duas centrifugações consecutivas, utilizando o volume total de 60µL de água mili-Q. As quantidades de RNA total obtidas foram avaliadas com o auxílio do equipamento NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), e as amostras foram armazenadas em freezer a -80ºC. 4.5.2. Realização dos ensaios de transcrição reversa e PCR quantitativa (qPCR) Ensaios de transcrição reversa seguidos por qPCR foram realizados para a quantificação relativa dos níveis transcricionais dos genes codificadores de fatores sigma quando C. pseudotuberculosis é exposta aos agentes geradores de estresse selecionados. As amostras de RNA total extraídas (item 4.6.1.) foram submetidas à reação de transcrição reversa com o uso do kit High Capacity cDNA Master Mix (Applied BiosystemsTM). O cDNA foi gerado a partir de pelo menos 100ng de RNA. As reações foram realizadas com auxílio do termociclador ATC 401 (NyxTechnik), programado de acordo com as recomendações da Applied BiosystemsTM. As amostras de cDNA foram armazenadas a -80ºC, e posteriormente submetidas à amplificação por qPCR (Tabela 7) com o uso dos pares de iniciadores confeccionados de acordo com o ítem 4.2, sendo realizadas pelo menos cinco réplicas de reações para cada condição e gene avaliados. O equipamento 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) foi empregado para as reações de qPCR em conjunto com o aplicativo SDS 2.4 (Applied BiosystemsTM), o qual permitiu acompanhar em tempo real as amplificações dos fragmentos de DNA (Tabela 8). 42 Tabela 7. Reagentes e suas quantidades utilizadas nas reações de qPCR. Reagente Concentração do estoque Concentração Volume por reação final na reação ® “SYBR Green PCR 2X 1X 7,5 µL Iniciador senso 2,5 pmol/ µL 0,16 pmol/ µL 1,0 µL Iniciador anti-senso 2,5 pmol/ µL 0,16 pmol/ µL 1,0 µL Amostra de cDNA Diluída 3 vezes - 3,0 µL (ausente para Master Mix” (Applied TM Biosystems ) 1 NTC ) H2O ultrapura estéril 1. - - qsp 15 µL Reações NTC (do inglês No Template Control) foram realizadas para a verificação da ausência de amplificação quando a amostra de cDNA é substituída por água ultrapura estéril. Tabela 8. Parâmetros configurados no termociclador 7900HT Fast RealTime PCR System para as reações de qPCR. Etapa da reação de qPCR Subetapa da reação de Temperatura Tempo qPCR Ativação da enzima - 95ºC 10 min Desnaturação 95ºC 15 s Anelamento e extensão de 60ºC 1 min Desnaturação 95ºC 15 s Renaturação 60ºC 1 min polimerase Estágio cíclico com 44 repetições iniciadores Análise contínua de dissociação 1 Desnaturação 1. 95ºC 30 s A etapa de análise de dissociação contínua foi realizada para a confirmação da amplificação de alvos específicos nas reações de qPCR. 43 4.5.3. Análise dos dados obtidos por qPCR Após as reações de qPCR, o limiar (ou threshold) selecionado para a coleta dos dados a serem utilizados nas análises de quantificação relativa foi configurado para cruzar a fase exponencial das curvas de amplificação plotadas em escala logaritmica. As análises de quantificação relativa se basearam nos valores dos ciclos da reação em que a fluorescência detectada para os produtos amplificados atingiu o limiar estabelecido (Cycle Thresholds - CTs). Para a avaliação da diferença nos níveis de expressão dos genes de interesse, foram considerados os valores de CTs encontrados para os genes de controle endógeno 16s rRNA e sigA. Todas as análises de expressão relativa se basearam na metodologia do 2-∆∆CT, utilizando o software REST2009 (Qiagen). 4.5.4. Determinação da especificidade das reações de qPCR e da eficiência de amplificação dos iniciadores utilizados O termociclador 7900HT Fast Real-Time PCR System foi configurado para elevar, após as etapas de amplificação do cDNA, a temperatura das amostras até 95ºC. Durante este processo, as variações na emissão de fluorescência foram detectadas e analisadas com o auxílio do aplicativo SDS 2.4. A especificidade da temperatura média de dissociação das moléculas de DNA serviu como parâmetro para a constatação da presença de fragmentos amplificados de um só tamanho. Além disso, os produtos das reações de qPCR também foram resolvidos em gel de agarose 1,5% corado por brometo de etídio, com a finalidade de se confirmar a presença de apenas uma banda de DNA de tamanho correspondente ao esperado. A eficiência de amplificação para todos os iniciadores utilizados para os ensaios de quantificação relativa foi estimada entre 90 e 110% (Rasmussen, 2001). 4.6. Análises Proteômicas 4.6.1. Extração de proteínas citoplasmáticas das linhagens 1002(wt), 1002(ΔsigC) e 1002(ΔsigH) de C. pseudotuberculosis As linhagens 1002(wt), 1002(ΔsigC) e 1002(ΔsigH) de C. pseudotuberculosis foram cultivadas em MQD até atingir a DO(600nm)=0,2, ponto da curva em que o agente de estresse plumbagina foi aplicado a 15µM. Após 30min as bactérias foram centrifugadas a 4°C, 4000rpm por 10min, e em seguida o sobrenadante foi separado do precipitado. Para a extração das proteínas citoplasmáticas, os precipitados bacterianos foram lavados 3 vezes com solução salina gelada e centrifugados por 10 minutos cada. Os precipitados foram ressuspendidos em 4mL de solução TE 44 (Tris 10mM EDTA 1mM). Depois, as bactérias foram sonicadas com 6 pulsos de 10s (amplitude 40%). As amostras resultantes foram centrifugadas a 4°C, 4000rpm por 10min e o sobrenadante foi separado para a ultracentrifugação a 4°C, 100000xg por 1,5h. Após, o sobrenadante foi concentrado 5 vezes em SpeedVac® por 2h. Para a obtenção das amostras mais concentradas, 150µL de cada aliquota foram submetidos a um protocolo de precipitação. Seiscentos microlitros de metanol absoluto foram adicionados aos microtubos contendo 150µL de proteínas. As amostras foram homogeneizadas e 150µL de clorofórmio foram adicionados, e novamente as amostras foram homogeneizadas. Após a adição de 450µL de água ultrapura, as amostras foram centrifugadas a 13000rpm por 5min e a parte superior ao disco protéico foi descartada. Quatrocentos e cinquenta microlitros de metanol foram adicionados às amostras, que foram homogeneizadas e centrifugadas a 13000rpm por 5min. Os sobrenadantes foram secados à temperatura ambiente por 3min. Uma parte dessas amostras foi ressuspendida para a quantificação de proteínas por Bradford e pelo kit Qubit® Protein Assay (Life Technologies), enquanto que outra parte foi ressuspendida em tampão de amostra para a resolução em SDS-PAGE, segundo Sambrook (2001). O restante das amostras foi estocado a -20ºC. 4.6.2. Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida 4.6.2.1. 2D SDS-PAGE A primeira dimensão foi realizada utilizando tiras Immobiline DryStrip (GE Healthcare) de 24cm com gradiente de pH 3-10NL imobilizado. Cento e cinquenta microgramas de proteínas foram ressuspendidos em tampão de reidratação [Uréia 7M, Tiouréia 2M, CHAPS 2%, Tris 40mM, azul de bromofenol 0,002%, Ditiotreitol (DTT) 75mM e IPG Buffer 1% (GE Healthcare)] e posteriormente incubados por 18h à temperatura ambiente. A focalização isoelétrica (IEF) foi realizada no equipamento IPGphor 2 (GE Healthcare) nas seguintes condições: 200V/2h, 500V/1h, 1000V/1h, 10000V/2.5h, 10000V/200000Vh e 500V/4h. Após a IEF as tiras foram equilibradas por 15min em 10mL da solução A (Tris-HCl 50mM pH 8.8, Uréia 6M, Glicerol 30%, SDS 2%, azul debromofenol 0,002%) contendo 100mg de DTT. Posteriormente, as tiras foram novamente equilibradas com 10mL da solução A com 250mg de Iodoacetamida (IAA). A segunda dimensão foi realizada em gel de poliacrilamida 12% selado com agarose, utilizando um sistema Ettan DaltSix (GE Healthcare). Os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue G-250 coloidal. Todos os experimentos foram realizados com réplicas biológicas. As imagens dos géis foram geradas utilizando o Image Scanner II (Amersham Biosciences) e analisadas com o programa ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare). 45 4.6.2.2. 2D-DIGE Paralelamente, os 2D-DIGEs foram realizados com proteínas citoplasmáticas extraídas de acordo com o item 4.7.1. As amostras protéicas provenientes de cada linhagem a ser comparada foram marcadas com os fluoróforos Cy3 e Cy5; já o fluoróforo Cy2 foi utilizado para a marcação de quantidades iguais das duas amostras (padrão interno), conforme as recomendações do fabricante (GE-Healthcare). Após a obtenção das amostras protéicas marcadas, a primeira dimensão foi realizada de modo semelhante à metodologia descrita no item 4.7.2.1, com utilização de tiras Immobiline DryStrip (GE-Healthcare) de 18cm e 24cm com gradientes de pH 3-10NL imobilizados. Cento e cinquenta microgramas da mistura das amostras marcadas com os fluoróforos foram suspendidos em tampão de reidratação e adsorvidos nas tiras de 18 ou 24cm. A IEF para a tira de 18cm foi realizada no equipamento IPGphor 2 (GE Helthcare) nas seguintes condições: 100V/1h, 500V/2h, 1000V/2h, 10000V/3h, 10.000V/60.000Vh, 500V/4h. A IEF da tira de 24cm, como também a etapa de equilíbrio das tiras dos dois tamanhos, foi realizada segundo procedimentos descritos no item 4.7.2.1. A segunda dimensão foi realizada em gel de poliacrilamida12% selado com agarose, utilizando um sistema Ettan DaltSix (GE Healthcare). Todos os experimentos foram realizados com réplicas biológicas. Os géis foram digitalizados no Scanner Ettan DIGE Imager (GE-Healthcare) e as imagens analisadas com o programa ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare). Para avaliar as diferenças significativas dos spots entre as diferentes amostras dos géis (p<0,05) foi utilizado o teste ANOVA. 4.6.3. Tripsinólise em gel de poliacrilamida Após as análises estatísticas, os spots com diferenças quantitativas significativas foram excisados dos géis com o auxílio de ponteiras descartáveis. Esses fragmentos foram lavados com 350µL cada de água ultrapura por 5 min, desidratados com 190µL de acetonitrila (ACN) por 20min em agitação, e então secados em SpeedVac®. Posteriormente, foram adicionados a cada amostra 15µL de Tripsina Gold (Promega), previamente diluída em bicarbonato de amônio (NH4HCO3) 50mM, na concentração de 33ng/µL para a digestão protéica. As amostras foram mantidas em gelo por 60min, o excesso de Tripsina foi removido, e os fragmentos incubados em banho-maria por 30min a 58°C. A digestão foi parada com 1µL de ácido fórmico a 5% (v/v). Trinta microlitros desta mesma solução contendo ACN a 50% (v/v) foram adicionados às amostras, que foram homogeneizadas em Vortex por 20s, ultrasonificadas por 10min e novamente homogeneizadas em Vortex por 20s. A solução contendo os peptídeos extraídos dos géis foi removida e guardada em novo microtubo. Esta etapa após a digestão por tripsina foi repetida uma vez. As amostras foram concentradas para o volume de 10µL em SpeedVac® e armazenadas a - 46 20°C. Finalmente, as amostras dos peptídeos foram purificadas utilizando colunas Zip-Tip C18 (Millipore), segundo recomendações do fabricante. 4.6.4. Identificação das proteínas por Espectrometrias de Massa 4.6.4.1. Matrix-assisted laser desorption/ionization A identificação das proteinas por MS/MS foram realizadas utilizando o espectrômetro de massas MALDI TOF-TOF Autoflex III TM (Brucker Daltonics, Billerica USA). O equipamento foi controlado no modo positivo/reflector utilizando o software FlexControl TM. A calibração foi realizada utilizando amostras do peptídeo padrão II (Angiotensin II, Angiotensin I, ACTH clip 1-17, ACTH clip 18-39, Bradykinin Fragment 1-7, Bombesin, Substance P, Renin Substrate Tetradecapeptide porcine, Somatostatin 28) (Brucker Daltonics). Os peptídeos purificados foram misturados na proporção 1:1 à matriz ácido alfaciano-4-hidroxicinâmico (Sigma), e aplicados em uma placa AnchorChipTM 600 (Brucker Daltonics) para a análise no espectrômetro de massa. O programa MASCOT® (http://www.matrixscience.com) foi utilizado para a busca por similaridades com sequências bacterianas já depositadas no banco de dados do NCBI-nr (http//www.ncbi.nlm.nih.gov). 4.6.4.2. LC-MSE A identificação das proteínas por LC-MSE foi independente de um gel de acrilamida. Dessa forma, após a extração e quantificação das proteínas citoplasmáticas de 1002(wt) e 1002(∆σC) de C. pseudotuberculosis (item 4.7.1), 50µg de cada amostra foram centrifugados e 10µL da solução NH4HCO3 50mM, pH 8.5 adicionados. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas com 25µL da solução RapiGest SF (Waters) 0,2%. As amostras foram incubadas a 80ºC por 15min, centrifugadas, e 2,5µL de DTT 100mM foram adicionados para nova homogeneização. Posteriormente, as amostras foram incubadas a 60ºC por 30min, resfriadas à temperatura ambiente e centrifugadas para a adição de 2,5µL de IAA. Depois de nova homogeneização, as amostras foram incubadas por 30min à temperatura ambiente e 10µL de Tripsina (Promega) foram adicionados para a digestão a 37ºC por toda a noite. Dez microlitros de ácido trifluoroacético (TFA) 5% foram adicionados, as amostras foram homogeneizadas e então incubadas por 37ºC por 90min. Após a centrifugação das amostras a 14000 rpm, 6ºC por 30min, o sobrenadante foi transferido para um tubo de coleta Total Recovery (Waters), e 5µL de hidróxido de amônio 1N foram adicionados para a efetiva captação das amostras na primeira dimensão da 47 coluna (Waters). Os demais procedimentos de calibração do equipamento, captação das amostras, eluição dos peptídeos, e geração dos espectros foram realizados segundo Pizzatti et al. (2012). Todas as análises foram realizadas com Nano-Electrospray Ionization em um modo Ion positivo nanoESI(+), com uma fonte NanoLockSpray (Waters). O banco de dados utilizado para a busca de similaridades entre os espectros gerados e as proteínas descritas foi o UniprotKB (www.uniprot.org), seguindo os procedimentos realizados por Pizzatt et al. (2012). 4.7. Análises Transcriptômicas 4.7.1. Padronização de um protocolo para a depleção do rRNA Para a padronização do protocolo, C. pseudotuberculosis equi linhagem 31 foi cultivada em meio BHI de acordo com o item 4.3, e o RNA total extraído de acordo com o item 4.6.1. Após a verificação da concentração de RNA utilizando o kit Qubit® RNA Assay (Life Technologies), as amostras foram submetidas à depleção do RNA ribossomal r(RNA) através de cromatografia em coluna RNASep™ Cartridge (Transgenomic®), utilizando o equipamento Wave® System 4500 (Transgenomic®). Todos os procedimentos foram descritos detalhadamente por Castro et al. (2012) (ANEXO IV). 4.7.2. RNA seq das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis A extração do RNA total das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis, a depleção do rRNA das amostras, os procedimentos de sequenciamento do RNA, e as análises bioinformáticas, foram realizados segundo Castro et al., (2012), com algumas modificações. As bibliotecas de cDNA foram preparadas utilizando o kit Ambion® RNA-Seq Library Construction. Resumidamente, cem nanogramas de RNAs depletados foram fragmentados com RNAse III, e adaptadores específicos (Ion adaptor mix) hibridizados de acordo com as recomendações do fabricante (Life Technologies). Os fragmentos de cDNA menores que 100pb (Agencourt AMPure® XP reagent, Beckman) foram eliminados e os cDNAs restantes purificados com o PureLink® PCR Micro kit (Invitrogen). A PCR em emulsão e a ligação às esferas para posterior sequenciamento em Ion Torrent Personal Machine™ (PGM) foram realizados com kits da Life Technologies, segundo as recomendações do fabricante. As amostras foram marcadas com códigos de barra (Ion Xpress™ RNA-seq Barcode kit, Life Technologies) e o chip Ion 318™ foi utilizado para os sequenciamentos. As análises de expressão se basearam nos programas CLC Genomics 48 Workbench e DEGseq, segundo Pinto (2012). Os dados obtidos também foram distribuídos em categorias utilizando Blast2go (disponível em http://www.blast2go.com/b2ghome). 4.8. Ensaios experimentais em Caenorhabditis elegans O modelo animal utilizado foi o nematódeo C. elegans, de acordo com Ott et al., (2012). Modificações nos procedimentos realizados são descritas a seguir. Resumidamente, as linhagens bacterianas 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis foram cultivadas em meio líquido BHI por 48h a 37ºC, e a linhagem controle OP50 de E. coli foi cultivada em meio líquido BHI por 24h a 37ºC. Vinte microlitros de cada uma das linhagens de C. pseudotuberculosis foram dispostos no centro das placas de Nematode Growth Medium (NGM), assim como 20µL da linhagem de E. coli. As placas foram incubadas por 48 e 24h de acordo com a espécie bacteriana. Vinte vermes previamente sincronizados (no mesmo estágio larval, L4) foram transferidos para cada placa de NGM contendo uma das três linhagens bacterianas. Diariamente, os vermes foram monitorados através da contagem dos vivos e transferidos para novas placas de NGM contendo as linhagens bacterianas previamente cultivadas. O experimento foi realizado em triplicata por um período de 10 dias e as análises estatísticas foram posteriormente realizadas no software GraphPad Prism v. 5 (GraphPad Software, Inc). 49 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO PARTE 1 – Avaliação da resposta de Corynebacterium pseudotuberculosis 1002 (wt) ao estresse oxidativo 5.1. Suscetibilidade da linhagem 1002(wt) a agentes geradores de estresse oxidativo A resposta desencadeada pelos fatores sigma bacterianos aos estímulos associados à ocorrência de estresse é extremamente complexa, podendo variar principalmente segundo o organismo estudado e a natureza do desequilíbrio das condições fisiológicas. Neste contexto, mesmo que sejam parcialmente conhecidos os papéis de alguns fatores sigma em organismos pertencentes à mesma Ordem - como M. tuberculosis - ou mesmo ao gênero Corynebacterium como C. glutamicum -, apenas o estudo envolvendo C. pseudotuberculosis poderia fornecer pistas sobre quais fatores sigma possuem papel mais relevante na resposta dessa bactéria ao estresse oxidativo. Para que fosse possível investigarmos o envolvimento dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta ao estresse oxidativo, optamos por avaliar, inicialmente, o efeito de diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio e plumbagina sobre o crescimento dessa bactéria em meio complexo (BHI). Para tal, as bactérias foram cultivadas até que a fase de crescimento exponencial inicial fosse atingida (momento em que as células se encontram com atividade metabólica acelerada), sendo então expostas aos agentes geradores de estresse seguindo a metodologia descrita no item 4.4. Primeiramente, foi realizada uma curva de crescimento com a adição de peróxido de hidrogênio à concentração final de 150mM, quando as culturas atingiram a DO(600nm)=0,2. Os dados de densidade ótica coletados indicaram a estagnação do crescimento de C. pseudotuberculosis sob esta condição de estresse (Figura 5A), fato confirmado pela manutenção dos níveis de unidades formadoras de colônias ao decorrer do tempo (dados não mostrados). Uma vez que não desejávamos a inibição forte e prolongada da atividade metabólica bacteriana, para que fosse possível avaliarmos futuramente a ativação da transcrição dos genes codificadores de fatores sigma alternativos em resposta ao estresse oxidativo, decidimos testar uma concentração consideravelmente menor de peróxido de hidrogênio: 40mM. Neste novo experimento, onde peróxido de hidrogênio à concentração final de 40mM foi adicionado às culturas em DO(600nm)=0,2, foi possível observar uma clara redução na taxa de replicação bacteriana em relação ao cultivo sob condições fisiológicas normais (Figura 5B). No entanto, também foi nítida a ocorrência de um efeito bacteriostático de menor intensidade em relação àquele causado por peróxido de hidrogênio a 150mM. 50 De modo semelhante aos experimentos envolvendo peróxido de hidrogênio, optamos por adicionar às culturas em fase de crescimento exponencial inicial plumbagina à concentração final de 50µM. Sob esta condição, C. pseudotuberculosis foi incapaz de esboçar reação suficiente para que, em um período de 6 horas de exposição, fosse capaz de retomar o crescimento tal qual quando cultivada sob condições fisiológicas normais (Figura 6A). Assim, testamos o emprego da plumbagina a duas novas concentrações finais, inferiores à primeiramente utilizada: 25µM e 15µM. Em ambos os casos houve retardo no crescimento de C. pseudotuberculosis ao longo das 6 horas de monitoramento (Figuras 6B e C), o qual foi evidentemente maior na concentração de 25µM. A concentração de 15µM foi capaz de provocar um efeito bacteriostático mais brando, de intensidade similar àquela anteriormente observada para os experimentos com peróxido de hidrogênio a 40mM. Dessa forma, acreditamos que as concentrações finais de 40mM e 15µM para peróxido de hidrogênio e plumbagina, respectivamente, seriam as ideiais para os ensaios de expressão gênica baseados na metodologia de RT-qPCR. (A) (B) Figura 5. Avaliação da suscetibilidade de C. pseudotuberculosis ao peróxido de hidrogênio. A) Representação gráfica das densidades óticas (600nm) das culturas sob condição controle e das culturas submetidas a 150mM de peróxido de hidrogênio. B) Representação gráfica das densidades óticas (600nm) das culturas sob condição controle e das culturas submetidas a 40mM de peróxido de hidrogênio. 51 (A) (B) (C) Figura 6. Avaliação da suscetibilidade de C. pseudotuberculosis à plumbagina. A) Representação gráfica das densidades óticas (600nm) das culturas sob condição controle e das culturas submetidas a 50µM de plumbagina. B) Representação gráfica das densidades óticas (600nm) das culturas sob condição controle e das culturas submetidas a 25µM de plumbagina. B) Representação gráfica das densidades óticas (600nm) das culturas sob condição controle e das culturas submetidas a 15µM de plumbagina. 52 5.2. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ao estresse oxidativo em meio BHI Parte da ativação dos fatores sigma bacterianos ocorre através de eventos póstraducionais, quando por exemplo, há dissolução do complexo formado pelo fator transcricional com seu fator anti-sigma cognato, ou mesmo uma mudança conformacional é induzida permitindo a exposição de domínios essenciais à ligação ao cerne da RNA polimerase e ao reconhecimento de sequências consenso na fita de DNA. Outra parte da regulação da atividade dos fatores sigma ocorre em nível transcricional, onde a ativação do gene codificador do próprio fator sigma determina a quantidade disponível dessa molécula e, por conseguinte, se a sua ação será significativa ou não frente a determinado estímulo fisiológico. Neste trabalho, avaliamos a atividade transcricional dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis quando esta é exposta a agentes capazes de interfervir no equilíbrio reducional-oxidativo celular. As concentrações finais de 40mM para peróxido de hidrogênio e 15µM para plumbagina foram consideradas relevantes para este ensaio por prejudicarem o crescimento bacteriano in vitro, mas sem paralisar a atividade metabólica do microrganismo (item 5.1.). O RNA total de C. pseudotuberculosis foi extraído como descrito no item 4.5.1, após a cultura bacteriana atingir a DO(600nm)=0,2 e ser submetida durante 15 e 60 minutos ao peróxido de hidrogênio ou à plumbagina. Após a realização da reação de transcrição reversa, procedemos com os ensaios de quantificação relativa dos transcritos dos genes codificadores de fatores sigma através de qPCR (item 4.5.2), utilizando os oligonucleotídeos citados do item 4.2. Estes iniciadores foram confeccionados como descrito no item 4.2 e empregados com sucesso em todos os ensaios de qPCR, uma vez que as eficiências de amplificação se aproximaram de 100% e os produtos amplificados foram altamente específicos, de acordo com as curvas de dissociação e a eletroforese em gel de agarose (dados não mostrados). Com base nos ensaios de qPCR, foi observado o aumento significativo da expressão dos genes codificadores dos fatores σC (sigC), σK (sigK) σH (sigH) após 15 minutos de exposição ao peróxido de hidrogênio, sendo que o sigH permaneceu ativado mesmo após 1 hora de exposição à condição de estresse. Ainda, o gene sigB - codificador do fator σB -, que mostrou apenas uma tendência à ativação após 15 minutos de estresse, teve sua expressão significativamente aumentada depois de 1 hora (Figura 7A e B). 53 Figura 7. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002 (wt) exposta ao estresse oxidativo em meio BHI. Os gráficos foram plotados e analisados com o auxílio do software REST2009 (Pfaffl et al., 2002). (A) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de exposição ao peróxido de hidrogênio a 40mM. (B) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de exposição ao peróxido de hidrogênio a 40mM. (C) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de exposição à plumbagina a 15µM. (D) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de exposição à plumbagina a 15µM. 54 Como realizado para a condição de peróxido de hidrogênio a 40mM, RNA total foi extraído de C. pseudotuberculosis exposta por 15 e 60 minutos à plumbagina, em caldo BHI.Os resultados alcançados pelos ensaios de qPCR indicam o aumento na expressão dos fatores σB, σC, σD, σE, σH e σM após 15 minutos de exposição ao estresse (Figura 7C). No entanto, depois de 60 minutos de exposição à plumbagina, apenas os genes sigC, sigH, sigK e sigM - este último codificador do fator σM - tiveram sua expressão aumentada (Figura 7D), resultado que lembra aquele obtido para a condição de peróxido de hidrogênio no tempo de 15 minutos. É interessante observar também a redução da expressão do gene sigB, em comparação com a condição controle, após 60 minutos de exposição à plumbagina. Como o fator σB está envolvido na resposta geral a estresses em diversas espécies bacterianas, podemos sugerir que o seu menor nível de expressão reflita a tendência à normalização do metabolismo celular e à neutralização da condição de estresse, mesmo que a bactéria ainda esteja sujeita aos efeitos causados pelo agente oxidante. Embora resultados interessantes tenham sido alcançados nos experimentos acima, pudemos notar que todos os genes avaliados chegaram a apresentar, em algum momento, expressão significativamente maior na condição de estresse em relação à condição controle. Este panorama se deve, em parte, ao fato de os genes codificadores dos fatores σD e σE terem sido ativados apenas no estresse causado pela plumbagina, após 15 minutos de exposição ao agente. Dessa forma, embora fosse possível sugerir um menor envolvimento destes reguladores na resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis, novos ensaios se fizeram necessários para que pudéssemos especificar seguramente quais fatores sigma são mais relevantes para a adaptação a esta condição ambiental. 5.3. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(wt) sob estresse oxidativo em MQD Dados os resultados até então obtidos, foi possível sugerir um menor envolvimento dos fatores σD e σE na resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis, enquanto que os genes sigH e sigC apresentaram maior frequência de ativação perante os codificadores dos demais fatores sigma alternativos. Para que novos ensaios de quantificação da transcrição desses genes fossem realizados, consideramos utilizar um outro meio de cultura, quimicamente definido, cuja composição fora previamente estabelecida e otimizada (Tabela 3) para o cultivo de C. pseudotuberculosis (Moura-Costa et al., 2002). O meio BHI possui composição complexa, baseada em componentes de origem animal que podem se apresentar sob diferentes quantidades dependendo do lote comercializado. Além disso, não desconsideramos a possibilidade de que a interação da própria bactéria com tais componentes intervenha nos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Em contrapartida, por apresentar formulação controlada (baseada em sais, 55 vitaminas, aminoácidos e glicose), o meio quimicamente definido (MQD) oferece um ambiente mais controlado para a indução do estresse desejado. Os novos experimentos realizados em MQD utilizaram exclusivamente a plumbagina como agente oxidante, tendo em vista a inespecificidade ocasionada por esta na ativação dos genes codificadores de fatores sigma alternativos em C. pseudotuberculosis cultivada em BHI. Assim como para os experimentos envolvendo BHI, a bactéria foi cultivada até atingir a DO(600nm)=0,2, quando a plumbagina foi adicionada à concentração de 15µM. Amostras de RNA bacteriano foram extraídas para duas réplicas experimentais independentes, após 15 e 60 minutos de exposição ao agente e respectivas condições-controle, e então submetidas à transcrição reversa e aos ensaios de qPCR como descrito no item 4.5.2. Foi observado que, nas duas réplicas experimentais, os genes sigB e sigH foram mais expressos após 15 minutos de estresse. Neste tempo, ainda, o gene sigC teve sua expressão significativamente aumentada na segunda réplica experimental de estresse, enquanto que houve apenas uma clara tendência ao aumento da expressão deste no primeiro experimento. Além dos genes já citados, tanto o sigK quanto o sigM esboçaram tendência ao aumento de expressão em um dos experimentos, mas, em contrapartida, aparentaram ser menos ativados na outra réplica experimental. Os genes sigD e sigE se destacaram pela sua expressão reprimida frente ao estresse: enquanto a diferença na expressão de sigD foi significativa somente no primeiro experimento, houve redução significativa para sigE nas duas réplicas experimentais (Figura 8A e C). Quanto à resposta ao estresse após 60 minutos de exposição à plumbagina, em MQD, os genes sigH e sigM foram os únicos significativamente ativados em ambas as réplicas experimentais. Os genes sigB, sigC e sigK foram significativamente ativados na primeira réplica experimental, mas apresentaram tendência a uma menor atividade transcricional na segunda réplica. Mais uma vez, o gene sigD foi significativamente reprimido em uma das réplicas e o gene sigE nas duas réplicas experimentais (Figura 8B e D). 56 Figura 8. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002 (wt) exposta à plumbagina 15µM de plumbagina, em meio MQD. Os gráficos foram plotados com auxílio do software REST2009 (Pfaffl et al., 2002). (A) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento I. (B) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento I. (C) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento II. (D) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento II. 57 5.4. Análise conjunta dos dados obtidos para a expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma em C. pseudotuberculosis 1002(wt) Os dados obtidos para as análises da transcrição gênica diferencial, tanto em resposta ao peróxido de hidrogênio quanto à plumbagina, em BHI e MQD, foram reunidos na Figura 9 para uma melhor visualização dos perfis de ativação e repressão gênica. É possível observar no heat map gerado que o gene sigH foi o único significativamente ativado em todas as condições de estresse e tempos analisados, o que nos permite sugerir que o seu papel na resposta ao estresse oxidativo é muito importante. A expressão de sigH, em relação à condição controle correspondente, variou desde 1,2 após 60 minutos de exposição à plumbagina até 7,8 após apenas 15 minutos de exposição ao mesmo agente. Ao compararmos os dois tempos analisados, observamos que a magnitude do aumento da expressão de sigH foi menor após 60 minutos, o que pode ser um indício de que a ação do fator σH é mais importante na resposta inicial ao estresse. Estudos reportam o importante envolvimento do fator σH na resposta ao estresse oxidativo em várias espécies bacterianas. Em M. tuberculosis, por exemplo, este regulador transcricional permanece em seu estado reprimido, ligado a um fator anti-sigma (RshA), quando as condições fisiológicas de crescimento são normais. Entretanto, na ocorrência de desequilíbrio no estado reducional-oxidativo, os grupos tiol presentes no RshA sofrem oxidação ocasionando a mudança conformacional desta proteína. Este evento resulta na liberação do σH, que pode então se ligar ao cerne da RNA polimerase e assim ativar a transcrição dos genes que compõem o seu regulon. Além disso, a ativação do σH promove a indução da expressão do gene sigH, uma vez que este possui, a montante de sua sequência codificadora, promotor que é reconhecido pelo próprio fator sigma em questão (Manganelli et al., 2004; Rodrigue et al., 2006). Este mecanismo autoregulatório permite que a bactéria potencialize ainda mais a ativação dos genes necessários à resposta e adaptação ao estresse oxidativo. Como já mencionado, no gênero Corynebacterium, C. glutamicum se destaca como o organismo cujas funções de seus fatores sigma são as mais conhecidas até o momento. Nesta bactéria, o gene sigH está situado a montante do gene codificador do fator anti-sigma rshA, caracteristica também observada em outras representantes do gênero, incluindo C. pseudotuberculosis. Foi relatado que, além de regular a expressão do seu próprio gene codificador (sigH) - assim como ocorre em M. tuberculosis -, o fator σH regula a expressão de pelo menos 80 outros genes em C. glutamicum, de acordo com o banco de dados CoryneRegNet (disponível em http://www.coryneregnet.de). Os genes que compõem o regulon σH estão envolvidos não apenas na resposta ao estresse oxidativo, como os que codificam componentes dos sistemas tiorredoxina e micotiol, mas também na resposta aos estresses provocados por choque térmico e pela fase estacionária de crescimento - dentre os quais podemos citar os codificadores de chaperoninas e proteases (Engels, 2004, Kim, 2005). Ainda, o fator σH está 58 envolvido na transcrição de vários outros genes codificadores de reguladores transcricionais, dentre os quais se destacam sigE, sigB e sigM. Figura 9. Representação em heat map dos níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ao peróxido de hidrogênio 40mM e à plumbagina 15µM. Os valores médios de variação da expressão gênica obtidos para os experimentos de RT-qPCR realizados para a linhagem 1002(wt) sob estresse foram dispostos nos quadrados, os quais foram preenchidos por cores representativas do nível de expressão em relação à condição controle correspondente. Os tons mais claros da cor verde indicam redução da expressão, enquanto que os tons avermelhados indicam o aumento da expressão. Quadrados verdes sem valores indicados representam a ausência de variação significativa da expressão gênica na condição considerada. Heat map elaborado com o auxílio da ferramenta web Matrix2png, disponível em http://www.chibi.ubc.ca/matrix2png/bin/matrix2png.cgi. 59 Os resultados dos nossos experimentos de RT-qPCR indicam que a expressão de sigE foi significativamente reprimida em três dos quatro experimentos relacionados aos 15 minutos de exposição ao estresse. Neste tempo, apenas o estresse provocado pela plumbagina, em meio BHI, foi capaz de induzir a expressão do gene sigE. No entanto, podemos observar que, nesta condição experimental, a expressão de outros cinco genes codificadores de fatores sigma alternativos também foi aumentada, o que pode significar a ativação simultânea de diversos grupos gênicos que atuam de forma complementar na resposta ao estresse. Após 60 minutos de estresse, a expressão de sigE pareceu similar à da condição controle, assim como ocorrido após 60 minutos de exposição ao peróxido de hidrogênio. Somado a isso, a expressão de sigE foi sginificativamente reduzida nos dois experimentos envolvendo a adição de plumbgina no meio MQD, também após 60 minutos de exposição. Dessa forma, podemos sugerir que, caso o fator σE exerça papel relevante na resposta ao estresse oxidativo, este se dá nos primeiros minutos de exposição ao agente oxidante. Esta possiblidade não pode ser descartada, uma vez que nosso grupo de pesquisa demonstrou que o fator σE é importante para a resistência de C. pseudotuberculosis ao estresse nitrosativo in vitro e in vivo (Pacheco et al., 2012). Além do fator σH, o σM também se destaca na literatura pelo seu envolvimento na resposta ao estresse oxidativo. Foi demonstrado, por exemplo, que M. smegmatis deficiente para o fator σM é mais suscetível ao estresse oxidativo e não é capaz de induzir a atividade tiorredoxina redutase, responsável pela redução de pontes dissulfeto indesejáveis (Arráiz et al., 2001). Já Raman et al. (2006) e Agarwal et al. (2007) foram incapazes de mostrar o envolvimento do σM na resposta ao estresse oxidativo em M. tuberculosis. Nesta espécie, o fator σM ativa, além do próprio gene sigM, a expressão de vários genes envolvidos na produção de proteínas secretadas ou de membrana plasmática - como EsxU e EsxT, as quais se assemelham ao conhecido antígeno ESAT-6 -, apresentando papel relevante na resposta ao choque térmico (Raman et al., 2006). Interessantemente, em C. glutamicum, o σM parece regular um subconjunto de genes pertencentes ao regulon de σH, englobando principalmente aqueles que apresentam funções voltadas para a manutenção do equilíbrio reducional-oxidativo, como a tiorredoxina redutase (trxB) e os genes que compõem o operón suf - atuantes na formação de complexos Ferro-Enxofre (FeS), além do clpB - codificador da protease ClpB (Nakunst et al., 2007). Nos nossos experimentos, o fator σM foi ativado apenas em resposta ao estresse causado pela plumbagina. Isto pode se dever ao fato de que, diferentemente do peróxido de hidrogênio, a plumbagina é um composto que apresenta atividade reducional-oxidativa cíclica capaz de intensificar a oxidação dos grupos tiol no meio intracelular (Paget et al., 1998; Kim et al., 2005). O gene sigM teve sua expressão aumentada após 15 minutos de exposição à plumbagina apenas no experimento baseado no meio BHI, enquanto que sua atividade permaneceu inalterada aos 15 minutos de estresse em meio MQD. O fato da expressão relativa de sigM ter sido maior após 60 minutos de estresse em BHI, além de ter sido significativamente ativada em MQD apenas para 60 este mesmo tempo, nos permite sugerir que este regulador transcricional é requerido principalmente para a resposta tardia ao estresse, quando provavelmente os níveis de oxidação dos grupos tiol atingem patamares mais elevados pelo longo período de ação da plumbagina. Finalmente, podemos supor que, no contexto onde σH é mais atuante nos primeiros minutos de estresse, o papel central que este fator tende a exercer no controle dos mecanismos de resposta ao estresse leva à ativação de outros reguladores transcricionais de menor abrangência - como o fator σM -, os quais podem, por sua vez, direcionar de forma específica a resposta aos estímulos sofridos pela célula (Pátek & Nesvera, 2010). A ativação simultânea de σH e σM poderia, também, representar a potencialização da resposta ao estresse tiólico-oxidativo provocado pela plumbagina. Também regulado pelo fator σH em C. glutamicum, o gene sigB foi mais expresso após 15 minutos de estresse em três dos quatro experimentos realizados (a excessão foi após a exposição ao peróxido de hidrogênio); enquanto que, após 60 minutos, foi mais expresso do que na condição controle depois da exposição ao peróxido de hidrogênio e em apenas um dos experimentos em MQD envolvendo a plumbagina. Contrastando com este útlimo experimento mencionado, a outra réplica experimental feita em MQD mostrou redução significativa na expressão de sigB frente ao estresse. A oscilação observada nos níveis de expressão diferencial deste gene, quando comparamos os quatro experimentos de estresse, talvez possa ser explicada pela provável alta complexidade dos mecanismos de regulação da atividade do fator σB em C. pseudotuberculosis. Em C. glutamicum, por exemplo, foi demonstrado que o σB coopera com outros reguladores transcricionais e está envolvido em diversas funções celulares, contribuindo para a modulação da expressão gênica em todas as fases de crescimento in vitro. Apesar disso, são notáveis as suas contribuições para a ativação de genes necessários à transição para a fase estacionária de crescimento, promovendo resistência à condição de hipóxia e a intensificação do metabolismo da glicose (Ehira et al., 2008). Os ensaios de RT-qPCR também nos permitiram detectar a ativação da transcrição de sigK aos 15 minutos de exposição ao peróxido de hidrogênio. No entanto, a expressão do gene após 60 minutos de exposição a este agente oxidante foi equiparada à condição controle. Em nenhum experimento utilizando a plumbagina o fator σ K foi ativado após 15 minutos de estresse, havendo inclusive repressão de sigK no meio BHI. Aos 60 minutos, tendo acontecido discreta ativação de σK sob estresse em um dos experimentos em MQD e discreta repressão deste fator na outra réplica experimental com MQD, o grande aumento de 17 vezes na expressão de sigK ante a plumbagina em meio BHI se destacou. Curiosamente, neste mesmo experimento onde houve grande aumento da atividade de σK, após 60 minutos de estresse, a expressão relativa dos genes sigM e sigC se apresentou sob os maiores níveis observados dentre todas as quantificações realizadas para estes alvos. Este fato nos permite sugerir que as funções 61 desempenhadas por estes fatores sigma em C. pseudotuberculosis podem se sobrepor em algum grau. Em M. tuberculosis, o fator σK está diretamente envolvido na regulação da expressão de genes que codificam para os antígenos MPT70 e MPT83 (Malkhed et al., 2011). Dessa forma, embora o fator σK possa ter papel importante na expressão de genes envolvidos na interação com o organismo hospedeiro, os estímulos responsáveis pela ativação deste regulador transcricional não são bem conhecidos (Said-Salim et al., 2006). Assim, o fator σK constitui um alvo interessante para futuros estudos em C. pseudotuberculosis, considerando-se ainda que este regulador transcricional é o único dentre os descritos até o momento para esta espécie que não está presente em C. glutamicum, bactéria não-patogênica com potencial biotecnológico (Pátek et al., 2011). O gene sigD teve sua expressão ativada, nos nossos experimentos, apenas aos 15 minutos de exposição à plumbagina em meio BHI, chegando a ser reprimido em outras três ocasiões. Em M. tuberculosis, o fator σD está relacionado à regulação da expressão de genes codificadores de constituintes do ribossomo, fatores de elongamento, proteínas com afinidade pelo DNA, e enzimas envolvidas na biossíntese de adenosina trifosfato (ATP). Assim, o fator sigma D parece ser importante para a manutenção da homeostase durante a fase estacionária de crescimento de M. tuberculosis. Ainda, foi demonstrado que a inativação deste fator sigma causa uma maior sobrevida de camundongos infectados com a bactéria, embora a persistência no hospedeiro permaneça inalterada em relação à M. tuberculosis selvagem (Raman et al., 2004). Em C. glutamicum, o fator σD foi relacionado à ativação de mecanismos importantes para a sobrevivência em condições de hipóxia (Ikeda et al., 2009). Por último, discutimos os resultados obtidos para o gene codificador do fator σC. Como afirmado anteriormente, o gene sigC apresentou expressão bastante aumentada após 60 minutos de exposição à plumbagina em meio BHI, concomitante com a evidente ativação de sigH, sigK e sigM. Neste mesmo tempo, em apenas mais um dos quatro experimentos realizados houve aumento significativo da expressão de sigC quando C. pseudotuberculosis foi exposta ao estresse oxidativo. No entanto, uma vez que o gene sigC teve sua expressão aumentada em três dos quatro experimentos após apenas 15 minutos de exposição ao estresse, é provável que o regulador codificado por este gene seja igualmente importante para a resposta inicial ao estresse oxidativo. As funções do fator σC em M. tuberculosis estão relacionadas à fase de crescimento exponencial in vitro, envolvendo o controle de processos biossintéticos de diversos componentes celulares e a regulação do metabolismo energético. Além disso, o σC desempenha papel importante para a resposta geral ao estresse nessa bactéria, e é requerido para a letalidade em camundongos infectados por M. tuberculosis (Manganelli et al., 2004; Abdul-Majid et al., 2008). Como as funções do σC ainda não são conhecidas em corinebactérias, consideramos altamente 62 relevante a obtenção de quaisquer informações que possam nos auxiliar na compreensão do papel deste fator não somente na resposta ao estresse oxidativo, mas também na regulação da transcrição gênica como um todo em C. pseudotuberculosis. 5.5. Análise de proteínas diferencialmente expressas em C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta à plumbagina Além de estudarmos o papel dos fatores sigma alternativos na resposta ao estresse oxidativo, procuramos investigar os principais mecanismos de C. pseudotuberculosis que estão relacionados à adaptação a esta condição. Considerando que agentes oxidantes podem alterar a síntese (ou expressão) de diferentes proteínas bacterianas (Levine et al., 1996), optamos por avaliar o perfil proteômico diferencial em culturas de 1002(wt) em crescimento exponencial inicial, com 30min de exposição ou não à plumbagina (concentração final de 15µM). Inicialmente, padronizamos um protocolo de extração de proteínas citoplasmáticas que nos permitiu a obtenção de pelo menos 150µg de proteínas para cada 200mL de cultura em meio MQD. A comparação entre o proteoma da bactéria sob estresse e sob crescimento normal foi então realizada segundo a metodologia 2D-DIGE, como descrito no item 4.6.2.2. As imagens obtidas para os géis e a sobreposição delas podem ser visualizadas na Figura 11. Na fluorescência verde (Figura 11A) podemos visualizar os spots referentes às proteínas citoplasmáticas da linhagem 1002(wt) não exposta à plumbagina, enquanto que na fluorescência vermelha (Figura 11B) são mostrados os spots das proteínas citoplasmáticas da mesma linhagem exposta à plumbagina. À primeira vista, poucas diferenças podem ser notadas entre essas duas imagens, no entanto, ao observarmos a sobreposição entre elas (Figura 11D) encontramos vários spots relativos a proteínas que foram diferencialmente expressas. O experimento representado na figura é relativo a apenas uma réplica experimental (biológica), e para que pudéssemos alcançar maior confiabilidade nas comparações realizadas, nos baseamos também em outras duas réplicas. Assim, fomos capazes de analisar o perfil proteômico diferencial combinando as três réplicas obtidas, com auxílio do software ImageMaster. No total, 22 spots apresentaram diferenças de expressão estatisticamente significativas (Figuras 11 e 12). Desses 22 spots, 19 foram mais expressos na linhagem submetida ao estresse. Por outro lado, os spots 3, 23 e 25 representados na figura apresentaram expressão diminuída na linhagem submetida ao estresse (Figura 12A e B). Realizando espectrometria de massa MALDITOF-MS/MS, fomos capazes de identificar as protéinas presentes em 15 dos spots diferencialmente expressos, como pode ser verificado na Tabela 9. Ao utilizarmos o aplicativo Blast2go, pudemos classificar as proteínas identificadas de acordo com as suas funções e os processos biológicos nos quais estão envolvidas em outros organismos (Tabela 10). 63 De acordo com a literatura, 10 das proteínas identificadas (spots 1,4, 5, 12, 13, 14, 15, 23 e 25) podem ter funções relevantes para o estresse oxidativo ou para o estabelecimento bacteriano no organismo hospedeiro. Primeiramente, destacamos duas dessas proteínas: a transaldolase e o fator de alongamento Tu. A transaldolase é uma enzima envolvida na glicólise e no metabolismo das pentoses-fosfato, apresentando atividade predominantemente citoplasmática; no entanto, há situações em que ela pode ser recrutada e exposta na superfície celular, através de uma via nãoclássica ou de um mecanismo de translocação ainda não elucidado. Neste caso, a transaldolase pode atuar na adesão ou agregação bacteriana durante a colonização do hospedeiro (GonzálezRodríguez et al., 2012). Em P. aeruginosa, o fator de alongamento Tu é uma proteína que pode ser exposta na superfície celular e se ligar a moléculas do plasma do hospedeiro, interferindo assim na atividade do sistema do complemento e permitindo a evasão do sistema imune (Kunert et al., 2007). Outra proteína que apresentou expressão aumentada nas culturas submetidas à plumbagina é a fosfoglicerato quinase (PGK) (spot 4). A PGK, enzima que participa da glicólise, foi associada à virulência do patógeno intracelular Brucella abortus, causador da brucelose em animais e humanos. Um estudo mostrou que uma linhagem de Brucella abortus mutante para o gene pgk apresenta persistência reduzida durante a infecção em macrófagos e camundongos. Ainda, ensaios de imunização em camundongos revelaram que esta linhagem mutante pode conferir proteção contra a enfermidade superior à de vacinas comercialmente disponíveis (Trant et al., 2010). Diretamente envolvido na resposta ao estresse oxidativo, o fator trigger (Tig, spot 13) foi encontrado em maior quantidade no nosso experimento com plumbagina. Ele é uma chaperonina molecular bastante conservada nas bactérias, e apresenta função central na biogênese e sobrevivência bacterianas em condições ambientais adversas. Foi demonstrado que, durante o evento da tradução, o Tig se liga à subunidade ribossomal 50S próximo à região do túnel de saída do ribossomo, sendo provavelmente a primeira proteína a interagir com os polipeptídeos recémsintetizados (Hesterkamp et al., 1996a). Desta maneira, o Tig parece ser importante para garantir que proteínas novas sejam corretamente modeladas, ao limitar as taxas de isomerização da prolina nestas. Além disso, já se sabe que o Tig pode interagir com a chaperonina GroEL, estimulando a mesma a se ligar às proteínas desdobradas (Hesterkamp et al., 1996b; Kandror et al., 1995). A GroEL (spot 14) também foi identificada no nosso experimento como sendo mais expressa no estresse. Além de assegurarem a estruturação protéica correta, as chaperoninas do tipo GroEL (spot 14) impedem a formação de agregados no citoplasma e também participam dos eventos de degradação e exportação de proteínas (Kusukawa et al., 1989; Kandror et al., 1994). De modo geral, a GroEL apresenta elevada expressão sob condições de estresse oxidativo em micobactérias (Dosanjh et al., 2005). 64 Ainda na condição de estresse, houve o aumento da expressão de uma outra chaperonina cuja denominação se baseou na sua própria atividade molecular: peptidil-prolil cis-trans isomerase A (spot 5). Esta atividade molecular, inclusive, é a mesma descrita para Tig, o que pode ser um indício de que essas duas chaperoninas atuam de maneira coordenada. Uma vez que a prolina é um dos aminoácidos mais sensíveis à hidroxilação - evento cuja frequência é intensificada sob condições oxidantes -, sugerimos que a atividade de tais chaperoninas têm papel de destaque na resistência de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo (Hesterkamp et al., 1996b; Kandror et al., 1995). Uma proteína que também nos chamou a atenção por ser mais expressa em C. pseudotuberculosis sob estresse é a D-alanil-D-alanina sintetase A (spot 9). A D-alanil-Dalanina é um dipeptídeo precursor do peptidoglicano, importante componente da parede celular bacteriana. A redução na expressão de genes envolvidos na síntese do peptidoglicano pode causar defeitos na parede celular e, assim, enfraquecer a resistência aos antibióticos de envelope bacteriano e reduzir a viabilidade, além de induzir à autólise (Bitoun et al., 2012). Desse modo, é provável que a parede celular de C. pseudotuberculosis exposta à plumbagina esteja sendo danificada, o que poderia ativar os mecanismos de síntese de precursores desta importante estrutura protetora. Uma superóxido dismutase foi identificada entre as proteínas menos expressas na condição de estresse: SodA (spot 23). Este resultado é surpreendente, uma vez que ions superóxido parecem figurar entre as principais espécies reativas de oxigênio geradas por quinonas como a plumbagina (Paget et al., 1998; Lin et al., 2010). Entretanto, estudos indicam que, apesar de apresentar atividade no citoplasma em várias espécies bacterianas, a SodA pode ser secretada através do sistema de secreção TAT (do inglês twin-arginine translocation), e então atuar na detoxificação no espaço periplasmático (Krehenbrink et al., 2011). Dessa forma, é possível que a linhagem 1002(wt) exposta à plumbagina tenha intensificado a secreção de SodA, tendo em vista o fato de que nós procuramos analisar os perfis apenas de proteínas citoplasmáticas nos nossos experimentos. Além disso, podemos considerar a existência de outros grupos de superóxido dismutase - cujos elementos cofatores são geralmente o cobre/zinco (SodC) e o ferro (SodB) - que poderiam apresentar papel mais relevante na detoxificação do O2.- de origem intracelular (Yesilkaya et al., 2000). Outra possível causa para a redução da expressão de SodA nos nossos experimentos diz respeito à provável menor disponibilidade de compostos metálicos na célula tratada com plumbagina, o que será discutido adiante. Ainda sobre a SodA, vários estudos têm demonstrado o envolvimento desta enzima na virulência bacteriana; um exemplo envolve a bactéria Yersinia enterocolitica, cuja inativação de SodA a tornou menos virulenta em camundongos (Roggenkamp et al., 1997). Por outro lado, a mutação de sodA de Bordetella pertussis não afetou a virulência dessa bactéria em camundongos (Graeff-Wohlleben et al., 1997). 65 Outra enzima menos expressa em 1002(wt) submetida ao estresse é a porfobilinogênio desaminase (spot 3), que está envolvida na via biossintética das porfirinas - estruturas compostas por anéis pirrólicos capazes de acomodar íons metálicos como o ferro (grupo heme). O porfobilinogênio é um dos precursores de enzimas importantes para a detoxificação celular - como as peroxidases e a catalase -, e é também necessário à síntese dos citocromos envolvidos na cadeia respiratória celular (Biel et al., 2002). Nesse contexto sugerimos que, sob estresse oxidativo, C. pseudotuberculosis sofre importante interferência na via das porfirinas e, dessa forma, tem a respiração aeróbia diminuída. Ainda, é provável que várias enzimas que utilizam íons metálicos como cofatores tenham sua atividade anulada pela ação oxidante da plumbagina. Assim, uma alternativa interessante para a neutralização dos efeitos causados por este composto na célula poderia ser justamente a inibição da síntese de cofatores metálicos. A diminuição da disponibilidade destes cofatores provocaria a redução no metabolismo de vários compostos celulares, o que, somado à redução da atividade de fosforilação oxidativa, pode explicar em parte os resultados das curvas de crescimento in vitro demonstrados no item 5.1. (Figura 6), nos quais C. pseudotuberculosis apresentou taxa de crescimento visivelmente reduzida quando exposta à plumbagina. Entretanto, a bactéria sob estresse pode também estar procurando compensar a deficiência na cadeia fosforilativa através da indução da expressão da enzima ATP sintase (spot 11). Adicionalmente, um estudo mostrou que a super-produção da porfobilinogênio desaminase no fungo Aspergillus nidulans causou uma maior tolerância às espécies reativas de nitrogênio, cuja ação tem natureza similar à da oxidação (Zhoue et al., 2011). Embora nosso resultado pareça discordante deste, ressaltamos que a plumbagina possui atividade quinona e é capaz de drenar elétrons de diversos compostos celulares envolvidos na atividade de óxido-redução. Como discutido anteriormente, a indisponibilização de cofatores metálicos (mesmo que eles estejam envolvidos na detoxificação) poderia ser um meio eficiente de diminuir os efeitos deletérios causados pela plumbagina na célula. Biel et al. (2002) também relatam que a produção de porfobilinogênio pode ser aumentada em condições de alta tensão de oxigênio, por intermédio da ativação da enzima aminolevulinato sintase. Por fim, encontramos na literatura informações relevantes a respeito da proteína prolina iminopeptidase (PIP - spot 25), que foi menos expressa na condição de estresse. O gene codificador da PIP é ortólogo ao gene luxR da bactéria Vibrio fischeri, o qual faz parte do mecanismo de comunicação inter-celular quorum sensing, responsivo ao aumento da densidade populacional. Embora nessa bactéria LuxR esteja envolvida na regulação da produção das luciferases, há exemplos de sistemas regulatórios análogos a este em bactérias patogênicas. Em P. aeruginosa, concentrações elevadas da molécula auto-indutora HSL promovem a ativação de LasR (proteína ortóloga a LuxR), que induz a expressão de alguns genes que codificam para fatores de virulência, como a elastase, a exotoxina A, e a fosfatase alcalina. Já em bactérias 66 Gram-positivas, as moléculas auto-indutoras são peptídeos secretados por intermédio do sistema transportador ABC (do inglês ATP-binding cassette transporter). Diferentemente do que ocorre em Gram-negativas, os peptídeos auto-indutores ativam proteínas de superfície que atuam por meio de uma cascata de sinalização fosforilativa (sistema de dois componentes, do inglês twocomponent system), ocasionando assim a ativação do regulador transcricional requerido para a resposta ao estímulo recebido (Miller & Bassler, 2001). Nesse contexto, podemos sugerir que a repressão de PIP em C. pseudotuberculosis sob estresse oxidativo pode estar associada ao aumento da atividade do sistema sensor de dois componentes, ocasionando o aumento da atividade de PIP e por conseguinte a inibição da expressão do gene codificador desta proteína. Neste caso, é possível que o estresse tenha induzido os mecanismos de resposta bacterianos envolvidos no controle do crescimento populacional, o que corrobora com os resultados de redução no crescimento in vitro observados nos experimentos do item 5.1 (Figura 7). De modo geral, os resultados obtidos apontam para a modulação de diferentes mecanismos de natureza intra ou extracelular e que aparentemente contribuem para a adaptação de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo. Além de apresentar atividade chaperonina aumentada, a bactéria sob estresse apresentou redução no metabolismo das porfirinas. Há indícios, ainda, de alterações no sistema de comunicação inter-celular e na síntese de moléculas importantes para a formação da parede celular, adesão e interação com o hospedeiro. Outro fato que parece ser relevante para a ativação dos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo é o aumento da atividade enzimática na via glicolítica, o que contribui para a geração de energia na célula e ainda para a síntese de diversos compostos celulares. Finalmente, sugerimos que a indução de estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis ocasionou a ativação de processos potencialmente relevantes para uma eventual infecção. 67 Figura 10. Resolução das proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não a Plumbagina (15µM) através de 2D-DIGE. As proteínas foram marcadas com CyDyes Cy3 (verde), Cy5 (vermelho) e Cy2 (amarelo), misturadas e resolvidas em um gel 2D. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 18cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDS-PAGE 12%. Os géis foram escaneados para a obtenção das imagens (A) Cy3: spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) não exposta a plumbagina, (B) Cy5: spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta a plumbagina, (C) Cy2: Controle interno e (D) A sobreposição dos dyes (Cy3 e Cy5) é observada em amarelo. 68 Figura 11. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina (15µM). (A) Spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) não exposta a plumbagina. (B) Spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta a plumbagina. A diferença de expressão foi significativa para vinte e dois spots, de acordo com o teste ANOVA<0.05. Os números seguidos dos traços verdes indicam os spots menos expressos e os números seguidos dos traços vermelhos indicam os spots mais expressos em cada condição avaliada. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 18cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDS-PAGE 12%. O marcador de peso molecular (GE Helthcare) está indicado à esquerda. 69 Figura 12. Visualização dos vinte e dois spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina (15µM). As análises foram realizadas com três replicas experimentais através do programa ImageMaster 2D Platinum, considerando o teste ANOVA<0.05 e o fold change>1.2. As linhas identificadas como wtN indicam os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da condição sem plumbagina e as linhas identificadas como wtPlb indicam os spots referentes às proteínas citoplasmáticas da condição com plumbagina. Os quadrados realçados em verde são referentes aos spots menos expressos na condição avaliada e aqueles realçados em vermelho são referentes aos spots mais expressos na condição avaliada. 70 Tabela 9. Proteínas citoplasmáticas identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MS, após análise de expressão diferencial na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina Nº do spot Genes ADL gi Proteínas identificadas 1 Tal 20983 384504702 Transaldolase 3 hemC 20177 384503878 Porphobilinogen deaminase 4 Pgk 20990 384504709 Phosphoglycerate kinase 5 ppiA 19928 384503625 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A 9 Ddl 20796 384504510 D-alanyl-D-alanine synthetase A 11 atpA 20733 384504445 ATP synthase subunit alpha 12 Ppa 21663 384505385 Inorganic pyrophosphatase 13 Tig 21470 384505192 Trigger fator 14 groEL 21673 384505396 Chaperonin 15 Tuf 20240 384503940 Elongation fator Tu 18 Mdh 21463 384505185 Malate dehydrogenase 19 Pnp 21147 384504868 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 23 sodA 21849 384505578 Manganese superoxide dismutase 25 Pip 20585 384504296 Proline iminopeptidase 26 manC 20396 384504102 Mannose-1-phosphate guanyltransferase Nº do spot correspondente ao número do spot das Figuras 11 e 12. ADL: identificação de locus gênico (NCBI); gi: número de identificação das proteínas através do MASCOT (homologia p<0,05); Média de números de peptídeos identificados: 2,5 Expressão diferencial: Teste ANOVA<0,05 e fold change>1,2. 71 Tabela 10. Classificação das proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) exposta ou não à plumbagina, de acordo com funções e processos do Blast2go. Proteínas identificadas Funções Processos Transaldolase Atividade transferase Metabolismo de carboidratos Catabolismo Porphobilinogen deaminase Atividade transferase Biossíntese e modificação de proteínas celulares Phosphoglycerate kinase Atividade quinase Metabolismo Ligação ao nucleotídeo Metabolismo de carboidratos Geração do precursor de metabólitos e energia Catabolismo Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase a Atividade catalítica Modificação de proteínas celulares D-alanyl-alanine synthetase a Atividade catalítica Organização da parede celular Ligação Biossíntese de carboidratos Atividade hydrolase Biossíntese de precursor de metabólitos e energia Atividade de transporte Transporte de íons Atividade hidrolase Metabolismo ATP synthase subunit alpha Inorganic pyrophosphatase Ligação Trigger factor Atividade catalítica Ciclo celular Modificação e transporte de proteínas Chaperonin Atividade quinase Metabolismo Ligação ao nucleotídeo Ligação à proteína Elongation factor tu Malate dehydrogenase Atividade de fator de tradução Metabolismo de ácidos nucléicos Atividade hidrolase Tradução Ligação ao ácido nucléico Catabolismo Atividade catalítica Metabolismo de carboidratos Ligação ao nucleotídeo Metabolismo Geração do precursor de metabólitos e energia Catabolismo Polyribonucleotide Atividade nuclease Metabolismo de ácidos nucléicos nucleotidyltransferase Atividade transferase Catabolismo Ligação ao RNA Manganese superoxide dismutase Atividade catalítica Metabolismo Ligação Proline iminopeptidase Atividade peptidase Metabolismo de proteínas Mannose-1-phosphate Atividade transferase Tradução guanyltransferase Atividade de fator de tradução Ligação aos ácidos nucléicos Catabolismo 72 PARTE 2 – Caracterização fenotípica de linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para os genes codificadores dos fatores sigma alternativos 5.6. Suscetibilidade diferencial das linhagens mutantes para os fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo Como apresentado no item 5.4, obtivemos resultados interessantes que apontam para os fatores sigma mais atuantes na resposta de C. pseudotuberculosis à condição de estresse oxidativo. Os genes codificadores dos fatores σH e σC se destacaram como aqueles cuja expressão foi induzida o maior número de vezes nos experimentos onde houve a indução do estresse, o que pode ser constatado na Figura 9. Ainda, o gene sigM se destacou principalmente pela sua ativação após 60 minutos de exposição à plumbagina, tanto em meio BHI quanto em meio MQD, sendo sugerido o seu papel na resposta tardia ao estresse oxidativo. Outro gene que nos chamou a atenção foi o sigK, cuja expressão após 60 minutos de exposição à plumbagina em MQD apresentou níveis bastante elevados, cerca de 17 vezes maiores do que havia sido encontrado na condição controle correspondente. No período de execução do presente trabalho, e a exemplo do que fora previamente realizado para o fator σE (Pacheco et al., 2012), fragmentos internos das regiões codificadoras dos genes de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis foram amplificados e clonados em vetor comercial não-replicativo nesta espécie, e então transformados na bactéria para a indução do evento de recombinação homóloga simples e a consequente obtenção de linhagens mutantes deficientes para os fatores sigma em questão (Figura 3). Após a obtenção e validação das linhagens mutantes para os fatores sigma alternativos - a saber, 1002(ΔsigB), 1002(ΔsigC), 1002(ΔsigD), 1002(ΔsigE), 1002(ΔsigH), 1002(ΔsigK), e 1002(ΔsigM) -, procuramos investigar se estas apresentam suscetibilidades aumentadas ou não ao estresse oxidativo em comparação com a linhagem 1002(wt) selvagem parental. Assim, poderíamos avaliar através de uma nova abordagem, complementar àquela apresentada no item 5.1, quais dos fatores sigma de C. pseudotuberculosis são mais relevantes para a adaptação ao estresse oxidativo gerado in vitro. Inicialmente, comparamos entre si os perfis de crescimento de todas as linhagens cultivadas sob condições normais (sem indução de estresse), por 29 horas, em meio MQD (Figura 13). Partindo de inóculos em fase de crescimento exponencial inicial (DO 540nm=0,12), após 12 de incubação a 37ºC todas as linhagens mutantes para os fatores sigma ECF (de função extracitoplasmática) haviam atingido a fase estacionária de crescimento, à excessão do mutante para o gene sigB. Portanto, a linhagem mutante para o fator σB apresenta a menor taxa de crescimento dentre as linhagens avaliadas. Ainda, esta linhagem aparentou ser mais sensível ao crescimento sob a condição de fase estacionária, pelo longo período de inflexão da curva durante 73 a transição do crescimento exponencial final para a próxima fase do crescimento. Sustentando esta observação, estudos mostram que o gene sigB de C. glutamicum é mais expresso durante a transição da fase de crescimento exponencial para a fase estacionária (Larish et al., 2007; Nesvera & Pátek, 2008). Já o mutante para o fator σC aparentou apresentar a menor taxa de crescimento dentre as linhagens deficientes para os fatores sigma ECF (σ D, σE, σH, σK, σM, além do próprio σC). Para a avaliação das suscetibilidades das linhagens mutantes para os fatores σB, σC, σD, σE, σH, σK e σM, e comparação destas com a suscetibilidade da linhagem 1002(wt) cultivada sob as mesmas condições de estresse, realizamos curvas de crescimento simultâneas em MQD onde, para cinco réplicas experimentais, adicionamos ou não o agente gerador oxidante (plumbagina ou peróxido de hidrogênio) às culturas em fase de crescimento exponencial inicial, utilizando as diferentes concentrações listadas na Tabela 6. Figura 13. Curvas de crescimento em MQD das linhagens 1002(wt) e mutantes para os genes codificadores dos fatores σB, σC, σD, σE, σH, σK e σM de C. pseudotuberculosis. 74 Primeiramente, discutimos os efeitos causados pela adição de plumbagina às culturas bacterianas (Figura 14). É possível observar, pelos perfis das curvas, que o crescimento da linhagem selvagem foi pouco afetado pela adição de plumbagina à concentração final de 5µM, o que se torna ainda mais perceptível quando observamos os perfis das curvas geradas para as linhagens mutantes para os fatores sigma. De modo geral, a percepção desta diferença era esperada, uma vez que vários fatores sigma podem contribuir em alguma extensão para os mecanismos de adaptação ao estresse. Ainda, é possível observarmos que as maiores diferenças entre condição de estresse e controle ocorreram para os mutantes para σH e σC, sendo mais evidentes nesta última linhagem. O mutante para o fator σC submetido ao estresse apresenta um evidente retardo na transição da fase inicial para a intermediária de crescimento exponencial, o que comparado aos resultados obtidos para os demais mutantes, nos permite sugerir que nesta linhagem a plumbagina tenha afetado de maneira mais significativa processos celulares importantes para o aumento da multiplicação celular. Considerando que o fator σ C parece ser relevante para o crescimento exponencial em M. tuberculosis (Manganelli et al., 1999), seria plausível supor que a ausência deste regulador inativa parte dos mecanismos envolvidos na adaptação de C. pseudotuberculosis a esta fase do crescimento in vitro, tornando-a mais vulnerável ao desequilíbrio reducional-oxidativo. Embora os gráficos representando as curvas de crescimento nos indiquem diferentes aspectos relacionados à suscetibilidade de cada linhagem ao estresse, optamos por analisar matematicamente os resultados obtidos seguindo metodologia descrita por Pacheco et al. (2012). As áreas sob as curvas (até o tempo de 10h) foram calculadas e então comparadas entre si pela razão do crescimento sob estresse e o crescimento sob a condição controle correspondente (item 4.3). As curvas de crescimento para o experimento com plumbagina a 5µM, assim como para a plumbagina a 15µM, serviram de base para os resultados apresentados na Figura 15 C e D. Sob esta nova abordagem, constatamos mais uma vez que o crescimento do mutante para sigC sob a plumbagina a 5µM foi claramente mais afetado em relação ao ocorrido com a linhagem selvagem parental 1002(wt) (Figura 15 C). Ainda, foi possível observar que nesta condição de estresse os mutantes para os fatores σE, σH e σK também se mostraram mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que a linhagem 1002(wt), porém em menor magnitude do que o mutante para σC. Ao aumentarmos a concentração de plumbagina para 15µM (Figura 15 D), observamos que a linhagem 1002(ΔsigH) apresentou a redução mais evidente de crescimento em comparação com todas as outras. Já o mutante para sigC aparentou ser mais suscetível que 1002(wt), embora não possamos considerar que a diferença tenha sido significativa. Ainda assim, acreditamos que este resultado seja complementar àquele obtido para a plumbagina a 5µM, uma vez que os mutantes para sigC e sigH figuraram novamente entre os mais afetados pelo estresse. Os mutantes para sigE e sigK, que mostraram suscetibilidade aumentada a 5µM de plumbagina, não 75 apresentaram diferenças significativas em relação à linhagem 1002(wt) neste experimento com concentração maior. Além dos experimentos com a plumbagina, realizamos outros dois experimentos de suscetibilidade utilizando o peróxido de hidrogênio como agente oxidativo. Os resultados das curvas de crescimento foram analisados segundo o modelo matemático já descrito, e são apresentados na Figura 15, A e B. Podemos observar que a suscetibilidade do mutante para sigC foi maior do que a de 1002(wt) após a exposição a 10mM de peróxido de hidrogênio. O mesmo ocorreu quando a concentração de 40mM foi empregada, para a qual a linhagem 1002(ΔsigH) apenas pareceu ser mais suscetível do que as demais analisadas. Finalmente, considerando os quatro experimentos com estresse analisados, a linhagem 1002(ΔsigC) foi mais suscetível que a 1002(wt) em pelo menos três deles, ao passo que a mutante para sigH se mostrou mais suscetível em dois e as mutantes para sigE e sigK em apenas um dos experimentos. 76 Figura 14. Curvas de crescimento representativas das linhagens 1002(wt) e mutantes para os fatores sigma alternativos sob condição normal e plumbagina 5µM. Cada curva plotada no gráfico é representativa de cinco réplicas experimentais. 77 Figura 15. Suscetibilidade das linhagens selvagem e mutantes de C. pseudotuberculosis aos agentes geradores de estresse oxidativo (peróxido de hidrogênio e plumbagina). Diferentes concentrações dos agentes foram aplicadas às culturas bacterianas na DO(540nm)= 0,2 (início da fase de crescimento exponencial). Para compararmos os efeitos no crescimento, as áreas sob as curvas foram calculadas usando o software GraphPad Prism 5. O crescimento de cada linhagem sob a condição normal foi considerado como 100% e usado como referência para avaliar o crescimento diferencial sob a condição de estresse. Os gráficos gerados representam os efeitos do estresse no crescimento de todas as linhagens sob (A) 10µM de H2O2 (B) 40µM de H2O2 (C) 5µM de plumbagina e (C) 15µM de plumbagina. 78 Em adição aos experimentos até então executados, decidimos realizar novas curvas de crescimento utilizando concentrações maiores de peróxido de hidrogênio, de modo que fosse possível detectar a total paralização do crescimento em pelo menos uma das linhagens. Primeiramente, utilizamos peróxido de hidrogênio a 75mM nas culturas, o qual visivelmente interfiriu no crescimento da linhagem 1002(wt) e das mutantes para os fatores sigma alternativos (Figura 16 A). No entanto, a linhagem 1002(ΔsigC) foi a única dentre as analisadas que não foi capaz de crescer (ou retomar o crescimento, visto que o estresse foi empregado nas culturas já em crescimento exponencial inicial) durante o período de 20 horas. Este resultado confirmou que a linhagem mutante para sigC é a mais suscetível ao estresse oxidativo nas condições experimentais empregadas. Além disso, testamos o efeito da adição de peróxido de hidrogênio à concentração de 100mM nas culturas (Figura 16 B). Podemos observar que nesta condição o crescimento das linhagens é ainda mais afetado do que no experimento anterior, sendo que, além do mutante para o gene sigC, os mutantes para os genes sigH e sigK não foram capazes de crescer após 20 horas de observação. Finalmente, consideramos que os nossos resultados envolvendo as curvas de crescimento com os mutantes complementam os anteriormente mostrados para a expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos em resposta ao estresse oxidativo (Figura 9). A transcrição do gene sigH foi ativada em todos os experimentos de estresse, após 15 e 60 minutos de exposição aos agentes oxidativos. Este fato, somado à evidente maior suscetibilidade do mutante 1002(ΔsigH) à plumbagina, indica que o fator σH tem papel de destaque para a ativação dos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis. Ainda, sugerimos mais uma vez que o fator σC também desempenha papel importante para a adaptação a esta condição, visto que o gene sigC teve sua expressão ativada sob o estresse em vários dos experimentos realizados (Figura 9), e que a linhagem mutante 1002(ΔsigC) mostrou ser a mais suscetível dentre todas na maior parte das vezes em que o peróxido de hidrogênio ou a plumbagina foram acrescentados às culturas. 79 Figura 16. Curvas de crescimento para avaliação do efeito causado pelo peróxido de hidrogênio sobre o crescimento das diferentes linhagens de C. pseudotuberculosis. A) Avaliação da suscetibilidade diferencial ao peróxido de hidrogênio a 75mM. B) Avaliação da suscetibilidade diferencial ao peróxido de hidrogênio a 100mM. 80 5.7. Avaliação proteômica diferencial das linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para os fatores sigma σH e σC em relação à parental 1002(wt) 5.7.1. Comparação do proteoma entre a linhagem mutante para o fator σH e 1002(wt) Após chegarmos à conclusão de que os fatores σH e σC são provavelmente os mais relevantes para a resposta ao estresse oxidativo, decidimos dar prosseguimento à caracterização das linhagens mutantes para estes dois reguladores transcricionais. De forma geral, como os fatores sigma ativam a expressão de determinados grupos gênicos, a eliminação de um destes reguladores pode levar à diminuição da atividade de genes específicos - parte dos quais possui região promotora reconhecida pelo fator sigma ausente - e também ao aumento da atividade de outros genes - o que possivelmente representa a ativação de mecanismos compensatórios pela não-indução de determinados processos celulares. Uma vez que muitas das mudanças que ocorrem em nível transcricional se refletem na atividade de síntese protéica, optamos inicialmente por empregar a metodologia 2D-DIGE (como descrito no item 4.6.2.2) para compararmos os perfis de proteínas citoplasmáticas dos mutantes para sigH e sigC com o apresentado pela linhagem 1002(wt) parental, utilizando culturas em MQD e sob fase inicial de crescimento exponencial. A seguir, discutiremos especificamente os resultados alcançados para a linhagem mutante para o gene sigH. Os 2D-DIGEs com as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) estão representados na Figura 17. Na imagem com fluorescência verde (Figura 17A) podemos visualizar as proteínas citoplasmáticas da linhagem selvagem, enquanto que na imagem com fluorescência vermelha (Figura 17B) podemos visualizar as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante. Após a sobreposição das duas imagens (Figura 17D), alguns spots relativos a proteínas que foram diferencialmente expressas puderam ser facilmente notados; no entanto, o experimento representado na figura é relativo a apenas uma réplica experimental (biológica). Para que pudéssemos alcançar maior confiabilidade nas comparações realizadas, nos baseamos também em outras duas réplicas experimentais que serviram de suporte para a análise do perfil proteômico diferencial utilizando o software ImageMaster. Ao todo, apenas 12 spots apresentaram diferenças de expressão estatisticamente significativas (Figuras 18 e 19). Desses 12 spots, 10 foram mais expressos na linhagem mutante e dois mais expressos na selvagem (Figura 19). Através de espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MS, fomos capazes de identificar oito proteínas (Tabela 11), cujos processos e funções atribuídos pelo aplicativo Blast2go estão relacionados na Tabela 12. Das oito proteínas identificadas, seis estão entre as que apresentaram expressão aumentada na linhagem mutante. 81 Primeiramente, apresentamos as duas proteínas mais expressas na linhagem selvagem 1002(wt). Uma delas é o fator de alongamento de transcrição GreA (spot 19), cuja função está associada à promoção da eficiência e fidelidade da atividade da RNA polimerase durante o evento transcricional. Foi mostrado que o aumento da atividade de GreA estimula principalmente a expressão de genes que codificam para proteínas ribossomais (Stepanova et al., 2007). Como a linhagem mutante para o gene sigH apresenta menores níveis de GreA, sugerimos que sua maquinaria de tradução seja mais sensível a perturbações, o que pode explicar, em parte, sua maior suscetibilidade ao estresse oxidativo. Além disso, é provável que o fator σ H seja um dos principais ativadores da expressão do gene greA. A outra proteína que também foi mais expressa na linhagem selvagem é um regulador transcricional do sistema de dois componentes (ou TCS) (spot 6), cuja função está relacionada à transdução de sinais do meio extra para o intracelular. O TCS é constituído de uma proteína ligada à membrana, chamada histidina quinase (HK), e uma proteína reguladora de resposta citosólica (RR). Na ocorrência de estímulos ambientais específicos, a HK se autofosforila e, então, transfere o fosfato para a RR, que sofre modificações conformacionais e é liberada. O TCS é comum em bactérias, estando inclusive relacionado ao controle da atividade de fatores sigma de função extracitoplasmática. Dessa forma, a ativação de reguladores transcricionais associados ao TCS pode modular mecanismos de osmoregulação, quimiotaxia, esporulação e patogenicidade (Paterson et al., 2006; Churchward et al., 2007). Discutiremos agora as proteínas que apresentaram expressão aumentada na linhagem 1002(ΔsigH). Duas delas são chaperoninas: GroEL (spot 9) e GroEL1 (spot 11). A GroEL já foi relatada no item 5.5, onde apresentou expressão aumentada na linhagem 1002(wt) submetida ao estresse oxidativo causado pela plumbagina. Ela está diretamente implicada em eventos de degradação e exportação de proteínas (Kusukawa et al., 1989; Kandror et al., 1994). Já a GroEL1, que assim como a chaperonina anterior, também está presente em micobactérias, se destaca pelo seu envolvimento na biossíntese dos ácidos micólicos durante a formação de biofilme (Kong et al., 1993; Ojha et al., 2005). Outra proteína já descrita no item 5.5 e que apresentou expressão aumentada na linhagem 1002(ΔsigH) é a fosfoglicerato quinase (PGK) (spot 10). Ela é atuante na glicólise e gliconeogênese, e já foi associada à virulência de B. abortus (Trant et al., 2010). A maior atividade desta enzima na ausência do fator σH pode indicar que a linhagem mutante apresenta respiração celular deficitária, o que a levaria a intensificar o processo de fermentação. Outra proteína cuja expressão foi maior na linhagem mutante é a 6-fosfogluconato desidrogenase (GND) (spot 5). Ela é uma enzima que participa do ciclo das pentoses-fostato, cuja função é catalisar a descarboxilação oxidativa da 6-fosfogluconato à ribose 5-fosfato, com a redução de NADP. A atividade da GND é a maior fonte de NADPH e pentose para a biossíntese dos ácidos nucléicos (Novello & McClean, 1968). Apesar da GND ser uma proteína 82 essencialmente de função citoplasmática, ela já foi encontrada na superfície celular de Streptococcus suis desempenhando atividade de adesina na patogenicidade (Tan et al., 2008). Finalmente, identificamos a enzima fosforibosilamina-glicina ligase (PurD, spot 15) como sendo mais expressa na linhagem mutante para sigH. Ela está envolvida na biossíntese nucleotídica de novo das purinas, catalisando a conversão de 5-fosforibosilamina em 5fosforibosilglicinamida (Cersini et al., 2003). Foi relatado que a PurD, juntamente com outras proteínas, apresenta um papel significativo na colonização precoce de Streptococcus uberis nas glândulas mamárias de vacas (Dego et al., 2011). A comparação dos perfis proteômicos entre as linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigH) revelou a expressão diferencial de componentes que estão envolvidos principalmente no metabolismo de proteínas e ácidos nucléicos. É possível sugerir, por exemplo, que apesar da linhagem mutante apresentar deficiências que possam prejudicar a transcrição gênica e a tradução, ela procura intensificar a produção de ácidos nucléicos para talvez contribuir com o aumento da atividade da RNA polimerase e dos ribossomos. Ainda, um dos fatores que mais nos chamou a atenção foi a produção em maior quantidade de chaperoninas, o que pode evidenciar uma maior vulnerabilidade às condições que interferem na manutenção da integridade e atividade protéica, como o estresse oxidativo. Por último, a expressão aumentada da enzima ATP sintase subunidade beta (spot 7) na linhagem mutante é um indício do incremento no metabolismo energético e na atividade metabólica geral da célula, o que também poderia deixá-la mais vulnerável à ação de agentes oxidativos. Como mostrado no item 5.6, o mutante para sigH se mostrou de fato mais suscetível principalmente ao estresse causado pela plumbagina. 83 Figura 17. Resolução das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) através de 2DDIGE. As proteínas foram marcadas com CyDyes Cy3 (verde), Cy5 (vermelho) e Cy2 (amarelo), misturadas e resolvidas em um gel 2D. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 24cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDS-PAGE 12%. Os géis foram escaneados para a obtenção das imagens (A) Cy3: spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt), (B) Cy5: spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigH), (C) Cy2: Controle interno e (D) A sobreposição dos dyes (Cy3 e Cy5) é observada em amarelo. 84 A B Figura 18. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH). (A) Spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt). (B) Spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigH). A diferença de expressão foi significativa para doze spots, de acordo com o teste ANOVA<0.05. Os números seguidos dos traços verdes indicam os spots menos expressos e os números seguidos dos traços vermelhos indicam os spots mais expressos em cada linhagem avaliada. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 24cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDSPAGE 12%. O marcador de peso molecular (GE Helthcare) está indicado à esquerda. 85 Figura 19. Visualização dos doze spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH). As análises foram realizadas com três replicas experimentais através do programa ImageMaster 2D Platinum, considerando o teste ANOVA<0.05 e o fold change>1,2. As linhas identificadas como wt indicam os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e as linhas identificadas como ΔsigH indicam os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigH). Os quadrados realçados em verde são referentes aos spots menos expressos na linhagem avaliada e aqueles realçados em vermelho são referentes aos spots mais expressos na linhagem avaliada. 86 Tabela 11. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) que foram identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS. Nº do spot Genes ADL gi Proteínas identificadas 5 gnd 20890 384504607 6-phosphogluconate dehydrogenase 6 tcsR4 20553 384504261 Two-component system transcriptional regulatory protein 7 atpB 20735 384504447 ATP synthase subunit beta 9 groEL 21673 384505396 Chaperonin GroEL 10 pgk 20990 384504709 Phosphoglycerate kinase 11 groEL1 20319 384504021 Chaperonin GroEL 1 15 purD 21604 384505328 Phosphoribosylamine-glycine ligase 19 greA 20612 384504322 Transcription elongation factor GreA Nº do spot correspondente ao número do spot das Figuras 18 e 19. ADL: identificação de locus gênico (NCBI); gi: número de identificação das proteínas através do MASCOT (homologia p<0,05); Média de números de peptídeos identificados: 2,9 Expressão diferencial: Teste ANOVA<0,05 e fold change>1,2. 87 Tabela 12. Classificação das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigH) identificadas por espectrometria de massa, de acordo com funções e processos do Blast2go. Descrição das proteínas Funções Processos 6-phosphogluconate Ligação ao nucleotídeo Metabolismo de ácidos nucléicos dehydrogenase Atividade Catalítica Metabolismo de carboidratos Two component system Atividade de regulação Transdução de sinal response regulator transcricional Regulação de processos biológicos Catabolismo Atividade de transdução de sinais Ligação ao DNA ATP synthase subunit beta Atividade hidrolase Biossíntese do precursor de metabólitos e Atividade transportadora energia Metabolismo de ácidos nucléicos Transporte de Íons Biossíntese Chaperonin Atividade quinase Metabolismo Ligação ao nucleotídeo Metabolismo de proteínas Ligação a proteína Phosphoglycerate kinase Atividade quinase Metabolismo Ligação ao nucleotídeo Biossíntese do precursor de metabólitos e energia Metabolismo de carboidratos Catabolismo Chaperonin Ligação à proteína Metabolismo de proteínas Ligação ao nucleotídeo Phosphoribosylamine--glycine Atividade catalítica Metabolismo de ácidos nucléicos ligase Ligação ao nucleotídeo Biossíntese Transcription elongation factor Atividade de fator de tradução Regulação de processos biológicos Ligação ao ácido nucléico Tradução Ligação ao DNA 88 5.7.2. Comparação do proteoma entre a linhagem mutante para o fator σC e 1002(wt) O mutante para o fator σC de C. pseudotuberculosis também foi submetido à caracterização proteômica, pela sua importância já mencionada. Os 2D-DIGEs com as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) estão representados na Figura 20. Na fluorescência verde (Figura 20A) podemos visualizar as proteínas citoplasmáticas da linhagem selvagem e na fluorescência vermelha (Figura 20B) podemos visualizar as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante. Embora vários spots tenham sido diferencialmente representados na comparação entre as duas linhagens, o que pode ser facilmente visualizado na Figura 21D, as análises feitas no software ImageMaster se basearam na comparação entre três réplicas experimentais distintas. No total, houve diferença significativa de expressão para apenas cinco spots, sendo que todos eles representam proteínas que foram sintetizadas em maior quantidade na linhagem mutante para sigC (Figuras 21 e 22). No entanto, apenas quatro spots tiveram suas respectivas proteínas identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS (Tabela 13). As funções e os processos dessas proteínas foram classificados de acordo com os termos do aplicativo Blast2go (Tabela 14). Uma das proteínas identificadas é a transaldolase, que pode atuar na adesão ou agregação bacteriana durante a colonização do organismo hospedeiro (González-Rodríguez et al., 2012). Curiosamente, esta proteína também foi mais expressa na linhagem 1002(wt) submetida à plumbagina (em comparação com a mesma linhagem cultivada sem a indução do estresse) (item 5.5, Tabela 9). Embora possamos concluir que o fator σC não é requerido para a produção da transaldolase, o fato desta ter sido encontrada em maior quantidade no citoplasma da linhagem 1002(ΔsigC) pode ser um indício da repressão ou da deficiência do mecanismo de exportação da mesma. Por outro lado, não podemos desconsiderar o fato de que a ativação da transaldolase intensifica a glicólise e, assim, pode ser importante para a geração de mais energia e compostos precursores de diversos componentes celulares. Como discutido no item 5.5, é provável que a linhagem selvagem de C. pseudotuberculosis tenha seu metabolismo aeróbio reduzido em decorrência do estresse oxidativo, o que a levaria a intensificar a atividade glicolítica para geração de energia. Assim, é possível que a linhagem mutante para o fator σC também apresente respiração aeróbia reduzida em comparação com a linhagem selvagem, o que poderia ocorrer pela maior suscetibilidade ao estresse oxidativo de origem endógena. Além disso, a fosfogliceromutase (spot 4), que assim como a transaldolase, está envolvida na glicólise, também foi mais expressa na linhagem mutante para sigC. As proteínas ribossomais 50S do tipo L7/L12 (spot 6) são componentes da estrutura da subunidade maior do ribossomo. Esta subunidade contribui para o deslocamento do complexo 89 ribossomal durante a tradução da fita de RNA, e apresenta atividade peptidil-transferase para a síntese protéica por conter a subunidade 23S. As proteínas ribossomais, como a que foi identificada no nosso experimento, são importantes para processos de decodificação, formação de sítios de ligação para fatores de tradução, e formação do túnel de saída para os petpídios recém-sintetizados, além de contribuírem para a atividade helicase dos ribossomos (Soung et al., 2009). É provável que a maior produção de tais proteínas possa servir de estímulo para o aumento da atividade ribossomal, o que nos permite supor que a linhagem mutante para o gene sigC, asim como a mutante para sigH, apresenta deficiências na maquinaria de tradução. Embora a última proteína identificada (spot 2) esteja envolvida no metabolismo de aminoácidos, segundo a classificação gerada pelo aplicativo Blast2go, ainda não obtivemos informações adicionais sobre sua atividade. O σC é um dos fatores sigma que ainda não foram caracterizados em bactérias do gênero Corynebacterium. Como poucas proteínas diferencialmente expressas entre 1002(ΔsigC) e 1002(wt) puderam ser identificadas nos nossos experimentos, e levando em consideração a importância que atribuímos ao fator σC para a resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis, optamos por priorizar a continuidade do estudo deste regulador transcricional no presente trabalho. 90 Figura 20. Resolução das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) através de 2DDIGE. As proteínas foram marcadas com CyDyes Cy3 (verde), Cy5 (vermelho) e Cy2 (amarelo), misturadas e resolvidas em um gel 2D. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 24cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDS-PAGE 12%. Os géis foram escaneados para a obtenção das imagens (A) Cy3: Spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt), (B) Cy5: Spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC), (C) Cy2: Controle interno, e (D) A sobreposição dos dyes (Cy3 e Cy5) é observada em amarelo. 91 Figura 21. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC). (A) Spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(wt). (B) Spots referentes às proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC). A diferença de expressão foi significativa para cinco spots, de acordo com o teste ANOVA<0.05. Os números seguidos dos traços verdes indicam os spots menos expressos e os números seguidos dos traços vermelhos indicam os spots mais expressos em cada linhagem avaliada. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 24cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDSPAGE 12%. O marcador de peso molecular (GE Helthcare) está indicado à esquerda. 92 Figura 22. Visualização dos cinco spots correspondentes às proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC). As análises foram realizadas com três replicas experimentais através do programa ImageMaster 2D Platinum, considerando o teste ANOVA<0,05 e o fold change>1,2. A linha identificada como wt indica os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e a linha identificada como ΔsigC indica os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC). Os quadrados realçados em verde são referentes aos spots menos expressos na linhagem avaliada e aqueles realçados em vermelho são referentes aos spots mais expressos na linhagem avaliada. Tabela 13. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas nas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) que foram identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS. Nº do spot Genes ADL gi Proteínas identificadas 2 Cp1002_1242 21124 384504847 hypothetical protein Cp1002_1242 3 Tal 20983 384504702 Transaldolase 4 gpmA 20161 384503862 Phosphoglyceromutase 6 rplL 20216 384503917 50S ribosomal protein L7/L12 Nº do spot correspondente ao número do spot das Figuras 22 e 23. ADL: identificação de locus gênico (NCBI); gi: número de identificação das proteínas através do MASCOT (homologia p<0,05); Média de números de peptídeos identificados: 2,5 Expressão diferencial: Teste ANOVA<0,05 e fold change>1,2. 93 Tabela 14. Classificação das proteínas citoplasmáticas das linhagens de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e 1002(ΔsigC) identificadas por espectrometria de massa, de acordo com funções e processos do Blast2go. Descrição das proteínas Hypothetical protein cpfrc_01249 Transaldolase Funções ND Atividade transferase Phosphoglyceromutase Atividade catalítica Glyoxalase/Dihydroxybiphenyl Dioxygenase 50s ribosomal protein l7 l12 ND: Não Determinados Atividade catalítica Processos Metabolismo de aminoácidos Metabolismo de carboidratos Metabolismo de ácidos nucléicos Catabolismo Metabolismo de carboidratos Geração do precursor de metabólitos e energia Catabolismo ND Atividade de molécula estrutural Tradução 5.8. Avaliação transcriptômica diferencial de C. pseudotuberculosis mutante para o fator σC em relação à linhagem 1002(wt) Após a avaliação do pefil proteômico diferencial de 1002(ΔsigC) em relação à linhagem selvagem parental 1002(wt), tivemos a oportunidade de aprofundarmos nossos estudos envolvendo esta linhagem mutante utilizando a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNAseq). No entanto, antes de avaliarmos o perfil transcriptômico dessa linhagem, padronizamos uma nova metodologia para a depleção de RNA ribossomal das amostras de RNA total bacteriano, a qual se baseou no emprego da cromatografia líquida desnaturante de alta performance (ou DHPLC, do inglês Denaturing high-performance liquid chromatography). A depleção do rRNA é comumente realizada para que se obtenha a menor quantidade possível de leituras de sequenciamento (reads) correspondentes aos transcritos de RNA ribossomal, os quais representam mais de 95% da atividade transcricional na célula. A metodologia padronizada pelo nosso grupo nos permitiu atingir eficiências de depleção iguais ou superiores àquelas conferidas por kits comerciais (em torno de 70 a 90%); no entanto, é financeiramente vantajosa quando se tem acesso ao equipamento cromatográfico necessário. Maiores detalhes sobre este trabalho podem ser encontrados na publicação em anexo (ANEXO IV). A seguir, apresentarei os resultados de transcriptômica relacionados à linhagem mutante 1002(ΔsigC), os quais se valeram do emprego da metodologia supracitada. Os procedimentos adotados para as análises transcriptômicas estão descritos no item 4.7. Resumidamente, comparamos neste experimento duas culturas bacterianas em fase inicial de crescimento exponencial: uma referente à linhagem 1002(wt) e a outra referente à linhagem 1002(ΔsigC). As amostras de RNA extraído foram transformadas em bibliotecas de cDNA e então sequenciadas pelo equipamento Ion Torrent PGMTM, originando quantidades de leituras (ou 94 sequências correspondentes aos transcritos) que representam a atividade transcricional dos genes presentes nas linhagens. Utilizando o software CLC Genomics Workbench, mapeamos contra o genoma de C. pseudotuberculosis 1.015.258 leituras de sequenciamento (ou 170.246.139 de bases) relativas à linhagem 1002(wt) e 888.738 leituras (ou 149.017.886 de bases) relativas à linhagem 1002(ΔsigC). O tamanho médio das leituras obtidas para cada uma das duas amostras sequenciadas está representado na Figura 24. A quantificação da expressão de cada gene foi normalizada segundo valores de RPKM (Mortazavi et al., 2008), e então verificamos através do software DEGseq se as diferenças detectadas entre as linhagens eram estatisticamente significativas. De um total de 2.203 genes anotados no genoma de C. pseudotuberculosis 1002, 1.987 foram representados no transcriptoma por pelo menos uma leitura (90,2% de cobertura). Deste total, apenas dez genes foram mais expressos na linhagem mutante para sigC, os quais apresentaram expressão (fold change) cerca de 1,5 até 4,5 vezes maior do que na linhagem 1002(wt) (Tabela 15). Todos estes genes mais expressos tiveram as proteínas para as quais eles codificam identificadas e validadas através da técnica de LC-MSE, como descrito no item 4.6.4.2. Três destes genes codificam para proteínas cuja função ainda é desconhecida, embora se saiba que uma delas se localiza na membrana da célula. Um gene que codifica para um regulador transcricional do tipo HTH (hélice-volta-hélice, do inglês helix-turn-helix) também foi identificado como sendo mais expresso, no entanto, sua função é desconhecida. Além deste, foram identificados outros dois genes que estão relacionados ao metabolismo dos ácidos nucléicos (xis e ndk). O gene ndk codifica para a nucleosídio difosfato quinase (NDK), enzima que cataliza a síntese de nucleotídios trifosfatados para a incorporação de bases nas fitas de DNA e RNA. A maior expressão de ndk pode ser um indício de que a linhagem mutante procura intensificar a atividade de mecanismos envolvidos na replicação do DNA e transcrição gênica. Foi relatado que a NDK possui papel importante no metabolismo celular e crescimento em diversos organismos, incluindo as micobactérias (Arumugam & Ajitkumar, 2013). Já o gene xis é pertencente aos fagos e codifica para a proteína exicionase (Xis), que é controladora dos processos de excisão e integração de DNA viral. A Xis atua em conjunto com vários complexos nucleotídio-proteína capazes de reconhecer sítios específicos no DNA bacteriano (Sam et al., 2006). Em bactérias patogênicas como C. pseudotuberculosis, genes de origem viral frequentemente se localizam em ilhas genômicas de patogenicidade e podem ter sua expressão induzida em resposta a uma situação ambiental desfavorável, como durante a infecção do hospedeiro (Ruiz et al., 2011; Soares et al., 2012). O aumento da atividade do gene xis pode ser um indício de que, na ausência do fator σC, é facilitada a ocorrência de eventos de recombinação e incorporação de DNA exógeno, o que poderia contribuir para a adaptação da bactéria a situações adversas. Além disso, também foi relatado que a ativação de genes virais pode contribuir para que o próprio fago 95 complete seu ciclo de replicação antes que a bactéria hospedeira sofra lise, garantindo assim a sua liberação ao ambiente e perpetuação em outros hospedeiros (Georgopoulos, 2006). A maior parte dos genes que se apresentaram diferencialmente regulados entre as duas linhagens foi mais expressa na bactéria selvagem parental. Neste caso, consideramos analisar os genes que apresentaram maior variação de expressão (fold change maior ou igual a 4,0) e que também tiveram valor de RPKM maior ou igual a 50 em pelo menos uma das duas linhagens estudadas (Tabela 16). Todos os genes que se enquadraram nestes parâmetros tiveram as proteínas para as quais eles codificam identificadas e validadas através da técnica de LC-MSE, como descrito no item 4.6.4.2. As funções e os processos atribuídos a cada um dos 64 genes mais expressos na linhagem 1002(wt) estão listados na Tabela 16, de acordo com os termos do aplicativo Blast2go. Para que as classificações desses genes pudessem ser agrupadas e facilmente visualizadas, representamos graficamente a distribuição de processos e funções na Figura 25. Observamos inicialmente que 19 genes (30% dos que foram mais expressos na linhagem selvagem) estão diretamente envolvidos na composição estrutural/biogênese dos ribossomos, o que provavelmente aponta para a menor eficiência na atividade da maquinaria de tradução na linhagem 1002(ΔsigC). Esta hipótese já havia sido levantada anteriormente no item 5.7.2, onde relatamos o aumento da produção da proteína ribossomal do tipo L7/L12 (Tabela 14) na linhagem mutante para sigC. Embora a associação entre esta observação e os resultados de RNAseq possa sugerir uma contradição, é importante observar que vários genes de outras proteínas ribossomais que não L7/L12 foram mais expressos na linhagem selvagem do que na mutante. Dessa forma, temos claros indícios de que a ausência do fator σC ocasiona a menor produção destas proteínas e, como forma de compensação, há uma maior produção de L7/L12 e possivelmente de outras proteínas que participam da biogênese ribossomal. Ainda, acreditamos que o fator σ C possa induzir diretamente a expressão da maioria desses 19 genes de proteínas ribossomais aos quais nos referimos; no entanto, é bastante provável que outros fatores sigma também estejam envolvidos (em menor importância) na ativação da transcrição deles. Considerando os relatos de que o fator σC atua principalmente na fase de crescimento exponencial em M. tuberculosis (Manganelli et al., 1999), também sugerimos que as 19 proteínas ribossomais acima mencionadas podem atuar ativamente nesta fase do crescimento na linhagem selvagem de C. pseudotuberculosis. Outro grupo de genes mais expressos na linhagem selvagem está diretamente implicado na fosforilação oxidativa: os que codificam as subunidades alfa, beta e delta da ATP sintase (enzima-chave no processo de respiração celular), e os que codificam duas subunidades (flavoproteína e citocromo b556) da succinato desidrogenase. A menor expressão destes genes no mutante para sigC corrobora a nossa hipótese anteriormente apresentada (item 5.7.2) de que essa linhagem tem atividade respiratória reduzida em relação à parental 1002(wt). Alguns outros 96 genes também estão envolvidos no metabolismo energético celular, como aqueles que codificam enzimas importantes para a conversão e utilização de açúcares (por exemplo, rpiB e ptsG, que codificam a ribose-5-fosfato isomerase B e a fosfotransferase, respectivamente). Outros genes mais expressos na linhagem selvagem estão envolvidos no metabolismo dos aminoácidos: CP1002_0569, argS, e ansA, os quais participam do metabolismo da arginina, alanina e prolina. O metabolismo das porfirinas também parece ser mais ativo na bactéria selvagem, que apresentou expressão aumentada dos genes hemL (codificador da glutamato-1semialdeído) e ftn (codificador da ferritina). Também observamos uma maior atividade transcricional do erpA, que codifica uma proteína de inserção de cofatores Fe-S. Diretamente envolvidos na adaptação ao estresse, os genes sodA, ccsX, e trxA1, dnaJ e dnaK também se encontram mais ativos na linhagem 1002(wt). Como já discutido anteriormente, a SodA possui atividade importante para a detoxificação de íons superóxido gerados em decorrência principalmente da respiração celular. Ainda, ccsX e trxA1 (que codificam duas proteínas com atividade tiorredoxina) têm papel fundamental para a redução de pontes dissulfeto que se formam nos grupos tiol de cisteínas em decorrência do desequilíbrio reducional-oxidativo. Assim como as chaperoninas, as tiorredoxinas contribuem para a manutenção da homeostase protéica celular (Salazar et al., 2001). Já os genes dnaJ e dnaK codificam duas proteínas (HSP40 e HSP70) conhecidas por heat shock proteins (proteínas do choque térmico). Estas proteínas possuem atividade chaperonina e desempenham um papel para a sobrevivência principalmente quando a bactéria é exposta a condições de estresse. Ainda, foi relatado que ambas HSP40 e HSP70 desempenham papel essencial para a iniciação da replicação de sequências virais, sendo que a HSP40 também está envolvida na replicação do DNA bacteriano (Costa et al., 2011; Suzuki et al., 2012). Assim como os demais fatores sigma alternativos ECF, é esperado que o fator σC esteja envolvido na regulação de genes implicados nos mecanismos de secreção e comunicação com o meio extracelular. Um dos genes mais expressos na linhagem 1002(wt) codifica uma porina (PorH), que constitui um canal cuja função é facilitar o transporte de nutrientes através da parede celular (Burkovski, 2013). Outro gene mais expresso foi o secG, codificador de um dos componentes do complexo de secreção SecYEG. Estudos sugerem que a deleção de secG causa fenótipo de sensibilidade a condições de baixa temperatura, além de defeitos severos na exportação de proteínas (Flower et al., 2000; Ligon et al., 2012). Dessa forma, sugerimos que a linhagem de C. pseudotuberculosis mutante para sigC apresenta deficiências no sistema de transporte de moléculas através do envelope celular. Finalmente, destacamos os genes que codificam duas proteínas descritas como sendo importantes na patogenicidade de outras espécies bacterianas. Uma delas é a proteína de invasão p60, que possui atividade hemolítica e atua na internalização de macrófagos em L. monocytogenes (Krawczyk-Balska et al., 2005). A outra é a trealose corinomicolil transferase C, 97 que foi descrita como uma proteína com função de adesina por se ligar à fibronectina das células do hospedeiro, facilitando a internalização do patógeno (Ramalu et al., 2006). Considerando todos os aspectos levantados no nosso experimento de RNAseq, concluímos que a inativação do fator σC em C. pseudotuberculosis ocasiona principalmente: (I) redução da atividade ribossomal e do metabolismo energético e de aminoácidos; (II) prejuízos no transporte e secreção de moléculas através do envelope celular; (III) redução da expressão de genes que codificam enzimas relevantes para a neutralização de ROS, bem como para os efeitos causados por estas sobre diversos componentes celulares; e (IV) redução da expressão de genes que codificam fatores de virulência descritos para outras bactérias. Figura 23. Quantidade total de leituras geradas no sequenciamento do RNA (RNA seq) distribuídas de acordo com o tamanho em pares de bases. O software utilizado para a análise foi o CLC Genomics Workbench. 98 Figura 24. Classificações funcionais e processuais dos genes mais expressos na linhagem 1002 (wt) de Corynebacterium pseudotuberculosis. As sequencias com fold change>4 e rpkm 50 foram consideradas. Gráficos do tipo multinível gerados com base no número de sequências gênicas classificadas para cada termo do Blast2go. A) Processos Biológicos. B) Funções. Representação apenas ilustrativa; redundâncias podem ocorrer tanto em A quanto em B. 99 Tabela 15. Genes mais expressos na linhagem 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis e suas respectivas funções e processos biológicos Genes cp1002_0202 cp1002_0503 cp1002_2011 Hth Xis Ndk Locus Tag Cp1002_0202 Cp1002_0503 Cp1002_2011 Cp1002_1515 Cp1002_0266 Cp1002_1589 Descrição das proteínas Conserved hypothetical protein Hypothetical protein Membrane protein Family transcriptional regulator DNA-binding protein Nucleoside diphosphate kinase *Fold change 2,741661613 4,569 1,592379219 3,849 1,849533628 3,198605215 Principais funções/processos biológicos (Blast2go) ND ND ND Ligação ao DNA/Transcrição Ligação nucleotídica Atividade quinase/Metabolismo dos nucleotídeos ND: Não Determinados ; *Valores obtidos pela razão entre RPKM da linhagem mutante 1002 (ΔsigC) e RPKM da linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis. 100 Tabela 16. Genes mais expressos na linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis e suas respectivas funções e processos biológicos Genes cp1002_0825 cp1002_1242 cp1002_0126a cp1002_0571 cp1002_0664 cp1002_0734 cp1002_1805 cp1002_2069 cp1002_1900 rsfS cp1002_1960 cp1002_0524 cp1002_0569 argS cp1002_1063 cp1002_1072a cp1002_1799 erpA Ftn rplK rplQ rplC rplE rplA rplJ rpsL rplD rplB rpsS rpsC rplN rpmB rplF rpsM rpsK rpmG Rpml rpsT infC Locus Tag Cp1002_0825 Cp1002_1242 Cp1002_0126a Cp1002_0571 Cp1002_0664 Cp1002_0734 Cp1002_1805 Cp1002_2069 Cp1002_1900 Cp1002_1576 Cp1002_1960 Cp1002_0524 Cp1002_0569 Cp1002_0829 Cp1002_1063 Cp1002_1072a Cp1002_1799 Cp1002_1427 Cp1002_1674 Cp1002_0308 Cp1002_0394 Cp1002_0347 Cp1002_0365 Cp1002_0309 Cp1002_0313 Cp1002_0335 Cp1002_0348 Cp1002_0350 Cp1002_0351 Cp1002_0353 Cp1002_0363 Cp1002_0657 Cp1002_0371 Cp1002_0390 Cp1002_0391 Cp1002_0656 Cp1002_0940 Cp1002_1568 Cp1002_0939 Descrição das proteínas *Fold change Uncharacterized protein 9,629197082 Uncharacterized protein 5,729770164 Uncharacterized protein 4,564489526 Uncharacterized protein 6,12767087 Uncharacterized protein 6,12767087 Uncharacterized protein 5,252289317 Uncharacterized protein 11,37996019 Uncharacterized protein 4,251853257 Uncharacterized protein 4,048639682 Ribosomal silencing factor 4,251853257 Membrane-associated phospholipid phosphatase 4,085113913 Stearoyl-CoA 9-desaturase electron transfer partner 5,570609882 Methylmalonyl-CoA carboxyltransferase 5S subunit 4,195426223 Arginine--tRNA ligase 4,705175847 Arginine/ornithine transport system ATPase 4,52280469 Invasion-associated protein p60 5,689980094 Rhodanese-related sulfurtransferase 6,565361647 Iron-sulfur cluster insertion protein erpA 4,026755143 Ferritin-like protein 8,170227827 50S ribosomal protein L11 4,46444592 50S ribosomal protein L17 5,377343825 50S ribosomal protein L3 6,252725378 50S ribosomal protein L5 5,010804751 50S ribosomal protein L1 7,003052423 50S ribosomal protein L10 6,577867097 30S ribosomal protein S12 4,158062376 50S ribosomal protein L4 4,949272626 50S ribosomal protein L2 6,477823491 30S ribosomal protein S19 4,158062376 30S ribosomal protein S3 8,503706514 50S ribosomal protein L14 4,501962272 50S ribosomal protein L28 4,683291308 50S ribosomal protein L6 4,699416758 30S ribosomal protein S13 5,446818551 30S ribosomal protein S11 5,398186243 50S ribosomal protein L33 5,331869458 50S ribosomal protein L35 4,376907764 30S ribosomal protein S20 5,602441938 Translation initiation factor IF-3 5,331869458 Principais funções/processos biológicos (Blast2go) ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Atividade Catalítica Atividade Oxidoredutase/ Oxidação-Redução Metabolismo da arginina, alanina e prolina Ligação ao ATP/ Metabolismo das argininas e prolinas Fator de iniciação da Tradução/ Regulação da Tradução Atividade hidrolase Atividade transferase Ligação ao grupo Fe-S/ Montagem do grupo Fe-S Atividade ferroxidase/ Oxidação-Redução/Homeostase Estrutura do ribossomo/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Tradução Ligação ao ribossomo/ Biogênese ribossomal Ligação ao tRNA/ Biogênese ribossomal Ligação ao rRNA e tRNA/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Biogênese do ribossomo Ligação ao tRNA/Tradução Ligação ao rRNA/ Biogênese do ribossomo Atividade transferase/ Tradução Ligação ao rRNA/ Tradução Ligação ao mRNA/ Tradução Ligação ao rRNA/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Tradução Ligação ao rRNA/ Tradução Ligação ao rRNA e tRNA/ Tradução Ligação ao rRNA/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Tradução Ligação ao rRNA/ Tradução Estrutura do ribossomo/ Tradução 101 Continua Pnp Cp1002_1266 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 4,197342318 dnaJ dnak lutA lutB Cp1002_1896 Cp1002_1898 Cp1002_0827 Cp1002_0826 Chaperone protein (Hsp40) Uncharacterized protein (Hsp70) Lactate utilization protein A Lactate utilization protein B 6,419464721 4,877125795 6,252725378 4,376907764 sodA ccsX trxA1 ahpC sdhA Cp1002_1993 Cp1002_0284 Cp1002_2020 Cp1002_1219 Cp1002_0243 Superoxide dismutase Thiol-disulfide isomerase/thioredoxin Thioredoxin Alkyl hydroperoxide reductase subunit C Succinate dehydrogenase flavoprotein subunit 7,294846274 4,52280469 7,003052423 4,960495466 4,604746799 sdhC rpiB ptsG hemL Cp1002_0242 Cp1002_1606 Cp1002_0930 Cp1002_0282 Succinate dehydrogenase cytochrome b556 subunit Ribose-5-phosphate isomerase B Phosphotransferase system II Component Glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase 4,251853257 6,002616363 4,041144977 4,713592977 mscL ansA malk atpB atpH atpA accBC Cp1002_0665 Cp1002_0368 Cp1002_0383 Cp1002_0841 Cp1002_0844 Cp1002_0845 Cp1002_0476 Large-conductance mechanosensitive channel L-asparaginase Glycerol-3-phosphate-transporting ATPase ATP synthase subunit beta ATP synthase subunit delta ATP synthase subunit alpha Acyl coenzyme A carboxylase 4,727060386 4,409329303 6,12767087 5,454300445 6,674784341 5,19923589 4,284762338 doxX secG Cp1002_0936 Cp1002_1102 DoxX family protein Protein-export membrane protein secG 6,455938953 4,668701615 porH cmtC Cp1002_1806a Cp1002_1955 Cell wall channel Trehalose corynomycolyl transferase C 8,024330901 4,178708168 Ligação ao rRNA/Exoribonuclease/ Catabolismo do RNA Replicação do DNA/ Resposta ao choque térmico Resposta ao estresse/ Modelamento de proteínas CoB-CoM heterosulfito redutase/Oxidação-redução Atividade Oxidoredutase/ Oxidação do lactato Superóxido dismutase/ Oxidação-redução Atividade antioxidante/ Oxidação-redução Atividade de oxidoredutase/ Homeostase redox celular Atividade Peroxidoxina/ Oxidação-Redução Succinato desidrogenase (ubiquinona)/ Fosforilação oxidativa Succinato desidrogenase/ Fosforilação oxidativa Ribose-5-fosfato isomerase/ Pentose-fosfato shunt Atividade quinase/ Fosforilação Atividade Transaminase/ Biossíntese do Protoporfobilinogênio Atividade de canal iônico Atividade de asparaginase/ Metabolismo da Alanina Ligação à ATP/ Catabolismo de ATPs Transporte de hidrogênio/ Geração de ATP Mecanismo rotacional/ Geração de ATP Transporte dehidrogênio/ Geração de ATP Atividade de biotina carboxilase/ Biossíntese dos Ácidos graxos ND Atividade transportadora transmembrânica/ Secreção de Proteínas ND Atividade trealose O-micoliltransferase ND: Não Determinados ; *Valores obtidos pela razão entre RPKM da linhagem selvagem 1002(wt) e RPKM da linhagem 1002 (ΔsigC) de C. pseudotuberculosis. 102 5.9. Avaliação da virulência das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis Os resultados até então apresentados apontam, de forma geral, que o fator σ C de C. pseudotuberculosis está envolvido na resposta ao estresse oxidativo e pode regular diversos processos celulares do metabolismo bacteriano. Nesse contexto, considerando ainda o provável envolvimento deste regulador transcricional na expressão de genes relacionados ao processo infeccioso (item 5.8), realizamos ensaios preliminares de virulência com a linhagem 1002(ΔsigC) como descrito no item 4.8. Diferentes modelos animais como amebas, insetos, peixes e nematódeos têm sido descritos para o estudo das interações patógeno-hospedeiro (Dorer & Isberg, 2006). Recentemente, o nematódeo C. elegans foi apresentado como um modelo apropriado para a realização de triagens que possam apontar as diferenças de virulência entre diferentes linhagens das corinebactérias (Ott et al., 2012). Assim, foram realizadas infecções experimentais com as linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis e os resultados são observados na Figura 25. Os dados demonstram um pequeno decréscimo na porcentagem de sobrevivência (em torno de 25%) dos nematódeos infectados com a linhagem mutante para o fator σ C, ao passo que a linhagem selvagem parental provocou a morte de aproximadamente 75% dos animais infectados. A taxa de sobrevivência dos nematódeos infectados pela linhagem controle E. coli OP50 se manteve próxima de 100% durante os 10 dias de experimento. Essa triagem realizada nos fornece indícios de que a linhagem mutante tem sua virulência reduzida, porém estudos em mamíferos ainda são necessários. 103 Figura 25. Sobrevivência dos nematódeos após infecção com as linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis. Os dados representados são as médias de três réplicas experimentais. O GraphPad Prism 6 foi utilizado para as análises de sobrevivência dos C. elegans. 104 PARTE 3 – Estudo do papel do fator σC na resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis 5.10. Expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) submetida ao estresse oxidativo Seguindo a caracterização da linhagem de C. pseudotuberculosis mutante para o gene sigC, o que foi feito até o momento sem a indução de estresse, realizamos novos experimentos baseados em qRT-PCR para avaliarmos o efeito da ausência do fator σC sobre o perfil transcricional dos genes codificadores de fatores sigma alternativos em resposta à plumbagina. Para isso, o RNA total de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) foi extraído como descrito no item 4.6.1, após a cultura bacteriana atingir a DO(600nm)=0,2 e ser submetida durante 15 e 60 minutos à plumbagina a 15µM. Após a realização da reação de transcrição reversa, procedemos com os ensaios de quantificação relativa dos transcritos como descrito no item 4.5.2. Os resultados de dois experimentos distintos (duas réplicas biológicas) para a análise da expressão diferencial dos genes sigB, sigD, sigE, sigH, sigK e sigM estão representados na Figura 26. Primeiramente observamos que, aos 15 minutos de exposição à plumbagina, os genes sigB e sigH foram significativamente mais expressos do que na condição controle (sem indução de estresse). Além disso, podemos observar que a expressão dos genes sigD, sigK e sigM foi ativada em apenas uma das réplicas avaliadas, enquanto que sigE não foi ativado. No tempo de 60 minutos, apenas o sigH teve sua expressão aumentada na condição de estresse. Os dados sugerem que, na ausência do fator σC, os fatores σB e σH exercem papel de destaque na adaptação ao estresse oxidativo, sendo que a participação do σB parece se restringir aos primeiros minutos de estresse. É interessante notarmos que o gene sigM não apresentou ativação tardia (aos 60 minutos de exposição à plumbagina) como havia apresentado quando a linhagem selvagem foi exposta ao mesmo agente oxidativo (Figuras 26 e 9). Este pode ser um indício de que o fator σC é um dos responsáveis pela ativação da transcrição de sigM em C. pseudotuberculosis. Outra observação relevante é a de que o aumento na expressão de sigB e sigH no mutante sob estresse também ocorreu nos experimentos anteriormente realizados com a linhagem selvagem (Figuras 26 e 9), o que inicialmente nos levou a sugerir que o fator σ C não é relevante para a ativação destes outros reguladores transcricionais. Nesse contexto, realizamos dois experimentos adicionais que nos permitiram avaliar se os níveis de expressão dos genes sigB, sigD, sigE, sigH, sigK e sigM na linhagem 1002(ΔsigC) submetida ao estresse são diferentes daqueles observados para a linhagem 1002(wt) também sob condição de estresse (Figura 27). Surpreendentemente, encontramos que o gene sigB sofreu maior ativação na linhagem 1002(ΔsigC) em relação à 1002(wt), o que parece indicar que o fator 105 σB compensa a ausência do fator σC na célula, ainda que parcialmente. Corroborando nossa hipótese, estudos em M. tuberculosis mostraram que, assim como o fator σB, o fator σC está envolvido na resposta geral ao estresse nessa bactéria (Newton-Foot et al., 2013). Assim, é possível sugerir que as funções desempenhadas pelos fatores σ B e σC de C. pseudotuberculosis (e por conseguinte os seus regulons) também se sobrepõem em algum grau. Com base na Figura 27, observamos que em nenhum momento a expressão de sigH na linhagem mutante sob estresse foi maior do que na linhagem selvagem sob a mesma condição. Ainda, sua expressão chegou a ser significativamente menor no mutante no tempo de 15 minutos, até atingir níveis similares aos de 1002(wt) depois de 60 minutos de estresse. Este resultado nos chamou a atenção por indicar que a ativação de sigH após 15 minutos de exposição à plumbagina parece depender em algum grau da ação de σC. Como o gene sigH é autoregulado em C. glutamicum (Busche et al., 2012), é possível que ele também o seja em C. pseudotuberculosis; neste sentido, podemos supor que a baixa expressão de sigH no tempo inicial leva gradualmente ao aumento da sua própria expressão, que atinge então os níveis observados para a linhagem selvagem após 60 minutos de estresse. Finalmente, também observamos pela Figura 27 que os genes sigK e sigM são expressos em menores níveis na linhagem mutante sob estresse (em relação à selvagem sob a mesma condição), o que pode indicar que a atividade destes reguladores também é controlada em algum grau pelo fator σC. 106 Figura 26. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002 (ΔsigC) exposta à plumbagina 15µM, em meio MQD. Os gráficos foram plotados com auxílio do software REST2009 (Pfaffl et al., 2002).. (A) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento I. (B) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento I. (C) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento II. (D) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento II. 107 Figura 27. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis 1002(wt) e (ΔsigC) expostas à plumbagina 15µM, em meio MQD. Os gráficos foram plotados com auxílio do software REST2009 (Pfaffl et al., 2002). (A) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento I. (B) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento I. (C) Níveis transcricionais referentes a 15 minutos de estresse – Experimento II. (D) Níveis transcricionais referentes a 60 minutos de estresse – Experimento II. 108 5.11. Análise de proteínas diferencialmente expressas na linhagem mutante para o fator σC exposta à plumbagina Como mostrado anteriormente, a linhagem 1002(ΔsigC) se destaca pela sua maior suscetibilidade a agentes geradores de estresse oxidativo do que a selvagem parental 1002(wt) (item 5.6.). Além disso, ela apresenta várias desordens de metabolismo e alterações nos sistemas de comunicação com o meio extracelular e detoxificação (item 5.8). Nesse contexto, decidimos investigar quais mecanismos estão envolvidos na resposta da linhagem mutante para sigC ao estresse causado pela plumbagina. Para esta finalidade, 2D-SDS-PAGE foram realizados após a extração de proteínas citoplasmáticas de culturas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) expostas ou não à plumbagina (15µM). A análise dos géis utilizando o software ImageMaster nos permitiu identificar 27 spots diferencialmente expressos entre as condições avaliadas (Figuras 28 e 29), considerando 3 réplicas biológicas. Todos estes 27 spots foram mais expressos na linhagem mutante cultivada sob condição normal (Figura 28A). As proteínas relativas a 18 dos spots diferencialmente expressos foram identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS (Tabela 17), e suas funções e os processos nos quais elas estão envolvidas estão resumidos na Tabela 18. A seguir, discutimos algumas das características relacionadas a estas proteínas. Primeiramente, destacamos a proteína L5 (spot 19), que é componente do complexo 5S rRNA-proteínas, um domínio estrutural autônomo e essencial para o correto funcionamento do ribossomo. Em E. coli a L5 está localizada na parte superior da protuberância central da subunidade ribossômica 50S, participando diretamente da montagem do ribossomo (Korepanov et al., 2012). Experimentos nesta bactéria demonstraram que a L5 é extremamente importante para a manutenção da viabilidade celular (Korepanov et al., 2007). Outra proteína identificada que é parte da estrutura ribossomal é a S2 ribossomal 30S (spot 28). Além das duas proteínas apresentadas, destacamos a identificação de uma proteína de tRNA denominada tRNA treonil carbamoil adenosina, cuja ausência pode prejudicar maturação dos ribossomos (Yacoubi et al., 2009). A proteína ParB (spot 10) é componente de complexos de nucleoproteínas que participam do evento de segregação cromossômica em bactérias (Gerdes et al., 2010). Foi descrito que a depleção de ParB (assim como a de seu cognato ParA) pode afetar a citocinese, o crescimento, a morfologia e a motilidade celular (Mohl et al., 2001; Bartosik et al., 2009; Lasocki et al., 2007). A timidilato sintase (spot 1) é uma enzima que cataliza a metilação redutiva da deoxiuridina monofosfato (dUMP) para a síntese de deoxitimidina monofosfato (dTMP), sendo importante para o metabolismo dos nucleotídios. Foi demonstrado que a baixa atividade da timidilato sintase pode dificultar o processo de replicação e reparo do DNA (Ahmad et al., 1998). Há ainda indícios de que, em S. aureus, a atividade do gene thyA (que codifica para esta enzima) pode ser importante 109 para a expressão de diferentes genes necessários à virulência deste patógeno, como agr (gene regulador acessório), hla (que codifica a alfa toxina) e spa (que codifica a proteína A) (Chatterjee et al., 2008). Outras duas das proteínas identificadas também estão envolvidas no metabolismo dos nucleotídios: a deoxiuridina 5-trifosfato nucleotidiohidrolase (spot 31) e a ribose 5-fosfato isomerase B (spot 30). Curiosamente, nos nossos experimentos com RNAseq (item 5.8) o gene codificador desta última enzima apresentou expressão reduzida no mutante para sigC, em comparação com 1002(wt) (Tabela 16). Como já discutido anteriormente, as proteínas que contém cofatores Fe-S são cruciais para o funcionamento das células procarióticas (Kiley e Beinert, 2003; Johnson et al., 2005). Estes cofatores conferem às proteínas funções diretamente envolvidas nas cadeias de transferência de elétrons, vias metabólicas e biossintéticas, na modificação de RNA e reparo do DNA (RinconEnriquez et al., 2008). Os átomos de enxofre dos grupos Fe-S são obtidos a partir da L-cisteína, como resultado da ação da cisteína desulfurase (CsdA), proteína identificada no nosso exprimento (spot 20). A ação desta enzima degrada a L-cisteína em L-alanina e sequestra o átomo de enxofre liberado sob a forma de persulfato, que é então transferido diretamente para o cofator Fe-S (Py & Barras, 2010). As ROS podem inativar os cofatores Fe-S através da oxidação, ocasionando a disponibilização de íons Fe2+ para a reação de Fenton. Desta maneira, radicais hidroxila altamente reativos são produzidos e podem reagir com os componentes celulares presentes nas proximidades, como o DNA (Py & Barras). Acreditamos que a redução na expressão da CsdA na linhagem 1002(ΔsigC) sob estresse (Figura 29, spot 20) possa contribuir para a redução dos efeitos causados pelas ROS, uma vez que menos cofatores Fe-S estarão disponíveis para a oxidação. Outra enzima identificada no experimento é a cisteína sintase (spot 6), que participa da síntese de cisteína, um aminoácido que desempenha funções vitais na estrutura e atividade catalítica de várias proteínas. Os resíduos de cisteína são fundamentais para a formação de proteínas ligadas aos cofatores Fe-S, dentre as quais podemos destacar os citocromos envolvidos na fosforilação oxidativa (Beinert et al., 1999). Além disso, este resíduo é importante para a atividade das moléculas glutationa e tioredoxina, as quais desempenham funções importantes para a manutenção de um ambiente intracelular redutor e a neutralização dos efeitos causados pelo estresse oxidativo (Carmel-Harel & Storz, 2000). Podemos ainda citar a importância da formação de pontes dissulfeto (propiciadas pelas cisteínas) para a atividade de reguladores transcricionais como o OxyR e de chaperoninas como a Hsp33 (Zheng et al., 1998; Jakob et al., 1999). Também identificamos a enzima manose-1-fosfato guaniltransferase (spot 2) no nosso experimento, a qual atua na etapa final de biossíntese da manose no citoplasma celular (Misha et al., 2012). A manose é um constituinte essencial para várias glicoproteínas e glicolipídios de micobactérias e corinebactérias, podendo atuar também na regulação da formação de septos e na 110 divisão celular bacteriana. Os componentes da parede celular Lipoarabinomanano (LAM) e Lipomanano (LM) também possuem manose (Jackson & Brennan, 2009; Mishra et al., 2011; Patterson et al,2003). A citrato sintase (spot 13) é uma enzima que catalisa a condensação entre acetil-coenzima A e oxaloacetato, dando origem ao citrato no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Por ocupar uma posição central no TCA, a citrato sintase atua como um ponto de controle importante para a determinação da taxa metabólica da célula. Trabalhos demonstram que os níveis de citrato sintase podem ser suprimidos pela glicose e em condições de anaerobiose, enquanto que se elevam na presença de oxigênio e acetato (Park et al., 1994). O fator de integração no hospedeiro (IHF) (spot 18) é uma proteína relacionada a uma ampla variedade de processos celulares, como aqueles envolvidos no controle da expressão gênica, no metabolismo do DNA e na patogênese (Freundlich et al., 1992; Goosen et al., 1995; Mahan et al., 1993). Foi sugerido que o IHF atua na regulação de genes requeridos para o estabelecimento da fase estacionária de crescimento em bactérias (Hengge-Aronis et al., 1996). O IHF de C. pseudotuberculosis é ortólogo ao fator de integração no hospedeiro de M. tuberculosis (Mihf). A chaperonina GroES (spot 4) também se encontra dentre as proteínas identificadas. As funções das chaperoninas foram descritas no item 5.5. A GroES é uma co-chaperonina de GroEL, com a qual forma um sistema essencial para o modelamento de várias proteínas bacterianas (Hartl et al., 2011; Chen et al., 2013). Interessantemente, mostramos em um experimento anterior (item 5.4.1) que a GroEL é expressa em maior quantidade na linhagem mutante para o fator sigH do que na linhagem selvagem 1002(wt). Nesse contexto, é mantida a possibilidade de que a expressão de GroEL seja regulada pelo fator σ C, uma vez também que os experimentos de RNAseq (item 5.8) indicaram que o gene codificador desta chaperonina é mais expresso na linhagem 1002(wt) do que na linhagem mutante para o gene sigC. Finalmente, a avaliação do perfil proteômico diferencial de C. pseudotuberculosis submetida à plumbagina nos forneceu claros indícios de redução da atividade metabólica sob esta condição, sendo principalmente prejudicados processos envolvidos na tradução gênica, na utilização de fontes de energia, na regulação da biossíntese de diferentes compostos celulares, e na detoxificação de ROS e neutralização dos efeitos causados por estas na célula. Quando consideramos os efeitos causados pela plumbagina sobre o proteoma da linhagem selvagem 1002(wt) submetida à mesma condição de estresse, o que foi apresentado no item 5.5, torna-se evidente o fato de que o fator σC é fundamental para a ativação direta ou indireta de uma ampla gama de processos que contribuem para a coordenação da resposta ao estresse oxidativo. 111 Figura 28. Proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina (15µM). (A) Spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) não exposta a plumbagina. (B) Spots referentes as proteínas citoplasmáticas de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta a plumbagina. A diferença de expressão foi significativa para vinte e sete spots, de acordo com o teste ANOVA<0.05. Os números seguidos dos traços verdes indicam os spots menos expressos e os números seguidos dos traços vermelhos indicam os spots mais expressos em cada condição avaliada. Para a primeira dimensão foram utilizadas tiras de 24cm (pH 3-10) e para a segunda dimensão um gel SDS-PAGE 12%. O marcador de peso molecular (GE Helthcare) está indicado à esquerda. 112 Figura 29. Visualização dos vinte e quatro spots correspondentes as proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina (15µM). As análises foram realizadas com três replicas experimentais através do programa ImageMaster 2D Platinum, considerando o teste ANOVA<0.05 e o fold change>1.2. As linhas identificadas como ΔsigC-N indicam os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da condição sem Plumbagina e as linhas identificadas como ΔsigCPlb indicam os spots referentes as proteínas citoplasmáticas da condição com Plumbagina. Os quadrados realçados em verde são referentes aos spots menos expressos na condição avaliada e aqueles realçados em vermelho são referentes aos spots mais expressos na condição avaliada. 113 Tabela 17. Proteínas citoplasmáticas identificadas por espectrometria de massa MALDI-TOFMS/MS, após análise de expressão diferencial na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina. Nº do spot Genes ADL Gi Proteínas identificadas 1 thyA 20525 384504233 Thymidylate synthase 2 manC 20396 384504102 Mannose-1-phosphate guanyltransferase 3 ywlC 20726 384504438 tRNA threonylcarbamoyladenosine biosynthesis Protein 4 GroES 20318 384504020 Chaperonin 6 cysK 21566 384505290 Cysteine synthase 7 pepC 20923 384504640 Aminopeptidase 2 8 dapC 20662 384504371 N-succinyldiaminopimelate aminotransferase 10 parB 21959 384505689 Chromosome partitioning protein ParB 13 gltA 20497 384504207 Citrate synthase 17 tcsR4 20553 384504261 Two component system response regulator 18 mihF 21010 384504729 Integration host factor MihF 19 rplE 20267 384503968 50S ribosomal protein L5 20 csdA 20972 384504691 Cysteine desulfurase (SufS)-like protein 28 rpsB 21188 384504908 30S ribosomal protein S2 29 Cp1002_1242 21124 384504847 Hypothetical protein Cp1002_1242 30 rpiB 21475 384505197 Ribose 5-phosphate isomerase B 31 dut 21084 384504806 Deoxyuridine 5-triphosphate nucleotidohydrolase 33 pckG 21799 384505527 Phosphoenol pyruvate carboxykinase Nº do spot correspondente ao número do spot da Figuras 30 e 31. ADL: identificação de locus gênico (NCBI); gi: número de identificação das proteínas através do MASCOT (homologia p<0,05); Média de números de peptídeos identificados: 2,6 Expressão diferencial: Teste ANOVA<0,05 e fold change>1,2. 114 Tabela 18. Classificação das proteínas citoplasmáticas diferencialmente expressas na linhagem de C. pseudotuberculosis 1002(ΔsigC) exposta ou não à plumbagina, de acordo com funções e processos do Blast2go. Descrição das proteínas Thymidylate synthase Funções Atividade transferase Mannose-1-phosphate guanyltransferase Atividade transferase Atividade de fator traducional Ligação ao ácido nucléico ND tRNA threonylcarbamoyladenosine biosynthesis protein Chaperonin Cysteine synthase Aminopeptidase 2 N-succinyldiaminopimelate aminotransferase Chromosome partitioning protein Citrate synthase Two component system response regulator Integration host factor 50s ribosomal protein l5 Cysteine desulfurase 30s ribosomal protein s2 Hypothetical protein cpfrc_01249 Ribose-5-phosphate isomerase b Deoxyuridine 5 -triphosphate nucleotidohydrolase Phosphoenolpyruvate carboxykinase Ligação ao nucleotídeo Ligação Atividade catalítica Atividade transferase Atividade de peptidase Ligação Ligação Atividade transferase Ligação ao DNA Atividade transferase Ligação ao DNA; Atividade sinalizadora para regulador transcricional Atividade transdutora ND Atividade de molécula estrutural Ligação ao RNA Ligação Atividade catalítica Atividade transferase Atividade de molécula estrutural ND Atividade catalítica Atividade hidrolase Ligação Atividade quinase Ligação ao nucleotídeo Atividade catalítica Processos Biossíntese Metabolismo de ácidos nucléicos Metabolismo Tradução ND Metabolismo de proteínas Biossíntese Metabolismo de proteínas Catabolismo Biossíntese ND Biossíntese de precursor de metabólitos e energia Catabolismo Metabolismo dos carboidratos Transdução de Sinal Regulação de processos biológicos ND Tradução ND Tradução ND Metabolismo de carboidratos Biossíntese Biossíntese Metabolismo de carboidratos Metabolismo ND:Não Determinado 115 6. CONCLUSÕES Os resultados obtidos com o presente estudo representam um significativo avanço para a compreensão da regulação gênica em C. pseudotuberculosis, contribuindo especialmente para o melhor entendimento do papel dos fatores sigma alternativos na adaptação ao estresse oxidativo nesta bactéria. Considerando as diferentes abordagens experimentais utilizadas, destacamos a seguir as principais conclusões de cada uma das partes apresentadas no item 5 deste manuscrito. 6.1. PARTE I Os genes codificadores dos fatores σH e σC de C. pseudotuberculosis 1002(wt) se destacaram como os mais frequentemente ativados quando a bactéria é exposta ao estresse oxidativo; A linhagem 1002(wt) de C. pseudotuberculosis exposta ao estresse oxidativo pode apresentar: (I) redução na produção de chaperoninas e porfirinas; (II) alterações no sistema de comunicação intercelular; (III) alterações na síntese de moléculas importantes para a parede celular, adesão e interação com o hospedeiro; e (IV) aumento da atividade enzimática na via glicolítica. 6.2. PARTE II As linhagens 1002(ΔsigC) e 1002(ΔsigH) de C. pseudotuberculosis são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que a linhagem 1002(wt) e as demais linhagens mutantes para os genes codificadores de fatores sigma alternativos; A inativação do fator σC de C. pseudotuberculosis pode ocasionar: (I) redução da atividade ribossomal e do metabolismo energético e de aminoácidos; (II) prejuízos no transporte e secreção de moléculas através do envelope celular; (III) redução da expressão de genes que codificam enzimas relevantes para a neutralização de ROS, bem como para os efeitos causados por estas sobre diversos componentes celulares; e (IV) redução da expressão de genes que codificam fatores de virulência descritos para outras bactérias; A linhagem 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis mostrou ser menos virulenta que a selvagem parental 1002(wt) em modelo de infecção com o nematódeo C. elegans. 116 6.3. PARTE III A expressão dos genes sigB e sigH é ativada quando a linhagem 1002(ΔsigC) é exposta ao estresse oxidativo, embora possamos sugerir que a expressão de sigH - assim como a de sigK e sigM - é estimulada pelo fator σC ; A linhagem 1002(ΔsigC) de C. pseudotuberculosis submetida ao estresse oxidativo apresentou redução da atividade metabólica, sendo principalmente prejudicados os processos envolvidos na tradução gênica, na utilização de fontes de carbono, na regulação da biossíntese de compostos celulares, e na detoxificação de ROS e neutralização dos efeitos causados por elas. 117 7. PERSPECTIVAS As principais persperctivas para a sequência deste trabalho são: Analisar as sequências promotoras a montante dos genes mais expressos na linhagem 1002(wt) em relação à linhagem 1002(ΔsigC); Clonar as sequências promotoras identificadas a montante da ORF codificadora de GFP no plasmídio promoterless pSM20, com o intuito de avaliar a indução diferencial da produção deste marcador nas linhagens 1002(ΔsigC) e 1002(wt) expostas a diferentes condições de estresse in vitro; Realizar experimentos de imunoprecipitação do fator σC seguida de sequenciamento de RNA (ChIP-seq) para validação dos genes diretamente regulados por este fator transcricional; Analisar o transcriptoma diferencial das linhagens 1002(wt) e 1002(ΔsigC) expostas ao estresse oxidativo in vitro. 118 8. REFERÊNCIAS ABDUL-MAJID, KB.; LY, L.H.; CONVERSE, P.J.; GEIMAN, D.E.; MCMURRAY, D.N., BISHAI, W.R. 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This pathogen mainly affects small ruminants, causing caseous lymphadenitis (CLA), but it also infects bovines, equines, pigs, deer, camels and humans, showing its zoonotic relevance. Phospholipase D (PLD) and the toxic lipid cell wall are the two most wellstudied virulence factors of this bacterium. They are responsible, in part, for the establishment of disease in the host. Current knowledge on the immunity induced by C. pseudotuberculosis indicates that the resistance to infection is a complex process involving components of both the non-speciic and speciic host responses, in which humoral and cellular immune responses are both operative. Despite this knowledge and the importance of the disease, a satisfactory vaccine model for sheep and goats has not been developed. Moreover, a control program that includes an eficient diagnostic method in addition to vaccination is crucial for avoiding the spread of bacteria inside locks. Further, because of its zoonotic potential, C. pseudotuberculosis infection of animals can contaminate meat and milk, putting consumers at risk. The ability of C. pseudotuberculosis to infect both animals and humans makes studies on prevention and diagnosis of this pathogen important. Keywords: Corynebacterium pseudotuberculosis; Caseous lymphadenitis; Immunology; Zoonotic potential; Vaccine; Phospholipase D; Diagnosis Introduction he genus Corynebacterium is classiied into the suborder Corynebacterineae (Actinobacteria: Actinomycetales), which includes the families Corynebacteriaceae, Mycobacteriaceae and Nocardiaceae (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy), commonly designated as the CMN group. Some characteristics common to this group include the organization of the cell wall, which is composed mainly of peptidoglycan, arabinogalactan and mycolic acids, as well as the high guanine-cytosine (G + C) content of the genome (47-74%) [1]. he CMN group comprises species of signiicant medical, veterinary and biotechnological interest, and thus has an important socioeconomic role. For example, the CMN group includes the species Mycobacterium tuberculosis and M. leprae, the etiologic agents of tuberculosis and leprosy, respectively. Within the genus Corynebacterium, there has been a signiicant expansion in the number of described species in the last decade due to increased concern regarding their potential pathogenic signiicance. he species that are of major clinical relevance are Corynebacterium diphtheriae, C. jeikeium and C. pseudotuberculosis, which are the causative agents of diphtheria, nosocomial infections in humans and caseous lymphadenitis (CLA) in goats and sheep, respectively [1-3]. C. glutamicum is used in the production of amino acids such as L-aspartate and L-lysine [4], and C. ulcerans causes pathologies in both humans and animals [5]. Most studies mainly report the incidence of C. pseudotuberculosis infection in small ruminants. Afected animals have characteristic abscesses in the lymph nodes, mainly in the parotid or retropharyngeal and/or viscera [6]. However, some infected sheep may have only internal abscesses, which are oten present in the lungs or mediastinal lymph nodes, and show no major outward signs of infection [7]. his J Clin Cell Immunol pathogen has a broad spectrum of hosts and causes clinical disease in cattle, horses, pigs, deer, camels and laboratory animals [8]. According to the World Animal Health Organization, among the 201 countries that described their sanitary conditions, 64 reported animals with CLA within their borders in 2009 [9]. Although human cases of infection are relatively rare, some case reports note the potential risks of infection of veterinarians and farm practitioners [10]. In this review, we present the general characteristics and virulence factors of C. pseudotuberculosis related to its immunopathogenesis, the response of the immune system, aspects associated with resistance to infection in animal models and diagnostics. We also discuss the zoonotic potential of the bacteria, presenting an update on human infections by C. pseudotuberculosis. Finally, we suggest guidelines for future research. General Characteristics of Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of CLA, which mainly afects populations of small ruminants throughout the world and generates signiicant economic losses [11]. his bacterium was irst described in 1888 by a French veterinarian, Edmound Nocard, *Corresponding author: Vasco Azevedo, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais. Avenida Antonio Carlos, 6627, Pampulha, Belo Horizonte, Brazil, 31270-901, Tel: 55 31 3409-2610; E-mail: [email protected] Received November 11, 2011; Accepted February 06, 2012 Published February 11, 2012 Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/21559899.S4-005 Copyright: © 2012 Bastos BL, et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 2 of 15 in a case of lymphangitis in cattle. In 1891, Hugo von Preisz isolated a similar bacterium in a renal abscess in sheep. Hence, the pathogen was named “Preisz-Nocard” bacillus, the name with which it was linked for decades thereater. In Australia, which is currently the country with the second largest sheep lock in the world, CLA was irstly described in 1934 by Churchward [8,12,13]. he current nomenclature was adopted in 1948 in the sixth edition of Bergey’s Manual; however, the designation C. ovis was used synonymously. C. pseudotuberculosis is characterized as a Grampositive facultative intracellular pathogen that displays pleomorphic forms, ranging from coccoid to ilamentous rods and measures approximately 0.5-0.6 µm in width and 1.0-3.0 µm in length. hese bacteria do not have a capsule or lagella and they do not sporulate; however, imbriae are present. he cell-wall peptidoglycan appears to be based on meso-diaminopimelic acid (meso-DAP), and the sugars arabinose and galactose are present in large quantities. Short chains of mycolic acid have also been found [14-16]. C. pseudotuberculosis is a mesophilic facultative anaerobic organism, and its optimum growth conditions are at 37ºC with pH values ranging between 7.0 and 7.2 [12,17]. However, according to Batey [18], C. pseudotuberculosis can grow well in a pH range of 7.0 to 8.0. C. pseudotuberculosis is a demanding organism from a nutritional standpoint, growing well on enriched media such as blood agar, brain heart infusion (BHI) agar or broth or enriched medium with animal serum. Its cultivation improves when BHI is complemented with yeast extract, tryptone or lactalbumin [19]. Its growth in a solid culture medium is initially sparse on an agar surface and then becomes organized in clumps or in palisades, taking on a cream to yellowish coloration. Colonies are dry, opaque and concentrically ringed, and ater several days of incubation, colonies can reach 3 mm in diameter [20]. When grown in blood agar, it is possible to detect beta-hemolysis ater a period of 48 to 72 hours of incubation [19,20]. Growth in liquid medium occurs as a bioilm on the surface, without medium clouding. his ilm is dismantled by agitation, forming lakes that precipitate [17,21]. he ilm formation is attributed to surface lipids, and the amount of these lipids in the cell membrane is directly correlated with the thickness of the bioilm and the virulence of the bacterial strain [22]. Some authors have reported better growth in an atmosphere of 5% CO2 [12,21]. Recently, a chemically deined medium (CDM) for C. pseudotuberculosis cultivation composed of dibasic phosphate, vitamins and amino acids was developed. his medium is free of macromolecules in its composition, allowing researchers to obtain the complex antigenic solution composed only of secreted/ excreted bacterial proteins, which would aid studies on this bacterium [23]. his CDM has been recently used with success to obtain pure secreted antigens for an exoproteome analysis of C. pseudotuberculosis [24]. Biochemically, C. pseudotuberculosis is characterized by the production of catalase, phospholipase D, and urease and by the fermentation of carbohydrates such as maltose, mannose, glucose, and galactose (the latter is used only occasionally) [17]. It does not perform lactose fermentation or gas production [21,25-27], has no proteolytic activity, does not have the ability to hydrolyze gelatin or digest casein and is oxidase negative [17,20]. It has been suggested that there are two biotypes of these bacteria based on the production of nitrate reductase, demonstrated by analysis with restriction enzymes. he reduction of nitrate to nitrite characterizes strains that infect mainly horses (biovar equi) and present sensitivity to streptomycin, while the strains that J Clin Cell Immunol infect goats and sheep (biovar ovis) are mainly nitrate negative and resistant to streptomycin [27,28]. Cattle are infected by both reducing and non-reducing nitrate strains [25,26]. Antigens and Virulence Factors Compared to other pathogenic bacteria, few studies have investigated the virulence determinants of C. pseudotuberculosis. However, an understanding of the molecular mechanisms and the genetic basis of virulence in C. pseudotuberculosis has rapidly improved. Two virulence determinants of C. pseudotuberculosis have been well characterized: the exotoxin PLD and the toxic lipid cell wall. PLD hydrolyzes phosphatidylcholine and sphingomyelin from mammalian cell membranes, resulting in the formation of choline and ceramide phosphate [29-31]. Biologically, this exotoxin works as a permeability factor that promotes the dissemination of the pathogen from the initial site of infection to all the body tissues of the host. Additionally, PLD causes the dermonecrosis of endothelial cells, which contributes to the passage of C. pseudotuberculosis from the dermis to small blood vessels, thereby gaining access to lymphatic vessels [32,33]. Further, PLD is considered a cytotoxic exotoxin for white blood cells, as it promotes the destruction of goat macrophages during experimental infection [34]. Studies using speciic anti-PLD antibodies have demonstrated that this exotoxin is essential to the spread of C. pseudotuberculosis, as the use of this antibody prevents its spread. In addition, the vaccination of goats with inactivated exotoxin is able to prevent the spread of the bacteria ater experimental challenge [35]. he role of PLD as a virulence determinant of C. pseudotuberculosis was demonstrated by the generation of pld-mutants. he mutant was unable to spread but did induce an immune response. However, these results suggest that the use of this mutant as a live vaccine model for CLA would be insuicient [36]. he spread of bacteria by the action of PLD can be explained by its induction of dermonecrosis, which causes direct damage to endothelial cells. During hydrolysis, PLD is able to work synergistically with cholesterol oxidase and phospholipase C, which are both, produced by Rhodococcus equi, and causes the β-hemolysis of sheep erythrocytes when cultured in blood agar. he phosphate ceramide generated, in turn, is hydrolyzed by phospholipase C of R. equi, producing ceramide [14,30]. In addition to the degradation of sphingomyelin to ceramide, PLD is also able to activate the complement system through the alternative pathway, although the exact mechanism is not well understood [37]. A 40-kDa protein from C. pseudotuberculosis that was previously identiied as a protective antigen against ovine CLA [38] was further investigated. Molecular and biochemical characterization revealed that this protein is a 379 amino acid protein encoded by an open reading frame of 1,137 bp. No signiicant homology with previously published DNA or amino acid sequences in the databases was found, suggesting that this is a novel protein. hus, the recombinant 40-kDa protein was over-expressed in E. coli for the biochemical analysis of the native and the recombinant 40-kDa proteins. he protein was found to be a serine protease with proteolytic activity and was designated corynebacterial protease 40 (CP40) [39]. Other antigens from both the secreted and somatic fractions were identiied by an immunoblotting analysis. One study used the serum of naturally infected sheep for immunoblotting to identify antigens from sonicated C. pseudotuberculosis and found eleven antigens with the following molecular weights: 20 kDa, 22.4 kDa, 31.6 kDa, 35.5 kDa, 36.3 kDa, 39.8 kDa, 45.7 kDa, 56.2 kDa, 63.1 kDa, 79.4 kDa and 100 Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 3 of 15 kDa. When the analyses were performed with secreted antigens from the culture supernatant, antigens with the following molecular weights were found: 20 kDa, 25.1 kDa, 31.6 kDa, 39.8 kDa and 63.1 kDa [40]. A previous immunoblotting analysis with sera from experimentally infected goats on secreted antigens from bacterial culture supernatants revealed antigens with the following molecular weights: 16, 20, 27, 30, 36, 40, 43, 58, 64, 68 and 125 kDa [41]. he introduction of more advanced technologies such as mass spectrometry (MS) has brought new perspectives to the study of bacterial secreted/excreted proteins. A comparative exoproteome analysis of C. pseudotuberculosis was recently performed using a highthroughput proteomic strategy based on liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). his study investigated the proteins that are exported from the bacteria, which might represent key components of the host-pathogen interplay. Ninety-three diferent extracellular proteins of C. pseudotuberculosis were identiied with high conidence using this strategy; 44 proteins were commonly identiied in two diferent strains that were isolated from distinct hosts, thus composing the core of the C. pseudotuberculosis exoproteome. his study generated a catalog of exoproteins, in which novel targets for future work on C. pseudotuberculosis molecular determinants of virulence can be identiied [24]. As C. pseudotuberculosis is classiied in the Actinomycetales order, it shares some common characteristics with this group. C. pseudotuberculosis has a signiicant amount of lipids in its cell wall called corynomycolic acids, and they are similar to the mycolic acids in M. tuberculosis cell walls. hese surface lipids have long been described as important factors for the pathogenesis of the disease, as virulent strains have more lipids than attenuated strains, and there is a direct relationship between the percentage of surface lipids and chronic abscesses [21]. his lipid layer protects against proteolytic enzymes present in phagolysosomes, allowing the microorganism to adhere, thereby promoting local cytotoxicity. he toxicity of the extracted lipid material was demonstrated by the induction of hemorrhagic necrosis ater intradermal injection into guinea pigs [22,42,43]. Recently, four genes within an operon that is involved in iron acquisition, designated fag A, B, C and D, were shown to have an important role in the virulence of C. pseudotuberculosis [44]. Recent advances in the understanding of pathogenicity pathways used by C. pseudotuberculosis in the infection process have been achieved through complete genome sequencing [45]. A C. pseudotuberculosis strain (FRC41) isolated from a 12-year-old girl with necrotizing lymphadenitis was completely sequenced and assembled, yielding the identiication of speciic gene sets associated with a variety of metabolic and pathogenic bacterial functions. Two gene clusters encoding proteins involved in the sortase-mediated polymerization of adhesive pili were found, and these proteins likely mediate the adherence to host tissue, thereby facilitating additional ligand-receptor interactions and the delivery of virulence factors. In addition, the prominent virulence factors PLD and CP40 were found in the genome of this human isolate. he genome also revealed additional serine proteases, neuraminidase H, nitric oxide reductase, an invasion-associated protein, and acyl-CoA carboxylase subunits involved in mycolic acid biosynthesis as potential virulence factors [46]. he genetic characterization of two strains of C. pseudotuberculosis from goat (Cp1002) and sheep (CpC231) using a predicted genome analysis contributed new information on genome evolution and lateral acquisition of virulence functions. C. pseudotuberculosis was J Clin Cell Immunol compared with other Corynebacterium species, revealing that this pathogenic species has lost numerous genes, resulting in one of the smallest genomes in the genus. Other diferences found were a lower GC content (approximately 52%) as well as a reduced gene repertoire. hese characteristics suggest adaptations that give the bacteria its pathogenesis. In addition, seven putative pathogenicity islands were found in its genome that contain several classical virulence factors, including genes for imbrial subunits, adhesion factors, iron uptake and secreted toxins [9]. Immunopathogenesis of CLA he progression of CLA in sheep and goats starts as primary wound infection, with lymphatic and hematogenous dissemination, followed by secondary infection of the lymph nodes and various visceral organs. his is followed by the elimination or containment of infection, the latter presenting as characteristic caseous lesions. he steps of infection have been separated into the following phases: an initial phase (day 1–4 p.i.), characterized by the recruitment of neutrophils to the inoculation site and the draining of the lymph nodes; an ampliication phase (day 5–10 p.i.), characterized by the development of pyogranuloma; and a stabilization phase, characterized by the maturation and persistence of the pyogranuloma [47]. Bacterial factors, including PLD and cytotoxic lipids, contribute to pathogenesis at a local level but have little efect on the systemic disease. Ater C. pseudotuberculosis is captured by phagocytic cells such as neutrophils and macrophages, the phagosome fuses with the lysosome, forming the phagolysosome [28]. However, C. pseudotuberculosis is a facultative intracellular pathogen that is capable of surviving within macrophages for more than 48 hours. During that time, bacteria are released as a result of a process that leads to phagocyte death, although this property varies among diferent strains. he speciic mechanisms of cell death caused by C. pseudotuberculosis are still unclear, as it does not induce the autophagy or apoptosis of macrophages. his has been demonstrated in murine macrophage cell lines, as evidenced by stable levels of microtubule-associated protein I light chain 3 (MAP-I LC3) activity and caspase-3 activity and an absence of nuclear fragmentation in infected macrophages [48]. he bacteria survive within macrophages because some macrophages cannot produce nitric oxide in response to C. pseudotuberculosis in vivo, which results in inefective clearing of the organism [49]. hese efects might be associated with the outer lipid layer in the cell wall of C. pseudotuberculosis and other antigenic components that attenuate the production of nitric oxide by macrophages. As a result of the uncontrolled bacterial growth within macrophages, the host attempts to restrain and limit the infection through the formation of pyogranulomas, which are characterized by the encapsulation of the C. pseudotuberculosis infected cells. he formation of pyogranulomas is dependent on adaptive immunity, which is a complex process in the case of infection by C. pseudotuberculosis that involves both humoral and cell-mediated immunity [28,50]. Immunohistochemical studies on the cellular composition of the pulmonary lesions in sheep infected by C. pseudotuberculosis have revealed a predominance of large macrophages that express major histocompatibility complex (MHC) class II molecules on their surfaces in the abscess walls and surrounding lung parenchyma. T lymphocytes were prominent in the same areas within the naturally occurring lesions, with a CD4+ T cell to CD8+ T cell ratio of 3.5:1. B lymphocytes and granulocytes comprised a minor portion of the iniltrating cells. hese data revealed the participation of macrophages and MHC class II-restricted T lymphocytes in the pathogenesis of CLA [51]. Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 4 of 15 Another immunohistochemical study revealed more features of the pyogranuloma cellular makeup. Lymphocytes localized to the inside of the collagen capsule were found to be in close contact with necrotic tissue and were organized into three layers. he innermost layer, which is immediately adjacent to the central necrotic tissue, consists of a narrow band of MHC class II-macrophages. CD4+, CD8+ and gamma delta T cells were unevenly distributed throughout the lymphoid layer, tending to be more numerous immediately peripheral to the macrophage layer. he intracapsular lymphoid tissue contained a high proportion of CD8+ lymphocytes (CD4:CD8, 1.5:1) and gamma delta lymphocytes (CD4:CD8: gamma delta, 1:0.7:0.8). However, in contrast to the previous immunohistochemical study, CD8+ and gamma delta+ T cells were found to be more abundant than CD4+ T cells [52]. Recent studies have clariied the cellular makeup of pyogranulomas. In an experimental pyogranuloma induced in lambs infected with C. pseudotuberculosis, three diferent monoclonal antibodies were used to characterize the presence of macrophages in situ and demonstrated that macrophages are the predominant cells in pyogranulomas [53]. Further immunohistochemical experiments on the cellular composition of 46 experimentally induced pyogranulomas in sheep also demonstrated that lesions localized to inoculation sites or draining lymph nodes consisted of macrophage and lymphocyte layers distributed around the necrotic center, surrounded by a ibrous capsule. However, the most signiicant observation from this work was that in immature lesions, CD4+ T cells were most predominant, whereas in mature lesions, the proportions of CD8+ T lymphocytes and gamma/delta receptor-expressing cells increased. In addition, this study found that many pyogranuloma cells expressed the interleukin-2 receptor, and a large individual variability in the proportions of macrophage and T cell subsets was observed in lesions at the same maturation point, with particular discrepancies in the number of epithelioid macrophages. his heterogeneity suggests that there are diferent cellular patterns based on the persistence or elimination of bacteria by the host [54]. A recent study aiming to evaluate the outcomes in mice ater inoculation with four equine-origin C. pseudotuberculosis strains (slow and rapid-growing strains) demonstrated that the tropism for the liver, spleen, lungs, and mesenteric lymph nodes is distinct for each strain. Speciically for the liver, the histological lesions associated with rapidly growing strains included focally extensive unencapsulated areas of acute, massive coagulative necrosis of hepatocytes. hese areas had intralesional colonies of bacteria and variable portal hepatitis characterized by the accumulation of mononuclear and polymorphonuclear inlammatory cells. In contrast, the livers from mice inoculated with slow-growing strains had multiple discrete, randomly distributed foci of hepatocellular necrosis and neutrophilic hepatitis that were considerably less severe than the lesions in the mice inoculated with the rapidly growing strains [55]. In addition to the formation of pyogranulomas, infection with C. pseudotuberculosis leads to the formation of subcutaneously located abscesses that do not originate from primary lymph node lesions. However, some abscesses can be closely association with lymph nodes, and as a result of the tissue destruction associated with abscesses and the expanding nature of these lesions, micro-abscesses that are composed of multiple caseous lesions of 0.5–1.0 cm in diameter can occur. Microscopically, these encapsulated abscesses contain partially calciied pus arranged in a concentric lamellar structure [56]. J Clin Cell Immunol Resistance to C. pseudotuberculosis Resistance to infection by C. pseudotuberculosis is a complex process involving components of both the non-speciic and speciic host response, in which both the humoral and cellular immune responses are operative [28,57,58]. he importance of humoral mechanisms has been demonstrated by assessing numerous commercial and experimental vaccine trials, which include preparations based on inactivated cellculture supernatant or toxoids [59,60], bacterial cell-wall fractions [61,62], attenuated and killed bacteria [63,64], exotoxins and their subunits [34,65] or genetically modiied pathogens [66,67]. Advances regarding immunoprophylaxis have been made, and the use of these preparations reduces the number and size of granulomas in challenged animals. However, to adequately control infection, the activation of macrophages needs to be improved; indeed, many researchers are now focusing on the gamma IFN (IFN-γ) response. Early studies in mice evaluated the ability of levamisole to promote nonspeciic immunity to C. pseudotuberculosis infection. he enhanced nonspeciic resistance was demonstrated with a quantitative reduction in immunoglobulin levels; the levels of IgG2 and IgA were lower in mice pretreated with levamisole. his result suggested that cell-mediated immunity might play a more important role than humoral immunity in resistance to C. pseudotuberculosis infection [68]. he role of IFN-γ was irst demonstrated in experimental infections of mice deicient for the IFN-γ receptor with attenuated C. pseudotuberculosis mutants. he study found that the production of IFN-γ and the presence of its receptors were directly associated with the control of primary infection in mice [63]. Another important cytokine that controls primarily infections by C. pseudotuberculosis is tumor necrosis factor alpha (TNF-α) [63,69,70]. he administration of anti-TNF-α and anti-IFNγ-monoclonal antibodies (mAbs) increased bacterial proliferation in infected mouse organs, leading to the death of the animals. Further, the injection of anti-CD4 or anti-CD8 mAbs also resulted in signiicantly increased mortality and a marked suppression of IFN-γ production but had no efect on TNF-α production. herefore, endogenous TNF-α and IFN-γ may have addictive efects on the anti-corynebacterial defense in the early stage of infection and could be critical for the generation of resistance [69]. he same group also investigated the role of these cytokines during secondary C. pseudotuberculosis infection in mice. hey found that both TNF-α and IFN-γ are required for survival and the development of protective immunity. During secondary infection, the mice recovered 50% faster, suggesting the importance of these cytokines in activating macrophages. In this trial, the administration of anti-CD4 mAb alone or anti-CD4 plus anti-CD8 mAbs increased mortality, bacterial proliferation and reduced the production of these cytokines, while treatment with anti-CD8 mAb alone showed no efect on either the resistance to infection or cytokine production. In conclusion, these data suggest that CD4+ T cells, likely h1 T cells, play an important role in immunity against secondary C. pseudotuberculosis infection [71]. Another study on the innate immune response during the early course of infection revealed the participation of the complement system in the defense against C. pseudotuberculosis. Experiments demonstrated that the type 3 complement receptor (CR3) plays a key role in inlammatory cell recruitment during the course of infection. Indeed, the treatment of mice with an anti-CR3 mAb resulted in the unrestricted proliferation of bacteria in the spleen and livers and dramatically increased the mortality of the infected mice within Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 5 of 15 3 days of infection. A histological examination also revealed that mononuclear phagocytes did not migrate to the sites of bacterial multiplication, as evidenced by the inhibition of inlammatory cell migration and large numbers of bacteria in their organs. hese results revealed the importance of CR3 in the resistance against primary as well as secondary C. pseudotuberculosis infection in mice [72]. Although the previous results highlight the importance of T cellmediated immunity against the infection, some evidence has also indicated that the production of antitoxin may protect the host during secondary exposures to the pathogen [14,57]. In mice previously immunized with washed bacterial suspensions, the antitoxin was unable to prevent the formation of pus ater inoculation, despite the fact that the antitoxin was able to prevent the spread of infection from the site of inoculation to internal organs [57]. hese results were later reproduced in several experiments demonstrating that anti-PLD antibodies present in host blood before infection exert a protective efect by neutralizing the permeability induced by PLD, thereby hindering the dissemination of C. pseudotuberculosis to draining lymph nodes. Further, the antibodies reduced secondary spread and prevented lesion development [73]. As CLA afects sheep and goats, a vast number of studies have been performed in these species since the 1980s [28,50-54,62,74]. A groundbreaking study was conducted in sheep inoculated with attenuated and wild-type strains of C. pseudotuberculosis; the authors assessed the expression of cytokine mRNA during infection. his study revealed that at the site of experimental inoculation, the levels of the inlammatory cytokines TNF-α and interleukin-1β (IL-1β) were increased, and the expression of interleukin-4 (IL-4) was decreased. Further, the cytokines IL-2 and IL-4 were up-regulated. he highest expression of TNF-α, IL-2 and IFN-γ occurred at the seventh day post-inoculation, and the highest levels of IL-1β and IL-6 mRNA were detected 28 days ater inoculation. he levels of mRNA for IL1β, IL-6, IL-8, TNF-α and MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) were elevated in animals with granulomas in the draining lymph nodes. hese results suggested that the development of granulomas could be a consequence of the presence of h1 and h2 cells as well as the elevated production of cytokines such as IFN-γ, IL-2, IL-4, TNF-α and MCP-1. hese data suggest that granulomas constitute an important factor for limiting C. pseudotuberculosis infection [47]. Another study assessed the kinetics of IgG and IFN-γ production in Corynebacterium pseudotuberculosis primary infection in goats. he authors demonstrated that the patterns of IgG production varied between animals, but the maximum titers were detected between days 11 and 21 post infection (PI). he levels further declined until 140 days PI. Serological positivity was detected from days 6 to 11 PI, but not all individuals remained positive throughout the 20 weeks of follow-up, indicating that humoral immunity is not long lasting. he same work demonstrated the existence of two patterns of the IFN-γ response, one considered high and another considered medium/low. In general, IFN-γ production was observed as a short-lived primary response on day 5 PI for the animals of both groups and a strong secondary response starting on day 16 and declining from days 42 to 56 ater infection in the high response group. he ‘‘IFN-γ low producer’’ group exhibited only a short-lived peak on day 5 ater infection and thereater displayed no further signiicant antigen-speciic cell-mediated stimulation [50]. his wide variation in the proiles of IFN-γ production was recently conirmed in a large study of sheep and goats. hese diferences have necessitated the use of assays with low sensitivity for measuring J Clin Cell Immunol IFN-γ produced by peripheral leukocytes ater stimulus with C. pseudotuberculosis; nonetheless, the production of IFN-γ remains a highly speciic indicator of CLA [75]. he role of the innate immune system in C. pseudotuberculosis infection is currently under investigation, including the response proinlammatory cytokines and the acute phase protein. Previous studies in sheep have demonstrated an acute phase response during the initial phase of infection, with a signiicant increase in the concentrations of haptoglobin approximately 5 days PI [76]. A recent study conirmed the acute phase reaction of haptoglobin in CLA but also revealed that serum amyloid A (SAA) and α1 acid glycoprotein (AGP) were increased in an experimental model of CLA in sheep. he study also revealed the continued production of AGP during the transition to the chronic phase of the disease. hese data suggest that AGP may be a valuable quantitative marker of the level of pathogenesis in experimental studies of CLA as well as a useful biomarker of natural infection and of chronic conditions in sheep [74]. Another recent study demonstrated that sheep that did not develop clinical signs of CLA presented signiicantly elevated levels of haptoglobin during the acute phase of the disease compared to sheep that developed supericial abscesses. Although the exact participation of this protein in the defense against infection by C. pseudotuberculosis requires further investigation, this suggests that innate immune mechanisms contribute to the resolution of infection or resistance to the development of CLA pyogranulomas. Further, haptoglobin has been suggested as a promising candidate marker for the clinical progression of C. pseudotuberculosis infection in sheep [77]. Vaccine Models Tested for CLA Studies have shown that primary infection with viable bacteria induces strong protection against subsequent exposures. Indeed, ewes with primary infection did not develop lesions as a result of further exposure, whereas immune-naïve ewes developed numerous pyogranulomas at diferent sites. However, ewes with primary infection remained carriers of the bacterium as a result of primary inoculation [78,79]. A study conducted in alpacas conirmed this observation, showing that primary infection with a low dose of 1.1×103 CFU protected animals against a signiicantly higher dose of 9×108 CFU of C. pseudotuberculosis. he primary infected alpacas had a febrile response and abscesses at the inoculation site and regional lymph nodes; however, ater the challenge, the primary infected animals showed no supericial lesions, in contrast to the immune-naïve alpacas that developed severe disease characterized by fever and abscesses in regional lymph nodes. In addition, primary infected alpacas had a robust antibody response against a C. pseudotuberculosis cell wall antigen [61]. hese studies have encouraged scientists to create a vaccine model based on the use of killed bacterial cells, called bacterin. Killed C. pseudotuberculosis cells can theoretically mimic the primary infection, promoting immunoprotection without causing disease. A summary of data from studies published in the last 40 years on vaccine models is presented in Table 1, including the country of origin of the research, the animal model, the composition of the immunogens, the type of adjuvants used and the route of administration of the preparations. Killed bacteria have been used by many scientists as potential vaccines [59,62,8084]. he degrees of protection have varied among these studies, but a common feature is that the protective efects were only partial. he immunogens did not completely prevent the disease, but the clinical course was milder, with signiicantly lower numbers of granulomas in immunized animals compared to unvaccinated control animals. Another vaccine model uses the secreted exotoxins of C. Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 6 of 15 Reference Year of publication Country of origin Animal model Composition of the immunogens Type of adjuvants Route of administration [81] 1972 Australia Sheep Bacterins AP ----- [62] 1984 USA Sheep Bacterin or CW WOE IM [119] 1985 USA Mice Bacterin or CW MDP, TDM, BCG and Cpar IP [35] 1986 USA Goat Toxoid FIA SC [120] 1987 USA Sheep Bacterin ----- SC [82] 1988 Brazil Goat Bacterin AP ----- [121] 1989 Norway Goat Bacterin or toxoid Levamisole ----- [122] 1989 Norway Goat Bacterin + toxoid ----- ----- [123] 1990 USA Sheep / mice Bacterin MDP IM / IP [83] 1991 USA Sheep / goat Dried whole Cp cells MO + AA IM [40] 1991 USA Sheep CST BPA ----- [60] 1991 Australia Sheep Toxoid or bacterin + toxoid AH SC [124] 1991 Australia Sheep Toxoid or toxoid Cp + 5 Clostridial toxoids AH / Sodium selenate SC [125] 1991 Australia Sheep Varying concentrations of toxoid Cp + 5 Clostridial toxoids AH SC [96] 1991 Brazil Goat Bacterin or live attenuated Cp AP (bacterin) ID [36] 1992 Australia Sheep Toxminus Cp ----- SC [98] 1994 Australia Sheep Toxminus Cp or recombinant Toxminus Cp ----- OR [38] 1994 Australia Sheep 40-kDa antigen AH SC [84] 1996 USA Sheep / goat Bacterin MDP + MO IM [3] 1997 Australia Mice Live Cp aroQ mutant or live Cp pld mutant ----- IP [64] 1998 Australia Sheep Live Cp aroQ mutant or live Cp pld mutant ----- SC [59] 1998 Canada Sheep Glanvac® 6, Case-Vac® or bacterin MDP + MO (bacterin) SC / IM [91] 1998 USA Sheep Bacterin + toxoid AH SC [65] 1999 Australia Sheep Glanvac 6 or recombinant Glanvac® 6 MA SC [126] 2000 German Goat CW ----- ----- [127] 2000 Australia Sheep Toxoid Cp + 5 Clostridial toxoids AH / Moxidectin SC [97] 2002 Brazil Goat Liophilized live attenuated Cp no ID [128] 2003 Perú Mice CST AH SC [58] 2005 Egypt Mice Bacterin, toxoid or bacterin + toxoid MO SC [99] 2006 United Kingdon Sheep Bacterin, rPLD, bacterin + rPLD, or Glanvac® 3 AH SC [61] 2007 Peru Alpacas Live Cp ---- SC [92] 2007 Peru Alpacas CW or CST MDP SC [129] 2007 Egypt Mice Bacterin, rPLD, or bacterin + rPLD MO SC FIA SC [90] 2008 Brazil Goat Crude CST, concentrated CST + oligodeoxynucleotide CpG, or live attenuated Cp [93] 2009 Brazil Mice Recombinant Heat-shock protein 60 (rHsp60) FCA / FIA SC [130] 2010 Egypt Sheep Bacterin, bacterin + rPLD, Gamma-irradiated Cp + rPLD or BCG + rPLD MO (except BCG) SC [131] 2010 USA Mice Bacterin + toxoid ----- ----- [132] 2010 Turkey Sheep Bacterin + toxoid FCA SC Olive oil SC [133] 2011 Saudi Arabia Sheep ® Glanvac 6 Abbreviations: Immunogens - Cp = Corynebacterium pseudotuberculosis; Bacterin = Cp killed whole cells; CW = sonicated Cp cell wall; CST = iltrated culture supernatant exotoxins; Toxoid = inactivated exotoxins or phospholipase D (PLD); rPLD = recombinant PLD; Glanvac® and Case-Vac® = commercial vaccines; Toxminus = Cp with deleted pld gene; Adjuvants - WOE = Water-in-oil emulsion; MO = mineral oil; AA = Arlacel A or monooleate of manitol; AH = aluminum hydroxide; AP = Aluminum phosphate; MDP = muramyl dipeptide; TDM = trehalose dimycolate; BCG = heat-killed Mycobacterium bovis BCG; Cpar = heat killed Corynebacterium parvum; FCA = complete Freund’s adjuvant; FIA = incomplete Freund’s adjuvant; BPA = block polymer adjuvant; MA= multicomponent adjuvant; Route of administration - SC = subcutaneous; IM = intramuscular; IP = intraperitoneal; ID = intradermal; OR = oral. Table 1: Summary of data from scientiic works published in the last 40 years related to vaccine models against infection caused by Corynebacterium pseudotuberculosis in different animal models. J Clin Cell Immunol Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 7 of 15 pseudotuberculosis. Speciically, PLD has been widely studied, as it is one of the few virulence factors known and is the best characterized protein of C. pseudotuberculosis. PLD has been puriied, cloned and expressed in E. coli [32,85-87]. In some studies, the exotoxins are treated with various concentrations of formaldehyde, producing toxoids. hese toxoid-based vaccines have been tested and increase antibody levels against the exotoxins as shown by ELISAs, which decreases CLA spread in sheep [35,60,88,89]. his boost in humoral immunity still only partially protected animals because vaccinated animals only had reduced numbers of lesions ater challenge compared to the unvaccinated sheep. In a recent study, animals inoculated with secreted antigen associated with Freund’s incomplete adjuvant and oligodeoxynucleotide containing unmethylated CpG dinucleotides (CpG ODN) showed a strong humoral response, but this inoculation could not prevent the spread of infection [90]. on live strains, researchers genetically engineered a mutant strain of C. pseudotuberculosis in which the gene for PLD was deleted by sitespeciic mutagenesis, named “Toxminus”. When inoculated into sheep, this mutant was less virulent, causing no local granulomas (108 CFU / dose). With a dose of 1010 CFU of mutant Toxminus, small granulomas were observed in draining lymph nodes, and the mutant bacterium was isolated in only one of these granulomas. hese results conirmed that PLD is essential for C. pseudotuberculosis survival in vivo. he humoral and cellular responses to this mutant were assessed and were found to be less severe than those induced by wild type strains. When animals vaccinated with Toxminus were challenged with a wild type strain (107 CFU), the number of granulomas and their extension were much smaller when compared with control animals. hus, the Toxminus strain that encodes a genetically modiied PLD is non-toxic and confers immunoprotection [36]. Some studies have used a combination of bacterins and toxoids. A product composed of killed C. pseudotuberculosis and PLD inactivated by formaldehyde was tested in ield trials, and the serological results demonstrated the presence of antibodies against PLD as well as against cellular antigens of C. pseudotuberculosis. A progressive signiicant increase in humoral response was observed in the eighth week, but antibody titers decreased by the thirty-second week. Ater the challenge, the number of granulomas was signiicantly lower in vaccinated animals compared to controls, supporting the use of a vaccine combining exotoxin with somatic antigens. However, the immune protection was still not adequate [91]. In further studies, the Toxminus group developed a new mutant, Toxminus with an additional gene encoding an inactive form of PLD. his inactive form was obtained by substituting a histidine for a tyrosine at the active site of the enzyme. Animals orally vaccinated with this mutant were 100% protected against a wild type strain. hese results conirmed the importance of PLD as a protective antigen and demonstrated both the potential for developing an oral CLA vaccine and C. pseudotuberculosis Toxminus as a live vaccine vector [98]. Subunit vaccine models have also been developed in an attempt to improve the speciic immunological response and promote greater rates of protection. he CP40 antigen protein from C. pseudotuberculosis was identiied by a strategy that employs locally derived antibody-secreting cells (ASCs). ASC probes generated by culture of ASCs obtained from lymph nodes draining at the site of infection showed speciicity for CP40. Sheep vaccinated twice with 100 µg per dose of CP40 in aluminum hydroxide adjuvant were protected against infection with C. pseudotuberculosis, with an 82% reduction in the number of infected sheep and a 98% reduction in lung lesions, suggesting that the 40-kDa antigen plays a major role in immunity to CLA [38]. Another study used an antigen of the C. pseudotuberculosis cell wall with muramyl dipeptide as an adjuvant and observed a reduction in CLA pyogranulomas [92]. C. pseudotuberculosis heat-shock protein (Hsp60) has also been tested as a vaccine candidate against CLA. he immunization of BALB/c mice with recombinant Hsp60 (rHsp60) that was expressed in E. coli and puriied induced a signiicant anti-Hsp60 IgG response, with greater production of IgG1 rather than IgG2a. Cell-mediated immune responses induced by immunization were characterized by an elevated production of IFN-γ and IL-10, while IL-4 concentrations were not signiicantly increased. However, the subcutaneous administration of rHsp60 did not induce efective protection against intraperitoneal infection with C. pseudotuberculosis [93]. Other studies have identiied immunodominant antigens by immunoblotting using the secreted/ excreted proteins of C. pseudotuberculosis with immune sera from infected goats and sheep [50,94,95], but these antigens have not yet been investigated in the context of vaccines. Experiments with live attenuated bacterial strains as vaccine models have also been performed, but the same pattern of results have been observed: evident humoral induction, varied degrees of immune protection and reduction only in the number of CLA lesions [90,96,97]. To improve the results of vaccine models based J Clin Cell Immunol Another mutant strain of C. pseudotuberculosis, designated aroQ, was constructed by allelic exchange [63] and tested in sheep models for its ability to act as a vaccine against a homologous challenge. he results demonstrated that aroQ mutants failed to elicit detectable speciic IFN-γ-secreting lymphocytes and induced only low levels of antibodies against C. pseudotuberculosis culture supernatant antigens. Subcutaneous vaccination with aroQ did not protect sheep from infection with the wild-type strain, but the clinical severity of disease resulting from challenge did appear to be lower. Attempts to improve the Toxminus strain have been made by replacing a histidine residue at position 20 in the active site of PLD with a serine residue. In vaccination trials, all the immunized sheep showed evidence of low antibody titers to PLD; however, ater the challenge, the titers increased signiicantly, indicating that animals had been sensitized by the vaccine. Nevertheless, the protection rate of the immunized animals was only 44% [65]. Recombinant DNA vaccine strategies have been pursued further. A model containing a DNA sequence for a genetically attenuated PLD and a model for the sequence that encodes the protein CTLA-4 were constructed. he goal of this study was to direct the toxin to the antigenpresenting cells (APCs) because CTLA-4 binds to B7-1 (CD80) or B7-2 (CD86) on APCs. Sheep vaccinated with the DNA vaccine for PLD protected sheep against infection, and this protection was even more pronounced in animals vaccinated with DNA for PLD associated with CTLA-4. he immune protection rates conferred by these vaccines in sheep were 56% and 70%, respectively [66]. he same DNA vaccine was tested for diferent routes of administration. In sheep, the vaccine was administered intramuscularly and subcutaneously. he route of administration signiicantly inluenced the efectiveness of the vaccine, and the intramuscular route was the most eicient for this vaccine [67]. hese studies opened new possibilities for improvement and innovation in veterinary immunoprophylaxis for CLA. In a recent study, sheep were immunized with a recombinant derivative of PLD, a formalin-killed bacterin, and a bacterin supplemented with recombinant PLD. Following homologous Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 8 of 15 experimental challenge, the PLD and bacterin vaccines conferred statistically signiicant protection against infection and appeared to restrict the dissemination of bacteria beyond the inoculation site in the majority of animals. he most interesting observation was that the combined vaccine provided absolute protection against infection, whereby challenge bacteria were eradicated from all the vaccinated sheep. In this experiment, in addition to the experimental vaccines, a commercially available CLA vaccine that is not licensed for use in the European Union was assessed in a heterologous challenge. he vaccine conferred signiicant protection, although the dissemination of infection beyond the inoculation site was not restricted as it was with the previous vaccines. he authors of this study highlighted the fact that if a single commercial vaccine is chosen, it must have the capacity to protect against infection by a variety of diferent isolates, irrespective of their geographical origin; this must be considered when developing and proposing any vaccine model [99]. Commercial vaccines are available in various regions of the world. For example, Fort Dodge Animal Health (now Pizer, www.pizer.com. br) produces a vaccine called Biodectin™ that is marketed in many countries. he combined vaccines of the Glanvac™ series, which are also marketed by Pizer, are available in Australia. Caseous D - T™ and Case - Bac™ are produced in the United States by the Colorado Serum Company (www.colorado-serum.com). A live attenuated strain of C. pseudotuberculosis (strain 1002) was licensed in the year 2000 for use as a vaccine in Brazil and was developed by the Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola (www.ebda.ba.gov.br) in collaboration with the Health Sciences Institute of the Federal University of Bahia, Brazil. Another attenuated live vaccine, LinfoVac (Laboratórios Vencofarma do Brasil Ltda; www.vencofarma.com.br), which is licensed for use in sheep and goats, is also currently available in Brazil. Despite the fact that these vaccines have been commercially available for a long time, CLA remains prevalent. here have been great advances in understanding the immune response against C. pseudotuberculosis, but improvements are still needed to develop a vaccine model for sheep and goats that promotes 100% protection. he partial protection provided by the immunization of goats and sheep with commercial vaccines may be associated with the type of immune response elicited. Protection against C. pseudotuberculosis is mainly dependent on an immune response that involves INF-γ production and cytotoxic T cells. A humoral response alone is insuicient to protect the animal, and a good cellular response is not achieved with inactivated vaccines. Once CLA is a long-term chronic disease, the success of a vaccination program can to be attributed to the correct use of vaccines and good practices of animal management. hese measures would allow younger animals that are already vaccinated to replace the older infected ones, thus eradicating the disease in the lock. In other words, vaccines should only be a part, though an essential part, of CLA control programs. Serological Diagnosis of CLA Currently, CLA diagnosis in small ruminants is based on characteristic clinical symptoms and the microbiological identiication of C. pseudotuberculosis in material collected from abscesses. However, eicient control requires a serological diagnosis because infected animals that have no apparent symptoms are a source of infection for healthy animals [100]. To date, the isolation and identiication of C. pseudotuberculosis by microbiological culture and biochemical testing J Clin Cell Immunol are still the most reliable methods of CLA diagnosis [101]. However, the puncture of the abscess for the removal of purulent material for culture infects the animal skin and the environment, representing a high risk for pathogen transmission within a herd. As such, the development of less invasive immunodiagnostic tests based on the detection of speciic antibodies to C. pseudotuberculosis in the serum of animals has been widely promoted throughout the world [6]. Several diagnostic methods have been proposed for the diagnosis of CLA, including indirect hemagglutination [102], complement ixation [100], immunodifusion [103], the synergistic inhibition of hemolysis [35] and PCR [104]. Numerous serological tests have been developed to detect antibodies against C. pseudotuberculosis in small ruminants [105]. ELISAs have been frequently used to control CLA in locks around the world, as they detect subclinical infections in a highly speciic manner [106-109]. However, no test has been found to be satisfactory alone [88]. Various antigen preparations have been assayed in ELISAs, including bacterial culture supernatants [108], cell wall antigens [7], PLD [106] and recombinant exotoxins [107]. Typically, the tests work well for goats, but they have reduced sensitivity in sheep, especially in sheep with subclinical infection or that only have internal abscesses. Most of these ELISAs are still not commercially available, and those that are have a relatively high cost [7,105,106]. As C. pseudotuberculosis is a facultative intracellular pathogen, cell-mediated immunity is an important component of the protective immune response [50]. hus, a whole-blood IFN-γ assay is a promising detection tool for CLA in small ruminant locks [75, 107, 110]. his method has been optimized, and its ability to correctly detect infected animals has been compared to ELISAs. Indeed, the IFN-γ test accurately detected C. pseudotuberculosis experimentally infected goats over a 363 day period with a reliability of 89.2% and in non-infected goats with a reliability of 97.1%, while a recombinant PLD-based ELISA detected C. pseudotuberculosis in experimentally infected goats over the same period with a reliability of 81.0% and in non-infected goats with a reliability of 97.0% [107]. A recent study developed an assay for the in vitro quantiication of IFN-γ that is secreted in the supernatant of antigen-stimulated cells and concentrated. he samples are simple and fast to prepare, and the test is inexpensive and convenient for IFN-γ quantiication. Although it is promising, the sensitivity of this method needs improvement, including eforts to improve the blood-cell culture conditions, antigen extraction procedures and stimulation protocols [75]. Sensitivity and speciicity are important factors that should be considered when selecting a diagnostic assay(s) for a screening program. A test with a lower speciicity can lead to false positives, whereas reduced sensitivity can lead to false-negative results. An alternative approach to the diagnosis of CLA might be the combined assessment of the in vitro cellular immune response to C. pseudotuberculosis antigens combined with ELISAs, which would fully evaluate the humoral response. Zoonotic Potential of C. pseudotuberculosis Sheep and goats are the most common animals infected within the broad spectrum of hosts in which C. pseudotuberculosis causes clinical disease. However, C. pseudotuberculosis is considered an emergent public health problem. his bacterium can produce diphtheria toxin as a consequence of lysogenization with a diphtheria phage. his has been clearly demonstrated in vitro [111] and has led authorities from many countries to urge their health services to be aware of diseases caused by all the diphtheria toxin-producing species of Corynebacterium, including C. pseudotuberculosis and C. ulcerans, in the diferential Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 9 of 15 diagnosis of diphtheria. For many years, the identiication of any toxigenic C. pseudotuberculosis required notiication to communicable disease control agencies [112]. Recently, a case of toxigenic C. pseudotuberculosis was reported. his is the only report in the literature of the isolation of toxigenic C. pseudotuberculosis from a human, and this isolation occurred in the UK. he organism was isolated from the aortic root vegetation of an intravenous drug user with endocarditis; this patient had no history of animal contact, and no possible source of infection was identiied [113]. In addition to the production of diphtheria toxin by lysogenic C. pseudotuberculosis, common strains can infect humans and cause suppurative lymphadenopathy; these events are traditionally associated with farm animal contact and contaminated dairy products. Pathologically, the infected lymph node tissue is replaced by necrotizing granulomas, while the general histological appearance resembles tuberculous lymphadenitis, catscratch disease and lymphogranuloma venereum, which must be considered in the diferential diagnosis. A summary of the human cases of infection is presented in Table 2, including the country of origin of the report, the sex and age of the patients, the source of exposure to the pathogen (professional or occasional), the main clinical presentations of the disease and treatment. he irst human case was described in 1966; a 37-year old man from Panama that worked as a grass cutter developed an inguinal lymphadenopathy. Initially, the clinical presentation was thought to be a lymphogranuloma venereum, and the patient was treated with tetracycline for a period of 3 weeks. he lymph node was excised and presented a characteristic histological appearance of the CLA pyogranulomas that normally occur in sheep and goats. he bacterial strain was isolated and was found to produce acid from glucose, fructose, galactose, sucrose, mannose, maltose, dextrin and xylose, as well as from hydrogen sulide, but it did not reduce nitrate to nitrite and was negative for the urease reaction [114]. Since that time, 32 new clinical cases have been reported, and the 19 human cases reported from Australia is higher than that from all other countries, with reports varying between 1 and 3 cases per country. A proile including the age, sex and source of exposure for the patients infected with C. pseudotuberculosis found in the reviewed literature is presented in Figure 1. Of the 33 human cases, most cases presented as axillary or epitroclear lymphadenopathy, and the main group of infected patients was men aged 21 to 40 years old that were exposed to farm animals, mostly sheep, at work. hese data strongly indicate that human infection by C. pseudotuberculosis constitutes a bona ide zoonosis. In most cases, lymphadenopathy has a prolonged course, and the formation of relapsing abscesses is frequent. Treatment with antibiotics is prolonged, normally lasting for more than two weeks, and typically comprises administration of intracellularly active antibiotics, such as tetracycline and macrolides. Although antibiotic therapy alone has been successful in a few cases, C. pseudotuberculosis is a facultative intracellular pathogen, and it is very diicult for antibiotics to reach the bacteria inside the pyogranuloma macrophages. hus, surgical interventions including drainage or excision were oten required to clear the purulent content of the thick collagen capsule. he combination of antimicrobial therapy with excision and drainage is the most successful course of treatment. It should be noted that two speciic cases of human infection due to C. pseudotuberculosis have involved clinical presentations other than the characteristic lymphadenopathy. In the irst case, a veterinary student who worked with equines was infected by C. pseudotuberculosis and J Clin Cell Immunol presented with an eosinophilic pneumonia [115]. In the second case, a 63-year old man presented an ocular infection by C. pseudotuberculosis, involving a scleral buckle ater retinal reattachment intervention; this case may be the irst human ocular C. pseudotuberculosis infection [116]. he prevalence of the human disease caused by C. pseudotuberculosis is likely underestimated, as only 33 cases have been reported over a period of 42 years (from 1966 to 2008). In addition to this low prevalence, some cases of human exposure to C. pseudotuberculosis that are found in the literature were written in Russian, making them diicult to utilize. In one report, a microbiological study of 69 Russian patients with allergic annual rhinitis (AAR) and infectious rhinitis (IR) was performed and demonstrated that among the species isolated in IR, C. pseudotuberculosis was the predominant species associated with Streptococci [117]. In another study from Russia, the bacteriologic examination of 1589 patients showed that, aside from C. diphtheriae, 11% of acute upper respiratory tract infections were caused by Corynebacterium species. he disease processes varied signiicantly, presenting as bronchitis, pyelonephritis, urethritis, colpitis, dermatitis and arthritis. Although C. pseudodiphtheriticum and C. xerosis were isolated more frequently from clinical specimens, C. diphtheriae and C. pseudotuberculosis were identiied as the most virulent species. Corynebacterium species (but not C. diphtheriae) were frequently isolated from clinical specimens with Staphylococci and Streptococci, and in those cases, pathogenicity and resistance to antibiotics were more pronounced; the strains isolated with other bacteria were resistant to tetracycline, penicillin, and erythromycin [118], which are the most common active antibiotics used for the treatment of intracellular bacteria. hese two Russian studies provide evidence demonstrating that C. pseudotuberculosis is a much more widespread pathogen than suggested by the 33 published cases. Additionally, because the published human cases involved zoonotic transmission due to work with farm animals, the proper training and education of these workers is needed. Future Directions he two virulence determinants of C. pseudotuberculosis, the toxic lipid cell wall and the exotoxin PLD, have proved to be highly associated with dissemination in tissues and development of granulomatous lesions, respectively. However, knowledge of the molecular mechanisms and genetic basis of virulence of C. pseudotuberculosis is central to understanding the host-pathogen associations. Because C. pseudotuberculosis is an intracellular pathogen, its immunopathogenesis is characterized by pyogranulomas; biologically, this represents a form of containment in the host’s tissues. Data suggest that antibodies might help to protect animals against infection, but full protection by any vaccine model must provide better stimulation of cellular immunity, such as the activation of CD8+ cells and the secretion of IFN-γ, to control the bacteria in an early phase of the infection process. hus, the molecular mechanisms of infection by C. pseudotuberculosis need to be more thoroughly understood so that speciic stimulation of cellular immune responses can be accomplished through immunization. A promising area of research is the acute phase response of the infection, as innate immunity is responsible for the early events in the control the bacterial spread; vaccines could be improved to better stimulate innate immunity. For the diagnosis of C. pseudotuberculosis infection, ELISA and IFN-γ quantiication are promising techniques that provide Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 10 of 15 Case nº Year Reference Country of origin Sex, age of patients Occupation / Source of exposition Main clinical presentation Treatment 1 1966 [114] Panama M, 37 Grass cutter Inguinal lymphadenopathy EX and TET 2 1967 [134] Australia M, 28 Manager of a sheep and cattle farm Lymphadenopathy in the inguinal, leg and thigh lymph nodes EX, DR and PEN 3 1968 [135] Australia M, 24 Sheep shearer Asymptomatic axillary lymphadenopathy EX, PEN and TET 4 1968 [136] Australia M, 23 Butcher Axillary lymphadenopathy EX and TET 5 1974 [137] Australia M, 20 Sheep rancher Axillary lymphadenopathy EX and DR 6 1974 [137] Australia M, 40 Rural worker Inguinal lymphadenopathy EX and ERY Asymptomatic cervical lymphadenopathy EX Axillary lymphadenopathy EX and CLO 7 1974 [137] Australia F, 50 Housewife of rural worker 8 1979 [138] Australia M, 21 Abbatoir worker 9 1979 [115] USA M, 28 Veterinary student Eosinophilic pneumonia ERY 10 1980 [139] France M, 27 Shepherd Axillary lymphadenopathy EX, TET and CHL 11 1981 [140] USA M, 30 Raw milk ingestion Cervical lymphadenopathy EX, DR, PEN and ERY Epitrochlear and axillary lymphadenopathy EX, DR, PEN, FLU, TET and ERY 12 1985 [141] Australia M, 18 Butcher 13 1985 [10] Australia M, 41 Farm worker Axillary lymphadenopathy EX 14 1985 [10] Australia F, 29 Farm worker Inguinal lymphadenopathy EX, PEN and FLU 15 1986 [142] New Zeland M, 29 Sheep rancher Asymptomatic inguinal lymphadenopathy EX, PEN, CLO, FLU and ERY 16 1986 [10] Australia M, 29 Meat inspector Axillary lymphadenopathy EX and DR 17 1988 [10] Australia M, 22 Butcher Axillary lymphadenopathy EX and ERY 18 1988 [10] Australia M, 20 Slaughterman Axillary lymphadenopathy EX, DR and ERY 19 1988 [10] Australia F, 53 Unknown exposure Supraclavicular lymphadenopathy EX 20 1989 [10] Australia M, 40 Abbatoir worker Epitrochlear and axillary lymphadenopathy EX and ERY 21 1991 [143] Belgium NF NF Axillary lymphadenopathy NF 22 1992 [10] Australia M, 27 Worker of a sheep saleyard Axillary lymphadenopathy EX, FLU and AMOX-CLAV 23 1992 [10] Australia M, 26 Abbatoir worker Axillary lymphadenopathy EX and PEN 24 1992 [10] Australia M, 40 Contact with sheep Axillary lymphadenopathy EX, ERY and FLU 25 1995 [144] Spain M, 34 Shepherd Inguinal lymphadenopathy EX and ERY 26 1997 [145] Switzerland M, 30 Sheep rancher and butcher (Turkey) Epitrochlear and axillary lymphadenopathy EX and CLA 27 1997 [146] Australia M, 17 Contact with farm animals Suppurative lymphadenopathy NF 28 1997 [147] New Zeland M, 22 Shepherd Axillary lymphadenopathy EX, DR and ATB 29 2004 [148] Spain F, 33 History of contact with a white rat Cervical lymphadenopathy AMOX-CLAC 30 2004 [149] France F, 63 Living in a rural area Axillary lymphadenopathy EX, DR, CLO, GEN, CIP and PRI 31 2005 [117] China M, 63 Contact only with a dog maintained as pet Ocular infection and mucopurulent discharge AMP, CLO, PEN and VAN 32 2006 [150] France F, 12 Contact with sheep during vacation in a rural area Asymptomatic lymphadenopathy EX, DR, IMI-CIL, RIF and OFL 33 2008 [113] United Kingdon NF Injecting drug user, unknown exposure Endocarditis NR Legend: EX = excision of the lymph node; DR = drainage of the lymph node content; ATB = antibiotics; TET = tetracycline; PEN = penicillin; CLO = cloxacillin; FLU = lucloxacillin; ERY = erythromycin; CHL = chloramphenicol; AMOX-CLAV = amoxicillin; CLA = clarithromycin; GEN = gentamicin; CIP = ciproloxacin; PRI = pristinamycin; AMP = ampicillin; VAN = vancomycin; IMI-CIL = imipenem-cilastatin; RIF = rifampin; OFL = oloxacin; NR = not reported; NF = not found. Table 2: Summary of data from 33 previously published cases of human infection by Corynebacterium pseudotuberculosis. J Clin Cell Immunol Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal Citation: Bastos BL, Dias Portela RW, Dorella FA, Ribeiro D, Seyffert N, et al. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. J Clin Cell Immunol S4:005. doi:10.4172/2155-9899.S4-005 Page 11 of 15 Figure 1: Proile of patients infected with C. pseudotuberculosis in 33 reviewed literature cases, according to sex, age and exposition to the pathogen. high levels of reliability. With some improvement, a great variety of tests will be available to lock owners and veterinarians. However, these methodologies require a minimal laboratory structure for implementation, including microplate readers and well-trained professionals. hese requirements would not allow these tests to be applied in ield situations during the routine care of small ruminant locks or in the inspection of slaughterhouses. hus, scientists are also encouraged to develop simpler technologies that could be used in ield conditions, such as a rapid immune-chromatographic test. Because of the zoonotic potential of C. pseudotuberculosis, studies should be performed to characterize the presence of the bacteria in carcasses and the rates of condemnation due to C. pseudotuberculosis. Further, the risks to consumers who come into contact with or ingest contaminated meat or milk need to be quantiied. Acknowledgments The authors are grateful for the inancial support from CAPES, CNPq, FAPEMIG, FAPEX, FUNDECE and RENORBIO. R Meyer, S C Oliveira, A Miyoshi and V Azevedo are research fellows of CNPq. BL Bastos and D Ribeiro are Ph.D. students with scholarships from CNPq and CAPES, respectively. References 1. Dorella FA, Pacheco LGC, Oliveira SC, Miyoshi A, Azevedo V (2006) Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet Res 37: 201-218. 2. Mattos-Guaraldi AL, Moreira LO, Damasco PV, Hirata Junior R (2003) Diphtheria remains a threat to health in the developing world - an overview. J Clin Cell Immunol Mem Inst Oswaldo Cruz 98: 987-993. 3. Tauch A, Kaiser O, Hain T, Goesmann A, Weisshaar B, et al. (2005) A Complete genome sequence and analysis of the multiresistant nosocomial pathogen Corynebacterium jeikeium K411, a lipid-requiring bacterium of the human skin lora. J Bacteriol 187: 4671-4682. 4. Koffas M, Stephanopoulos G (2005) Strain improvement by metabolic engineering: lysine production as a case study for systems biology. Curr Opin Biotechnol 16: 361-366. 5. 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Submit your next manuscript and get advantages of OMICS Group submissions Unique features: • Userfriendly/feasiblewebsite-translationofyourpaperto50world’sleadinglanguages • AudioVersionofpublishedpaper • Digitalarticlestoshareandexplore Special features: Thisarticlewasoriginallypublishedinaspecialissue,Vaccine Development and Immune ResponsehandledbyEditor(s).Dr.JanetPlate, RushUniversity,USA J Clin Cell Immunol • 200OpenAccessJournals • 15,000editorialteam • 21daysrapidreviewprocess • Qualityandquickeditorial,reviewandpublicationprocessing • IndexingatPubMed(partial),Scopus,DOAJ,EBSCO,IndexCopernicusandGoogleScholaretc • SharingOption:SocialNetworkingEnabled • Authors,ReviewersandEditorsrewardedwithonlineScientiicCredits • Betterdiscountforyoursubsequentarticles Submityourmanuscriptat:www.editorialmanager.com/clinicalgroup Vaccine Development and Immune Response ISSN:2155-9899 JCCI, an open access journal ANEXO II Volume No: 6, Issue: 7, e201303013, http://dx.doi.org/10.5936/csbj.201303013 CSBJ Progression of 'OMICS' methodologies for understanding the pathogenicity of Corynebacterium pseudotuberculosis: the Brazilian experience Fernanda A. Dorella a, Alfonso Gala-Garcia a, Anne C. Pinto a, Boutros Sarrouh a, Camila A. Antunes a, Dayana Ribeiro a, Flavia F. Aburjaile a, Karina K. Fiaux a, Luis C. Guimarães a, Núbia Seyffert a, Rachid A. El-Aouar a, Renata Silva a, Syed S. Hassan a, Thiago L. P. Castro a, Wanderson S. Marques a, Rommel Ramos b, Adriana Carneiro b, Pablo de Sá b, Anderson Miyoshi a, Vasco Azevedo a,*, Artur Silva b,* Abstract: Since the first successful attempt at sequencing the Corynebacterium pseudotuberculosis genome, large amounts of genomic, transcriptomic and proteomic data have been generated. C. pseudotuberculosis is an interesting bacterium due to its great zoonotic potential and because it causes considerable economic losses worldwide. Furthermore, different strains of C. pseudotuberculosis are capable of causing various diseases in different hosts. Currently, we seek information about the phylogenetic relationships between different strains of C. pseudotuberculosis isolates from different hosts across the world and to employ these data to develop tools to diagnose and eradicate the diseases these strains cause. In this review, we present the latest findings on C. pseudotuberculosis that have been obtained with the most advanced techniques for sequencing and genomic organization. We also discuss the development of in silico tools for processing these data to prompt a better understanding of this pathogen. Background Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that belongs to the class Actinobacteria. This pathogen is aerobic, has mycolic acid in its cell wall, displays pleomorphic forms, does not sporulate or encapsulate, is non-motile and possesses fimbriae. C. pseudotuberculosis has great infectious potential and implications for zoonotic transmission, as it affects goats, sheep, horses, buffaloes, camels, cattle and primates, causing different symptoms. Furthermore, it has already been reported as the causative agent of more than 33 cases of infection in humans. C. pseudotuberculosis presents two biovars, ovis (nitrate negative reduction) and equi (nitrate positive reduction); the former biovar is mainly associated with the globally-distributed disease Caseous Lymph Adenitis (CLA), which affects the lymph nodes and visceral organs of goats and sheep and causes economic losses by compromising the skin, weight, milk and meat production of the animals as well as causing death and compromising the carcass. Although many vaccines exist, they are mainly intended for use in sheep and goats and provide variable levels of protection [1, 2, 3]. C. pseudotuberculosis has interesting survival mechanisms and is able to utilize different strategies to adapt to its environment. Once it is successfully established within a host and able to replicate inside phagocytic cells, this pathogen will evade the immune system with apparent ease. As a result, chronic infections may last for most, if not all, of an animal’s life [3]. In the present review, we report the latest 1 aLaboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brazil bInstituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brazil * Corresponding author. E-mail address: [email protected] (or) [email protected] information regarding the genomic, proteomic and transcriptomic features of this interesting microorganism, and we attempt to correlate such information with its virulence and pathogenicity. Genomics The first attempt to identify the genomic sequence of C. pseudotuberculosis was performed by Dorella and collaborators [4], in which genomic libraries of the 1002 strain of this species were constructed using a bacterial artificial chromosome (BAC) vector. This high-quality genomic library, containing approximately 1,800 clones, harbored inserts ranging from 24.5-121 kbp. Partial characterization of this library through a BAC end-sequencing strategy, namely the identification of genome survey sequences (GSS), generated 215 GSS at relatively low cost; these were deposited on the NCBI website. Using these sequences for in silico analysis, it was possible to identify putative genes involved in virulence based on their similarity to other deposited sequences and generate a catalog of genes, such as the putative siderophore-binding protein (GSS number BH740428) that increased our biological knowledge of the microorganism. The high quality, low redundancy and absence of contaminants in the library, together with the large number of clones it contained, permitted this library to serve as a physical map for the characterization of the C. pseudotuberculosis genome. Moreover, library characterization also allowed for confirmation of the close phylogenetic relationship between C. pseudotuberculosis and C. diphtheriae, C. glutamicum, C. efficiens and C. jeikeium [4]. Based on this initiative, a project to sequence the first entire genome of C. pseudotuberculosis 1002 strain was started by the Rede Genoma de Minas Gerais (RGMG-Brazil) in 2006 and concluded in 2009. This genome was sequenced using the Sanger di-deoxy method and has now been assembled, annotated and deposited in the NCBI database under accession number CP001809. Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis 2 The C. pseudotuberculosis genome project has expanded its boundaries and today the network includes the Rede Paraense de Genômica e Proteômica, which has worked with all of the versions of SOLiDTM (Life Technologies) since v.2 and now employs the most advanced next-generation sequencing (NGS) platforms: the SOLiD TM 5500 series (Life Technologies) and Ion Torrent PGM (Life Technologies). These NGS platforms can sequence more than one bacterial genome per day, thus demonstrating the feasibility of sequencing C. pseudotuberculosis strains. This important partnership has also contributed computational resources to process the huge amount of data generated by these new DNA-sequencing technologies. To date, fifteen strains of C. pseudotuberculosis have been sequenced (Table 1), employing all of the presently available technologies. Based on the data obtained by sequencing, the average G+C content of all 15 strains is 52.2%; each genome has an average of approximately 2,195 genes, and total genome sizes range from 2.28 to 2.34 Mb. The sequencing of several strains of C. pseudotuberculosis is paving the way for further studies. In 2011, Barh and colleagues compared four genomes of C. pseudotuberculosis (strains FRC41, 1002, C231 and I19) with eight other sequenced genomes of pathogens belonging to a group that includes genera such Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia and Rhodococcus, Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 which are commonly found in humans, goats, sheep, cattle and horses [5]. As a result of this comparative genomic analysis, potential molecular targets were identified for the production of drugs and vaccines. The study of the diversity among strains promotes our understanding of gene rearrangement, genomic plasticity as loss and gains and inversions in the genome. In addition, this research provides valuable information regarding molecular epidemiology, microevolution, lineage-specific genes and common genes among the isolates [6], contributing to the development of new therapies that are more effective for the control of caseous lymphadenitis (CLA). Of the fifteen genomes deposited at NCBI, nine belong to the biovar ovis, and six belong to the biovar equi (Table 1). While the ovis strains have almost no genetic differences, the grouping of the equi strains appears to be asymmetric in relation to biovar ovis. Therefore, it is important to detect the differences between ovis and equi to develop a common vaccine or diagnostic tool for all of them. Typically, vaccines against C. pseudotuberculosis infection designed for sheep do not have equal efficacy in goats, although both species are usually infected by bacteria belonging to the biovar ovis. Thus, the vaccines developed for C. pseudotuberculosis biovar ovis may not have the same efficacy in hosts infected with biovar equi, which Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis further complicates treatment of C. pseudotuberculosis by different animal breeders [1]. Interestingly, no major differences between the structural characteristics of biovars equi and ovis have been observed, such as the numbers of CDS, genes or proteins, which are very similar between strains of both biovars (Table 1). The differential pathogenicities of the biovars might be due to the presence of genes that are strainspecific, as each pathogen appears to preferentially infect particular hosts, therefore causing different disease symptoms. Thus, specific genes and other unknown process may underlie host preference and determine the different symptoms of the infection process [1]. Features that are common among all of the strains are GC content and the number of ribosomal clusters. GC content is related to different intrinsic or extrinsic factors, and a high GC content suggests that the genetic material has greater stability, providing a more robust genome that suffers less from the influence of environmental variations [7]. With regard to the number of rDNA operons, all strains present four copies, and each ribosome consists of one 5S, one 16S and one 23S. This fact may possibly be related to the slower replication of C. pseudotuberculosis compared to Escherichia coli, which has seven copies of the rDNA operon, or C. glutamicum, which has six copies, considering that ribosomal operons can perform diverse functions related to the control of protein synthesis [8]. A rapid increase in the number of complete genomes over the past few decades in the form of large molecular datasets in public databases has provoked researchers to develop numerous computational tools and public or proprietary databases. These holistic approaches have facilitated the rapid study and understanding of the innumerable biological functions that are encoded by genomic DNA. The barrier to unraveling prokaryotic genomes has been eliminated using the next generation of high-throughput sequencing technologies, such as SOLiD, GS FLX, Ion Torrent PGM and Illumina, which have prominent advantages over Sanger sequencing. However, although these technologies significantly reduce the cost and time for genome sequencing, they still pose challenges for various aspects of data processing and analysis, such as the assembly of short reads [9]. A number of user-friendly interfaces and stand-alone computational tools have been developed to evaluate the genomic and transcriptomic data obtained from these high-throughput platforms. Presently, bioinformaticians have developed and are further revising some useful tools and software packages using different algorithms and in-house scripts. A brief description and application of each software program for the data analysis of C. pseudotuberculosis and/or taxonomically related organisms is presented below. 3 1- Pathogenicity Island-Prediction Software (PIPS): This software is designed to predict the pathogenicity islands (PAIs) in bacterial genomes, utilizing multiple features in an integrative manner. PAIs are large genomic regions acquired through horizontal gene transfer, which have in common the following: deviations in G+C content and codon usage, the presence of transposase and virulence factors, flanking insertion sequences and/or tRNA genes and their absence in non-pathogenic organisms of the same genus or related species. PIPS uses these multiple features to detect PAIs. For validation purposes, PIPS was utilized with model organisms of the genera Corynebacterium and Escherichia, and the results showed that PIPS provided better accuracy (85-88%) and superior efficiency compared with the other available software tools. Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 This software is easy to install on a personal computer and provides a user-friendly interface for students and researchers [10]. 2- Quality Assessment Software (QA): This software is used to analyze the quality of sequence reads from next-generation platforms. The software removes the reads, which present average quality below the Phred quality cutoffs. The process of quality filtering reduces miss-assemblies and incorrect mapping against the reference genome that are attributable to low quality sequences from the raw data. The software helps to review graphs that show the distribution of quality values from the sequencing reads, including the average and the accumulated quality for each base. Libraries of fragments from SOLiD sequencing of C. pseudotuberculosis (Cp162) and Exiguobacterium antarcticum (B7) were used as sample data to test the software. QA is a Java-based program that is available at http://qualevaluato.sourceforge.net [11]. A new version of this software, called Quality Assessment Long Reads [12], was developed to apply the Phred quality filter over Ion Torrent PGM data due to the read length: ≈120 bp for the first release of the platform and ≈400 bp with a recent protocol. 3- Singular Value Decomposition (SVD): This is a very useful technique for information retrieval that helps to uncover the relationships between elements that are not prima facie related. In turn, this leads to the improved inference of evolutionary relationships between amino acid sequences of different species. SVD produces a revised distance matrix for a set of related elements and provides results resembling the internationally accepted scientific gold standard of Linnaean taxonomy. The SVD-based computations establish non-obvious, relevant relationships among the clustered elements, providing a deterministic method for grouping related species. This approach was initially developed to reduce the time needed for information retrieval and analysis of very large-scale genome and proteome data sets in the complex Internet environment. The results obtained by this technique are in close approximation with results based on Linnaean taxonomy, which indicates that SVD can indicate evolutionary relationships of species and construct better quality clusters and phylogenetic trees [13]. The analysis of prokaryotic genomes can be further aided with new algorithmic methods and tools and advancements in bioinformatics and computational biology. These techniques will provide more opportunities to study in detail the “OMICS” of specific organisms. Unifying current and upcoming computational resources to provide a global and integral picture of biology is important and can be achieved by mutual cooperation among researchers from distinct areas. 4- Core StImulon (CSI) One methodology for performing RNA sequencing (RNA-seq) analyses is the de novo approach, which is commonly used when reference genomes are not available in biological databases. An important feature of this method is that it identifies shared transcripts among stimulons (i.e., the set of expressed genes under a given condition), which can permit the selection of possible candidates for vaccine studies through searches for the specific genes of an organism in addition to permitting the identification of new transcripts that have not been previously annotated. We sequenced the cDNA of Corynebacterium pseudotuberculosis strain 1002 using the SOLiD V3 system under the following conditions: osmotic stress (2 M), acidity (low pH), heat shock (50°C) and a control condition. To identify the transcripts that were shared among the stimulons and integrate this information with the BLAST and BLAST2GO results, Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis the software CoreStImulon (CSI) was developed, which allows genes to be characterized in terms of their ontology [14]. 5- FunSys FunSys software, which is a stand-alone tool with a user-friendly interface, was developed to evaluate and correlate the differential expression profiles from RNA-seq and proteomics datasets. FunSys produces charts and reports based on the results of the analysis of differential expression (generated using other software) to aid in the interpretation of the results [15]. Proteomics 4 Unlike genomic studies, proteomics evaluates the protein profile of a cell, tissue or organism [16, 17]. Proteomic studies can provide valuable information about changes in protein synthesis, posttranslational modifications and protein-protein interactions, thereby increasing knowledge of physiological phenomena for a specific condition and helping to establish a fundamental understanding of an organism’s cellular physiology and virulence factors [16, 18]. The global expression of bacterial proteins is required for growth, survival or pathogenicity, and cataloguing these proteins in response to a determined condition is a key step toward understanding the physiology of these microorganisms [18, 19]. To identify virulence factors and obtain further information about the biology of pathogenic bacteria, studies have been performed using proteomics to characterize whole cells, cytoplasmic and membrane proteomes and the secretome/exoproteome of these pathogens [18]. The primary proteomic studies involving C. pseudotuberculosis were intended to analyze the extracellular protein fraction. This protein fraction is associated with the uptake of nutrients, cell-to-cell communication, proteolysis, hemolysis, detoxification, escape from the immune system and destruction of competing microorganisms in their respective environments. However, during the process of adaptation and survival in hostile environments, pathogenic bacteria need to secrete different molecules for adhesion, invasion, proliferation and survival in the host cell [20, 21]. Thus, the study of extracellular proteins is a useful strategy to identify new virulence factors and target immunogenics [22]. Initially, with the aim of identifying new targets for the development of immunodiagnostics and vaccine targets to combat CLA, various research groups conducted proteomic studies using onedimensional electrophoresis based on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting to characterize the whole cell fraction and extracellular proteins of C. pseudotuberculosis. The bacteria in these studies were grown in complex media containing exogenous proteins that would contaminate extractions of extracellular proteins [23, 24]. Studies showed that the use of chemically defined medium (CDM) is an effective strategy to identify bacterial components for therapeutic applications [25]. In this context, a CDM for C. pseudotuberculosis growth in macromolecule-free conditions was developed [26]. The evaluation of humoral and cellular immune responses of goats experimentally infected with C. pseudotuberculosis showed that interferon-γ (IFN- γ) detection using excreted-secreted antigen after cultivation of this pathogen in CDM provided more specific results compared with the use of whole cell sonicated antigen [27]. This suggested that the bacterial growth in CMD and use of the secreted protein fraction may be an interesting strategy for the study of immunogenic proteins of C. pseudotuberculosis. Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 To optimize the process of obtaining the extracellular fraction, Paule and colleagues [27] established an efficient protocol for extracting the extracellular proteins of C. pseudotuberculosis based on the three-phase partitioning (TPP) technique. After analyzing the protein extract by SDS-PAGE and immunoblotting, it was possible to detect proteins that were not detected in previous studies [28]. Notably, all of the results obtained by Paule and colleagues [28] only indicated the molecular weights of the proteins or reactivity of the proteins against the sera of infected animals without protein characterization by mass spectrometry (MS). The C. pseudotuberculosis genome project [29] generated information about the pathogenicity and virulence of this microorganism. From the genomic data, the in silico pan-exoproteome of C. pseudotuberculosis has been deduced [30]. However, how these gene products interact and what their functions are in physiological processes must be elucidated. To respond to these questions and validate gene annotations, proteomic approaches have been applied to characterize the exoproteome of C. pseudotuberculosis. Studies have demonstrated that comparative proteomics is a powerful strategy to characterize bacterial proteomes, and thus it has been adopted to characterize the proteomes of various pathogenic bacteria [21, 31, 32]. A comparative proteomic study was conducted using the "shotgun proteomics" approach to characterize the exoproteome of two strains, Cp1002 and CpC231, of C. pseudotuberculosis, both of which belong to the biovar ovis but were isolated from different hosts (goat and sheep, respectively). This study combined the techniques of TPP [27] and gel-free separation using liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LCMS), called TPP-LC/MSE [33]. The two strains were maintained on BHI agar or in broth and in CDM to study proteome growth. The results obtained from this work showed quantitative and qualitative changes between the exoproteomes of both strains. Furthermore, this strategy permitted the characterization of 93 extracellular proteins of C. pseudotuberculosis that were associated with the physiology and virulence of this pathogen [33]. The identified proteins that play a role in virulence include phospholipase D (PLD), the main virulence factor of C. pseudotuberculosis, which is associated with the spread of bacteria within the host [34]; iron siderophore binding protein (FagD), a component of an iron uptake system [35]; and serine proteinase (CP40), which showed protective activity against infection by C. pseudotuberculosis [36]. However, these proteins were identified only in the extracellular proteome of CpC231, suggesting that these proteins may not be secreted by Cp1002, which may influence the pathogenesis of this strain [33]. Another approach that has been employed to analyze the exoproteome of C. pseudotuberculosis is serological proteome analysis (SERPA), which involves 2-DE immunoblotting and identification of antigenic spots by an MS technique. This strategy has been applied to several pathogenic bacterial species to identify virulence factors, target the development of drugs and vaccines and conduct immunodiagnostics [37, 38]. In this context, Seyffert et al. [39] conducted a preliminary serological secretome analysis of C. pseudotuberculosis and evaluated the exoproteome of strain 1002 ovis. The use of the SERPA approach enabled the characterization of six immunoreactive proteins against the serum of animals infected with C. pseudotuberculosis. These identified proteins represent potential targets for developing vaccine targets and diagnostics to combat CLA. Currently, with advances in proteomic studies, new techniques have been developed and applied for the study of several pathogens. Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis Thus, the application of different proteomic approaches is a powerful strategy to characterize the proteome of C. pseudotuberculosis and broaden our knowledge of the physiology and pathogenesis of this pathogen. Transcriptomics 5 The mechanisms with which pathogenic microorganisms surpass the hostile conditions found in a host are of great importance for successful infection, and the genes related to such adaptations constitute clear targets for the development of new diagnostics and vaccines. The advent of RNA microarrays and high-throughput RNA-seq technologies has allowed not only the comprehensive assessment of differential gene expression in bacteria but also the identification of genetic structures such as operons, transcriptional start sites, non-coding regulatory RNAs and small RNAs [40]. Similar to M. tuberculosis, C. pseudotuberculosis infects and persists inside macrophages, although it does not prevent fusion between the phagosome and lysosome. Because this bacterium is subjected to different stresses in the phagolysosome, Pinto and colleagues [14] evaluated its transcriptome following in vitro exposure to high osmolarity (sodium chloride at a final concentration of 2 M), heat shock (50°C) or acidic pH (5.0) by performing RNA-seq with SOLiD technology. When the sets of genes expressed only under each stress condition, which together compose the core stimulon of C. pseudotuberculosis, were examined, most of the targets identified were related to oxidation and reduction events, while cell division and the cell cycle were the second- and third-most upregulated processes, respectively. According to the Gene Ontology database, some of the genes in the core stimulon are directly involved in stress responses; one example involves an encoder of a two-component system response-regulator protein that is also linked to pathogenesis. Other genes highlighted by the authors include dps (a gene involved in resistance to oxidative stress) and a gene that encodes for one component of the ABC-type iron-uptake system. The assessment of global transcriptional profiles in bacteria constitutes a key strategy for unveiling mechanisms that are important for virulence and pathogenicity; thus, any efforts to increase the feasibility of RNA-seq experiments are welcome when studying pathogens such as C. pseudotuberculosis. Because large portions of sequencing reads are mapped to ribosomal RNA genes, Castro and colleagues [41] tested a new methodology, based on denaturing highperformance liquid chromatography, to deplete ribosomal transcripts from bacterial total RNA samples using C. pseudotuberculosis (biovar equi) as a model organism. With the elimination of 78% to 92% of rRNA, which are levels that resemble those obtained with a conventional subtraction kit, this new method offers financial advantages for researchers who have access to a chromatographic system. The elucidation of which gene products of C. pseudotuberculosis are directly involved in survival and adaptation during infection has yet to come. As global gene expression profiling will most likely provide key knowledge for the development of effective prophylactic measures in the future, researchers will certainly take a step ahead by integrating information from both transcriptomic and proteomic approaches. experimental methods, algorithms and tools and advances in bioinformatics and computational biology. The main objective of these studies is to find clues that may be useful in developing a vaccine and a diagnostic approach that is effective for all hosts that suffer from C. pseudotuberculosis infection. Another goal is to elucidate the physiology, pathogenicity and virulence mechanisms of this bacterium. In response to advances in molecular biology in the last few years, much information regarding biological systems has been elucidated via a variety of genome-sequencing projects. However, sequencing reveals little about how the proteins of an organism operate individually or together to perform their functions. The integration of both current and upcoming resources to provide a global and integral biological picture is important and can be achieved by mutual cooperation between researchers from distinct areas. Future of this field Studies of prokaryotic genomes, transcriptomes and proteomes have been considerably improved with the development of new Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis 6 Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org Genomes and proteomes of C. pseudotuberculosis Keywords: Corynebacterium pseudotuberculosis, SOLiD next generation sequencing, Ion Torrent next generation sequencing, SDS-PAGE, mass spectrometry, RNA-seq Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. © 2013 Dorella et al. Licensee: Computational and Structural Biotechnology Journal. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are properly cited. 7 Volume No: 6, Issue: 7, e201303013 Computational and Structural Biotechnology Journal | www.csbj.org ANEXO III Gram-positive bacteria σECF factors: a focus on Bacillus subtilis and the CMNR group Running title: Bacillus subtilis and CMNR group bacteria σECF factors Bianca Mendes Souza1, Thiago Luiz de Paula Castro1, Rodrigo Dias de Oliveira Carvalho1, Nubia Seyffert1, Artur Silva2, Anderson Miyoshi1, Vasco Azevedo1* 1 Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil. 2 Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Genética, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil. *Correspondence to: Vasco Azevedo; Email: [email protected] Conflict-of-interest disclosure statement There are no conflicts of interest. Financial disclosure statement The authors have no relevant financial interests or conflicts related to this manuscript. Keywords: transcription regulation, sigma factor, ECF, stress response, Bacillus subtilis, Corynebacterium, Mycobacterium. 1 Abbreviations and acronyms: σ, sigma factor; σECF, extracytoplasmic function sigma factor; ABC transporter, ATP-binding cassette transporter; Ag85A, constituent A of the antigen 85 complex; Ag85C, constituent C of the antigen 85 complex; ATP, adenosine triphosphate; BHI, brain heart infusion; C, cytosine; CMNR, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia and Rhodococcus; C-terminal, carboxi-terminal; DNA, deoxyribonucleic acid; EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid; Enoyl-ACP, enoyl-acyl carrier protein; FBS, fetal bovine serum; Fe-S, iron-sulfur; G, guanine; GlcNAc, N-acetylglucosamine; H2O2, hidrogen peroxide; INH, isoniazid; iNOS, inducible nitric oxide synthase; iNOS-/-, iNOS knockout; Kb, kilobase; kDa, kilodalton; mRNA, messenger RNA; MurNAc, N-acetylmuramic acid; phosphate; N-terminal, NADPH, nicotinamide amino-terminal; N-terminus, adenine dinucleotide amino-terminus; PDIM, phthiocerol dimycocerosate; PE, phosphatidiletanolamine; PGRS, polymorphic GC-rich repetitive sequences; Poly(RboP), poly(ribitol phosphate); ppGpp, guanosine tetraphosphate; qRT-PCR, quantitative real time-polymerase chain reaction; RNA, ribonucleic acid; RNAP, RNA polymerase; SDS, sodium dodecyl sulfate; TB, tuberculosis; T CD4+, CD4+ T helper lymphocyte; T CD8+, CD8+ T helper lymphocyte; WHO, World Health Organization. Abstract In this review, we present an overview of the sigma factors, which are proteins that interact with the RNA polymerase and act as transcriptional regulators. Then, we focus on a specific group of alternative sigma factors – the so called σECF factors – of the 2 model Gram-positive bacterium – B. subtilis – and some of the main species that comprise the CMNR Group - Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pseudotuberculosis and Mycobacterium tuberculosis, providing information on the role that such factors exert in the i oo ga is s ph siolog and pointing some of the genes whose transcription is regulated by them. Introduction During their lifetime, bacteria are exposed to a range of different circumstances in which the activation of adaptive mechanisms is essential for cell maintenance and survival. The modulation of such activity is intricately driven by the means of gene regulation, involving diverse events at the transcriptional, translational and posttranslational levels. Thus, since transcription initiation is considered to be the major step in the control of bacterial genes, we discuss herein features and roles of the sigma (σ) factors, a class of proteins which interact with the RNA polymerase (RNAP) and act as transcriptional regulators.1-4 When inactive, the RNAP comprises only its core, which is formed by the subunits α2, β, β a d ω. On the other hand, when in association with a sigma factor, the core transiently becomes a RNAP holoenzyme, whose function is to transcribe the DNA into RNA.1,4-7 Therefore, the sigma factors, when in association with core RNAP, provide a dynamic mechanism for cellular responses held by redirecting the transcription initiation.8,9 Also, not only they contain many, if not all, of the promoter 3 recognition determinants,1,5,7 but they contribute to DNA strand separation during this process.8,9 Because these proteins preferentially recognize specific promoters in the genome, having distinct combinations of several of them with RNAP consists an effective way of modulating transcription profiles,3,10 switching expression of large groups of genes – regulons – in response to various environmental stimuli and changing extracellular and/or intracellular conditions4 in accordance with the physiological requirements of the organism.6 In some cases, the genes that comprise a specific regulon have a clearly defined primary function, like the ones regulated by the sporulation sigma factors in Bacillus subtilis;9,11 and in other cases, these genes contribute to multiple functions, such as those related to the stationary phase of growth and general stress response, regulated by the alternative sigma factor σB in Listeria monocytogenes.9,12 Also, particularly in the case of bacterial pathogens, the mechanism of changing sigma factors regulates the expression of virulence genes that encode proteins whose functions are essential for the bacterium to effectively establish an infection - and virulence associated genes - which contribute to survival in the host and other environments.9 Most of the sigma factors are not essential for cell viability under optimum growth conditions, so they are referred to as alternative sigma factors. Their functions typically encompass recognition of promoters of genes that become active in response to specific stimuli,4,7,13 like various stress conditions, in the stationary growth phase, during starvation for various nutrients,4 and during morphological differentiation.14 Nevertheless, bacteria (mainly the rapidly growing ones) usually have a single primary 4 sigma factor that is responsible for the transcription of genes required for basic survival, namely housekeeping genes.4,7,13 In fact, the number of alternative sigma factors in a bacterium may range from two - as in Streptomyces pyogenes, a Gram-positive bacterium whose habitat is restricted to the human oropharynx - to more than 60 - like in Streptomyces coelicolor, a soil bacterium whose habitat, opposite to that of S. pyogenes, is highly variable in terms of nutrients, stresses and competing microbial flora. Likewise, besides the fact that, in general, the number of sigma factors usually increases with genome size, bacteria that have developed differentiation programmes, like the ones that sporulate, have a tendency of presenting higher ratios of alternative sigma factors per genome size than those that are obligate pathogens or commensal bacteria.1,3,7 Classification overview of bacterial sigma factors Bacterial sigma factors can be classified into two structurally, functionally and phylogenetically distinct families designated σ54 family and σ70 family.1,4,6,7,9,15 The sigma factors of the σ54 family, which belong to this family because of their similarity to the 54 kDa sigma factor that is responsible for the regulation of the genes involved in the metabolism of nitrogen in Escherichia coli, require ATP and the action of an enhancer for exerting their function. Besides that, they are considered relatively rare1,4,7,15 since there are no known representatives of this family in any GC-rich Grampositive bacteria and cyanobacteria. On the other hand, the sigma factors of the σ70 family, which belong to this family because of their similarity to the 70 kDa primary 5 sigma factor from E. coli, can be found in all bacterial species.1,7,15 One could also say that this family includes the primary as well as their related alternative sigma factors which can be further categorized by the physiological processes that they control.9,16 Generally, groupings by function are correlated to the phylogenetic relationships among the sigma factors protein sequences 9,16 and, concerning this kind of classification, it is possible to say that the sigma factors of the σ70 family are modular proteins1,4 that are consisted of up to four conserved regions 1,3,4,17 that can further be divided into subregions. Region 1, which lies in the N-terminal portion of the protein, comprises subregions 1.1 and 1.2, being, the former, responsible for inhibiting the sigma factors that are not bound to the RNAP from biding to the DNA. Region 2, on the other hand, is consisted of four subregions, being subregion 2.3 involved in the formation of the transcription bubble and, subregion 2.4 required for the recognition of the -10 promoter element. Region 3, in turn, is composed of subregions 3.0, 3.1 and 3.2, being subregion 3.0 implicated in the recognition of the extended -10 promoter element. Lastly, region 4 includes subregions 4.1 and 4.2, being, the latter, responsible for interacting to various transcription activators as well as being required for the recognition of the -35 promoter element.1,3,4,16,18-25 Besides, all of these regions contribute to the sigma factor biding to the core RNAP.3,26,27 Also, depending on their structure and function, the sigma factors that belong to the σ70 family can still be divided into four groups. The first group (Group 1) is o posed of the p i a sig a fa to s , which have all four domains characteristic of 6 sigma factors and are considered to be essential to the survival of the microorganism, since they are responsible for most housekeeping genes transcription.1,3,6,7,15,16,28 The se o d g oup G oup like sig a fa to s , , o the othe ha d, is o posed of the p i a - hi h, although ei g losel elated to the sig a fa to s that belong to Group 1, are not considered essential to the survival of bacteria in normal growth conditions. Besides, they do not present most part of the conserved domain 1 in their structure. Also, the best characterized factors of this group are involved in the transcription of general stress response genes and of genes required for the survival of bacteria during the stationary growth phase. Nevertheless, these sigma factors are encountered only in a limited number of bacterial species (Proteobacteria, Cyanobacteria and Gram-positive bacteria with high G+C content in their genomes).1,3,6,7,16,28 The third group (Group 3), in turn, is composed of sigma factors more distantly related to the primary sigma factors, which present only the conserved domains 2, 3 and 4 in their structure. Also, the sigma factors that belong to this group are related to the transcription of genes such as those required for heat shock response, sporulation and flagellar biosynthesis.1,3,7,16,28 Finally, the fourth group (Group 4), considered being the largest and most heterogeneous among the groups that belong to the σ70 family, is composed of the e t a toplas i fu tio sig a fa to s σECF , hi h p ese t o l the o se ed domains 2 and 4 in their structure. These factors contribute to controlling the expression of genes whose products exert various functions in response to specific extracellular signals that come from the environment that surrounds the bacterium; 7 such as the presence of denatured proteins or toxic molecules, changes in osmolality or barometric pressure, nutrient limitation, oxidative and surface stresses. Besides that, several sigma factors that belong to this group are involved in the regulation of components that are considered to be important to the virulence of pathogenic bacteria.1,3,6,7,16, 28-30 Post-translational regulation of bacterial sigma factors One of the requirements for an effective bacterial gene expression is that it should be well orchestrated by the correct modulation of both the activity and the levels of its alternative sigma factors.7,31 In this sense, regulation of such factors could also be considered a key to the a ti atio of these i oo ga is s ade uate responses to specific external stimuli.4 The alternative sigma factors are regulated in the transcriptional, translational and post-translational levels,32 being, the transcriptional regulation, possible since one sigma factor may have more than one promoter. Additionally, these can be recognized by more than one transcriptional regulator that, in turn, can be activated by certain environmental stimuli. On the other hand, the translational regulation is often accomplished by the action of factors that can either allow or inhibit the translation of the mRNA. Interesting, however, is the fact that transcription of a gene that encodes a sigma factor through the recognition of determined promoters result in the synthesis of leaderless mRNAs, which preferentially bind to 70S ribosomes and, therefore, can be more efficiently translated in situations – such as carbon starvation, stationary 8 growth phase and slow growth – when the presence of the 70S ribosome prevails.33 Lastly, the post-translational regulation can be directly done by the anti-sigma factors.34 These factors act through a pa t e s it hi g s ste 7,31 in which protein- protein interactions result in the prevention of an anti-sigma fa to s og ate sig a factor bindi g to the o e ‘NAP, i hi iti g the sig a fa to s i fluence on gene expression profiles until the appropriate stimulus is noticed by the bacteria.3 The anti-σECF factors are inner membrane proteins with at least one transmembrane domain. It could also be said that, opposite to their C-terminal region, these anti-sigma factors N-terminus is highly conserved.31 Nevertheless, such characteristics are not without a purpose: the N-terminal region of these proteins, which is located in the cytoplasm, interacts specifically with the anti-sigma s og ate sigma factor. On the other hand, their C-terminus is projected to the periplasm, where it can interact with a sensor protein. In case of sensing a specific stimulus, the sensor protein interacts with the C-terminal portion of the anti-σECF factor, what modifies the anti-sig a s st u tu al o fo atio , leadi g to the disso iatio of the sig a fa to from its cognate anti-sigma factor. This, in turn, leads to the activation of proteases in order to degrade the anti-σECF factor. This way, the sig a fa to s i hi itio is a ulled and the genes that comprise its regulon are finally transcribed. However, the transcription of such genes only lasts while the sensor protein is still able to sense that stimulus and, once this extracellular signal is ceased, the regulation cycle reinitiates.30 9 The model Gram-positive a terium’s σECF factors The non-pathogenic bacterium called B. subtilis is one of the best studied microorganisms, being considered a model of study for Gram-positive bacteria with low G+C contents – which encompass deadly pathogens, such as Bacillus anthracis; and bacteria that are extensively used in industry, such as other bacilli and lactococci.35 This endospore-forming bacterium is one of the main sources of industrial enzymes – chiefly amylases and proteases – and, because of that, they are also used to study protein secretion and heterologous protein production.36 Found in association with plants, in water sources and, most commonly, in soil;36 B. subtilis often faces different harsh environmental conditions, such as oxygen and nutrient starvation, thermal, oxidative and osmotic stresses. Thus, this bacterium has to make use of some strategies in order to maintain its viability under such stresses and also to ensure its persistence and regrowth in that particular environment,37 being one of these strategies the activation of alternative sigma factors, such as one of its seven σECF factors: σM, σV, σW, σX, σY, σYlaC and σZ (Table 1).38-42 The σM factor of B. subtilis is encoded by a gene known as sigM. This gene is part of an operon in which it is located upstream of genes yhdL and yhdK that, in turn, encode for the anti-σM factor.43 Since σM is one of the best known σECF factors of B. subtilis, significant progress has been made in defining the functions of this sigma factor. This way, it has already been reported by several research groups that σM 10 contributes to B. subtilis response to cell wall antibiotics, such as vancomycin, bacitracin and phosphomycin; heat shock; and osmotic, ethanol, acid and superoxide stresses.42-46 Also, among the genes that comprise the σM regulon, it is more frequently pointed up ponA, which codes for a penicillin-binding protein; bcrC, which encodes a bacitracin resistance protein; yjbD, which seems to be involved in competence development; ftsH, which codes for a protease that is located in the cytoplasmic membrane; yqjL, which encodes a putative hydrolase; yceC, which belongs to the yceCDEFGH detoxification operon; yrhJ, which codes for a cytochrome P450/NADPH reductase; yraA, which encodes an intracellular protease PH1704 of Pyrococcus horikoshii homologue that was the first protein found to be essential for acid stress tolerance in this bacterial genus; yacK, which is a class III heat shock protein; yjbC and yacL, which are members of the heat shock stimulon.43-46 On the other hand, σV, which is one of the least studied σECF factors of B. subtilis, is encoded by a gene called sigV. This σECF factor is a member of an operon where it is localized upstream of the following genes: rsiV (previously named as yrhM), which encodes the anti-σV factor; oatA (previously named yrhL), which codes for a peptidoglycan O-acetyltransferase; and yrhK, whose function is still unknown.42,47,48 Until now, there are only a limited number of studies reporting the functions of the σV factor in the physiology of B. subtilis. Nevertheless, it has been recently reported by two different research groups that this σECF factor is not only strongly, but also specifically induced by lysozyme – an enzyme that hydrolyzes the β-1,4-glycosidic bond between the N-acetylmuramic acid (MurNAc) and the N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) of the peptidoglycan polysaccharide backbone.42,48 Also, Guariglia-Oropeza and 11 Helmann42 suggested that σV is the main responsible for B. subtilis response to lysozyme stress since the ΔsigV mutant and the mutant strain with null mutations in all seven σECF factor genes presented almost the same level of sensitivity to the stress in question. Besides, the intrinsic ability of B. subtilis to resist to lysozyme exposure is probably due to the fact that its σV, sometimes along with other σECF factors, is responsible for the upregulation of oatA, which encodes a peptidoglycan Oacetyltransferase; dltA, which is part of the dltABCDE operon that, in turn, codes for enzymes for teichoic acid D-alanylation; and, apparently in a lesser extent, pbpX, which is a penicillin-binding protein.42,48 The σW factor of B. subtilis, another one of the best studied sigma factors of this bacterium, is encoded by a gene named sigW that is located upstream of the rsiW gene, which codes for the anti-σW factor.49 It is already known that the σW regulon is relatively large, being induced, most of the times, when the microorganism is exposed to agents that interfere in the cell wall biosynthesis and/or in its proper functioning.50 In this sense, σW activates the expression of several genes that have an important role in the detoxification of the bacterium, such as fosB, which encodes a phosphomycin resistance protein; ybfO, which codes for an erythromycin esterase; ydjP, which encodes a bromoperoxidase; yfhM, which codes for an epoxide hidrolase; pbpE, which encodes a penicillin-binding protein and the already cited yceC, which belongs to the yceCDEFGH detoxification operon and is also induced by the σM factor, that codes for a tellurium resistance protein. Besides, σW can activate the expression of genes that, probably, participate in the synthesis and/or secretion of bacteriocins, such as ywoA, which codes for a predicted bacteriocin permease; yqeZ and sppA, which encode 12 protease IV homologues and the yknXYZ operon, which codes for an ABC transporter that is supposedly involved in bacteriocins exportation.50,51 This way, Cao et al.50 suggested that the σW factor of B. subtilis o t ols a a ti iosis regulon – as they called it, which includes genes that code both defensive and offensive components for the survival of the microorganism. The σX of B. subtilis, which is encoded by a gene known as sigX, is found upstream of the rsiX gene (previously named ypuN) that codes for the anti-σX factor. Interestingly, sigX and rsiX are homologous to fecI and fecR of E. coli, being the former the σECF factor responsible for activating the transcription of the fecABCDE operon, which encodes the ferric citrate transport genes; and the latter a transmembrane protein responsible for inducing the transcription of the ferric citrate transport genes once ferric citrate binds to an outer membrane protein called FecA. Nonetheless, inasmuch as the SG64 strain (trpC2, lacR1 and lacA17 genotype) does not use ferric citrate as an iron source, studies showed that neither sigX nor rsiX are involved in ferric citrate transport in B. subtilis.52 On the other hand, they appear to be involved in controlling cell envelope modification processes, such as resistance to heat shock53 and to cationic antimicrobial peptides,54 septum and wall synthesis53 and biofilm architecture.55 Among the genes that comprise the σX regulon are tarA, which is related to poly(RboP) – the most important teichoic acid of the W23 strain (prototroph, Strr phenotype) – synthesis; divIC, whose product is required for the initiation of septum formation; lytR, whose product negatively regulates the lytABC operon, being LytC an amidase; dltABCDE, which encodes enzymes for teichoic acid Dalanylation; csbB, which codes for a membrane-bound glucosyl transferase; rapD, 13 which encodes a response regulator aspartate phosphatase; pssA and psd, which code for phosphatidiletanolamine (PE) biosynthesis enzymes; and abh, whose product is an AbrB homologue that regulates biofilm architecture.53-55 The σY of B. subtilis, which is encoded by a gene known as sigY, appears to be regulated by the product of the gene yxlC, located immediately downstream of sigY in the sigY-yxlCDEFG operon.56,57 This factor, being another one of the least studied σECF factors of this bacterium, does not have its functions well defined. Nevertheless, Mendez et al.57 reported that, besides regulating the transcription of its own operon, σY is required for maintaining the Spβ prophage, which is a viral genome of 135 Kb that owns genes for the production of and resistance to the antibiotic sublancin, in the chromosome of B. subtilis. This way, it was concluded that, like other σECF factors of B. subtilis, σY is responsible for the regulation of genes that contribute to the survival of the bacterium when it comes to the necessity of producing and resisting to the action of antibiotics in a certain environment.57 The σYlaC of B. subtilis is encoded by a gene known as ylaC, which is found upstream of the ylaD gene – whose product is the probable anti-σYlaC factor – in the ylaABCD operon.58,59 This σECF factor, like σV and σY, does not have its functions well elucidated. However, Matsumoto et al.58 as well as Ryu et al.59 have suggested that this sigma factor contributes to B. subtilis resistance to oxidative stress, since YlaD is very similar to RsrA, the anti-σR factor of S. coelicolor that presents several cysteine residues that, in turn, sense the cytoplasmic thiol-disulphide status. Nevertheless, only Ryu et al.59 were able to show that σYlaC, in fact, contributed to oxidative stress resistance, when they observed that a strain overproducing this factor exhibited a 14 peroxidase activity of almost three times the activity of the control strain under hydrogen peroxide treatment. Lastly, the least studied σECF factor of B. subtilis – σZ – is encoded by a gene known as sigZ. Interestingly, opposite to the other σECF factors of this bacterium, σZ appears to be monocistronic and it does not seem to direct its own transcription. Also, it looks like σZ does not regulate many genes, being gsiB – a proven σB target – and yrpG the only genes which have been suggested so far to be possibly activated by this sigma factor.60 σECF factors in the CMNR group Within the Class Actinobacteria, which is mainly characterized by the high G+C content in the genome of its members, there is a group of microorganisms referred to as the CMNR Group. This, in turn, is characterized by the cell wall organization of its members – which is based on the presence of a polymer complex that is composed by peptidoglycans, arabinogalactans and mycolic acids – that belong to the genera Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia and Rhodococcus.61 Nevertheless, it must be highlighted that, until now, there are no reports on the σECF factors of the bacteria belonging to the Nocardia and Rhodococcus genera and that is the reason why they were not discussed here. Corynebacterium’s σECF factors 15 Corynebacterium glutamicum Some of the species that compose the CMNR Group stand out by their potential to be used as biotechnological tools, such as C. glutamicum, which has been widely used in the industrial production of several amino acids and nucleic acids.62 This bacterium, which is a non-pathogenic species of increasing interest as a model organism to closely related pathogenic species, has only 5 σECF factors, namely σC, σD, σE, σH and σM (Table 2). Of these, only σE, σH and σM have been studied in more detail and, on the other hand, there are not any studies on σC published so far.4 Also, to date, there is only one report that might give some hints about the functions of σD, being suggested that this sigma factor contributes to the survival of C. glutamicum under low oxygen concentrations.63 In this context, it has already been reported that σE – encoded by a gene called sigE that is located upstream of cseE which codes for the anti-σE factor – has a role in the resistance of C. glutamicum to cell surface stresses, such as those caused by the addition of SDS, lysozyme, EDTA and antibiotics to the culture medium; deficiency of magnesium and heat.64,65 Also, it appears that σE o t i utes to this a te iu s response to nutritional stress, long-term exposure to lactic acid and microaerobic conditions.63,66,67 In turn, it has been demonstrated that the σH of C. glutamicum, which is encoded by a gene called sigH that is found upstream of the gene rshA that appears to code for the anti-σH factor, regulates directly or indirectly the expression of more than 65 genes,68 among which are found genes that act in the response of this 16 microorganism to heat shock and oxidative stress. Besides, interestingly, this sigma factor is involved in the regulation of transcription of sigB, sigE, sigH and sigM – genes that code for alternative sigma factors; hspR, clgR, sufR, whcA and whcE – genes that code for other stress response regulators. Thus, these data suggest that σH holds a central position in the sigma factors regulatory network, playing a key role in the response of C. glutamicum to several environmental stresses.4 Lastly, the σM of C. glutamicum – encoded by a gene called sigM – takes part in this a te iu s esponse to cold, heat and oxidative stresses. In regard to the response of C. glutamicum to disulfide stress, it appears that σM activates the transcription of the suf genes – sufR and sufBDCUS, which are involved in the formation of iron-sulfur (Fe-S) clusters and their insertion in proteins; trxB, trxC and trxB1, which are involved in the ell s espo se to thiol o idizi g o ditio s; groES, groEL and clpB, which code for chaperones. Noteworthy, as mentioned before, it was also suggested that σH activates the transcription of σM when this microorganism is exposed to oxidative stress.69 Corynebacterium pseudotuberculosis C. pseudotuberculosis is a facultative intracellular pathogen that is capable of infecting different types of animals, such as goats, sheep, horses, llamas, buffaloes, camels, antelopes and primates.70 Until the year 2005, this bacterium had already been associated to the occurrence of at least 25 cases of human infection, being the majority of the infected people who had had contact with sick animals, such as 17 breeders and veterinarians, what indicates the high occupational zoonotic potential of this bacterium.71,72 Thereby, it could be said that one of the reasons why C. pseudotuberculosis is able to cause successful infections in such a wide range of hosts is due to transient activation of its sigma factors, including its σECF factors: σC, σD, σE, σH, σK and σM (Table 2). To date, however, there are not any reports about the functions of sigma factors other than σD and σE in this bacterium. After conducting growth curves of C. pseudotuberculosis in Brain Heart Infusion (BHI) broth and Fetal Bovine Serum (FBS), it was observed that the bacterium presented an increased growth rate when cultured in FBS (a culture medium that mimics the presence of some host factors, such as serum proteins, hormones, lipids and vitamins), indicating that there had been changes in the physiology of C. pseudotuberculosis under those conditions. Thus, in order to evaluate the differential expression of the genes that code for the alternative sigma factors of this microorganism in the presence of FBS, reactions of qRT-PCR (quantitative Real TimePolymerase Chain Reaction) were performed. From the results obtained, it was possible to observe changes in the expression of the sigB, sigC, sigD, sigE, sigH, sigK and sigM genes. However, only sigD presented significantly higher transcriptional levels in the tested environmental condition. This, in turn, indicates that σD represents an important target in the study of C. pseudotuberculosis molecular determinants of virulence.73 Also, it was demonstrated that the σE of C. pseudotuberculosis – encoded by a gene called sigE that is located upstream of the gene cseE, which, in turn, probably 18 codes for the anti-σE factor – has a role in the resistance of this bacterium to SDS, lysozyme, acid, nitric oxide and nitric oxide/peroxide stresses. Noteworthy, it was also reported that this sigma factor is required for the resistance of C. pseudotuberculosis to nitric oxide stress during infection since, opposite to the sigE null mutant (ΔsigE) that persisted only in the spleens of mice that were unable to produce nitric oxide in their intraphagosomes - iNOS knockout (iNOS-/-) mice, the 1002 wild-type strain still persisted in the spleens of C57BL/6 and iNOS-/- mice after three days of infection.74 Mycobacterium’s σECF factors Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis is the main etiologic agent of human tuberculosis (TB),75 being TB an infectocontagious disease intimately associated to poverty that occurs mostly in developing countries.76,77 Besides that, it was estimated by the World Health Organization (WHO)78 that, by the year 2010, almost nine million people had contracted and approximately 1.5 million people had died from this disease all over the world. One of the reasons why M. tuberculosis is such a successful intracellular pathogen is its ability to respond to the different stresses that it is submitted to once it has infected the host by transiently activating its alternative sigma factors, which include the σECF factors σC, σD, σE, σG, σH, σI, σJ, σK, σL and σM (Table 3). 19 In this context, the σC of M. tuberculosis, which is encoded by a gene known as sigC, appears to have a crucial role in the pathogenicity of this mycobacteria,79-81 regulating the transcription of virulence genes, such as hspX - crystalline homologue; senX3, which encodes a sensor kinase; mtrA, which codes for a response regulator; and fbpC, which encodes the constituent C of the antigen 85 complex – Ag85C.79 In turn, σD, which is encoded by the sigD gene, appears to be related to the response of M. tuberculosis to nutrient starvation that is, at least, partially dependent on the activation of this sigma factor by the ppGpp synthase RelA. Besides that, σD seems to promote optimum growth of this microorganism in the beginning of infection, having an important role in nascent protein folding.82 Also, during the stationary phase of growth, this σECF sigma factor appears to activate the transcription of genes that code for ribosome components and factors that participate in ATP biosynthesis, DNA repair, the elongation step of translation and bacterial virulence; such as atpC and atpD, which code for subunits of a proton-gradient ATP synthase; hns, which encodes a histone-like protein; recR, which codes for a DNA repair enzyme; tsf, fusA and tuf, which are elongation factors; pks10, which encodes a polyketide-like chalcone synthase; fbpA, which codes for the constituent A of the antigen 85 complex – Ag85A; and mce1, which encodes a protein that has a role in M. tuberculosis uptake into cells that are not phagocytic.83 σE, one of the best studied σECF factors of M. tuberculosis – encoded by the gene sigE, seems to be related to the response of this bacterium to heat shock, oxidative stress, vancomycin and membrane-disrupting agents, such as SDS. Besides, it 20 has already been reported that mutants deficient for σE show some difficulty to grow inside inactivated murine and human macrophages and are more sensitive to the microbicide activity of activated murine macrophages.84-87 Also, this sigma factor appears to regulate the transcription of genes involved in fatty acid degradation, such as aceA – which codes for an isocitrate lyase – and fadB2 – which encodes a 3hydroxyacyl-CoA dehydrogenase; heat shock proteins, such as hsp – which codes for a chaperone – and htpX – which encodes a membrane prenyl-protease; and other transcriptional regulators, such as sigB – which codes for the primary-like sigma factor σB.84 σG - which is encoded by a gene called sigG – is one of the least studied σECF factors of M. tuberculosis, along with σI and σJ. This factor, which, according to Lee et al.88, appears to be involved in the response of M. tuberculosis to DNA damage and seems to regulate directly and/or indirectly genes that have a role in the SOS system, such as lexA – which codes for a repressor of the activity of other genes that take part in this response. However, according to Smollett et al.89, σG is only part of the RecAindependent regulon and appears to control the transcription of secondary genes that are not directly responsible for the repair of damaged DNA. Nevertheless, this σECF sigma factor also seems to regulate, in a direct and/or indirect manner, genes that are induced in the murine model of infection, such as lat – which codes for an L-lysineepsilon aminotransferase; have a role in fatty acid metabolism, such as aceA – which encodes an isocitrate lyase that is also part of the σE regulon; fadE5 – which codes for an acyl-CoA dehydrogenase; and scoA – which encodes a succinyl-CoA. Also, σG appears to be involved in the regulation of genes that are part of other transcriptional 21 regulators regulons, such as rpfC – which encodes a resuscitation-promoting factor regulated by σD; clpB, dnaK – which code for heat shock proteins – and trxB2 – which encodes a thioredoxin reductase – regulated by σH.88 The alternative sigma factor σH – which is encoded by the gene sigH – has an important role in the response of M. tuberculosis to heat shock and oxidative stress9094 and presents its transcriptional levels increased during macrophage infection in vitro.90,91 It appears to regulate the transcription of genes involved in the response to heat shock, such as dnaK and clpB – which code for heat shock proteins/chaperones; genes involved in the response to oxidative stress, such as trxB2 – which encodes a thioredoxin reductase – and trxC – which codes for a thioredoxin; and other transcriptional regulators involved in the response to the same stresses, such as sigB – which encodes the primary-like sigma factor σB – and sigE – which codes for the alternative sigma factor σE.91 Besides that, the infection of resistant (B57BL/6) and sensitive (C3H) mice with the wild-type and mutant (ΔsigH) strains of M. tuberculosis showed that the former presents an increased immunopathology when compared to the latter, what seems to be due to the reduced recruitment of T CD4 + and CD8+ cells by the mutant strain.92 This, in turn, suggests that the regulon of σH is required for the modulation of the innate immune response of the host against M. tuberculosis.94 σI, one of the least studied σECF factors of M. tuberculosis, is encoded by the gene sigI. This sigma factor, which appears to regulate directly or indirectly the transcription of the genes that code an ATP synthase (Rv1304), heat shock proteins (Rv0440, Rv0350 and Rv3417) and the catalase/peroxidase KatG; seems to have a role in the response of this microorganism to isoniazid (INH) – one of the drugs that are 22 commonly used in the treatment of tuberculosis. However, interestingly, opposite to what is usually seen, it is the ΔsigI mutant strain – and not the wild-type strain – that is resistant to the antibiotic. In fact, this happens once the absence of σI contributes to the decrease of the transcription of the gene katG, which encodes the catalase/peroxidase KatG. The reduced levels of this enzyme, in turn, contributes to the decrease of the activation of INH and, this way, there is a reduction of the inhibition of the enoyl-ACP reductase InhA, which is needed for mycolic acid biosynthesis. Besides that, also noteworthy is the fact that the mutant strain was considered hypervirulent in the mouse model of tuberculosis when compared to the wild-type strain.95 According to Hu and Coates,96 the sigJ gene – which codifies the poorly studied σJ, had its transcription highly increased in M. tuberculosis cultures in the late stationary phase, being the level of transcription of sigJ not altered when the antibiotic rifampicin was added to the cultures. Thereby, it was concluded that the σJ factor appea ed to e i po ta t to the a te iu s su i al in the stationary phase even in the presence of antibiotics. However, a few years later, the same research group showed that, in a microaerophilic in vitro model, the survival of the ΔsigJ mutant strain was similar to the survival of the wild-type strain. Also, it was demonstrated that, even with the addition of rifampicin, the viability of both strains was still the same. Besides that, it was shown that the growth of the wild-type and mutant strains was similar in an immune stasis murine model. Thus, this time, it was concluded that σJ did not contribute to M. tuberculosis survival in the stationary phase of growth either in the presence or in the absence of antibiotics. Interestingly, it was also concluded that the 23 ΔsigJ mutant strain was more sensitive to oxidative stress caused by hydrogen peroxide (H2O2) than the wild-type one.97 The σK factor of M. tuberculosis – codified by the sigK gene, which is regulated by the anti-σK factor RskA, has a relatively small regulon when compared to the regulons of the other σECF factors, being the σK regulated genes those found in the sigK and mpt70/mpt83 loci. An interesting fact, however, is that, in M. tuberculosis, the transcription of the Mpt70 and Mpt83 proteins – whose functions are still unknown – only increases during infection and, in Mycobacterium bovis, the transcription of these proteins is constitutively high due to two mutations in the anti-σK factor codifying gene – rskA.98-100 σL, which is codified by the sigL gene, does not seem to be a stress response regulator like the other σECF factors of M. tuberculosis. Instead, it appears to regulate the transcription of genes that have a role in polyketide-lipid synthesis and genes that codify membrane associated genes that, in turn, are involved in proteins posttranslational modifications. In fact, this σECF factor has a relatively small regulon that comprises four small operons: sigL-rslA – which code for the σL factor and the anti-σL factor; mpt53-Rv2877c – which encode a disulfide oxidoreductase and a thiol disulfide; pks10-pks7 – which code for a type III polyketide synthase and a multifunctional enzyme; and Rv1139c-Rv1138c – which encode an oxidoreductase and a membrane protein with a isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase motif. Besides, it is possible that it regulates four PE-PGRS genes indirectly. Also, it is noteworthy that the ΔsigL strain is highly attenuated in an in vivo mouse model of infection. That, together 24 with the data presented above, indicates that σL probably contributes to M. tuberculosis pathogenicity.101 σM – the last σECF factor of M. tuberculosis – is encoded by the gene sigM. This sigma factor seems to positively regulate genes such as those that codify ESAT-6-like proteins – esxU-esxT and esxE-esxF, members of the PPE protein family and a nonribosomal peptide synthase. Also, it appears to negatively regulate genes involved in phthiocerol dimycocerosate (PDIM) synthesis and the kasA-kasB operon, which is related to the mycolic acid synthesis, among others.102,103 However, according to Agarwal et al.,103 the transcripts of the genes regulated by σM accumulate – also in relatively low levels – only during the stationary phase of growth and when the bacteria is submitted to heat shock. Besides that, a ΔsigM mutant strain had the same behavior as the wild-type strain in an in vitro macrophage infection and in an in vivo mouse infection.103 Thus, in accordance with Raman et al.,102 it is likely that σM is one of the transcriptional regulators responsible for promoting successful host-pathogen interactions at the later stages of infection. Conclusions A great part of bacteria s e satilit – at least the ones cited here – is due to the role of their sigma factors, especially their σECF factors, as positive and/or negative regulators of gene transcription, what, in turn, influences the adaptation of the microorganisms to changes in the surrounding environments. Thus, the elucidation of the specific stimuli that activate the σECF factors, the genes whose expression is 25 regulated by them and their regulatory networks would contribute to a better understanding of the overall regulation of gene expression and, hence, of the physiology of these microorganisms. Also, it could provide information on new bacterial strains with biotechnological potential and/or on how to improve the capability of currently used strains, such as those of B. subtilis and C. glutamicum. Finally, it could assist in the search for virulence factors of pathogens, such as C. pseudotuberculosis and M. tuberculosis, what could point to therapeutic and vaccine targets. Acknowledgments We acknowledge the financial support from Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). References 1. Gruber TM, Gross CA. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol 2003; 57: 441-66. 2. Browning DF, Busby SJ. The regulation of bacterial transcription initiation. Nat Rev 2004; 2: 57-65. 3. Rodrigue S, Prowed R, Jacques P, Gaudreau L; Manganelli R. The σ factors of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiol Ver 2006; 30: 926-41. 26 4. Pátek M, Neš e a J. “ig a fa to s a d p o ote s i Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol 2011; 154:101-13. 5. 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Function -Response to cell wall antibiotics; heat shock; and osmotic, ethanol, acid and superoxide stresses -Response to lysozyme stress -Response to agents that interfere in cell wall biosynthesis and/or in its proper functioning -Detoxification of the bacterium -Synthesis and/or secretion of bacteriocins -Control of cell envelope modification processes -Response to heat shock and cationic antimicrobial peptides -Septum and wall synthesis; -Biofilm architecture -Production of and resistance to the antibiotic sublancin -Response to oxidative stress -To be elucidated Table 2: Corynebacterium’s σ factors and their corresponding functions. Sigma Coding Species Function factor gene C sigC σ -To be elucidated D sigD σ -Response to microaerobic conditions -Response to nutritional and cell surface stresses; heat shock; deficiency of E sigE σ magnesium; long exposure to lactic acid; Corynebacterium and microaerobic conditions glutamicum -Response to heat shock and oxidative H sigH σ stress -Response to heat shock, cold and M sigM oxidative stresses σ Reference 42-46 42,48 50,51 53-55 57 59 60 ECF σ D σ sigC sigD σ E sigE σ K σ M σ sigH sigK sigM C Corynebacterium pseudotuberculosis H -To be elucidated -Appears to have a role in virulence -Response to SDS, lysozyme, acid, nitric oxide and nitric oxide/peroxide stresses -To be elucidated -To be elucidated -To be elucidated Reference 4 63 63-67 4 69 73 74 - 41 Table 3: Mycobacterium tuberculosis’ σ factors and their corresponding functions. Sigma Coding Function factor gene C sigC σ -Appears to have a role in virulence -Response to nutrient starvation -Promotion of optimum growth in the beginning of infection D sigD σ -Folding of nascent protein -Role in ATP biosynthesis, DNA repair, the elongation step of translation and bacterial virulence -Response to heat shock, oxidative stress, vancomycin and membrane-disrupting agents E sigE σ -Appears to have a role in virulence -Role in fatty acid degradation -Appears to have a role in DNA repair, virulence and fatty acid G sigG σ metabolism -Response to heat shock and oxidative stress H sigH σ -Appears to have a role in virulence -Response to heat shock and to the drug isoniazid I sigI σ -Role in ATP biosynthesis J sigJ σ -Appears to have a role in the response to oxidative stress K sigK σ -To be elucidated -Appears to have a role in proteins post-translational L sigL σ modifications and virulence -Appears to promote successful host-pathogen interactions at M sigM σ the later stages of infection ECF Reference 79-81 82,83 84-87 88,89 90-94 95 97 98-100 101 102,103 42 ANEXO IV bs_bs_banner Ion Torrent-based transcriptional assessment of a Corynebacterium pseudotuberculosis equi strain reveals denaturing high-performance liquid chromatography a promising rRNA depletion method Thiago L. P. Castro,1 Nubia Seyffert,1 Rommel T. J. Ramos,2 Silvanira Barbosa,2 Rodrigo D. O. Carvalho,1 Anne Cybelle Pinto,1 Adriana Ribeiro Carneiro,2 Wanderson Marques Silva,1 Luis G. C. Pacheco,3 Christopher Downson,4 Maria P. C. Schneider,2 Anderson Miyoshi,1 Vasco Azevedo1 and Artur Silva2* 1 Institute of Biological Sciences, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil. 2 Genome and Proteome Network of the State of Pará, Universidade Federal do Pará, Brazil. 3 Institute of Health Sciences, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Brazil. 4 School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry, UK. Summary Corynebacterium pseudotuberculosis equi is a Grampositive pathogenic bacterium which affects a variety of hosts. Besides the great economic losses it causes to horse-breeders, this organism is also known to be an important infectious agent to cattle and buffaloes. As an outcome of the efforts in characterizing the molecular basis of its virulence, several complete genome sequences were made available in recent years, enabling the large-scale assessment of genes throughout distinct isolates. Meanwhile, the RNA-seq stood out as the technology of choice for comprehensive transcriptome studies, which may bring valuable information regarding active genomic regions, despite of the still impeditive associated costs. In an attempt to increase the use of generated reads per instrument run, by effectively eliminating unwanted rRNAs from total RNA samples without relying on any commercially available kits, we applied denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) as Received 1 October, 2012; revised 13 November, 2012; accepted 14 November, 2012. *For correspondence. E-mail [email protected]; Tel. +55-91-32018426; Fax +55-91-31837931. doi:10.1111/1751-7915.12020 Funding Information This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). an alternative method to assess the transcriptional profile of C. pseudotuberculosis. We have found that the DHPLC depletion method, allied to Ion Torrent sequencing, allows mapping of transcripts in a comprehensive way and identifying novel transcripts when a de novo approach is used. These data encourage us to use DHPLC in future transcriptional evaluations in C. pseudotuberculosis. Introduction Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive and facultative intracellular bacterium that does not sporulate, has fimbriae, and displays pleomorphic cells which vary from coccoid to filamentary rods, measuring up to 0.6 mm per 3 mm in size (Jones and Collins, 1986; Baird and Fontaine, 2007). Two biovars have been described for C. pseudotuberculosis, ovis and equi; they are mainly distinguished by their ability to reduce nitrate and tropism for infecting particular kinds of animals (Biberstein et al., 1971). Caprine, ovine, equine and bovine are among the most prominent hosts, to whom the infection by C. pseudotuberculosis can cause distinct clinical signals. The nitrate-negative biovar ovis, the most studied of C. pseudotuberculosis, causes caseous lymphadenitis in sheep and goats, a chronic disease characterized by the abscessation of external and internal lymphnodes. On the other hand, the biovar equi commonly tests positive for nitrate reduction, and is associated to distinct diseases in a variety of hosts, including ulcerative lymphangitis in horses and contagious acne in cattle (Paton et al., 1994; Braverman et al., 1999; Spier et al., 2004). Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi is also the causative agent of oedematous skin disease in buffaloes, characterized by superficial swellings which culminate in the formation of abscesses and release of serous bloody exudates (Barakat et al., 1984). Recent efforts in elucidating the molecular features associated to host tropism and virulence have led to the acquisition of whole-genome sequences of six different strains of C. pseudotuberculosis equi, all of them made public in the National Center for Biotechnology Information databases (NCBI). However, additional studies © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 2 T. L. P. Castro et al. comparing such sequenced strains are necessary, similarly to what is already being done with biovar ovis specimens. Two distinct studies have lately benefited from genomic data to compare traits among the strains 1002 and C231, isolated from goat and sheep respectively. Ruiz and colleagues (2011) revealed that C231 lacks genes involved in gluconeogenesis and triacylglycerol degradation, while these pathways are likely to be present in 1002. Still, the availability of annotated features, combined to LC-MSE proteomics, has allowed Pacheco and colleagues (2011) to accurately identify 49 proteins which are exported uniquely by one of these two strains. The assessment of differences between intraspecies genomes is challenging due to their strong evolutionary links, but this process may be largely facilitated by associating high-quality genomic information with comprehensive transcriptomic data. In this context, the massively parallel RNA-sequencing technologies (so-called RNAseq) stand out providing the ultimate strategy for validating regions in the genome which are predicted to be transcribed, as well as estimating their transcriptional levels. By performing RNA-seq of an organism, it is also possible to identify operon structures and set new coding sequences (CDS), including untranslated regulatory elements (ncRNAs), what allows a more precise annotation of features present in the genome (Sorek and Cossart, 2010). The first RNA-seq work involving C. pseudotuberculosis was published recently by Pinto and colleagues (2012). The authors describe a set of genes from the 1002 strain which are co-regulated in response to adverse environmental conditions, such as high temperature and elevated osmolarity in the growth medium. Despite being of great value for structural genomics, RNA-seq experiments are limited by the large quantity of reads which correspond to ribosomal RNA sequences. This is explained by the fact that more than 80% of the overall synthesized RNA in bacteria and eukatyotes is ribosomal (Westermann et al., 2012). Therefore, it is usual to submit total RNA to rRNA subtraction prior to the cDNA library construction, using commercially available kits based on rRNA exonuclease digestion or hybridization with specific probes. In the specific case of eukaryotic transcriptomes, it is also possible to enrich mRNA molecules with poly(A) selection (Martin and Wang, 2011). Although the effectiveness of these methods can be questioned, due to the presence of residual rRNAs in sequencing samples and additional costs involved, none remarkable published work regarding RNA-seq analysis in prokaryotes have ignored the depletion step (van Vliet, 2010). Considering the current demand on RNA-seq experiments for C. pseudotuberculosis and other related bacteria, and the desire to improve the rates of mRNA sequences compared with those obtained with a commer- cially available kit, we decided to test denaturing highperformance liquid chromatography (DHPLC) as an alternative method for rRNA depletion. This chromatographic method allows the separation of nucleic acid molecules according to their hydrophobic characters, relying on a nonporous alkylated poly(styrene divinylbenzene) bead matrix as stationary phase. (Azarani and Hecker, 2000). In spite of being usually applied to mutational analysis and gene mapping purposes, the DHPLC could fit our needs since fractional recovery of initially loaded samples for downstream applications is possible, besides the fact that differences between rRNAs and mRNAs are visualized in the UV (260 nm) absorption-based chromatograms. In order to evaluate the outcomes brought about by DHPLC treatment, we have chosen the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM™) for cDNA library sequencing, once it is recognized as providing satisfactory read lengths in a time- and cost-effective manner (Meldrum et al., 2011; Jünemann et al., 2012). Therefore, by assessing the transcriptional activity of a C. pseudotuberculosis equi strain, we report a novel strategy combining DHPLC rRNA depletion and high-throughput sequencing, which could be employed in additional works on this species, apart from potentially extended to other model organisms. Results and discussion DHPLC depletion of rRNA and qRT-PCR validation All extracted total RNA samples from C. pseudotuberculosis 31 showed similar chromatogram profiles after DHPLC analysis, such as the one illustrated in Fig. 1A. This is an important result for us, once in order to standardize the DHPLC rRNA depletion methodology we had to set a reliable interval representing our fraction of interest. Taking into account the WAVE® DHPLC System manufacturer’s recommendations (Transgenomic) and the separation profiles generated for C. pseudotuberculosis, the retention period from 10 up to 14 min constituted the fraction to be collected for further evaluations of depletion in this work. The collected material was reanalysed using DHPLC, and a prominent peak likely to be formed by mRNA molecules came out in the chromatographic profile (Fig. 1B). Quantitative reverse transcription PCR assays (qRTPCR) showed partial removal of 16S rRNA after DHPLC fractioning, as occurred with samples treated in a parallel way using the commercial depletion kit RiboMinus (Chen and Duan, 2011) (Fig. 2). The rates of depletion with DHPLC ranged from 78.2% up to 92.2% in relation to the initial rRNA levels observed in non-treated total RNA samples. For the RiboMinus treatment, the rates ranged from 58.8% up to 88%, with a greater experimental variation in depletion efficiency when compared with what was © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. An alternative methodology for rRNA depletion 3 Fig. 1. Chromatograms of a RNA sample before and after DHPLC fractionation for rRNA removal. A. Total RNA sample chromatographic profile. The two highest spikes correspond to ribosomal RNAs, and the red dashed lines delimitate the interval of run corresponding to the collected sample (mRNA) for downstream applications. B. Chromatographic profile of sample submitted to depletion with DHPLC. The green dashed lines virtually represent the previously selected area for sample collection. The proportion between the selected peak and the rRNA-related spikes appears to be more balanced in this case. seen for DHPLC. This leads us to suggest that the DHPLC fractionation method is probably less sensitive to minor inter-sample variations than the hybridization subtractionbased RiboMinus kit. However, it was not possible to state DHPLC as the most efficient depletion method, since it significantly demonstrated better performance in only two out of four independent experiments. In this context, it is prudent to consider that for our model organism, DHPLC provides at least the same depletion levels of a wellestablished and broadly trusted commercially available kit. Fig. 2. Percentages of 16S rRNA depletion for each of four independently prepared biological replicates, in relation to the sigA gene mRNA levels. DHPLC and RiboMinus treatments were performed in a parallel way for each replicate. The asterisks indicate the cases where the levels of depletion observed for DHPLC were significantly different from those seen for RiboMinus, according to the software REST 2009. © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. 4 T. L. P. Castro et al. Reference-based transcriptional assessment The transcriptome of C. pseudotuberculosis 31 was assessed based on the RiboMinus- and DHPLC-depleted RNA samples, both derived from the same extraction but independently converted into cDNA for Ion Torrent sequencing. For RiboMinus, we estimated 58.75% of all sequences with Phred quality score greater or equal to 15 as being related to rRNA-coding genes (198 366 out of 337 645 reads), while for DHPLC the proportion of rRNArelated sequences decreased to 45.08% of total with Phred 15 score (183 963 out of 408 082 reads). The reads which have mapped against the CDS from the reference genome but are not ribosomal totalize 53 679 and 74 029 for RiboMinus and DHPLC respectively. The average length of total mapped reads was 143.35 nucleotide bases for RiboMinus and 144.59 bases for DHPLC. For both transcriptomes, we investigated the representativity of biological processes and molecular functions attributed by Gene Ontology (GO) (Fig. 3). By comparing the samples, we noticed some similarity in the distribution of transcribed genes across the different classes considered, and this was expected since the same biological condition was addressed. However, the majority of classes presented a higher number of different transcripts in the case of DHPLC, what can be partially attributed to the larger number of non-ribosomal mapped reads acquired for the sample treated by this method. The process represented by the greatest number of transcripts was oxidation-reduction, whereas only a few transcribed elements were related to pathogenesis or cell adhesion, what is supported by the fact that the bacteria had been cultured without interacting with any hosts. Taking into account the functional classification, while transcripts for the class of structural constituents of ribosomes were the most abundant ones in the RiboMinustreated sample, there was a greater representativity for the class of nucleic acid binding in the case of DHPLC depletion, including genes directly involved in transcriptional regulation. Many of the identified transcripts were shared by both transcriptomes; among them we highlight the antigen 84, which is reported to be essential for Mycobacterium smegmatis polarization during cellular division, besides acting in the modulation of cell shape in pleiomorphic actinobacteria (Nguyen et al., 2007). Other interesting detected transcript codifies for a protein similar to the diphteria toxin (DT). The DT is described as the main virulence factor produced by Corynebacterium diphtheriae, and other proteins which are similar to DT in molecular weight and immunological structure have been detected in other pathogenic corynebacteria (Wong and Groman, 1984; Efstratiou et al., 1998). We can also mention the transcript for superoxide dismutase, known to be important for survival of M. tuberculosis inside activated macrophage cells (Piddington et al., 2001). Finally, we cite the transcripts for heat shock proteins (HSPs), which are involved in thermal stress adaptation and are also capable of inducing both humoral and cellular immune responses in the host (Pinho et al., 2009). Among the transcripts uniquely identified following DHPLC fractionation we highlight those coding for a thioredoxin-related protein, engaged in oxidationreduction processes; an urease accessory protein, which has been correlated to pathogenicity in corynebacteria; and the cell adhesion involved manganese ABC transporter substrate-binding protein and periplasmic zincbinding protein TroA (Nolden et al., 2000; Hantke, 2005; Papp-Wallace and Maguire, 2006; Colbert et al., 2006). As uniquely identified in the RiboMinus-treated sample, we emphasize the transcripts linked to the transcriptional regulator sigma factor K and the detoxification-related mycothione glutathione reductase (Patel and Blanchard, 1999). Analysis of the genome of C. pseudotuberculosis 31 using the Rfam software allowed us to predict eleven non-coding functional RNAs (ncRNAs), other than rRNAs and tRNAs, which belong to three distinct known families: riboswitches, ribozymes and small RNAs (Table 1). Many of these ncRNAs are codified by bacteria of the genus Streptomyces and Clostridium (Weinberg et al., 2010; Chen et al., 2011), but their functions are not yet well understood. Among the predicted features, eight ncRNAs were confirmed to be transcribed, of which the tmRNA appeared as the most represented one in both RiboMinus- and DHPLC-related transcriptomes. The Bacillus subtilis tmRNA is required for growth at high temperature condition, beyond under cadmium and ethanol in vitro exposure (Muto et al., 2000). Other ncRNA relatively known and whose transcript was detected only in the RiboMinus-treated sample is the 6C.1, which plays a role in dormancy in Streptomyces coelicolor (Swiercz et al., 2008). In conclusion, although it may seem that the RiboMinus performed slightly better than DHPLC in maintaining ncRNA molecules in the pool of RNAs subjected to sequencing, further evaluations are necessary to better compare the efficiency of the two depletion methods on this issue. We also speculate that alternative fractions following the DHPLC treatment can be tested on their content of ncRNAs or any other specific group of RNAs. De novo strategy for new transcripts screening One key possibility arising from transcriptome assessments is the identification of non-predicted CDS in the genome. Aiming to evaluate how our RiboMinus- and DHPLC-depleted RNA-sequencing data perform to allow © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. An alternative methodology for rRNA depletion 5 Fig. 3. Classification of reads mapped against the CDS of C. pseudotuberculosis 31, according to terms of Gene Ontology. A. The identified transcripts were grouped by the biological processes to which their products are associated with. The horizontal bars indicate the amounts of grouped transcripts (genes) for each category, considering transcriptome results for both RiboMinus- and DHPLC-treated samples. B. In a similar way as before, the identified transcripts were sorted by their association with different classes of molecular functions. the detection of new genes in C. pseudotuberculosis 31, we assembled all reads that had not mapped against the CDS from the reference genome into contigs (Table 2). Despite observing a higher number of non-mapped reads for the DHPLC sample, and a higher total of assembled contigs in this case as well, the removal of redundant sequences evidenced a larger amount of different contigs for RiboMinus (3836 against 1247 for DHPLC) (Table 3). One explanation for such inversion resides in the fact that larger contigs could be generated for DHPLC, what is in accordance with its greater N50 value (455 against 399 for RiboMinus). Following redundancy removal, we found that 487 DHPLC assembled contigs and 3058 RiboMinus assembled ones presented no matches against CDS of C. pseudotuberculosis 31 (Table 3). These considerable amounts of dissimilar sequences could be explained by intrinsic sequencing errors, which have caused penalties to matches under the criteria adopted by us (alignments should be larger than or equal to 30 bp and present © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. 6 T. L. P. Castro et al. Table 1. Evaluation of ncRNAs present in C. pseudotuberculosis 31 by combining genomic with transcriptomic data. Corresponding read counts (RNA-seq) ncRNAs predicted in the genome Corresponding strand Rfam bits score Genomic stancea (bp) RiboMinus-treated sample DHPLC-treated sample tmRNA.1 RNaseP_bact_a.1 cspA.1 msiK.1 Bacteria_small_SRP.1 mraW.1 6C.1 Cobalamin.2 Cobalamin.1 TPP.1 yybP-ykoY.1 + + + + + + + - 136.29 250.04 55.15 54.15 55.35 48.99 32.18 72.55 74.77 57.38 40.90 605 717–606 098 1 601 151–1 601 563 231 046–231 384 398 399–398 458 149 269–149 361 1 528 518–1 528 622 223 511–223 577 724 215–724 451 924 216–924 412 793 275–793 405 1 362 468–1 362 614 1497 16 12 0 0 1 1 2 0 0 0 444 13 5 1 1 0 0 0 0 0 0 a. In reference to the whole-genome sequence of C. pseudotuberculosis 31 (NC_017730.1). e-value lower than or equal to 1e-05). Furthermore, our reference genome underwent automatic annotation process based on previously annotated genomes from other C. pseudotuberculosis strains, so it is plausible to consider that a number of CDS may have not been annotated in strain 31. To analyse the similarity of all unknown contigs to the non-redundant nucleotide collection from the NCBI, we decided to use more strict criteria: only matches of at least 100 bp and with e-value lower than or equal to 1e-05 were considered. In spite of sequencing errors, which may have hampered our analysis, we could identify 15 different genes that were not previously annotated in the C. pseudotuberculosis 31 genome, six out of them related to hypothetical proteins in other organisms and one of unknown function (Table 4). Among the newly identified features are various genes coding for surface-anchored proteins, which participate in the bacterial pilli assembly and belong in their majority to the Spa family. Predicted to be present in the C. pseudotuberculosis ovis FRC41 strain, these proteins were proved to mediate, in C. diphteriae and other pathogens, bacterial attachment and colonization of host tissues (Gaspar and Ton-That, 2006; Trost et al., 2010). The remaining new transcripts, exclusively identified for the DHPLC-depleted sample, codify for anaerobic dehydrogenase and subunits alpha and beta of nitrate reductase, enzyme which plays an important role in the nitrogen assimilation (Richardson et al., 2001). With respect to these findings, we highlight that the DHPLC depletion method associated with Ion Torrent sequencing allowed us to successfully discover nonannotated genes in the genome of C. pseudotuberculosis 31, as occurred when RiboMinus was used. The next step to be taken is to thoroughly analyse and correct all annotation errors, collaborating with upcoming studies regarding this organism. In case the differences observed between the RiboMinus- and DHPLC-treated samples are caused by peculiarities of each depletion procedure, additional transcriptome evaluations are necessary for indicating to what extent these could alter the set of transcripts to be sequenced. Recent improvements on Ion Torrent technology will certainly benefit such work, by providing larger Table 2. Statistics concerning the use of Oases software in the de novo approach. rRNA depletion method RiboMinus DHPLC Non-mapped reads useda 85 600 150 090 Assembly round Total of contigs assembled N50 of the contigs Total base pairs assembled MergeK25 MergeK27 MergeK29 MergeK31 MergeK33 MergeK35 MergeK25 MergeK27 MergeK29 MergeK31 MergeK33 MergeK35 674 1 225 2 358 4 595 9 032 17 822 1 681 2 740 4 799 8 834 16 948 32 659 282 283 288 291 296 310 429 441 445 447 450 456 172 401 318 679 623 789 1 229 563 2 454 627 5 195 511 564 199 949 402 1 706 112 3 200 016 6 210 773 12 134 747 a. Reads which did not match against CDS from C. pseudotuberculosis 31 (query coverage < 60% and similarity < 70%). © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. An alternative methodology for rRNA depletion Table 3. Statistics for the de novo approach after removal of redundant contigs using the Simplifier software. 7 Experimental procedures Bacterial strain, growth condition and preparation of bacterial pellet Non-redundant contigs (transcripts) rRNA depletion method RiboMinus DHPLC Total number Total base pairs N50 Longer Smaller With hitsa Without hitsa 3 836 1 392 183 399 1 712 103 778 (407 620 bp) 3 058 (984 563 bp) 1 247 449 947 455 2 237 100 760 (295 852 bp) 487 (154 095 bp) a. Alignments performed against CDS of C. psedutoberculosis 31. Were considered negligible alignments < 30 bp with e-value > 1e-0.5). reads in a more efficient high-throughput way, and therefore minimizing the adverse effects caused by errors in sequences. Still, we speculate that the DHPLC rRNA depletion method could also be applied to the RNA-seq analysis intended for differential expression purposes, representing a cost-effective alternative for those groups which have access to the required equipment, since the expenses with depletion kits surely overcome those associated with the reagents for chromatography. On the other hand, in cases where only restricted amounts of total RNA are available, the DHPLC method is not likely to provide sufficient material for downstream applications. In conclusion, this work outlines a new rRNA depletion strategy which will be strongly considered to be applied in our future works about the transcriptional activity of C. pseudotuberculosis. A Corynebacterium pseudotuberculosis equi strain, identified as 31, was previously isolated from an infected buffalo in Egypt and confirmed by biochemical and molecular methods. This strain was regularly cultivated in Brain Heart Infusion broth (BHI, HiMedia Laboratories) and stored at -80°C with 50% glycerol. For the transcriptional assessments, Tween 80 (Sigma-Aldrich) was added to the BHI medium at 0.05% to avoid clumping of cells in suspension. The inoculated bacteria were grown at 37°C, 140 r.p.m., until the exponential phase was reached (OD600nm = 0.4). For each culture, 20 ml were centrifuged at 5000 r.p.m. for 5 min, and then 5 ml of RNAlater® stabilizing reagent (Ambion) were added prior to storing at -80°C. RNA extraction from C. pseudotuberculosis C31 Stabilized bacteria were thawed on ice and then pelleted at 5000 r.p.m. for 5 min. Then they were suspended in RLT buffer (Qiagen) and submitted to mechanical disruption, using glass beads with 0.1 mm of diameter (VK01, Berthold Technologies). Two homogenization cycles were performed at 6500 r.p.m., 30 s each, with interval of 30 s between them, in a Precellys®24 equipment (Bertin Technologies). The total RNA was purified using RNeasy Mini kit (Qiagen), according to the manufacturer’s recommendations. Optional on-column DNase treatment was carried out with the RNase-Free DNase set (Qiagen). The RNA was eluted from the purification column using RNase-free water, yielding at least 140 mg according to the Qubit® Fluorometric Quantitation kit (Invitrogen). Additionally, the RNA integrity was checked by electrophoresis in 1% agarose gels, in an RNase-free environment Table 4. New gene products found among the C. pseudotuberculosis 31 assembled transcripts. Gene product Number of matching contigsa Average size of contigs (bp) Hypothetical protein 20 1510 Hypothetical protein 31 1235 Hypothetical protein Hypothetical protein 2 1 782 366 Hypothetical protein 2 1040 Conserved hypothetical protein Unknown protein spaF gene product spaE gene product spaY gene product spaC gene product Surface-anchored fimbrial protein Anaerobic dehydrogenase Nitrate reductase beta subunit nitrate reductase alpha subunit 1 1 8 6 3 1 8 1 2 4 572 344 1732 880 642 958 958 332 554 651 Matching strain/product Propionibacterium acnes HL053PA2 (HMPREF9565_01483 protein) Propionibacterium acnes HL074PA1 (HMPREF9574_00607 protein) Corynebacterium glutamicum R (cgr 1268 protein) Bacteroides capillosus ATCC 29799 (BACCAP_03832 protein) Collinsella aerofaciens ATCC 25986 (COLAER_01671 protein) Lactobacillus jensenii JV-V16 Streptococcus suis 98HAH33 Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41 Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41 Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41 Corynebacterium ulcerans 809 Corynebacterium ulcerans BR-AD22 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Propionibacterium acnes HL074PA1 Corynebacterium diphtheriae HC04 a. Only matches ⱖ 100 bp with e-value ⱕ 1e-05 were considered. © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. Depletion method used DHPLC/RiboMinus RiboMinus DHPLC RiboMinus RiboMinus RiboMinus RiboMinus DHPLC DHPLC DHPLC DHPLC DHPLC DHPLC DHPLC DHPLC 8 T. L. P. Castro et al. (Sambrook and Russell, 2001). Total extracted RNAs were stored at -80°C until use. rRNA depletion For the rRNA depletion through DHPLC, four subsamples of 20 mg of total RNA each, provenient from the same extraction, were separately injected into the WAVE® System 4500 equipment loaded with the RNASep™ Cartridge (Transgenomic®). This procedure was necessary to achieve, at the end of the process, depleted RNA in sufficient amount for subsequent assays (over than 200 ng). The chromatographic process was carried out at fully denaturing condition (75°C). The buffers A [0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) at pH 7.0] and B [0.1 M TEAA (at pH 7.0) containing 25% acetonitrile] were used to elute samples at the flow rate of 0.9 ml min-1, under a gradient condition as described by Azarani and Hecker (2001): 38% to 40% B in 1 min, 40% to 60% B in 15 min, 60% to 66% B in 6 min, 66% to 70% B in 0.5 min, 70% to 100% B in 0.5 min, kept at 100% B for 1 min, 100% to 38% B in 1 min, kept at 38% B for 2 min. The fraction corresponding to rRNA-depleted sample was collected, and then the subsamples were co-precipitated with sodium acetate (3 M), ethanol and glycogen (20 mg ml-1). The RNA pellets were dried and resuspended with RNase-free water. The chromatograms were analysed using the Wave® System’s Navigator™ software (Transgenomic®). For each procedure of rRNA depletion through the RiboMinus™ Transcriptome Isolation Kit (Invitrogen), 6 mg of total RNA were loaded and treated according to the manufacturer’s recommendations. Each RiboMinus-depleted sample, as occurred for DHPLC, yielded over than 200 ng of RNA, according to the Qubit® Fluorometric Quantitation kit (Invitrogen). All depleted RNA samples were stored at -80°C prior to further manipulations. Quantitative RT-PCR analysis Fifty nanograms of each RNA sample, submitted or not to rRNA depletion procedures, were converted into cDNA using the Affinity Script QPCR cDNA Synthesis Kit (Agilent Technologies), according to the manufacturer’s protocol. Reverse transcription was conducted as the following steps: 5 min at 25°C, 5 min at 42°C, 15 min at 55°C, and 5 min at 95°C. For the real-time PCR assays, we employed two distinct sets of oligonucleotide primers. The first pair anneals to the 16S rRNA-coding region in the genome of C. pseudotuberculosis, promoting a 92 bp amplicon, and the second is complementary to the sigma factor A locus (sigA gene). Both pairs provided amplification efficiencies greater than 0.95 under the tested conditions. The reactions for relative quantification were prepared as follows: 7.5 ml Brilliant SYBR® Green qPCR reagent (Agilent Technologies), 0.375 ml ROX reference dye (50¥ diluted), 1 ml forward primer (2 pmol), 1 ml reverse primer (2 pmol), 2 ml template cDNA (10¥ diluted), and ultrapure water to final 15 ml volume. All amplifications were performed using the Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System supplied with the software SDS, version 2.4. Dissociation curves were performed as follows: 95°C for 15 s, 60°C for 15 s, and 95°C for 15 s. For each of the four experimental replicates, the generated cycle-threshold values were loaded into the REST 2009 software (Qiagen), and then the 16S rRNA levels were assessed in relation to the corresponding housekeeping sigA gene transcription levels, as described by Pfaffl and colleagues (2002). In general lines, the qRT-PCR assays were performed in accordance with Bustin and colleagues (2009). Following the relative quantification, the mean and standard error values calculated for the 16S rRNA were converted into percentages, which were considered for all comparisons between the depletion methods. The outcome data were plotted with the software GraphPad Prism, version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). RNA-sequencing For RNA-sequencing, we started from a single total RNA sample, which was subdivided and passed through two independent rRNA depletion procedures: one with the RiboMinus kit and the other based on the DHPLC method. The cDNA libraries were prepared using Ambion® RNA-Seq Library Construction Kit. Briefly, 200 ng of fresh depleted RNA were fragmented with RNase III. After clean up, specific adapters (Ion adaptor mix, Life Technologies) were hybridized with 100 ng of each sample. The reverse transcription was carried out following the manufacturer’s recommendations, and the resulting cDNA samples were purified. Only molecules with more than 100 bp were selected using the Agencourt AMPure® XP reagent (Beckman). After this stage, the cDNA was amplified and then purified with PureLink® PCR Micro Kit (Invitrogen). Quantification of amplified DNA samples was performed with the Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). Subsequently, the IKA® Ultra-Turrax® Tube Drive system was applied for an emulsion PCR, performed with reagents from the Ion Template Reagents Kit and the Ion Template Preparation Kit (Life Technologies). In brief, the DNA fragments were bonded onto spheres (Ion Sphere™ particles) and then amplified. Following the amplification, the emulsion was broken with successive washes (Ion Template Solutions Kit, Life Technologies), and the spheres without template were removed using the Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 Magnetic Beads (Invitrogen). The spheres-bonded amplified fragments were mixed with the Ion Torrent sequencing primers and the sequencing polymerase enzyme, using the Ion Sequencing Reagents Kit (Life Technologies). The resulting mixtures were loaded on the Ion 314™ Chip for sequencing with the Ion Torrent Personal Genome Machine™ (PGM) (Life Technologies). All procedures adopted are in agreement with what is recommended by the handbooks of Ion Sequencing Reagent Kit and Ion Xpress™ Template Kit (Life Technologies). Bioinformatic analysis The Ion Torrent-generated reads were trimmed and filtered according to in-house bioinformatic scripts. Sequences presenting an average Phred quality score inferior to 15 were eliminated by the Quality Assessment Software (Ramos et al., 2011). The reference-based assessment relied on the genome of C. pseudotuberculosis 31, obtained from the NCBI (NC_017730.1); and alignments which covered at least 60% of query sequences and achieved 70% or more of © 2013 The Authors. Published by Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd. An alternative methodology for rRNA depletion similarity with annotated CDS were considered for our analysis. To categorize the gene products into biological processes and molecular functions, the transcripts were processed with the Blast2GO software (Conesa et al., 2005). The outcome data were plotted using GraphPad Prism. With respect to the ncRNAs identification, genomes RefSeq of the CMNR group members were obtained from the NCBI, and then a local database was built for predictions with the GeneMark software (Lukashin and Borodovsky, 1998). Subsequently, the Rfam software (http://rfam.sanger.ac.uk/) was used for prediction of ncRNAs. The identification of transcribed ncRNAs was performed as described for the reference-based assessment. For the de novo strategy, we used all non-mapped reads from the reference-based analysis on the Velvet assembler (Zerbino and Birney, 2008) combined with the Oases software (Schulz et al., 2012). In brief, initial assemblies with different k-mers (25, 27, 29, 31, 33 and 35) were generated with Velvet. Subsequently, the transcripts obtained in each assembly were added into a single file, which was then submitted to new assemblies with Oases (k-mers 25–35). All assembled contigs for each rRNA depletion method were combined into a single multifasta file, and then undesired redundancies were removed by the Simplifier software (Ramos et al., 2012). The resulting contigs were blasted against the CDS of C. pseudotuberculosis 31, and were considered negligible alignments of less than 30 bp and which presented e-value greater than 1e-05. The dissimilar transcripts were then selected and blasted against the NCBI non-redundant nucleotide collection, and were considered new genes the hits covering 100 bp or more of queries and presenting e-value lower than or equal to 1e-05. Acknowledgements We thank Salah Abdel Karim Selim and Mohamed Salah Moawad (University of Cairo) for providing the C. pseudotuberculosis 31 strain. Conflict of interest None declared. References Azarani, A., and Hecker, K.H. (2000) RNA chromatography under thermally denaturing conditions?: analysis and quality determination of RNA. Appl Note 116: 1–4. Azarani, A., and Hecker, K.H. (2001) RNA analysis by ionpair reversed-phase high performance liquid chromatography. Nucleic Acids Res 29: E7. Baird, G.J., and Fontaine, M.C. (2007) Corynebacterium pseudotuberculosis and its role in ovine caseous lymphadenitis. J Comp Pathol 137: 179–210. Barakat, A.A., Selim, S.A., Atef, A., Saber, M.S., Nafie, E.K., and El-Ebeedy, A.A. 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