UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE
CORDEIROS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS
PELA ANÁLISE CITOLÓGICA, TESTE DE CLEMENTS E
CONTAGEM DE CORPOS LAMELARES DO LÍQUIDO
AMNIÓTICO
Natália Cristina de Souza
Médica Veterinária
ARAÇATUBA-SP
2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE
CORDEIROS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS
PELA ANÁLISE CITOLÓGICA, TESTE DE CLEMENTS E
CONTAGEM DE CORPOS LAMELARES DO LÍQUIDO
AMNIÓTICO
Natália Cristina de Souza
Orientador: Prof. Adjunto Francisco Leydson F. Feitosa
Dissertação
apresentada
à
Faculdade de Medicina Veterinária –
Unesp, Câmpus de Araçatuba, como
parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal
(Fisiopatologia Médica e Cirúrgica de
Pequenos Animais)
ARAÇATUBA-SP
2014
Catalogação na Publicação(CIP)
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP
Souza, Natalia Cristina de
S729a
Avaliação da maturidade pulmonar de cordeiros nascidos a termo e
prematuros pela análise citológica, teste de clements e contagem de
corpos lamelares do líquido amniótico / Natalia Cristina de Souza. -Araçatuba: [s.n], 2014.
109 f. il.; + CD-ROM
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade
de Medicina Veterinária, 2014.
Orientador: Prof. Adj. Francisco Leydson Formiga Feitosa
1. Maturidade dos órgãos fetais. 2. Técnicas e procedimentos
diagnósticos. 3. Neonatologia. 4. Ovinos I. T.
CDD 599.649
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
NATÁLIA CRISTINA DE SOUZA – Nascida em Araçatuba no dia 2 de
Outubro de 1984. Iniciou e concluiu o curso de graduação em Medicina
Veterinária na FAI – Faculdades Adamantinenses Integradas (2005-.2009)
Ingressou no Programa de Residência Médico Veterinária na área de
Fisiopatologia da Reprodução e Obstetrícia Veterinária da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Araçatuba, São Paulo
(2010-2011). Em 2012 iniciou o mestrado no Programa de Pós-graduação em
Ciência Animal da Faculdade de Medicina Veterinária (FMVA – UNESP) –
UNESP – Araçatuba, São Paulo.
“Vencedor não é apenas quem conquista algo. Vencedor é quem conquista, não
perde sua essência e jamais esquece de onde veio e de quem o ajudou no caminho.”
(Angélica Araújo)
Dedicatória
Dedico à minha filha e alma gêmea Maria Eduarda de Souza Faleiros,
por me lembrar todos os dias, que eu tenho um grande motivo para ser feliz e
correr atrás dos meus sonhos .
Aos meus Pais, Sandra Aparecida e Gerson Ângelo, pelo carinho, pelo
apoio, força e esforço para minha formação e realização de mais um sonho.
Aos meus irmãos Aline Esther e Renan Ângelo, pela força e apoio nas
horas em que mais precisei.
A Deus, por toda a força e por tudo que me proporcionou ao longo
destes anos, pelas oportunidades que me ofereceu, pela minha família que
amo tanto e por me conceder a dádiva de ser mãe.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP, pela concessão da bolsa de mestrado (2011/14933-3) e pelo
apoio financeiro (2011/20219-1).
Ao
meu
orientador,
Francisco
Leydson
Formiga
Feitosa
pela
oportunidade, confiança e pela compreensão durante esses anos de
convivência.
Aos meus pais, Sandra Aparecida e Gerson Ângelo, razões da minha
vida, por todo esforço e preocupação em me tornar uma pessoa melhor,
responsável e trabalhadora.
Aos meus avós, alicerces da minha vida e toda minha família que
sempre me mandaram força para eu seguir em frente.
À minha mãe Sandra Aparecida, minha irmã, Aline Esther e minha tia
Rosemary de Freitas, pela ajuda nos cuidados com minha filha, enquanto
concluía este projeto.
Aos meus colegas de trabalho Gabriel Isola , Fernanda Bovino, Larissa
Gabriela, Jefferson Alcindo, Maurício Desck, Daniela Denadai, Renata
Nogueira, Luis Gustavo Narciso, Fernanda Fink, Eduardo Panelli, Arthur
Araújo, Eduardo Tadeu (Duzão), Thomas, Guto, Janete, Diogo Gaubeur,
Guilherme, em especial à minha amiga Juliane Teramachi pela força e ajuda.
Aos professores Paulo Ciarlini e Sueli Mogami Bomfim, pela autorização
da utilização de seus laboratórios.
À Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba FMVA- UNESP, por
permitir a realização deste trabalho e aos funcionários da Faculdade de
Medicina Veterinária de Araçatuba, pela colaboração do projeto, em especial a
Isabel P. Matos, Lorinaldo Lopes e Martha Gonzales. E aos funcionários
Cláudia Ribeirinho, Teresa e José Augusto do Departamento de microscopia
eletrônica da UNESP de Jaboticabal – SP e da USP de Ribeirão Preto -SP, que
foram anjos em minha vida, e pela educação, paciência e dedicação.
SUMÁRIO
PÁGINA
1 INTRODUÇÂO........................................................................................
11
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................
13
2.1 O líquido aminiótico...........................................................................
15
2.2 Colheita do líquido aminiótico.............................................................
17
2.3 Avaliação da maturidade pulmonar e fetal ........................................... 18
2.4Testes propostos para avaliação da maturidade pulmonar e fetalError 19
2.4.1 Método citológico ............................................................................. 19
2.4.2 Teste de Clements...........................................................................
20
2.4.3 Contagem de corpos lamelares ....................................................
21
2.5 Análise hematológica dos neonatos..................................................
22
2.5.1 Glicemia..........................................................................................
22
2.5.2 Lactato ...........................................................................................
23
2.5.3 Hemogasometria.............................................................................
23
2.5.4 Hemograma....................................................................................
25
2.6 Objetivos.............................................................................................
26
2.6.1 Objetivo geral..................................................................................
26
2.6.2 Objetivos especificos......................................................................
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................
27
3.1 Características dos animais e grupos experimentais ........................... 27
3.2 Instalações e manejo.........................................................................
28
3.3 Anestesia e procedimento cirúrgico .................................................... 28
3.4 Colheita e preparação das amostras de líquido amniótico................... 29
3.5 Avaliação do líquido amniótico..........................................................
31
3.5.1 Coloração de azul de Nilo a 0,1%...................................................
32
3.5.2 Coloração Hematoxilina Shorr........................................................
33
3.5.3Teste de Clements.........................................................................
33
3.5.4 Teste de Clements por Barreto (2006)...........................................
34
3.5.5 Contagem de Corpos Lamelares...................................................
35
3.6 Avaliação dos recém nascidos.........................................................
35
3.6.1 Colheitas e preparação das amostras ...........................................
37
3.6.1.1 Glicemia e Lactato........................................................................
37
3.6.1.2 Hemogasometria........................................................................... 37
3.6.4 Hemograma....................................................................................
38
3.6.5 Exame Radiográfico........................................................................
39
3.7 Análise Estatítica...............................................................................
39
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................
40
4.1 Análise do líquido amniótico ................................................................ 40
4.1.1 Método citológico- Coloração de Azul de Nilo 0,1%..................
43
4.1.2 Método Citológico - Coloração Hematoxilina Shorr..................
46
4.1.3 Teste de Clements (1972).........................................................
49
4.1.4 Teste de Clements Modificado por Barreto..............................
53
4.1.5 Contagem de corpos lamelares.................................................
53
4.2 Avaliação dos recém-nascidos ........................................................... 58
4.2.1 APGAR ....................................................................................
59
4.2.2 Frequência cardíaca ................................................................
62
4.2.3 Frequência Respiratória ..........................................................
64
4.2.4 Temperatura Retal ...................................................................
67
4.2.5. Exame das mucosas..................................................................
70
4.2.6. Glicemia .....................................................................................
74
4.2.7. Lactato .......................................................................................
75
4.2.8. Hemogasometria ........................................................................
78
4.2.8.1. pH............................................................................................
79
4.2.8.2. PCO2.....................................................................................................................................
80
4.2.8.3. Bicarbonato HCO3...................................................................................................... 80
4.2.8.4. Déficit e ou excesso de base (BE)..........................................
81
4.2.9. Hemograma................................................................................
82
4.2.9.1. Hematócrito (Ht).......................................................................
82
4.2.9.2. Hemoglobina............................................................................
83
4.2.9.3. Proteína Total..........................................................................
84
4.2.9.4. Fibrinogênio.............................................................................
85
4.2.9.5. Leucócitos Totais......................................................................
86
4.2.9.6. Neutrófilos segmentados..........................................................
87
4.2.9.7. Linfócitos..................................................................................
87
4.2.9.8. Monócitos................................................................................. 88
4.2.10. Avaliação Radiográfica pulmonar dos recém-nascidos............ 89
5. CONCLUSÃO........................................................................................
94
6. REFERÊNCIAS......................................................................................
95
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE CORDEIROS
NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS PELA ANÁLISE CITOLÓGICA,
TESTE DE CLEMENTS E CONTAGEM DE CORPOS LAMELARES DO
LÍQUIDO AMNIÓTICO
RESUMO - O objetivo deste estudo foi avaliar a maturidade pulmonar de
cordeiros, por meio do teste de Clements, da análise citológica pela coloração
de Azul de Nilo e Shorr, e da contagem de corpos lamelares no líquido
amniótico de ovelhas. Para tanto, foram utilizados 56 animais (24 ovelhas e 32
cordeiros), divididos em três grupos, a saber : Grupo I: constituído por oito
ovelhas, com gestação em torno de 145 dias, e por 10 cordeiros nascidos de
partos normais; grupo II: composto por oito ovelhas, com 138 dias de gestação,
e por onze cordeiros nascidos de cesarianas; e, grupo III : constituído por oito
ovelhas com 138 dias de gestação e que receberam 16mg/ovelha de
dexametasona, por via intramuscular, 36 horas antes da cirurgia eletiva, e por
11 cordeiros delas nascidos. Na coloração de azul de Nilo observou-se
diferença significativa entre os grupos I e III, porém esta técnica não foi
satisfatória. Entretanto, a citologia utilizando a coloração de Hematoxilina-Shorr
mostrou-se confiável, onde o grupo I diferiu estatisticamente do grupo III. Cerca
de 20% dos cordeiros do grupo I possuíam maturidade pulmonar pelo teste de
Clements. Contudo, o grupo II foi o que apresentou menor quantidade de
bolhas (9,1%). O grupo III teve maior porcentagem de animais com maturidade
pulmonar (36,4%), quando comparados aos grupos I e II. Os corpos lamenares
apresentavam tamanhos variando entre 0,019 a 0,590 micrometros. A
avaliação da maturidade pulmonar e fetal na neonatologia veterinária visa
determinar o nascimento de paciente com alto risco, bem como o imediato
estabelecimento de terapia de suporte ao recém-nascido, minimizando
possíveis complicações e melhorando as taxas de sobrevivência.
Palavras-chave: maturidade dos órgãos fetais, técnicas de diagnósticos,
neonatologia, ovinos
EVALUATION OF THE LUNG MATURITY IN NEWBORN AND
PREMATURE LAMBS, USING CYTOLOGICAL ANALYSIS, CLEMENTS
TEST AND LAMELLAR BODIES COUNT IN THE AMNIOTIC FLUID
SUMMARY – The aim of this study was to determine pulmonary and fetal
maturity of lambs by means of cytological tests using Nile Blue and HematoxilinShorr staining, Clements’ test and amniotic fluid lamellar body count. Amniotic
fluid samples were collected from 24 sheep in order to evaluate pulmonary and
fetal maturity of their 32 lambs, which were divided into three groups: Normal
group included 10 lambs born at term, after 145 days of gestation; Caesarean
group included 11 lambs delivered by caesarean section, after 138 days of
gestation; and Caesarean+Dexamethasone group included 11 lambs born from
sheep submitted to caesarean section, after 138 days of gestation, and
dexamethasone 16 mg/animal (IM) administration two days prior to the surgical
procedure.. A significant difference was observed between Normal and
Caesarean+Dexametasone groups using Nile Blue staining. However, this
technique was not effective. Hematoxilin-Shorr staining was reliable and it was
possible to verify that the Normal group differed statistically from the group
submitted to Caesarean+Dexamethasone. In Clements’ test, aiming to observe
the presence of surfactant, which is characterized by the formation of bubble
rings, approximately 20% of animals in the Normal group presented pulmonary
maturity. However, the Caesarean group showed the least amount of bubbles
(9.1%). The Caesarean+Dexamethasone group showed higher percentage of
animals with pulmonary maturity (36.4%) when compared to the Normal and
Caesarean groups The lamellar bodies were then measured to verify their size,
which varied between 0.019 and 0.590 micrometers.
Key-words: fetal organ maturity, diagnostic techniques and procedures,
neonatology, sheep
11
1 INTRODUÇÃO
A abordagem emergencial dos neonatos difere marcadamente do
paciente crítico adulto pela fisiologia e pelos parâmetros hemodinâmicos
particulares. Após o nascimento, inicia-se um período crítico chamado de
“período de transição”, que engloba a adaptação do neonato da vida
intrauterina para a extrauterina. Nesta fase, os sistemas corporais promovem
ajustes fisiológicos considerados cruciais para o neonato. Sob condições não
fisiológicas, relacionadas, em especial, aos partos distócicos e ao nascimento
prematuro, estabelecem-se os quadros de asfixia precoce e tardia. A
vulnerabilidade do neonato às condições adversas do meio relacionadas à
imaturidade dos sistemas compensatórios e regulatórios orgânicos, bem como
a ineficácia dos mecanismos de defesa intrínsecos ao período inicial do
desenvolvimento, faz dessa categoria animal tópico especial na terapêutica
veterinária. Neste prisma, pode-se pressupor que a adaptação e a
vulnerabilidade ao meio externo são, indubitavelmente, ainda mais instáveis e
desafiadores em animais prematuros.
A neonatologia de animais pecuários ainda é área que caminha a
passos lentos. Na pediatria, consegue-se, com certa facilidade, não somente a
sobrevivência de pacientes de alto risco, como também, a quase certeza de
que estes fetos prematuros terão, futuramente, qualidade de vida satisfatória.
Atualmente, crianças nascidas prematuras, de mães com seis meses de
gestação e pesando cerca de 600 g geralmente conseguem sobreviver sem
qualquer tipo de complicação, fato improvável há alguns anos. Em veterinária,
cabritos e cordeiros nascidos com apenas seis dias antes da data prevista para
o parto apresentam enorme risco de morrerem antes mesmo das primeiras 24
horas de vida.
12
É sabido que quase a totalidade dos trabalhos científicos desenvolvidos
no Brasil e em outros países é realizada com bezerros e potros, com
pouquíssima atenção para os animais das espécies ovina e caprina. Existem
escassos dados com relação às alterações clínicas e de componentes
sanguíneos em cordeiros recém-nascidos normais e prematuros. Sem dúvida,
os avanços da biotecnologia (Produção in Vitro, clonagens) têm trazido
grandes benefícios à pecuária nacional, principalmente no que tange à rápida
melhoria genética dos rebanhos. Contudo, vários problemas têm sido
observados em decorrência dos mesmos, tais como : a) maior intervenção aos
trabalhos de parto em virtude da elevada taxa de distocias em fêmeas
primíparas, causadas pelo seu menor diâmetro pélvico e/ou pelo grande
tamanho dos produtos gerados por técnicas avançadas de concepção; e b)
necessidade de melhor e mais intensivista assistência ao recém-nascido, pelo
desenvolvimento de inúmeras alterações orgânicas e funcionais (acidose
respiratória e metabólica, falha de transferência de imunidade passiva,
hipertensão, arritmias cardíacas, espessamento excessivo do cordão umbilical,
entre outras). Infelizmente, poucos profissionais conhecem e militam na área
de neonatologia veterinária, sendo cada vez mais necessárias pesquisas que
viabilizem informações importantes aos colegas, para que procedimentos,
durante o período perinatal, tenham sucesso e auxiliem a reduzir a taxa de
morbimortalidade de animais recém-nascidos pecuários, e, em particular, de
neonatos prematuros.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
O período do periparto é fase de alto risco para o feto e a mãe. Cerca de
5 a 10% dos bezerros e 15 a 20% dos cordeiros nascidos por ano nos Estados
Unidos morrem antes de mamar (VAALA; HOUSE, 2006). Entre 50 e 70% da
mortalidade neonatal ocorrem nos primeiros três dias de vida (DWYER, 2008;
SAWALHA et al., 2007), sendo a distocia, a inanição e a hipotermia,
responsáveis por 50 a 60% dessas perdas (VAALA; HOUSE, 2006).
Grande parte dos avanços ocorridos nas últimas décadas, com relação à
assistência perinatal e neonatal, relacionam-se com a função respiratória, visto
que a capacidade funcional pulmonar é imprescindível para a sobrevivência do
neonato. A maturidade fetal pode ser clinicamente caracterizada, entre outros
fatores, pela insuficiência respiratória. Dentro deste contexto é de grande
importância para o clínico avaliar o grau de maturidade pulmonar fetal, levandose em consideração que qualquer problema na formação de algum
componente pulmonar ou o nascimento prematuro pode acarretar problemas
respiratórios ao neonato, como a síndrome da angústia respiratória (SAR) e
outras. Evitar o nascimento prematuro constitui a principal medida preventiva
para reduzir os riscos e sequelas da morbidade respiratória neonatal (LOBATO,
2011;TABORDA et al.,1998).
Antes do nascimento não existem alvéolos maduros. Assim, em
humanos, além das células endoteliais e das células epiteliais alveolares
achatadas, outro tipo celular se desenvolve ao final do sexto mês. Essas
células são denominadas de pneumócitos tipo II, que é uma célula rica em
corpos lamelares (CL), que são estruturas intracelulares com 1 a 5 µ de
diâmetro, ricas em lipídios e que armazenam as substâncias surfactantes, que
são compostas por 70 a 80% de fosfolipídios, 10% de proteínas e 10% de
lipídeos neutros, sendo esses fosfolipídios constituídos por fosfatidilcolina,
fosfatidilinositol e fosfatidilglicerol (LOBATO, 2011; VAALA; HOUSE, 2006;).
14
O surfactante é estocado pelos corpos lamelares, os quais são
estruturas carreadas para o espaço alveolar através dos movimentos
respiratórios fetais e exsudação de líquido, sendo facilmente demonstradas no
líquido amniótico (LA) por meio da microscopia eletrônica. Vários estudos têm
demonstrado que os corpos lamelares aumentam com o progredir da gestação
e a sua determinação no LA tem boa correlação com outros indicadores de
maturidade pulmonar fetal (LEE, et al., 1996).
As consequências clínicas da ausência desse líquido pulmonar
(surfactante pulmonar) podem ser observadas em várias situações. Em
humanos, neonatos prematuros que não possuem surfactante apresentam
grande dificuldade para insuflar os pulmões, especialmente nas primeiras
respirações. Mesmo quando seus alvéolos são insuflados artificialmente, é
grande a tendência ao colapso espontâneo, por seus alvéolos serem menos
estáveis sem surfactante pulmonar. Por essa razão, a ausência dessa
substância ou alterações na quantidade ou qualidade dos fosfolipídios que o
compõem, em um neonato prematuro, podem ser fatores importantes para
desenvolvimento de síndrome da angustia respiratória (SAR) neonatal, também
conhecida como síndrome da membrana hialina. Como consequência poderá
ocorrer
atelectasia
progressiva,
edema,
alteração
da
relação
ventilação/perfusão, levando à hipóxia tecidual; (DUBIN et al., 2000;
GRENACHE ; GRONOWSKI, 2006; LOBATO, 2011; WIJNBERGER et al.,
2009)
O
atendimento
clínico
ao
animal
recém-nascido
é
iniciado,
tradicionalmente, ao nascimento. Porém, há crescente reconhecimento da
importância da avaliação pré-natal e da parturiente para a subsequente
viabilidade dos neonatos (RADOSTITS et al., 2002). Na medicina perinatal, um
dos problemas encontrados está na determinação da morbidade respiratória
neonatal. Os métodos de diagnóstico diretos, geralmente mais eficazes, são
aqueles que utilizam amostras de LA para análise específica dos componentes
do surfactante pulmonar, incluindo a medida da relação lecitina/esfingomielina
(L/E), dosagem de fosfatadilglicerol (PG), relação surfactante/albumina (S/A),
15
contagem de corpos lamelares (CL) e teste de Clements (COSTA et al., 2001;
TABORDA et al., 2000).
2.1 O líquido amniótico
O
LA
desempenha
importante
papel
no
crescimento
e
desenvolvimento fetal. Circunda e protege o feto na cavidade amniótica,
proporcionando um coxim contra os limites constritivos do útero gravídico,
permitindo-lhe espaço para movimento e crescimento, e protegendo-o de
traumatismos externos. Este espaço ao redor do feto é importante para o
desenvolvimento e maturação de seus pulmões. Além disso, tem como
funções manter a temperatura corporal, proteger contra desidratação,
prevenir a aderência entre o feto e o âmnio, promover a dilatação da cérvix,
vagina e vulva durante o parto, facilitando a passagem do feto, além de
inibir o crescimento bacteriano e participar da homeostasia de líquidos e
eletrólitos (JAINUDEEN; HAFEZ, 2004; MOURA et al., 2009).
Os animais domésticos possuem os líquidos alantoideano e
amniótico nas respectivas bolsas, diferenciando-se, assim, da mulher, que
apresenta, como único líquido fetal, o fluido amniótico (GRUNERT; BIRGEL,
1984).
Nos pequenos ruminantes, o LA predomina no terço médio da
gestação e, nos outros momentos, o alantoideano prevalece. O fluido
amniótico tem coloração esbranquiçada ou amarela clara, com aspecto
transparente, consistência viscosa e volume de 350 a 1200 mL. Quanto à
capacidade volumétrica, Malan et al. (1937) revelaram que o volume total
de fluídos fetais aumenta com o avançar da idade do concepto, entretanto
os volumes dos fluídos fetais separados mostram tendências diferentes.
Assim, durante os três primeiros meses, o fluído alantoide se acumula
lentamente, por exemplo, 131 mL aos três meses, ao passo que o aumento
do LA ocorre em grande parte durante este tempo, de modo que, aos três
meses, atinge 604 mL. No quinto mês o aumento do fluído alantoideano é
16
muito acelerado chegando a 485 mL, enquanto que o LA apresenta pouco
aumento. Durante o último mês de gestação (quinto), o fluído alantóide
quase duplica o seu volume para 834 mL, mas o volume de LA diminui para
369 mL. Quando há presença de gêmeos a totalidade de líquidos é de,
aproximadamente, o dobro.
O líquido alantoideano tem coloração amarela clara a âmbar, aspecto
transparente, consistência aquosa e volume variando de 100 a 2000 mL
(TONIOLLO; VICENTE, 1995). De acordo com Souza et al. (2000a), o
aspecto do fluido amniótico em ovelhas varia do amarelo claro ao límpido
viscoso, sendo visto nos últimos dias da gestação. Com o evoluir da
gestação, o fluido amniótico vai se enriquecendo de células fetais
originárias da pele fetal, do folheto amniótico e dos tratos respiratório,
urinário e digestório (SOUZA et al., 2000b).
A cavidade amniótica é formada entre 13 a 16 dias após a concepção
em ovelhas e apresenta-se como um saco de camada dupla repleto de
líquido e em íntimo contato com o feto (ROBERTS, 1998). A origem dos
fluidos fetais (amniótico e alantoideano) e as secreções que para ele
contribuem são complexas. Existem, pelo menos, quatro locais em que
podem ocorrer a absorção e a secreção: sistema respiratório, urinário,
digestivo e a pele (JAINUDEEN; HAFEZ, 2004).
No feto ovino, a urina formada nos mesonéfrons passa para dentro
da cavidade alantoideana por meio do úraco até os 90 dias de gestação.
Depois disso, a urina migra em quantidades crescentes para a cavidade
amniótica devido à oclusão do úraco e à abertura da uretra. Deste modo, a
urina fetal forma a maior fonte de fluido amniótico na última fase da
gestação em ovinos (JAINUDEEN; HAFEZ, 2004).
O LA e o líquido alantoideano contêm constituintes metabólicos,
eletrólitos, enzimas, hormônios, células do concepto e outras estruturas
como pêlos, podendo encontrar mecônio em caso de sofrimento fetal
(MOYA, 2005).
17
2.2 Colheita do líquido amniótico
Para obtenção de fluidos fetais, o método eleito é o da amniocentese
transabdominal, sendo procedimento seguro, que pode ser realizado no
ambulatório humano. Em ovinos, Mellor e Slater (1972) indicaram a
cateterização para a colheita de LA.
Em estudos com amniocentese, Bongso e Basrur (1975) afirmaram
que a técnica tem realização limitada, devido à anatomia do útero gravídico,
dos sacos e fluidos fetais. Os primeiros estudos em medicina veterinária
para analisar a fisiologia e o comportamento bioquímico do LA, obtido por
amniocentese, foram realizados em ovinos (ALEXANDER et al., 1958;
McDOUGALL, 1949; MELLOR e SLATER, 1972), em bovinos (LEIBO; RALL,
1990), em caprinos (AIDANASI; CHAUMAN, 1992), e em equinos
(SCHMIDT et al., 1991).
No entanto, Prestes et al. (2001) obtiveram o LA aos 70, 100 e 145
dias de gestação em ovelhas, para determinação bioquímica, por meio de
laparotomia e punção direta do útero, sendo relatado que não houve
problemas posteriores, como por exemplo, aborto ou morte dos fetos. Já em
caprinos, Lovell et al. (1995) recomendaram a ultrassonografia como guia da
via aspirativa, entre 59 a 65 dias de gestação, como técnica ideal.
Entretanto, Khadjeh et al. (2007) realizando colheitas de LA durante o
período gestacional de cabras, por meio de cirurgias nas quais o útero era
incidido na sua curvatura dorsal e as carúnculas separadas dos cotilédones
delicadamente, com posterior obtenção do LA; não relataram os resultados
das cirurgias em relação aos possíveis problemas ocorridos. Já na espécie
canina, Barreto (2002), empregou o procedimento cirúrgico (cesariana) para
obtenção dos fluidos fetais de cadelas.
18
2.3 Avaliação da maturidade pulmonar e fetal por meio do líquido amniótico
O LA é fonte importante para avaliação das condições fetais. Uma
variedade de métodos bioquímicos, citológicos, biofísicos e imunológicos
permitem a determinação do grau de maturação pulmonar, renal e epidérmica
fetais, além de anormalidades genéticas e outras afecções (KJELDSBERG;
KNIGHT, 1998).
Para análise do LA, os métodos diretos geralmente são mais eficazes,
por analisarem os componentes específicos do surfactante pulmonar, incluindo
a medida da relação lecitina/esfingomielina (L/E), dosagem do fosfatidilglicerol
(PG), teste de Clements, contagem de corpos lamelares (CL), relação
surfactante/albumina (S/A), determinação da absorbância do LA a 650nm, além
da citologia do LA (COSTA et al., 2001; DALENCE et al., 1995).
A medida da relação surfactante/albumina (S/A), por polarização de
fluorescência, é método de avaliação quantitativa da maturidade pulmonar fetal
bastante utilizado na medicina humana de países desenvolvidos. Baseia-se na
ligação competitiva de uma sonda fluorescente à albumina e ao surfactante no
líquido amniótico. A polarização é alta quando a sonda está ligada à albumina e
baixa quando ligada ao surfactante (GRENACHE; GRONOWSKI, 2006).
A medida da relação L/E, descrita por Gluck et al. (1971), é uma das
provas laboratoriais mais utilizadas na identificação de conceptos com pulmões
imaturos em humanos, visto que vários estudos comprovaram a segurança da
técnica. (COSTA et al., 2001; BERTINI et al., 1992). Esta medida é
considerada o teste padrão ouro para maturidade pulmonar; no entanto,
apresenta aspectos negativos, pois é técnica dispendiosa, laboriosa, devendo
ser realizada em laboratório capacitado (DUBIN et al., 2000).
A identificação de fosfatidilglicerol (PG) no LA oferece garantia de
maturidade pulmonar ao nascimento, mas também é um método extremamente
caro e demorado (BERTINI et al., 1992; TABORDA et al., 2000).
O teste ideal para avaliar a maturidade pulmonar fetal é aquele de fácil
execução, com gastos mínimos, equipamentos simples, que não necessite de
19
profissionais especializados, rapidamente reproduzível, clinicamente confiável
e, finalmente, aplicável na maioria das gestações (FIELD, 1997).
2.4 Testes propostos para avaliação da maturidade pulmonar e fetal
2.4.1 Método citológico
Mediante o estudo citológico do LA e suas modificações em relação ao
período gestacional, pode ser factível a determinação da maturidade do
concepto. Para a visualização das células do LA, uma das técnicas
empregadas é a coloração por Sulfato de Azul do Nilo. Estabeleceu-se, em
humanos, a proporção de células lipídicas coradas por esta técnica, que se
apresentam alaranjadas, possibilitando, portanto, a avaliação da maturidade
fetal. A presença de grande quantidade de células orangeofílicas no fluido
amniótico é indicativa da maturidade das glândulas sebáceas, e a porcentagem
dessas
células
está
diretamente
relacionada
à
maturidade
fetal
(KJELDSBERG; KNIGHT, 1998).
Em ovinos, essas células alaranjadas praticamente inexistem no início
da gestação, aparecendo em pequena proporção no terço médio e se
proliferam até o momento do parto, representando cerca de 50 a 95% da
população celular encontrada no LA, com maiores valores encontrados nos
fetos mais velhos, revelando que a análise citológica é um bom meio para
predizer a idade fetal (SOUZA et al., 2000b).
A técnica de citologia de Azul de Nilo (0,1%) ou índice cito-lipídico
consiste na mistura de uma gota de LA com uma gota de corante,
homogeneização e posterior leitura em microscopia óptica (NOMURA et al.,
2001). Esta técnica permite a classificação celular quanto ao grau de
maturidade, pois quanto mais vermelho-amarelado, mais maduro (CAMPANA
et al., 2003).
Existem vários métodos de colorações além da técnica de citologia
corada pelo sulfato de Azul de Nilo a 0,1% que podem ser utilizados para
20
analisar a citologia do LA. Dentre elas destacam-se o método Hematoxilina–
Shorr, Lugol forte, Giemsa, entre outras.
Martins (2003) realizou ensaio sobre a citologia do LA de cadelas, onde
comparou os métodos de colorações de Hematoxilina Shorr, Giemsa e DiffQuick, e concluiu que apesar da coloração pelo método de Hematoxilina-Shorr
ser trabalhosa e, portanto, mais lenta, permite melhor avaliação da morfologia e
determina com mais exatidão o estágio de maturação fetal, em virtude de suas
características tintoriais.
2.4.2 – Teste de Clements
O teste de Clements, proposto por Clements et al. (1972), constitui-se
prova rápida, simples, econômica e segura, que se baseia na propriedade
biofísica do surfactante de manter a superfície de tensão na interface ar-líquido,
representada pela formação de um halo estável de bolhas, pela reação com o
álcool (esterificação). Em humanos, a acurácia desse teste não apresenta
resultados falso-positivos, variando de 1 a 3%. No entanto, os falso-negativos
são mais frequentes, variando de 8 a 40%. Cita-se que o teste de Clements
deve ser utilizado como triagem para a presença de maturidade pulmonar,
acreditando-se nos resultados positivos e submetendo, contudo, os resultados
negativos a exames mais sensíveis (AMORIM et al., 1998). Em cães, o teste de
Clements modificado pode ser empregado para a avaliação da viabilidade fetal
e maturidade pulmonar (BARRETO, 2002).
2.4.3 Contagem de corpos lamelares
A contagem de corpos lamelares (CCL) tem sido proposta também como
um teste de triagem para avaliação de maturidade pulmonar (COSTA et al.,
2001; CARRILLO et al., 1997). Esse método foi descrito por Dubin (1998), e é
21
um teste rápido, de baixo custo, requerendo pequeno volume de amostra,
podendo ser facilmente quantificado por aparelhos habitualmente usados para
realização de hemogramas (DALENCE et al., 1995), já que seu tamanho (1 a 5
µm) é muito semelhante ao das plaquetas (1-3 µm) de humanos (DUBIN,
1998).
O surfactante pulmonar, produzido principalmente nos pneumócitos tipo
II dos alvéolos, é “empacotado” em estruturas chamadas corpos lamelares,
cujo diâmetro é de 1 – 5 µm, semelhante ao das plaquetas. Os corpos
lamelares servem, aparentemente, de reservatórios intracelulares, que vão
sendo secretados para a superfície alveolar por exocitose. Acredita-se que o
estiramento do alvéolo pela insuflação de ar pode ser estímulo fisiológico
relevante para secreção dessas organelas. Uma vez fora da célula, os corpos
lamelares desenrolam-se para tomar a forma de mielina tubular, responsável
pela diminuição da tensão superficial dos alvéolos (STEIBEL, 2008).
FIGURA 1 – A) Microscopia eletrônica evidenciando corpo lamelar em líquido oriundo
da espécie equina medindo 0,83 µm, (CASTAGNETTI, 2007); B)
Microscopia eletrônica de corpo lamelar humano (WONG et al.,1998); C)
Microscopia eletrônica evidenciando corpo lamelar de rato (STAHLMAN,
et al., 2000).
2.5 Análises Hematológicas dos neonatos
2.5.1 Glicemia
Os recém-nascidos sofrem alterações orgânicas que podem influenciar
diversos constituintes sanguíneos, devido à maturação funcional dos órgãos e
22
sistemas, além da adaptação nutricional decorrente da ruptura do cordão
umbilical no parto e interrupção do transporte de nutrientes materno-fetal.
Portanto, a necessidade energética para suportar a termorregulação,
respiração e atividade muscular, encontra-se aumentada.
A glicose sanguínea, um dos substratos energéticos primários
disponíveis ao ruminante neonato, é baixa no recém-nascido até a primeira
ingestão de colostro (YANAKA et. al.,2012).
Os teores de glicose em bezerros logo ao nascimento, na ausência da
ingestão de colostro, estão relacionados ao metabolismo hepático e de
glicogênio muscular, os quais respondem principalmente à ação de
catecolaminas, como a noradrenalina e adrenalina (CHAN et.al., 1993).
A maioria dos neonatos debilitados também são hipoglicêmicos,
principalmente devido à depleção dos estoques de glicogênio e imaturidade
hepática (MACINTIRE, 1999). Salhab et. al. (2004) observaram que a
hipoglicemia é um fator de risco adicional à injúria cerebral, principalmente em
neonatos deprimidos por hipóxia, isquemia e asfixia, ou submetidos à
manobras de ressuscitação. Assim sendo, a determinação da glicemia, tornase essencial na neonatologia veterinária, podendo auxiliar no tratamento
suporte do neonato.
2.5.2 Lactato
Na obstetrícia humana, o lactato desempenha um papel central como
marcador de sofrimento fetal e neonatal. A presença de lactato em níveis
excessivos documenta a utilização de vias secundárias de oxigenação devido à
hipóxia decorrente de eventos que ocorreram durante o parto (GROPPETTI et
al., 2010; SAUGSTAD, 2002).
23
A mensuração da concentração de lactato é uma técnica minimamente
invasiva que pode ser realizada com amostras de sangue venoso
(McMICHAEL et al., 2005).
Em humanos, os níveis de lactato têm se mostrado uma ferramenta útil
para diagnóstico, monitoração e prognóstico de uma ampla gama de síndromes
clínicas (BUENO et al., 2012).
Segundo Koliski et al. (2005), em estudo sobre a utilização de lactato
sérico como marcador prognóstico em crianças gravemente doentes, na
maioria dos pacientes com concentrações de lactato acima de 2mmol/L
evidenciou sinais clínicos de hipoperfusão. A normalização ou diminuição da
concentração, a partir de 24 horas de internação, esteve significativamente
relacionada com a maior probabilidade de sobrevivência (BARROSO et.
al.,2006).
2.5.3 Hemogasometria
Durante a fase gestacional, e durante o nascimento, o animal está
sujeito a baixo suprimento de oxigênio. Os neonatos saudáveis sofrem de
acidose discreta, sendo que os animais nascidos de partos laboriosos
apresentam, invariavelmente, níveis significativamente mais baixos de pH
sanguíneo (GARDINER, 1980; WILSON et al., 1976).
As contrações uterinas e a ruptura das membranas fetais durante o parto
normal
causam
distúrbios
na
circulação
sanguínea
uteroplacentárias,
promovendo leve, porém transitória, acidose mista, considerada fisiológica,
encontrando-se, o pH sanguíneo, em torno de 7,2 (RAVARY-PLUMIOËN,
2009). Observa-se acidose metabólica e respiratória transitória discreta após a
ruptura do cordão umbilical, por causa da glicólise anaeróbia em tecidos pouco
perfundidos, durante a transição do fornecimento placentário de oxigênio para
o estabelecimento da função respiratória (VAALA; HOUSE, 2006). Esta
condição é agravada pela reduzida capacidade respiratória do neonato,
caracterizada por hipoventilação, que não garante a remoção do dióxido de
carbono (CO2) na mesma intensidade em que é produzida, levando, pelo seu
24
acúmulo, à produção de ácido carbônico e, consequentemente, à diminuição
do pH (PICCIONE et al., 2006).
Para combater os desequilíbrios ácido-básicos o organismo se utiliza de
três mecanismos principais, a saber: tamponamento químico pelo bicarbonato,
ajuste respiratório e excreção de íons hidrogênio pelos rins. Os sistemas
tampões e respiratório atuam em poucos minutos, ao contrário dos rins, que
respondem mais tardiamente ao excesso de ácido ou de base (GUYTON;
HALL, 2006; HOUPT, 2006).
Em bezerros é descrito que os desequilíbrios ácido-básicos fisiológicos,
presentes logo após o nascimento, são solucionados em torno de duas horas
no caso da acidose respiratória e em torno de 24 a 48 horas para a acidose
metabólica (VARGA et al., 1998; UYSTEPRUYST, 2006).
Tal condição pode ser devida à reversão fisiológica da acidemia sofrida
durante o parto, em virtude do início da atividade respiratória e do mecanismo
de filtração renal, obedecendo ao novo padrão circulatório e respiratório
estabelecido pelo organismo (BENESI, 1993; HASKINS, 1977).
Em bezerros recém-nascidos observou-se a influência etária nos valores
hemogasométricos e do balanço ácido-básico em suas primeiras 24 horas de
vida, tanto no sangue venoso quanto no arterial (VARGA et al., 1998; LISBÔA
et al., 2002; GASPARELLI, 2007).
Yanaka (2009) observou que caprinos recém-nascidos possuíam valores
mais baixos de pH sanguíneo, e valores de pCO2 aumentados, caracterizando,
assim, acidose respiratória. Entretanto, às 48 horas de vida, estes valores
apresentavam-se normalizados. Camargo (2010) descreveu a ocorrência de
discreta acidose, para os cabritos nascidos de partos normais, e de acidose
mais severa para os nascidos de cesarianas, os quais, às 24 horas de vida, já
se encontravam bem próximos aos valores de referência.
Normalmente, quando há indicação de cesariana, vários fenômenos
encontram-se associados. Entre os mais importantes, cita-se a emergência
requerida à distocia materna e/ou fetal, tornando o ato cirúrgico e a anestesia
mais difíceis. Nestes casos o risco de morte aumenta, pois ocorrem eventos
25
fisiológicos que alteram a resposta da paciente e do feto em relação aos
anestésicos (MASSONE, 2008).
Os agentes anestésicos que afetam o sistema nervoso central materno
produzirão os mesmos efeitos no feto, que são caracterizados, geralmente, por
depressão
e
viabilidade
diminuída
(RAFFE;
CARPENTER,
2007).
A
oxigenação uterina é diretamente proporcional à pressão de perfusão e
indiretamente proporcional à resistência vascular uterina, ou seja, como na
gestante anestesiada há diminuição na circulação uterina, pode haver redução
na viabilidade fetal (GAIDO, 1997).
2.5.4 Hemograma
A avaliação hematológica neonatal representa um recurso diagnóstico
de grande valia. Mohri et al. (2007) afirmam haver relação entre à
disponibilidade de ferro para os neonatos e à concentração de hemoglobina e o
hematócrito. A hemoglobina fetal tende a desaparecer e ser substituída pela
adulta logo ao nascimento. Os eritrócitos adultos são de menor tamanho e
necessitam de menores quantidades de hemoglobina, sem necessariamente
relacionar-se aos níveis sanguíneos de ferro.
No período neonatal, o recém-nascido está mais susceptível às doenças
(RADOSTITIS, 2002) e a mortalidade de neonatos constitui um relevante
problema na criação da espécie ovina (CHRISTLEY et al., 2003) sendo
importante, portanto, a realização dos estudos que auxiliem a compreensão
dos mecanismos fisiológicos e esclareçam as causas das afecções para
minimizar os prejuízos. Dentre os processos patológicos que comprometem a
saúde dos pequenos ruminantes, destacam-se aqueles que, em sua evolução
clínica, determinam o aparecimento de quadros de anemia (KANEKO; MILLES,
1970).
A hematologia clínica constitui-se em importante área de estudo sobre o
estado de saúde dos animais, sendo o hemograma um dos métodos auxiliares
26
de avaliação de diagnóstico e prognóstico de enfermidades (GAMA et al.,
2008). Neste estudo, foram utilizados os valores de referência de acordo Jain
(1993) e Meyer (1995).
2.6 Objetivos
2.6.1 Objetivo geral
Avaliar a maturidade pulmonar de cordeiros nascidos a termo e
prematuros, pela análise do líquido amniótico, por meio de citologia, do teste de
Clements e contagem de corpos lamelares.
2.6.2 Objetivos específicos
● Determinar, avaliar e comparar a vitalidade, a coloração de mucosas,
a temperatura retal, a frequência cardíaca e função respiratória (frequência e
padrão respiratório) de cordeiros nascidos a termo e prematuros, ao longo das
48 horas de vida;
● Determinar, avaliar e comparar os valores do hemograma completo,
incluindo volume globular (VG) e hemoglobina (Hb), ao longo das 48 horas de
vida;
● Determinar, avaliar e comparar os valores de pH, PCO2, HCO3 e BE
de amostras de sangue venoso de cordeiros nascidos a termo e prematuros,
ao longo das 48 horas de vida;
●Determinar, avaliar e comparar os níveis séricos de glicose e lactato
em cordeiros nascidos a termo e prematuros, ao longo das 48 horas de vida;
●Determinar, avaliar e comparar as taxas de morbimortalidade de
cordeiros em decorrência do grau de imaturidade pulmonar;
27
●Determinar e avaliar a utilização dos testes de Clements, contagem de
corpos lamelares e as características citologias, visando à avaliação da
maturidade pulmonar em cordeiros prematuros e a termo.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Característica dos animais e grupos experimentais
Para atingir os objetivos propostos, foram utilizados, no total, 56 animais
(24 ovelhas e 32 cordeiros) da espécie ovina, mestiços de Suffolk, provenientes
de rebanho da região de Araçatuba/SP, distribuídos em três Grupos
experimentais, a saber:
GRUPOS
GRUPO I
GRUPO II
GRUPO III
3.2
ANIMAISANIMAIS
ƒ
Constituído por oito ovelhas, com
gestação em torno de 145 dias, e por 10 cordeiros
nascidos de partos normais.
ƒ
Composto por oito ovelhas, com 138 dias
de gestação, e por oito cordeiros nascidos de
cesarianas.
ƒ
Constituído por oito ovelhas com 138 dias
de gestação e que receberam 16mg/ovelha de
dexametasona1, por via intramuscular, 36 horas antes da
cirurgia eletiva, e por 11 cordeiros.
Instalações e Manejo
Os animais foram mantidos a pasto e suplementados com silagem e
ração comercial, indicada para a espécie ovina. Próximo à data prevista do
parto e/ou da realização da cesariana, transferiu-se os animais para a baia,
para facilitar a observação do parto. As ovelhas pertencentes ao grupo I foram
monitoradas durante as 24 horas do dia, para que houvesse adequado
acompanhamento, caso entrassem em trabalho de parto.
28
A fim de concentrar as parições e facilitar o manejo, adotou-se um
protocolo de sincronização de estro com esponjas vaginais de progesterona b,
seguidas da administração de 0,4 mL de prostaglandina (PGF2α) via
intramuscular no dia zero (D0), e, no sétimo dia (D7), aplicou-se 5.000 UI de
gonadotrofina coriônica equina (ECG)c e 0,4 mL de prostaglandinad por via
intramuscular. O carneiro utilizado como reprodutor era marcado na região
peitoral com tinta a cada 36 horas, sendo a sua cor alterada a intervalos de 15
dias. Com as datas de cobertura das ovelhas conhecidas, realizou-se exame
ultrassonográfico (DP 2200 Vet, Mindray) abdominal para confirmação da
gestação entre 45 e 60 dias após a última data de cobertura.
3.3
Anestesia e procedimento cirúrgico
Para o procedimento anestésico adotado nas cirurgias cesarianas
empregou-se a anestesia local com bloqueio paravertebral proximal nos ramos
nervosos das vértebras T13, L1 e L2, utilizando-se cloridrato de lidocaína
(Xylestesin® 2%, Cristália), no volume de 5 mL em cada ponto dorsal e ventral
aos processos transversos. Associou-se à anestesia peridural lombossacra
(L6- S1), sulfato de morfina (Dimorf®, Cristália) na dose de 0,1 mg/kg diluída
em 5 mL de solução fisiológica. Nos casos em que a anestesia paravertebral
não foi eficiente, realizou-se bloqueio infiltrativo no local da incisão com
cloridrato de lidocaína. Após a retirada do feto, quando necessário, as ovelhas
recebiam sedação com maleato de midazolam (Dormonid ®, Roche) na dose de
0,2 mg/kg. O procedimento cirúrgico foi feito com as ovelhas colocadas em
decúbito lateral direito, para incisão em região do flanco esquerdo, conforme
técnica descrita por Tibary e Van Metre (2004).
3.4
Colheita e preparação das amostras de líquido amniótico
As colheitas de amostras aos 138 dias (Grupos II e III) foram
realizadas em ovelhas submetidas à cesariana. Após a tricotomia, a fêmea
29
permanecia na mesa cirúrgica onde realizava-se a incisão em região do
flanco esquerdo. O útero era localizado e exteriorizado, verificando-se a
melhor região para a realização da incisão uterina, a fim de se evitar
hemorragia excessiva e a contaminação da amostra com sangue. Após a
exposição
placentária
rompia-se
delicadamente
a
membrana
corioalantóideana e amniótica, e com uma seringa de 20 mL e agulha 40x12
retirava-se a maior quantidade de LA possível. Nas ovelhas que pariram
normalmente (Grupo I), o método de colheita do LA era feito após a expulsão
da bolsa amniótica; caso a mesma permanecesse intacta, colhia-se com a
utilização de uma agulha 40x12 acoplada a uma seringa de 20 mL. Caso
rompesse, o mesmo era obtido por meio da colocação de um tubo “falcon”
apoiado à vulva da fêmea.
Devido a pouca quantidade de pessoas na equipe, e priorizando-se o
conforto respiratório e o tratamento suporte do neonato, não foi possível a
realização dos testes para avaliação de maturidade fetal imediatamente
após a colheita. Dessa forma, as amostras eram mantidas refrigeradas em
isopor com gelo reciclável, durante todo procedimento cirúrgico, sendo,
posteriormente, separadas em alíquotas e congeladas a -18º C.
30
FIGURA 2- A) Obtenção do LA do grupo I (Parto normal), B) evidenciando a
colheita do fluído amniótico pelo método de escoamento durante as
contrações uterinas para o interior do tubo e/ou seringa descartável
(20 mL), apoiando-se à vulva da fêmea.
FIGURA 3 - Colheita de LA de ovelha submetida à cesariana (Grupos II e III).
31
3.5
Avaliação do líquido amniótico
O LA foi avaliado em sua totalidade, incluindo os testes para avaliação
da maturidade fetal e pulmonar propostos neste trabalho (Teste de Clements,
contagem de corpos lamelares e citologia com azul de Nilo a 0,1 %), bem
como a avaliação macroscópica (aspecto, viscosidade, coloração, volume e
possíveis contaminações), além de sua morfologia celular. Além da técnica
de azul de Nilo, realizou-se, concomitantemente, o método de Hematoxilina–
Shorr, utilizada por Moya (2005), como método alternativo. Da mesma forma,
realizou-se, além do teste de Clements et al (1972), o teste modificado como
sugerido por Barreto (2006). Todos os dados obtidos foram anotados em
fichas individuais (Figura 5).
FIGURA 4 – Ficha de acompanhamento individual, onde foram anotados os
dados obtidos após análises do líquido amniótico.
32
3.5.1 Método citológico - Coloração de azul de Nilo a 0,1%
Uma gota (50uL) de LA foi colocada sobre uma lâmina de vidro e
diluída em uma gota (50uL) de corante Azul de Nilo a 0,1%. Posteriormente,
esta lâmina era coberta por uma lamínula (Figura 5) e observada à
microscopia óptica com objetiva de 40 vezes, para facilitar a visualização do
campo para a contagem, e em outra objetiva de 100 vezes, para evidenciar
as
nuances
celulares.
As
porcentagens
de
células
orangeofílicas
(alaranjadas) foram relacionadas com às cianofílicas (azuladas). A
observação de proporção superior a 10% foi considerada significativa para a
maturidade fetal.
FIGURA 5 – Preparo das lâminas para posterior análise em microscopia óptica.
33
3.5.2 Método citológico : coloração de Hematoxilina-Shorr
Nos casos em que a amostra era acompanhada pela presença de muco,
procedia-se nova centrifugação a 3.000 rpm por três minutos, para que não
ocorresse lise das células. Posteriormente, era submetida à citocentrífugação.
As amostras que não tinham muco eram imediatamente citocentrifugadas.
Após a secagem da lâmina, procedia-se a coloração de Hematoxilina-Shorr.
Moya (2005) relatou que devido à pequena quantidade de células nos fluídos
fetais, as amostras necessitavam de nova centrifugação a 4000 rpm, durante
seis minutos. Porém, o tempo de seis minutos foi mantido neste trabalho,
mesmo realizando-se a centrifugação a 1000 rpm, já que tal velocidade
mostrou-se adequada para a separação celular. As lâminas passaram por 19
fases de coloração, seguindo as recomendações de Oliveira, et.al. (2000).
3.5.3 Teste de Clements
Clements et al. (1972) propuseram a prova com cinco diluições
diferentes de LA (Quadro 1) em tubos de vidro de 14x100 mm, quimicamente
limpos com éter e previamente numerados, nos quais eram distribuídos os
volumes de LA, solução salina a 0,9% (SF) e etanol a 95% (E). Os tubos,
fechados com tampa de borracha limpa, foram vigorosamente agitados durante
15 segundos e colocados verticalmente em suporte adequado. A persistência
de um anel intacto de bolhas na interface ar/líquido após 15 minutos de
observação configurou o resultado positivo.
Neste estudo, o teste foi dividido
em duas categorias de resultados: (1) negativo ou "imaturo" - não-persistência
de bolhas no 1º tubo ou somente nos 2 primeiros tubos e ausente no 3º e (2)
positivo ou "maduro" - espuma estável até o 3º tubo. (CLEMENTS et al., 1972;
COSTA et al., 2001; TABORDA et al., 2000).
34
QUADRO 1. Diluições utilizadas para a realização do teste de Clements et al.
(1972).
1°. Tubo
1,0 mL LA + 1,0 mL Etanol 95%
2°. Tubo
0,75 mL LA + 0,25 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
3°. Tubo
0,50 mL LA + 0,5 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
4°. Tubo
0,25 mL LA + 0,75 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
5°. Tubo
0,20 mL LA + 0,8 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
Caso ocorressem problemas, como os verificados por Barreto (2006),
que ao realizar a técnica proposta por Clements não se constatou halo de
espuma em nenhum dos tubos, optava-se pela não diluição das amostras com
solução fisiológica (teste de Clements modificado) conforme realizado por
Barreto (2006).
3.5.4 Teste de Clements modificado por Barreto (2006)
O teste de Clements modificado por Barreto (2006) tem como
base a reação de saponificação dos surfactantes presentes. Realizaram-se
diluições gradativas dos fluídos com etanol a 95%, observando-se possíveis
halos de espuma nos tubos de ensaio. O halo recebeu valores de 0 a 4 de
acordo com a sua intensidade. Optou-se pela exclusão da diluição com um (1)
mL de solução fisiológica como preconiza o teste, pois não propiciou a
formação de bolha. Excluiu-se, também, a maior (1mL) e menor (0,5 mL)
diluições, em virtude do volume colhido (BARRETO, 2006).
QUADRO 2- Teste de Clements modificado, proposto por Barreto (2006).
1° Tubo
2° Tubo
3° Tubo
4° Tubo
0,9 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
0,8 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
0,7 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
0,6 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
35
3.5.5 Contagem de corpos lamelares
A contagem de CCL foi realizada no canal de plaquetas em analisadores
hematológicos, necessitando-se de 0,5 mL de LA por amostra. O equipamento
era calibrado com os parâmetros utilizados para a contagem de plaquetas entre
25 a 35 fL ovinos. As amostras foram filtradas, colocadas em tubos medindo 12
x 75 mm, sendo o sobrenadante testado por meio de sistema automatizado
Coulter STKS®, no canal de plaquetas, por medida volumétrica e por meio da
distribuição de tamanho, comparando-se a curva logarítmica (tecnologia de
fluxo de arraste (FAKHOURY et al., 1994; LEWIS et al., 1999; CARRILLO et
al., 1997). Caso a técnica proposta não se mostrasse satisfatória, uma alíquota
de LA (com 2 mL, aproximadamente) de cada amostra era encaminhada ao
Laboratório de Microscopia Eletrônica (Biocell) da Universidade Estadual
Paulista – USP de Ribeirão Preto, para processamento e posterior análise por
meio da microscopia eletrônica (MET JEOL JEM 100 CX II), com intuito de se
avaliar a presença de corpos lamelares.
3.6 Avaliação dos recém-nascidos
Com o objetivo de estudar as alterações dos parâmetros vitais e das
características cardiorrespiratórias de cordeiros nascidos a termo e prematuros,
todos os animais dos diferentes grupos foram submetidos à aferição da
temperatura retal, frequência cardíaca, frequência respiratória e à avaliação
das características respiratórias, ao nascimento, aos 15 e 60 minutos, bem
como às seis, 12, 24 e 48 horas de vida.
Para avaliação da vitalidade dos cordeiros, utilizou-se o escore Apgar
modificado por Born (1981). Os quatro itens de avaliação, pontuados de zero a
dois, foram os seguintes: a) movimentação da cabeça com água fria (zero –
ausente; um - diminuída; dois - espontânea e com movimentos ativos); b)
resposta reflexa óculo-palpebral e interdigital (zero – ausente; um – um reflexo
presente; dois – dois reflexos presentes); c) tipo de respiração (zero –
36
imperceptível; um - lenta e irregular; dois – rítmica e profundidade normal); e d)
coloração das mucosas visíveis (zero – branco-azulada; um – azul e dois –
róseo-avermelhada), com pontuação interpretada da seguinte forma: sete a oito
representam boa vitalidade; quatro a seis caracterizam animal com moderada
vitalidade, e pontuação entre zero a três é sugestiva de que o recém-nascido
encontra-se com baixa vitalidade (deprimido).
Os cuidados referentes à manutenção de temperatura e suporte
ventilatório, quando do desenvolvimento de hipotermia e hipóxia, foram feitos
mantendo os neonatos em incubadora apropriada e ventilação com auxílio de
ambu, respectivamente. Outros procedimentos terapêuticos eram realizados,
caso houvesse necessidade, levando-se em consideração a manifestação
clínica apresentada (hipoglicemia, hipovolemia), na tentativa de mantê-los vivos
e saudáveis ao longo das avaliações.
FIGURA 6 -
Manutenção da temperatura e suporte ventilatório de cordeiro em
incubador apropriada. Cordeiro com sondas nasotraqueal e esofágica.
37
3.6.1 Colheitas e preparação de amostras de sangue
3.6.1.1 Determinação da glicemia e do lactato
As mensurações da glicemia e da concentração plasmática de lactato
foram realizadas imediatamente após a colheita de sangue em cada momento,
em glicosímetro (One Touch Ultra II®, Johnson & Johnson) e lactímetro
(Accutrend Plus®, Roche), respectivamente, seguindo-se as recomendações
dos fabricantes.
3.6.1.2 Hemogasometria
Para a realização da colheita foram utilizadas seringas de plástico 2,
contendo heparina lítio cálcio (80 UI de heparina), para volume de 1,6 mL,
acoplada à agulha hipodérmica 25 x 0,7 mm. Quando presentes, o ar residual
e as bolhas foram desprezados, e as seringas mantidas seladas e
armazenadas em recipiente térmico contendo água e gelo reciclável, até o
seu processamento, sem contato direto, sendo as amostras processadas,
invariavelmente, em até 15 minutos após a colheita, como recomendado por
Lisboa et al. (2002). Efetuou-se a determinação dos valores de pH, pressão
parcial de gás carbônico (pCO2), bicarbonato (HCO3) e excesso/déficit de
base (BE) em analisador clínico eletrônico portátil (i-Stat® Portable Clinical
Analyzer), utilizando-se cartuchos específicos (EG7+ Cartridge) de acordo
com as recomendações do fabricante, sendo calibrado automaticamente
antes do processamento das amostras. Adicionalmente, como controle de
qualidade, foi utilizado o simulador eletrônico (i-Stat® Electronic Simulator)
para
verificar
o
funcionamento
correto
do
equipamento
antes
do
processamento. Os valores de pH e pCO2 foram ajustados pelo aparelho, de
38
acordo com a temperatura retal de cada animal, aferida com termômetro
clínico digital.
3.6.1.3 Hemograma
Amostras de sangue venoso foram colhidas logo após o nascimento
(M0h), aos 15 minutos (M15min), aos 60 minutos (M60min), às 24 horas
(M24h) e às 48 horas de vida (M48h). Para a colheita das amostras de sangue
realizou-se assepsia local, seguida por punção da veia jugular, utilizando-se
agulhas 25 x 0,7 mm acopladas a tubos com anticoagulante ácido
etilenodiamino tetracético3 (EDTA), para volume de cinco (5) mL, e tubos
siliconizados sem anticoagulante4, para volume de 10 mL. O sangue recolhido
para obtenção do soro era mantido em temperatura ambiente, ao abrigo da luz,
até a coagulação e retração do coágulo. Em seguida, centrifugado a 3.000
r.p.m., durante cinco minutos, para melhor separação do soro, sendo, então,
transferido para eppendorfs apropriados, divididos em três alíquotas, e
congelado imediatamente a -20o C, até o momento do seu processamento. O
teor de hemoglobina foi mensurado em espectrofotômetro semiautomático
(Labquest, Labtest, Belo Horizonte, Minas Gerais), empregando-se o reativo
comercial de cianometahemoglobina. O volume globular foi obtido com a
utilização de tubos capilares e centrífuga para microhematócrito, sendo as
amostras de sangue com EDTA centrifugadas a 13.000 x G, durante cinco
minutos.
A concentração plasmática de proteína total foi determinada utilizandose refratômetro clínico (Master-SUR/NM, ATAGO, Tóquio, Japão) e o teor
plasmático de fibrinogênio realizado pelo método de precipitação pelo calor
com posterior leitura em refratômetro (MILLAR et al., 1971).
O leucograma foi realizado mediante a contagem leucocitária manual,
em câmara de Neubauer (Neubauer Improved Bright-Lined, New Optik),
diluindo-se a amostra com a utilização de pipetas (Pipeta de Thoma, Writeg,
39
Alemanha). Para cada amostra colhida preparou-se esfregaço sanguíneo
corado, para a contagem de 100 células, com corante Panótico Rápido
(LaborClin) visando a contagem diferencial de leucócitos (GARCIA-NAVARRO,
1994).
3.6.2 Exame Radiográfico
Realizou- se o
exame radiográfico pulmonar
no momento do
nascimento dos cordeiros (M0), às 24 e às 48 horas de vida (M24 e M48), por
meio do aparelho5 de Raio-X fixo, posicionando-se os animais em decúbito
látero-lateral.
3.7
Análise Estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância com medidas
repetidas, por meio do procedimento MIXED do SAS (Statistical Analysis
Sistem) e estrutura de covariância utilizada definida pelo critério de
informação de Akaike. As comparações múltiplas das médias foram
realizadas com o LSMEANS (Least Squares Means), ajustado para Tukey.
Os valores das variáveis (tabelas com as medianas) foram analisados
usando o teste de Kruskal Wallis para comparar os grupos em cada
momento e teste de Friedman para comparar os momentos para cada grupo,
seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn. Os valores das
variáveis, coloração da mucosa e do Teste de Clements utilizando o líquido
amniótico, foram analisados usando o teste exato de Fisher. O nível de
significância adotado foi de 5%.
40
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise do líquido amniótico
Por maturidade fetal entende-se que determinados órgãos fetais em
determinada categoria gestacional apresentam grau de desenvolvimento
funcional semelhante ao encontrado em recém-nascido nascidos a termo.
(NEME, 1988). Na medicina humana muitas técnicas são empregadas para
avaliação tanto da maturidade fetal quanto da maturidade pulmonar, porém, na
medicina veterinária, algumas técnicas utilizadas em humanos e denominadas
como técnicas “padrão ouro”, são muito caras e difíceis de serem realizadas na
rotina clínica.
Na literatura são poucos os trabalhos desenvolvidos com a análise do
LA e sua relação com a maturidade fetal e pulmonar em ovinos. Portanto, a
maioria dos trabalhos propostos é baseada em trabalhos feitos em humanos.
O LA é considerado como produto oriundo de secreções das paredes ou
folhetos amnióticos, bem como pela saliva, secreção do trato respiratório do
feto e, temporariamente, pela urina. Considerando que esse líquido envolve
diretamente o feto, nele pode ser encontrado pêlos, células epiteliais, restos de
escamações cutâneas e, em casos de sofrimento fetal, mecônio. (PRESTES,
2012). Portanto, antes de se realizar as análises para avaliação da maturidade
fetal e pulmonar, foi preciso observar macroscopicamente o aspecto deste
fluído amniótico após a colheita. Ressalta-se, que, por serem as ovelhas
também
submetidas à
cesariana,
existia
a
possibilidade
de
ocorrer
sangramento e contaminação das amostras com sangue. As características
macroscópicas verificadas no LA dos animais dos grupos I (Parto Normal), II
(Cesárea) e III (Cesárea + Dexa) estão dispostas na Tabela 1. A classificação
utilizada, no presente trabalho, para a avaliação macroscópica do LA foi:
Coloração: CLARA (C), AMARELA (A) e VERMELHA (V); Aspecto: TURVO
(T), TRANSPARENTE (TR); Viscosidade:0 para ausência de viscosidade, 1 e
2 baixa viscosidade, 3 viscosidade intermediária e 4 e 5 para consistência
41
altamente viscosa; Contaminação: Mecônio (M) e Sangue (S), com cruzes de
incidência : + = poucos; ++ = médio; +++ = muitos.
42
Tabela 1- Dados individuais das características do LA pertencente aos grupos
I (Parto Normal), II (Cesárea) e III (Cesárea + Dexametasona).
Araçatuba- SP, 2014.
Grupo III
Grupo II
Grupo I
AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
Animais
Volume
(ml)
Coloração
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
14
14
22
20
20
25
11
20
22
24
AMARELA
AMARELA
CLARA
AMARELA
AMARELA
CLARA
CLARA
CLARA
AMARELA
CLARA
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TURVO
TURVO
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
4
4
5
5
5
3
3
4
4
3
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
MECÔNIO
AUSENTE
C1
14,5
AMARELA
TURVO
3
MECÔNIO ++
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
10
CLARA
TRANSPARENTE
2
MECÔNIO +
24,5
20
20
12,5
7
7
16
26
26
AVERMELHADA
CLARA
CLARA
CLARA
CLARA
CLARA
AMARELA
CLARA
CLARA
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TURVO
TURVO
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
4
4
4
3
5
5
3
3
3
SANGUE +
AUSENTE
AUSENTE
MECÔNIO +
AUSENTE
AUSENTE
MECÔNIO +
AUSENTE
AUSENTE
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
12,5
5
13
15
15
16
16
CLARA
AMARELA
AMARELA
CLARA
CLARA
AVERMELHADA
AVERMELHADA
TURVO
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
4
4
4
3
3
3
3
C8
C9
C10
C11
10
23
24
24
AVERMELHADA
AMARELA
CLARA
CLARA
TURVO
TURVO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
5
3
3
3
MECÔNIO +
MECÔNIO ++
MECÔNIO ++
AUSENTE
AUSENTE
SANGUE +
MECÔNIO +
SANGUE +
MECÔNIO +
AUSENTE
AUSENTE
AUSENTE
Aspecto
Viscosidade
(0 a 5)
Contaminação
De maneira geral, o mínimo de 20 mL e o máximo de 40 mL de LA foi
colhido das ovelhas que compuseram os diferentes grupos. As amostras de
43
líquido amniótico das ovelhas do grupo I apresentaram menor contaminação e
maior viscosidade quando comparadas às dos outros grupos (II e III). Naquelas
obtidas do grupo III constatou-se maior contaminação, principalmente por
mecônio, quando comparado aos dois grupos restantes (I e II).
4.1.1 Método citológico – Coloração de azul de Nilo 0,1%
Neme (1988) cita que o sulfato de Azul de Nilo é a mistura de sulfato de
oxazona (cor azul) e oxazona que cora lípides, dando tonalidade alaranjada.
Assim, evidenciam-se dois tipos celulares principais neste teste, quais sejam :
a) células grandes poligonais, de citoplasma azulado e núcleo preservado,
consideradas células de imaturidade; b) células alaranjadas com núcleo
picnótico ou ausente, denominadas células orangeófilas e consideradas como
sendo células indicativas de maturidade. Com relação à morfologia celular,
tanto na citologia utilizando o azul de Nilo a 0,1% quanto na técnica citológica
de Hematoxilina–Shorr, adotou-se, neste trabalho, o mesmo padrão de
classificação celular descrito por Moya, (2005), dividindo-o em quatro tipos de
células, a saber: célula intermediária pequena (CIP), intermediária grande
(CIG), célula superficial nucleada (CSN) e célula superficial anucleada (CSA).
Além do estudo da morfologia celular, as células oriundas do fluído amniótico
foram classificadas como células cianofílicas (células azuis), sendo as mesmas
consideradas células com características de imaturidade fetal, bem como a
presença de células orangeofílicas (células coradas de laranja) onde sua
presença é tida como indicadora de maturidade fetal.
Após a análise
estatística (Tabela II), observou-se que o grupo I (Parto Normal) não
apresentou diferenças significativas em relação ao grupo II (Cesariana) em
relação às células cianofílicas e orangeofílicas; porém, o grupo III
(Cesariana+Dexametasona) diferiu do grupo de parto normal (Grupo I),
demonstrando que o LA oriundo de ovelhas que receberam administração de
corticoide antes da parição possuía maior concentração do que o líquido
44
amniótico de cordeiros oriundos de cirurgia eletiva sem a indução por este
fármaco.
Medianas (Md), mínimo e máximo das porcentagens de células
cianofílicas (células azuis) e orangeofílicas (células alaranjadas)
encontradas no líquido amniótico, utilizando a técnica de Azul de
Nilo (0,1%), de ovelhas oriundas de parto normal( Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona(Grupo III) –
Araçatuba, SP – 2013.
Tabela 2 –
NORMAL
Citologia
Azul de Nilo
Cianofílicas
Orangeofílicas
A,
CESARIANA +
DEXAMETASONA
CESARIANA
n
10
Md
96,1 A
Min - Max
84,0 - 98,0
n
11
Md
90,5 AB
Min - Max
73,0 - 96,3
n
11
Md
87,0 B
Min - Max
80,8 - 96,9
10
4,0 A
2,0 - 16,0
11
9,5 AB
3,7 - 27,0
11
13,0 B
3,1 - 19,3
Medianas seguidas de letras diferentes na linha, diferem entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
Observou-se, em todos os grupos (Tabela 2), maior quantidade de
células
cianofílicas
(azuis),
quando
comparadas
às
orangeofílicas
(alaranjadas), com medianas de 96,1%, 90,5% e 87%, respectivamente. Tais
resultados poderiam ser explicados pelo fato de os animais dos grupos II e III
terem nascidos por meio de realização de cirurgias eletivas aos 138 dias de
gestação, o que denotaria maior quantidade de células indicativas de
imaturidade fetal. Contudo, quando o grupo de parto normal (Grupo I) foi
avaliado, constataram-se resultados similares aos dos animais prematuros,
com poucas células laranja e muitas células azuis.
45
Tabela 3 – Medianas (Md), mínimo e máximo das porcentagens da morfologia
celular encontrada no líquido amniótico, coradas pela técnica de
Azul de Nilo (0,1%), classificadas de acordo com Moya ( 2005),
como:
CIP(Células Intermediárias pequenas), CIG ( Células
Intermediárias Grandes), CSN (Células superficiais nucleadas e
CSA (Células Superficiais Anucleadas) de cordeiros pertencentes
aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana (Grupo II) e
cesariana + dexametasona (Grupo III) – Araçatuba, SP – 2014.
Morfologia
celular Azul
de Nilo
CIP %
CIG %
CSN %
CSA %
A,
NORMAL
n
5
4
10
10
Md
3,8 AB
2,0 AB
19,3
79,8
CESARIANA +
DEXAMETASONA
CESARIANA
Min-Max
2,0 - 7,9
1,4 - 3,0
8,0 - 76,0
19,0 - 92,0
n
11
11
11
11
Md
12,0 A
6,0 A
33,3
40,5
Min-Max
0,0 - 43,0
0,0 - 14,1
2,5 - 69,4
23,1 - 74,6
n
11
11
11
11
Md
3,1 B
1,5 B
34,0
59,7
Min-Max
0,0 - 11,2
0,0 - 5,1
14,5 - 81,3
12,0 -84,1
Medianas seguidas de letras diferentes na linha, diferem entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
Observando-se os resultados, ressalta-se, na Tabela 3, que as variáveis
CIP (Célula Intermediária Pequena) e CIG (Células Intermediária Grande),
diferiram entre os grupos II (Cesariana) e III (Cesariana+Dexametasona),
porém, com relação as CSN (Células Superficiais Nucleadas) e CSA (Células
Superficiais Anucleadas) não se denotou o mesmo comportamento entre os
diferentes grupos (I, II e III).
Visualizou-se (Tabela 3), também, maior quantidade de células
superficiais, chegando ao máximo de 92% para o grupo I (Parto Normal), de
74,6%
para
o
grupo
II
(Cesariana)
e
de
84,1%
no
grupo
III
(Cesariana+Dexametasona).
Durante a pesquisa verificou-se que quando o feto apresentava-se
maduro, a incidência de CSN (células superficiais nucleadas) e CSA (células
superficiais anucleadas) era maior quando comparada aos prematuros (Grupo
II e III). Contudo, estas células que deviam apresentar-se coradas de laranja,
indicando maturidade fetal na técnica de azul de Nilo (0,1%), também se
apresentavam coradas de azuis (Figura 6), corroborando com Moya (2005),
46
que afirmou que a realização da técnica de coloração azul de Nilo visando à
avaliação da maturidade fetal não apresenta resultados satisfatórios.
Desta forma, devido aos resultados insatisfatórios obtidos na presente
pesquisa,
propôs-se
realizar-se,
concomitantemente,
a
citologia
de
Hematoxilina–Shorr, proposta por Moya (2005), para avaliação e comparação
dos resultados obtidos entre ambas as técnicas, apesar de não fazer parte do
delineamento experimental inicial deste trabalho.
FIGURA 7- Lâmina corada com Azul de Nilo a 0,1%, em aumento de 400
vezes/campo, evidenciando maior quantidade de células cianofílicas e
superficiais nucleadas.
4.1.2 Método citológico – Coloração Hematoxilina Shorr
Souza, et al. (2000) citaram que estas células alaranjadas praticamente
inexistem no início da gestação de ovelhas, aparecendo em pequena
proporção no terço médio, e se proliferando até o momento do parto,
47
representando cerca de 50 a 95% da população celular encontrada no LA, com
maiores valores verificados nos fetos mais velhos, servindo, desta forma, como
indicadoras da idade fetal.
Tabela 4-
Medianas (Md), mínimo e máximo das porcentagens de células
cianofílicas (células azuis) e orangeofílicas (células alaranjadas)
encontradas no líquido amniótico,utilizando o método de
Hematoxilina Shorr, de cordeiros pertencentes aos grupos de parto
normal (Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III) – Araçatuba, SP – 2014.
Citologia
Hematoxilina
Shoor
NORMAL
n
10
10
Min - Max
8,0 - 42,7
57,3 - 92,0
n
11
11
Min - Max
19,8 - 66,7
33,3 - 80,2
A,
Medianas seguidas de letras diferentes na linha, diferem entre si pelo teste de Dunn (p < 0, 05).
Cianofílicas
Orangeofílicas
Md
21,0 A
79,0 A
CESARIANA
Md
40,0 AB
60,0 AB
CESARIANA +
DEXAMETASONA
n
Md
Min - Max
11
45,6 B 32,0 - 64,9
11
54,4 B 35,1 - 68,0
Tabela 5 – Medianas (Md), mínimo e máximo das porcentagens da morfologia
celular encontrada no líquido amniótico, coradas pelo método
Hematoxilina Shorr, classificadas de acordo com Moya (2005), de
cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III) –
Araçatuba, SP – 2014.
Morfologia
coloração
de Shoor
CIP %
CIG %
CSN %
CSA %
NORMAL
n
5
4
10
10
Md
3,2
4,4
38,8
55,8
Min-Max
1,2 - 9,4
3,2 - 4,4
24,4 - 70,6
27,9 - 74,4
CESARIANA +
DEXAMETASONA
CESARIANA
n
11
11
11
11
Md
10,3
1,5
29,0
62,7
Min-Max
0,0 - 54,6
0,0 - 13,3
15,8 - 62,3
16,4 - 71,0
n
11
11
11
11
Md
4,7
1,9
30,8
61,5
Min-Max
0,0 - 13,0
0,0 - 7,3
14,5 - 81,3
12,0 - 84,1
CIP (Células Intermediárias pequenas), CIG (Células Intermediárias Grandes), CSN (Células superficiais nucleadas e
CSA (Células Superficiais Anucleadas) A,Medianas seguidas de letras diferentes na linha, diferem entre si pelo teste de
Dunn (p < 0,05).
Apesar de, estatisticamente, os resultados do grupo I (Parto Normal) e
do grupo II (Cesariana) não diferirem, ficou evidente, nesta técnica, que o
grupo I possuía maior quantidade de células orangeofílicas, atingindo a
porcentagem máxima de 92% (Tabela 4), valor este que condiz com a
literatura, já que se espera maior incidência de células características de
maturidade pulmonar em amostras de LA de animais com tempo de gestação
48
considerado normal para a espécie em referência. Na tabela 5, foi possível
verificar maior ocorrência de células superficiais anucleadas (CSA), atingindo
os valores máximos no grupo I (Parto Normal) de 74,4. Nas amostras de LA
dos animais do grupo II (Cesariana) constatou-se em torno de 71% no grupo III
(Cesariana+ Dexametasona), chegando a equiparar-se com as células
superficiais nucleadas (81,3).
Nos grupos II e III (Tabela 4), observou-se que quando a porcentagem
das células orangeofílicas (maduras) diminuía, apresentando valor mínimo de
33,3%, a quantidade de células cianofílicas (imaturas) aumentava (valor
máximo de 66,7%), resultados indicativos de imaturidade fetal. De forma
semelhante, quando a porcentagem das células orangeofílicas aumentava
(valor máximo de 92 %), a quantidade de cianofílicas diminuía (valor mínimo
42,7%), caracterizando a ocorrência de maturidade fetal.
Contraditoriamente ao que ocorre na técnica de azul de Nilo, onde se
verifica maior quantidade de células azuis, no método de Hematoxilina-Shorr
obteve-se maior incidência de células orangeofílicas. Contudo, o número de
células orangeofílicas foi comparativamente menor nos grupos cesariana e
cesariana + dexametasona, em relação às amostras obtidas das ovelhas de
parturição normal, fato este que condiz com a maior imaturidade de cordeiros
que nasceram prematuramente. Portanto, estas observações reforçaram a
inclusão do estudo citológico do líquido amniótico pelo método de
Hematoxilina-Shorr, por ter se mostrado pouco dispendioso, confiável e de fácil
execução.
49
A
B
FIGURA 8 -
A) Lâmina corada pelo método de Hematoxilina - Shorr
pertencente ao Grupo II (Cesariana), em aumento de 400
vezes/campo, evidenciando maior quantidade de células
cianofílicas
(verdeazuladas),com
relação
às
células
orangeofílicas. B) Lâmina pertencente ao Grupo I (Parto Normal),
em aumento de 400 vezes/campo, demonstrando maior presença
de células orangeofílicas. Nesta figura a maior incidência são
células superficiais anucleadas
4.1.3 Teste de Clements (1972)
Diante da prematuridade, o fator limitante à sobrevida do recém-nascido
é, indubitavelmente, o sistema respiratório. Havendo a funcionalidade do
pulmão fetal, o recém-nascido prematuro com assistência neonatal adequada
terá boas possibilidades de sobreviver.
O teste de Clements é um método físico para determinar a presença de
surfactante pulmonar no líquido amniótico. Descrito por Clements et al. (1972),
o complexo surfactante diminui a tensão superficial da solução na qual se
encontra diluído. Portanto, ao se acrescentar uma substância surfactante em
qualquer líquido e agitá-lo, formar-se-ão bolhas na interface líquido-âmnio. As
bolhas serão tão mais estáveis quanto maior a quantidade de substância
surfactante existir na solução (NEME, 1988).
Com relação ao teste de Clements, foi possível observar que o LA de
duas ovelhas do grupo I apresentava-se positivo, confirmando-se, contudo, a
50
presença de bolhas somente até o 1° tubo, e ausência nos demais, sem
evidenciar, no entanto, sem diferenças estatísticas entre eles (Tabela 6).
Tabela 6 – Número (n) e porcentagem (%) do teste de Clements realizado com
líquido amniótico, de cordeiros pertencentes aos grupos de parto
normal (Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III), sendo classificado como Positivo ( presença de bolhas)
indicando maturidade pulmonar fetal e Negativo (ausência de
bolhas), indicando imaturidade fetal – Araçatuba, SP – 2014.
TUBO
S
LA Clements
Positivo
Negativo
Positivo
2°
Negativo
Positivo
3°
Negativo
4°
Negativo
5°
Negativo
(1) teste exato de Fisher
1°
GRUPO I
n
2
8
10
10
10
10
%
20,0
80,0
100,0
100,0
100,0
100,0
GRUPO II
n
1
10
1
10
1
10
11
11
%
9,1
90,9
9,1
90,9
9,1
90,9
100,0
100,0
GRUPO III
n
4
7
2
9
11
11
11
%
36,4
63,6
18,2
81,8
100,0
100,0
100,0
P(1)
0,3313
0,7560
1,0000
-
Constatou-se presença de bolhas até o 3° tubo e ausência nos demais
(4° e 5° tubos) no LA de um cordeiro pertencente ao grupo II. Todavia, os
líquidos amnióticos obtidos de quatro cordeiros do grupo III (36,4% em um total
de 11 animais) apresentavam-se com bolhas, porém os fluídos analisados de
dois cordeiros demonstraram a presença de bolhas somente no 1° tubo e até o
2° tubo dos outros dois animais, com ausência de bolhas, entretanto, nos
demais (3°, 4° e 5° tubos).
Para Fernandes (2006), o teste de Clements em humanos foi
considerado satisfatório quando um anel completo de bolhas era visto no 3°
tubo (contendo 0,5 mL de líquido amniótico). Clements et al. (1972),
consideraram teste confirmatório quando todos os tubos apresentavam-se
positivos; atribuiu-se, como teste negativo, quando o primeiro tubo não
demonstrava bolhas e, para as demais variações, como testes intermediários.
Resultados falso-positivos ocorrem quando há presença de mecônio ou sangue
no líquido amniótico.
51
Como o fluído amniótico pertencente aos grupos II (Cesariana) e III
(Cesariana + Dexametasona) refere-se ao de ovelhas que foram submetidas à
cesariana aos 138 dias de gestação, os resultados negativos são compatíveis
com as características de animais prematuros, que, sabidamente, têm menor
quantidade de surfactante no líquido amniótico. O LA destes dois grupos (II e
III) apresentou halo de bolhas. Contudo, observou-se bolhas até o 3° tubo,
naqueles das ovelhas do grupo II (cesariana), como demonstrado na Figura 8,
provavelmente pelo fato de seus rebentos possuírem maior maturidade fetal e
pulmonar quando comparado aos demais cordeiros que obtiveram resultados
negativos. No caso do grupo III (Cesariana + Dexametasona) o LA analisado
de quatro ovelhas também apresentava bolhas. Acredita-se, neste caso, que a
maior quantidade de LA com bolhas foi devido à administração de
dexametasona, levando a maior maturação pulmonar em alguns dos cordeiros
pertencentes a este grupo. Isto pode ser confirmado quando se associa o teste
de Clements com o teste citológico de Hematoxilina-Shorr (Tabela 4), o qual
demonstrou maiores índices de células orangeofílicas, e que também obteve
classificação positiva ao teste de Clements, com resultados indicativos de
maturidade fetal. O fato de as bolhas ocorrerem até o terceiro tubo é devido à
quantidade decrescente de LA pipetada, levando-se a concluir, que, quanto
maior o volume de LA, maior a possibilidade da presença de bolhas. A
ocorrência, por exemplo, de bolhas no tubo de número cinco, por possuir
menor quantidade de LA (0,20 mL) e maior diluição com solução fisiológica
(0,80 mL) e etanol (1 mL), dever-se-ia ser interpretada como indicadora de
maturidade pulmonar.
Neste estudo, esperava-se maior presença de halos de bolhas no LA de
cordeiros pertencentes ao grupo I, o que não ocorreu. Fernandes et al. (2006)
asseguraram que existe maturidade pulmonar fetal quando o teste for
“maduro”, porém sua especificidade e seu valor preditivo positivo são baixos, o
que demonstra que os resultados obtidos no trabalho ora desenvolvido são
confiáveis e fidedignos, uma vez que, e ainda de acordo com os autores supra
referidos, mesmo quando a maioria dos resultados obtidos pelo teste de
52
Clements era condizente com a existência de imaturidade, constatava-se, na
realidade, a ocorrência de maturidade pulmonar fetal, fato também observado
nos cordeiros nascidos a termo utilizados no presente estudo, oriundos de
ovelhas que apresentavam as suas amostras de líquido amniótico negativas ao
referido teste. Isto posto, recomenda-se que resultados negativos ao teste de
Clements devam ser avaliados com cautela e, se possível, associados a outros
métodos de avaliação de maturidade pulmonar fetal. Portanto, o teste de
Clements quando adequadamente realizado e associado a outro método de
avaliação de maturidade fetal e pulmonar, como a avaliação citológica por
Hematoxilina-Shorr, por exemplo, tornam os resultados mais fidedignos,
propiciando melhores parâmetros de viabilidade neonatal. Souza, et.al. (2000b)
relataram que todas as amostras de LA obtidas de ovelhas apresentaram fraca
reação para o teste de Clements, sendo, por isso, consideradas negativas, o
que afere a falta de acurácia da técnica aplicada à espécie ovina e/ou à
inexistência de surfactante nas fases gestacionais correspondentes.
53
FIGURA 9 – Teste de Clements do LAobtido do animal C3, pertencente ao grupo II
(Prematuro) : A) observar a presença de halo de bolhas até o 3° tubo;
B) imagem evidenciando a presença de bolhas nos três tubos.
Araçatuba –SP, 2014.
4.1.4 Teste de Clements modificado por Barreto (2006)
Não se observou a presença de halo de bolhas em qualquer LA obtido
das ovelhas pertencentes aos diferentes grupos estudados, incluindo-se
aqueles que se mostraram positivos ao teste de Clements (1972), o que
impossibilitou a realização estatística prevista. Tal constatação demonstra que
há a necessidade de se ajustar a diluição para melhor avaliação do LA de
fêmeas da espécie ovina em futuros trabalhos que visem estudar o referido
tema.
4.1.5 Contagem de corpos lamelares
A contagem de corpos lamelares (CCL), método originalmente descrito
em 1989, vem ganhando destaque na literatura mundial devido a sua precisão,
simplicidade e baixo custo. Diversos estudos indicam que a CCL tem
desempenho igual ou superior aos testes tidos como preferenciais, com a
vantagem de ser um método de baixo custo (FERNANDES et al., 2006).
Na medicina humana o tamanho dos corpos lamelares (0,2 a 2 µ), é
compatível com o tamanho de uma plaqueta (1 a 3 µ). Portanto, os corpos
54
lamelares podem ser facilmente quantificados por contadores hematológicos,
habitualmente utilizados para a realização de hemogramas, sendo o número
impresso obtido como correspondente ao total de plaquetas que deve ser
considerado como a totalidade numérica de corpos lamelares.
Ao pesquisar trabalhos sobre a avaliação da maturidade pulmonar fetal
pelo método de contagem de corpos lamelares presentes no líquido amniótico,
foram encontrados somente trabalhos voltados para humanos e apenas um
artigo da área veterinária direcionado à espécie equina.
A quantificação dos corpos lamelares do LA das ovelhas utilizadas neste
experimento por meio de contadores hematológicos mostrou-se insatisfatória,
pela não obtenção de resultados, apesar de sucessivas tentativas. Dessa
forma, optou-se pela realização da microscopia eletrônica, para verificar a
existência dos corpos lamelares no LA das ovelhas, uma vez que não havia
trabalhos e ou pesquisas realizadas, pairando a dúvida da real existência
destas estruturas na referida espécie. Castagnetti et al. (2007) avaliando a
maturidade pulmonar de potro recém-nascido pela análise do líquido amniótico
por microscopia eletrônica, relataram que os corpos lamelares mostravam-se
como estruturas compostas por várias lamelas concêntricas, com tamanho
variando de 1,6 – 3,3 mm de diâmetro, os quais apresentavam-se, algumas
vezes, parcialmente quebrados (Figura 1 – A ). Ao analisar as amostras das
ovelhas no serviço de microscopia do Departamento de Microscopia Eletrônica
da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP, Câmpus de
Jaboticabal/SP, e do Departamento de Biologia Celular e Molecular e
Bioagentes Patogênicos (Biocel) da Faculdade de Medicina da USP, Câmpus
de Ribeirão Preto/SP, observou-se a existência de corpos lamelares no LA
apenas quando as amostras eram avaliadas no aumento de 25.000 a 70.000
vezes, mostrando-se impossível a sua observação em microscopia de luz
(aumento de, no máximo, 1.000 vezes), comprovando que os corpos lamelares
do LA de ovelhas são muito menores aos de humanos. Este fato explicaria as
frustradas tentativas da quantificação dos corpos lamelares por meio de
contadores hematológicos, por serem, tais estruturas, menores que 1 a 3 nm.
55
Todavia, não foi possível a contagem de corpos lamelares na
microscopia eletrônica, devido ao fato, de que, para visualizar estas estruturas
no microscópio eletrônico, são processadas “grades” das diferentes amostras,
e, dependendo do corte realizado, poucos corpos lamelares são encontrados.
A ausência de material (Tabela 7) em algumas amostras dificultou a contagem.
Apesar da impossibilidade da realização da contagem de corpos lamelares em
microscopia eletrônica, foi possível mensurar estas estruturas através de um
programa editor de imagem denominado Image J
®
(Figura 9). Foram
mensurados os corpos lamelares dos grupos I (Parto Normal), II (Cesariana) e
III (Parto Normal), sendo os resultados representados pela unidade de medida
em nm (nanometros), o que significa ser equivalente a um milionésimo de
milímetros, ou seja bem menor quando comparada a um micrômetro (µm).
Contudo, como nos trabalhos estudados as unidades de medidas descritas são
sempre em µm (micrômetro), os resultados em nanometros foram convertidos
em micrômetros (Tabela 7), com o objetivo de demonstrar o quão pequenas
são estas estruturas pertencentes à espécie ovina, quando comparadas às
pesquisas realizadas em humanos e neonatos equinos. Para a conversão das
unidades de medidas foi utilizado um site de conversão de unidades, colocando
os resultados em nanômetros, sendo, por fim, transformados em micrometros.
Ao observar a Tabela 7, foi possível verificar que os grupos II
(Cesariana) e III (Cesariana+Dexametasona) apresentaram maior ausência de
corpos lamelares em algumas amostras de líquido amniótico, quando
comparados ao grupo I (parto normal). Quanto ao comprimento, os corpos
lamelares variam de 0,019 a 0,590 µm (micrometros), justificando a
impossibilidade
de
contagem
de
corpos
lamelares
nos
contadores
hematológicos, uma vez que estas estruturas são menores (1 a 3 µm) que uma
plaqueta.
56
Tabela 7 – Valores mínimos e máximos representados pela mensuração dos
corpos lamelares do líquido amniótico de ovelhas pertencentes ao
grupo
I
(Parto
Normal),
II
(Cesariana)
e
III
(Cesariana+Dexametasona). Araçatuba – SP, 2014.
GRUPOS
AMOSTRAS
C7 NAT
C8 NAT
GRUPO I
GRUPO II
GRUPO III
COMPRIMENTO –
Mín x Máx (nm)
CONVERSÃO
( Mín x Máx) (µm)
51,426 - 230,132
0,051 - 0,230
51,426 - 230,132
0,051- 0,230
C9 419
***
***
C10 404
87 , 413 - 250, 842
0,087 - 0,251
C11 404
87, 413 - 250,842
0,087 - 0,251
C12 416
63,906 - 107, 517
0,064 - 0,108
C13 PAT
32,311 - 186,000
0,032 - 0,186
C14 L12
68 , 475 - 268,768
0.068 - 0,269
C 16 L9
***
***
C17 L8
56,321 - 316,291
0,056 - 0,316
C1 SN
***
***
C2 11
82,812 -173,955
0,083 - 0,174
C3 402
89,076 - 137,509
0,089 - 0,138
C6 L1
137,097 - 270,968
0,137 - 0,271
C7 L1
137,097 - 270,968
0,137 - 0,271
C8 L6
56,467- 210,038
0,056 - 0,210
C9 L7
67,583 - 236,857
0,068 - 0,237
C10 L7
67,583 - 236,857
0,068 - 0,237
C11 O11
***
***
C12 419
***
***
C13 419
***
***
L9
68, 481 - 589,730
0,068 - 0,590
C3 L7
75,459 - 212,672
0,075 - 0,213
C4 426
110,775 - 139,236
0,111 - 0,139
C5 L1
18,750 - 257,143
0,019 - 0,257
C6 L1
71,546 - 301,182
0,072 - 0,301
C7 L5
***
***
C8 L5
***
***
C9 406
132,093 - 287,306
0,132 - 0,287
C10 T1
196,749 - 444,000
0,197 - 0,444
C12 L3
***
***
C13 L3
***
***
*** (Ausência de material)
57
FIGURA 10 – Programa editor de imagens denominado “Image J®”, utilizado para
mensurar os corpos lamelares. Figura demonstrando um corpo
lamelar pertencente ao Grupo II (cesariana), observado em aumento
de 25.000X e mensurado (linha amarela), evidenciando suas lâminas
concêntricas, representada por uma camada delgada de diâmetros
reduzidos, acompanhados por um centro em sua estrutura.
58
A
B
C
FIGURA 11 – Imagem evidenciando Corpos lamelares (representados pelas setas): A)
visualizados em microscopia eletrônica, pertencentes ao grupo I (Parto
Normal) em aumento de 75.000 x; B) grupo II (Cesariana) em aumento
de 50.000 x; C) e, grupo III (Cesariana + Dexametasona) em aumento
de 120.000 x .
4.2 Avaliação dos recém- nascidos
Como esperado, a taxa de mortalidade nos grupos de animais
prematuros foi elevada (Grupos II e III), principalmente naqueles oriundos de
ovelhas que não receberam dexametasona, 36 horas antes da realização da
cirurgia eletiva (Grupo II), já que sete (6/11 = 63%) dos recém-nascidos
sucumbiram entre o nascimento e os 15 minutos de vida e um animal entre 15
minutos até 12 horas pós-nascimento. Nos cordeiros prematuros, provenientes
de ovelhas que receberam 16 mg/ovelha de dexametasona (Grupo III),
constatou-se os óbitos de três animais (3/11 = 27%), sendo que dois destes
morreram até os 15 minutos de vida (M15) e o terceiro antes de uma hora
(M60).
Desta forma, foram acompanhados oito cordeiros nascidos a termo
(Grupo I), oito cordeiros oriundos de cesariana (Grupo II) e oito cordeiros
oriundos de cesariana com administração de dexamestasona (Grupo III) dois
dias antes da cirurgia eletiva. Constataram-se oito partos gemelares. No total,
avaliaram-se 32 cordeiros; porém, apesar de estes cordeiros oriundos de
partos gemelares serem incluídos e analisados, o objetivo deste projeto não
visou à comparação do LA da mesma ovelha, e sim, o de se fazer ilação das
59
características de LA de diferentes ovelhas, com posterior analogia em relação
à avaliação do nível de maturidade fetal entre os grupos.
4.2.1 Escore Apgar modificado por Born (1981)
A vitalidade dos cordeiros foi realizada por meio do escore APGAR
modificado por Born (1981), que tem como meta pontuar a presença de
determinados parâmetros (tipo e padrão respiratório, reflexo interdigital e óculopalpebral, resposta à água fria e coloração das mucosas). Animais com boa
vitalidade têm pontuação entre sete e oito, enquanto os que obtêm pontuação
entre quatro e seis têm moderada vitalidade. Pontuação entre zero e três é
indicativa de pobre vitalidade. Esta avaliação foi realizada ao nascimento e
aos15 e 60 minutos de vida dos recém-nascidos (Tabela 7).
Tabela 8 –
Escore Apgar modificado por Born (1981), pontuados de 0 a 3
(baixa vitalidade), 4 a 6 (moderada vitalidade) e 7 a 8 (boa
vitalidade), de cordeiros pertencentes ao grupo de parto normal
(Grupo I), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e aos 60 minutos
(M60) – Araçatuba, SP – 2014.
GRUPO I
Momentos
APGAR
n
0
15
60
Boa Vitalidade
Moderada Vitalidade
9
1
90%
90%
60%
10%
10%
40%
Baixa Vitalidade
0
0%
0%
0%
ÓBITOS
0
0%
0%
0%
Dos dez cordeiros nascidos de parto normal (Tabela 8), 90% dos
animais apresentaram boa vitalidade, e 10% apresentaram moderada
vitalidade ao nascimento (M0) e aos 15 minutos (M15). No entanto, aos 60
minutos, somente 60% dos animais denotaram boa vitalidade, e 40% dos
60
animais apresentaram moderada vitalidade. Neste grupo não houve animais
com baixa vitalidade, e nenhum dos cordeiros veio a óbito.
Tabela 9 -
Escore Apgar modificado por Born (1981), pontuados de 0 a 3
(baixa vitalidade), 4 a 6 (moderada vitalidade) e 7 a 8 (boa
vitalidade), de cordeiros pertencentes ao grupo cesariana
(Grupo II), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e aos 60 minutos
(M60)– Araçatuba, SP – 2014.
GRUPO II
Momentos
APGAR
n
0
15
60
Boa Vitalidade
Moderada Vitalidade
2
3
18%
18%
9%
27%
36%
36%
Baixa Vitalidade
6
55%
9%
0%
ÓBITOS
0
0%
36%
55%
A incidência de cordeiros nascidos com boa vitalidade foi de 18%, nos
animais do grupo II (Tabela 9), sendo que 27% dos cordeiros apresentaram
moderada vitalidade e 55% baixa vitalidade ao nascimento (M0). Já aos 15
minutos, 36% dos animais apresentaram moderada vitalidade e somente 9%
dos cordeiros apresentaram baixo vigor. A mortalidade de cordeiros foi alta, já
36% dos animais (4/11) veio a óbito aos 15 minutos, e 55% (6/11) morreram
aos 60 minutos.
Ao observar a tabela 10, verificou-se que cerca de 64% dos animais
nascidos de mães que receberam administração de dexametasona 36 horas
antes da cirurgia eletiva possuía moderada vitalidade ao nascimento (M0) aos
15 minutos, com melhora na vitalidade aos 60 minutos, quando comparado aos
outros momentos. Neste grupo foi possível constatar que 9% e 27% dos
animais veio a óbito, aos 15 e aos 60 minutos de vida, respectivamente.
61
Tabela 10 - Escore Apgar modificado por Born (1981), pontuados de 0 a 3
(baixa vitalidade), 4 a 6 (moderada vitalidade) e 7 a 8 (boa
vitalidade), de cordeiros pertencentes ao grupo de cesariana +
dexametasona (Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e
aos 60 minutos (M60) – Araçatuba, SP – 2014.
GRUPO III
Momentos
APGAR
n
Boa Vitalidade
2
Moderada Vitalidade
7
Baixa Vitalidade
2
ÓBITOS
0
0
15
60
18%
9%
27%
64%
64%
45%
18%
18%
0%
0%
9%
27%
Resumidamente, tais resultados explicitam que cordeiros nascidos de
parto normal (Grupo I) apresentam maior vitalidade, ou seja, melhores
condições clínicas ao nascimento do que os cordeiros oriundos de ovelhas
submetidas à cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), o
que condiz com a literatura, já que estes são considerados prematuros,
confirmando que animais prematuros (nascidos aos 138 dias de gestação)
nascem debilitados, letárgicos e possuem moderada vitalidade e/ou baixa
vitalidade em sua grande maioria.
Apesar de não diferirem estaticamente, as porcentagens foram
superiores nos animais do grupo III do que naqueles do grupo II,
provavelmente em decorrência da administração de dexamestasona nas
ovelhas, 36 horas antes das respectivas parições. Ressalta-se, também, com
relação ao escore Apgar, aos 60 minutos (M60) nos respectivos grupos, a
maioria dos animais apresentaram melhora da vitalidade , quando comparado
aos outros momentos, compatíveis àqueles considerados como níveis normais,
o que condiz com a existência de boa vitalidade, corroborando parcialmente
com as descrições de Rodrigues et al. (2007), que constataram pontuação
62
máxima do Apgar uma hora após o nascimento. Contudo, ressalta-se que
ocorre diminuição gradativa fisiológica das respostas a alguns estímulos
efetuados visando à avaliação da vitalidade dos cordeiros recém-nascidos
neste trabalho (ovina), como, por exemplo, o reflexo à água fria, o que,
indubitavelmente, diminui a somatória total dos pontos obtidos, influenciando,
portanto, na atribuição da classificação final do escore Apgar, como também
constatado por Bovino (2011). Tal comportamento pode ser comprovado
avaliando-se a menor pontuação obtida por aqueles cordeiros nascidos de
parturições eutócicas e a termo, em relação aos momentos anteriores .
4.2.2 Frequência Cardíaca
A frequência cardíaca dos 32 cordeiros pertencentes aos três grupos foi
realizada
com
auxílio
de
aparelho
de
auscultação
(fonendoscópio),
posicionando-o diretamente em região ventro-lateral torácica esquerda, nos
seguintes momentos: ao nascimento, aos 15 e 60 minutos, bem como as seis,
12, 24 e 48 horas após o nascimento (Tabela 11 e Figura 14).
63
Tabela 11 – Médias ( ) e desvios-padrões (S) da Frequência Cardíaca (bpm),
de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao
nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como
às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às 48
horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
VARIÁVEL
FC
GRUPO I
MOMENTO
GRUPO II
M0
M15
M60
n
10
10
10
±S
146 ± 36 b
199 ± 35 a
187 ± 20 ABa
n
11
7
5
M6
10
171 ± 16 Bab
M12
M24
M48
10
10
10
183 ± 27 a
173 ± 37 ab
183 ± 20 a
GRUPO III
n
11
10
8
±S
113 ± 38 b
174 ± 47 a
220 ± 26 Aa
5
±S
140 ± 24 b
155 ± 4 ab
170 ± 40
Bab
214 ± 48 Aa
7
5
4
4
192 ± 41 ab
177 ± 16 ab
188 ± 22 ab
7
8
8
203 ± 20
Aba
179 ± 36 a
192 ± 39 a
195 ± 48 a
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
**
*
*
*
*
FIGURA 12 - Valores médios da frequência cardíaca dos cordeiros do grupo I (Parto
Normal); grupo II (Cesariana) e grupo III (Cesariana + Dexametasona),
ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e aos 60 minutos (M60), bem como
às 06 (M6), às 12 (M12), às 24 (M24) e às 48 horas de vida (M48).
Araçatuba, SP – 2014.* representa diferenças entre os momentos.
*Representa diferenças entre os grupos.
64
Observando-se os valores estatísticos e a representação gráfica,
denotou-se, na comparação entre os grupos, que os animais do grupo I (parto
normal) possuíam, às seis horas (171 bpm), menores valores de frequência
cardíaca em relação aos cordeiros do grupo II e III (214 e 203 bpm,
respectivamente). Os grupos, de maneira geral, demonstraram diferenças
estatisticamente significativas em seus valores ao longo do tempo, com
estabilização pontual a partir das 12 horas de vida, principalmente nos
cordeiros nascidos a termo e aqueles nascidos de ovelhas que receberam
administrações parenterais de dexametasona, por meio de cirurgias eletivas.
Os animais deste último grupo obtiveram maiores diferenças, particularmente
quando comparados aos do grupo II (cesariana).
Os valores médios de frequência cardíaca (Tabela 11) de alguns
cordeiros pertencentes ao grupo III encontravam-se ligeiramente acima dos
valores de referência para a espécie e idade (SMITH, 2006) nas primeiras
horas de vida. Porém, são semelhantes aos descritos no trabalho de Lima, et
al. (2010), que apresentaram valores médios ao nascimento de 203,28 ± 43,22
bpm, com diminuição gradativa até os 90 dias de vida, quando, por fim,
atingiram os patamares fisiológicos descritos para a espécie. No decorrer do
experimento, esses valores foram gradativamente alcançando aqueles
referenciados como parâmetros de normalidade (SMITH, 2006). Os outros dois
grupos (I e II) mostraram valores mais próximos da normalidade desde a
primeira aferição deste parâmetro clínico. A oscilação era esperada haja vista a
constante manipulação dos cordeiros durante a avaliação física e colheita de
material biológico.
4.2.3 Frequência Respiratória
O sistema respiratório é capaz de desenvolver várias funções no
organismo animal, tais como as trocas gasosas, a manutenção do equilíbrio
ácido-básico, atuando, ainda, como um dos importantes órgãos para a função
de termorregulação. (FEITOSA, 2014).
65
No bezerro clinicamente sadio, a respiração espontânea começa 30
segundos após o nascimento, sendo inicialmente irregular, se estabilizando
posteriormente em 45-60 mpm (PRESTES, 2012). Portanto, principalmente
após o nascimento, inicia-se um período crítico denominado de “período de
transição”, aonde, nesta fase, os sistemas corporais promovem ajustes
fisiológicos considerados cruciais para o neonato, principalmente no quesito
respiratório, visto que a capacidade funcional pulmonar é imprescindível para a
sobrevivência do neonato; sendo assim, é de suma importância avaliar o
padrão respiratório dos cordeiros após o nascimento.
Tabela 12 – Média ( ) e desvio padrão (S) dos parâmetros vitais como
Frequência Respiratória (FR) em movimentos por minuto
(mpm), de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos
(M60), bem como às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24
horas (M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP –
2014.
VARIÁVE
L
MOMENTO
FR
M0
M15
M60
M6
M12
M24
M48
GRUPO I
n
10
10
10
10
10
10
10
±S
73 ± 19 A
77 ± 12
70 ± 9
71 ± 15
75 ± 19
88 ± 15
80 ± 18
GRUPO II
N
11
7
5
5
5
4
4
±S
31 ± 42 B
57 ± 43
78 ± 28
58 ± 7
73 ± 14
72 ± 26
83 ± 18
GRUPO III
n
11
10
8
7
7
8
8
±S
35 ± 35 Bc
53 ± 34 bc
78 ± 12 ab
85 ± 32 ab
84 ± 25 ab
93 ± 19 a
109 ± 19 a
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
66
FIGURA 13 - Valores médios da frequência respiratória dos cordeiros dos grupo I
(Parto Normal); grupo II (Cesariana) e grupo III (Cesariana +
dexametasona), ao nascimento, aos 15 e 60 minutos, bem como às 06,
às 12, às 24 e às 48 horas. Araçatuba-SP, 2014. * representa a
diferença do grupo I com os demais grupos ( Grupos II e IIII), ao
nascimento (M0).
Ao comparar os valores de FR (Tabela 12), entre os três grupos,
observa-se apenas diferença significativa ao nascimento (M0), onde o valor
médio para o grupo I foi de 73 (mpm); para os animais do grupo II foi de 31
mpm, e de 35 mpm para o grupo III. Ao comparar os momentos em cada grupo
constatou-se diferença significativa no grupo III, evidenciando-se aumento da
FR ao longo do tempo. A frequência respiratória encontrava-se, de maneira
geral, acima da variação considerada normal (SMITH, 2006) em todos os
grupos. Contudo, os animais do grupo II apresentaram valores ligeiramente
abaixo do normal ao nascimento. A frequência respiratória dos cordeiros
aumentou ao longo das 48 horas de vida nos três grupos. Os valores médios
de FR descritos neste trabalho estão de acordo com os resultados observados
por Lima, et. al. (2010).
Considerando que os pulmões são responsáveis pelas trocas gasosas,
manutenção da temperatura corpórea e equilíbrio ácido-básico, pode-se
67
considerar que os cordeiros dos grupos II e III nasceram com essas funções
comprometidas com grande chance de desenvolver doenças pulmonares,
como, por exemplo, pneumonia. A oscilação dos valores deste parâmetro,
assim como os da frequência cardíaca, pode ser explicada pela manipulação
dos cordeiros durante o exame físico e colheitas de sangue ao longo das 48
horas, exceto nos três primeiros momentos nos grupos II e III, cujos valores
baixos observados, refletiram, possivelmente, a prematuridade.
4.2.4 Temperatura retal
4.2.5
A temperatura retal (TR) no recém-nascido encontra-se, geralmente, em
cerca de 0,5°C abaixo daquela obtida de sua mãe. Esse decréscimo ocorre
entre 15 a 30 minutos após o parto. Um bom indicativo de problemas
adaptativos do neonato é quando a temperatura continua a cair. Diversas
condições podem levar à hipotermia, mesmo em ambientes aquecidos, como
hipóxia, problemas circulatórios, distúrbios ácido-básicos e letargia. Os
cuidados recomendados, nesse caso, incluem a utilização de aquecedores,
lâmpadas
aquecedoras,
cobertores
elétricos
ou
outros
recursos
mantenham a temperatura corporal próxima ao normal. (PRESTES, 2012).
que
68
Tabela 13 -
VARIÁVEL
Média ( ) e desvios-padrão(S) da temperatura retal (TR), em ° C,
de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao
nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como
às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às 48
horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
GRUPO I
MOMENTO
N
M0
M15
M60
M6
M12
M24
M48
TR (°C)
10
10
10
10
10
10
10
±S
40,0 ± 0,4 Aa
39,6 ± 0,7 Aab
39,4 ± 0,5 Ab
39,2 ± 0,4 Ab
39,1 ± 0,3 Ab
39,2 ± 0,2 b
39,3 ± 0,5 Ab
GRUPO II
n
1
7
5
5
5
4
4
±S
38,8 ± 1,0 Ba
37,4 ±1,3 Ba
35,7 ± 1,8 Bb
37,9 ± 0,4 Ba
38,6 ± 0,3 Ba
38,7 ± 0,1 a
38,4 ± 0,5 Ba
GRUPO III
N
11
10
8
7
7
8
8
±S
38,6 ± 0,6 Ba
36,6 ± 0,6 Bb
36,8 ± 1,4 Bb
38,8 ± 0,2 Aa
39,2 ± 0,2 Aa
39,0 ± 0,4 a
38,9 ± 0,7 ABa
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
41,0
40,0
TR (°C)
39,0
38,0
37,0
36,0
35,0
34,0
33,0
M0
M15
M60
G1
M6
G2
M12
M24
M48
G3
FIGURA 14 – Valores de temperatura retal dos cordeiros do grupo I (Parto Normal),
grupo II (Cesariana) e grupo III (Cesariana + Dexametasona), ao
nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como às 06,
às 12, às 24 e às 48 horas de vida – Araçatuba, SP – 2014.
69
Na comparação entre os momentos, observou-se diminuição da TR
(Tabela 13), com pequenas diferenças entre os M60, M6, M12, M24 e M48.
Verificou-se diferença significativa entre todos os momentos nos animais do
grupo II, com menores valores médios de TR aos 60 minutos de vida; porém,
denotou-se recuperação destes valores ao longo do tempo. Com relação aos
animais do grupo III, visualizaram-se diferenças entre os momentos M15 e M60
e os M0, M6, M12, M24 e M48, com menores valores aos 15 minutos da
avaliação realizada. Os grupos II e III diferiram do grupo I (parto normal) ao
nascimento, aos 15 e 60 minutos. Os grupos I e III diferiram do grupo II às 6 e
às 12 horas. Contudo, somente o grupo II (cesariana) apresentou menores
valores nestes momentos. O grupo I (parto normal) diferiu do grupo II, às 48
horas de vida.
Os valores supracitados para os cordeiros do grupo I são semelhantes
àqueles de temperatura retal de ovinos jovens, propostos por Rodrigues et al
(2007) e aos publicados por Lima et al. (2010), em cordeiros recém-nascidos.
Todavia, os animais prematuros de ambos os grupos apresentavam-se
levemente hipotérmicos ao nascimento, muito provavelmente, pela menor
capacidade metabólica e baixo peso ao nascimento, tornando as reservas de
gordura marrom ainda mais escassas, condições essas, essenciais para maior
incremento na produção de calor em pacientes da espécie ovina situados na
referida categoria etária. A hipotermia mostrou-se mais duradoura nos animais
do grupo II, sendo que esta foi bastante evidenciada no M60, já que estes
valores, fora da faixa de normalidade de temperatura retal, perduraram até às
48 horas de vida, sinalizando que animais nascidos em situação semelhante
necessitariam de melhor e maior aporte de calor e nutricional em suas
primeiras horas de vida.
É necessário ressaltar que o aumento da temperatura nos grupos II e III,
a partir das seis horas de vida (M6), deveu-se exclusivamente à ingestão de
colostro.
70
4.2.5 Exame das Mucosas
O exame das mucosas é de real importância para a determinação de
alterações locais e/ou sistêmicas nos animais domésticos. No presente
trabalho avaliaram-se, principalmente, as mucosas óculo-palpebrais. Segundo
FEITOSA (2014), as mucosas do animal recém-nascido apresentam coloração
rósea menos intensa.
Tabela 14 - Número (n) e porcentagem (%), segundo a coloração de mucosa
ocular, de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos
(M60), bem como às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24
horas (M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
MOMENTO
M0
M15
M60
M6
M12
M24
M48
COLORAÇÃO
DA MUCOSA
Rósea
Hiperêmica
Cianótica
Rósea
Hiperêmica
Cianótica
Rósea
Hiperêmica
Rósea
Rósea
Hiperêmica
Rósea
Hiperêmica
Rósea
Hiperêmica
GRUPO I
n
10
9
1
9
1
10
5
5
7
3
8
2
%
100,0
90,0
10,0
90,0
10,0
100,0
50,0
50,0
70,0
30,0
80,0
20,0
GRUPO II
N
8
2
1
6
1
5
5
5
4
4
-
%
72,7
18,2
9,1
85,7
14,3
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
-
GRUPO III
n
10
1
9
1
8
7
6
1
8
8
-
%
90,9
9,1
90,0
10,0
100,0
100,0
85,7
14,3
100,0
100,0
-
P(1)
0,4147
0,7949
1,0000
0,1270
0,2597
0,6537
(1) teste exato de Fisher
Não se observou diferenças estatísticas entre os grupos nos diferentes
momentos (Tabela 14). Porém, foi possível constatar que a totalidade dos
cordeiros pertencentes aos animais do grupo I apresentou, de maneira geral,
71
mucosas róseas no M0, com decréscimo nesta porcentagem aos 15 minutos
de vida, por um dos cordeiros se apresentar com mucosas hiperêmicas. Às 48
horas, 20% dos cordeiros apresentavam mucosas hiperêmicas. No grupo II
(Cesariana), 72,7% dos cordeiros possuíam mucosas róseas, ao nascimento,
com os demais apresentando coloração variando entre hiperêmica e azulada
(cianótica). Aos 15 minutos, cerca de 85,7% dos animais encontrava-se com
coloração rósea, e os demais (14,3%), azuladas. A partir da primeira hora de
vida todos os animais apresentavam coloração de mucosas róseas. Denotouse, no grupo III, que 90,9% dos animais possuíam coloração de mucosas
róseas com poucos animais com coloração azulada, indicando privação parcial
de oxigênio. Nos M60 e M6 horas de vida, 100% dos animais mostrava-se com
mucosa rósea. Porém, no M12, houve declínio, com 85,7% com coloração
rósea e, 14,3%, hiperêmica. Contudo, às 24 e às 48 horas de vida, 100% de
cordeiros tinha coloração rósea das mucosas.
A cianose é a coloração azulada da pele e das mucosas, causada pelo
aumento da quantidade absoluta de hemoglobina reduzida no sangue. A
coloração azulada das mucosas indica, portanto, distúrbio da hematose (troca
gasosa que ocorre nos alvéolos), que depende mais dos pulmões que do
coração, porém, este órgão poderá levar à cianose caso não consiga
proporcionar ao organismo circulação sanguínea adequada. Muitas são as
causas de cianose, sendo algumas de origem circulatória e outras por
processos respiratórios ou sistêmicos (FEITOSA, 2014). A cianose de origem
respiratória ocorreu possivelmente pela cianose ocorrida no grupo II. Além da
imaturidade pulmonar, o cordeiro geralmente apresenta grande quantidade de
LA em seus pulmões, o que dificulta a sua insuflação pelo cordeiro, diminuindo,
consequentemente, a sua capacidade respiratória. Contudo, Silva et al. (2008),
observaram que a inspeção das mucosas aparentes mostrou, por sua variação,
pouco fidedigna na identificação de neonatos caninos com graus leves de
alterações cardiorrespiratórias e do equilíbrio ácido-básico.
Verificou-se que o grupo II apresentou mais alterações de coloração da
mucosa
(hiperêmicas
e
cianóticas),
provavelmente
pelos
nascimentos
72
ocorridos aos 138 dias de gestação, sem que suas mães recebessem qualquer
aplicação medicamentosa que possibilitasse a precoce maturação fetal,
tornando-os, pela hipóxia, mais suscetíveis as modificações de coloração das
nucosas, quando comparados aos do grupo de cordeiros oriundos de parto
normal (Grupo I).
É necessário ressaltar que os cordeiros do grupo III, apesar de nascidos
de ovelhas que receberam dexametasona com o objetivo incrementar a
maturação pulmonar do feto, apresentavam alterações na coloração de suas
mucosas, porém em menores proporções quando comparados aos do grupo II;
todavia, mesmo que o concepto apresentasse maior vitalidade ao nascimento
quando comparado aqueles do grupo II, estes animais também tinham
dificuldades respiratórias, devido à maior quantidade de líquidos no pulmão e
elevada presença de mecônio no líquido amniótico, o que indicaria sofrimento
fetal, promovendo alterações em sua capacidade respiratória e em sua
vitalidade. O tempo de perfusão capilar (TPC) é tão importante quanto os
outros parâmetros, já que reflete o estado circulatório do animal, sendo
avaliado junto à mucosa bucal, considerando-se o tempo para que os vasos
voltem a ser completamente preenchidos por sangue, após a pressão digital
ser cessada (FEITOSA, 2014). Os resultados da avaliação do TPC (tempo de
perfusão
capilar)
não
mostraram
diferenças
significativas,
permaneceram dentro da normalidade em todos os grupos.
ou
seja,
73
Tabela 15 – Médias ( ) e desvios padrões (S) dos valores de tempo de
perfusão capilar (TPC) determinado em segundos, de cordeiros
pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana
(Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao nascimento
(M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como às 06 horas
(M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida
(M48). Araçatuba, SP – 2014.
TPC
MOMENTO
GRUPO I
n
M0
M15
M60
M6
M12
M24
M48
10
10
10
10
10
10
10
±S
2 ± 0,48
2 ± 0,48
2 ± 0,52
2 ± 0,48
2 ± 0,48
1 ± 0,52
2 ± 0,53
GRUPO II
N
11
7
5
5
5
4
4
±S
2 ± 0,52
1 ± 0,53
2 ± 0,55
2 ± 0,45
1 ± 0,55
2 ± 0,58
2 ± 0,58
GRUPO III
n
11
10
8
7
7
8
8
±S
2 ± 0,69
2 ± 0,82
1 ± 0,46
2 ± 0,53
1 ± 0,53
1 ± 0,46
1 ± 0,52
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
FIGURA 15 - Representação gráfica demonstrando o tempo de perfusão capilar (TPC)
em segundos, de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III),
ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como às 06
horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida
(M48). Araçatuba, SP – 2014.
74
4.2.6 Glicemia
A glicemia normalmente é regulada pelos hormônios insulina e glucagon,
mas também é influenciada por outros fatores. O jejum raramente resulta em
hipoglicemia, a não ser em neonatos, por estes animais terem reservas
energéticas limitadas. Qualquer doença, lesão, alteração congênita, rejeição
materna, agalactia ou erro de manejo que limite a ingestão de alimento
(colostro/leite), pode resultar em hipoglicemia acentuada, associada à
depressão e coma (SMITH, 2006).
Tabela 16 – Medianas, mínimo e máximo dos valores de glicose sanguínea
(mg/dL), de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo
III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem
como às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às
48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
MOMENTO
M0
M15
M60
n
10
10
10
GRUPO I
Md
Min-Max
44 Ac
30 - 69
47 bc
22 - 82
41 c
< 20 - 73
n
9
7
5
M6
M12
M24
M48
10
10
10
10
76 abc
85 ab
110 a
112 a
5
5
4
4
29 - 182
38 - 191
59 - 136
55 - 144
Glicose (mg/dL)
GRUPO II
Md
Min-Max
23 B
<20 – 50
29
<20 - 87
24
<20 – 54
<20 –
126
67
63
23 – 97
81
23 – 151
89
30 – 112
n
10
9
7
GRUPO III
Md
Min-Max
21 B
<20 – 100
39
<20 – 129
57
22 – 135
7
7
7
7
66
67
99
105
35 – 99
38 – 92
76 – 145
81 -170
aA,
Medianas seguidas de letras diferentes, minúscula na coluna e maiúscula na linha, diferem entre si
pelo teste de Dunn (p<0,05).
Ao comparar os grupos em cada momento, verificou-se diferença
significativa ao nascimento (M0), com divergência entre o grupo I e os demais.
Observou-se que somente os animais nascidos a termo apresentaram
divergência estatística entre os momentos (Tabela 16).
É possível visualizar que o grupo I foi o que obteve maiores níveis
glicêmicos no M0, ficando evidente a elevação ou estabilização dos níveis
75
glicêmicos a partir dos 60 minutos, com exceção do grupo II, que obteve níveis
glicêmicos menores até o final da avaliação (M48 horas). Ressalta-se que
algumas amostras sanguíneas do grupo II possuíam níveis inferiores ao limite
do aparelho (20 mg/dL) até o M6, sendo que, após este momento, os níveis
aumentaram até às 48 horas (M48), possivelmente em decorrência da ingestão
do colostro.
A menor concentração de glicose ao nascimento deveu-se à
insuficiência dos mecanismos regulatórios da glicose sanguínea bem como à
imaturidade hepática do neonato (gliconeogênese hepática ineficaz, menores
estoques de glicogênio hepático) e glicosúria, em decorrência da imaturidade
renal (GORMAN, 2011). Devido a esta insuficiência dos mecanismos
regulatórios os grupos mais acometidos foram àqueles considerados
prematuros (Grupo II e III), devido à imaturidade de suas diferentes estruturas
orgânicas.
Os animais do grupo III (Cesariana + Dexametasona) também obtiveram
níveis glicêmicos levemente mais alto que o grupo II, porém, estes dois grupos,
apresentaram teores praticamente iguais. Ambos os grupos apresentaram
estabilização de seus valores em níveis normais ao longo das 48 horas de vida.
4.2.7 Lactato
A concentração do lactato sanguíneo é fortemente influenciada pelo
equilíbrio de seu metabolismo, de modo que a hiperlactatemia caracteriza-se
pelo aumento na produção e/ou diminuição no consumo do substrato (RONCO,
2005). Nas situações de hipóxia, há redução da captação de lactato pelo
fígado, além de, ocasionalmente, poder se tornar produtor do metabólito
(ELIAS, 2006).
76
Tabela 17 - Média ( ) e desvio padrão (S) dos valores de lactato sérico
(mg/dL), de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo
III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem
como às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às
48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
LACTATO1
GRUPO I
MOMENTO
M0
M15
M60
M6
M12
M24
M48
n
10
10
10
10
10
10
10
±S
8,2 ± 2,4
7,9 ± 2,5
6,6± 1,3
6,4±1,9
6,4± 1,6
5,4± 1,0
5,5± 3,4
GRUPO II
n
11
7
5
5
5
4
4
±S
9,7 ± 3,6
9,3 ± 2,8
8,5 ± 2,2
8,9 ± 1,1
8,0 ± 1,2
6,1 ± 2,1
4,1 ± 1,1
GRUPO III
n
11
10
8
7
7
8
8
±S
9,5 ± 1,7
11,1 ± 3,3
8,3 ± 2,6
7,5 ± 1,4
5,8 ± 1,3
5,3 ± 1,4
5,3 ± 1,4
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
FIGURA 16 -
Valores médios dos níveis de lactato de cordeiros nascidos dos
grupos I (Normal), II (Cesarianas) e III (Cesariana + Dexametasona),
ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e aos 60 minutos (M60), bem
como às 06 (M6), às 12 (M12), às 24 (M24) e às 48 horas de vida
(M48). Araçatuba, SP – 2014.
77
No presente estudo não se verificou diferença significativa entre grupos
e entre momentos (p>0,05), porém foi possível observar que todos os cordeiros
apresentavam-se hiperlactatêmicos ao nascimento, com diminuição gradativa e
acentuada dos teores de lactato ao longo das 48 horas de vida (Tabela 17 e
Figura 16). Os cordeiros do grupo II apresentaram os maiores níveis de lactato
no M15, atingindo, contudo, valores de normalidade às 48 horas de vida.
A elevação da concentração de lactato indica a ocorrência de eventos
hipóxicos fisiológicos ou patológicos durante o parto (CASTAGNETTI, 2010).
Neste caso, a transição da vida fetal para a neonatal (extrauterina) é
considerada evento de hipóxia fisiológica transitória, caracterizado pelo período
que ocorre a substituição do conteúdo alveolar líquido por gasoso, atingindo o
patamar de normalidade após este período.
Segundo Robertson (1989), a acidose lática possui ação depressora
direta sobre a contratilidade e débito cardíacos, que, no animal adulto, pode ser
compensada por estimulação simpática do miocárdio pela elevação da FC.
Este comportamento compensatório não foi observado nos cordeiros utilizados
no presente estudo, e, particularmente, naqueles pertencentes ao grupo II,
possuidores dos maiores teores de lactato sérico, concordando com as
informações de GRUNDY (2006), que afirmaram que tal mecanismo era
ineficiente em neonatos, em virtude do incompleto desenvolvimento do sistema
simpático, sendo o coração incapaz de aumentar sua força de contração.
78
4.2.8 Hemogasometria
Tabela 18 -
VARIÁVEL
Médias ( ) e desvios padrões (S) dos valores hemogasométricos
de pH, pCo2, pO2, HCO3 e sO2, de cordeiros pertencentes aos
grupos de parto normal (Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana
+ dexametasona (Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e
60 minutos (M60), bem como às 06 horas (M6), às 12 horas
(M12), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba,
SP – 2014.
MOMENT
O
NORMAL
n
±S
M0
10
7,18 ± 0,04 Ad
M15
10
7,21 ± 0,05 Ad
M60
10
7,26 ± 0,04 Ac
pH
M6
10 7,32 ± 0,03 Abc
M12
10
7,36 ± 0,08 ab
M24
10
7,39 ± 0,06 a
M48
10
7,39 ± 0,03 a
M0
10 72,92 ± 4,72 Ba
M15
10
72,60 ± 9,14 a
M60
10
66,75 ± 8,25 a
pCO2
M6
10
57,89 ± 8,54 b
M12
10
52,35 ± 8,00 b
M24
10
49,91 ± 4,26 b
M48
10
50,85 ± 6,10 b
M0
10
26,23 ± 1,65 c
M15
10 27,71 ± 2,17 Abc
M60
10 29,49 ± 3,15 Aab
HCO3
M6
10
27,55 ± 3,00 bc
M12
10 28,29 ± 2,72 Aab
M24
10 29,67 ± 3,07 ab
M48
10
30,22 ± 3,06 a
aA,
Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
CESARIANA
n
±S
11
7,01 ± 0,16 Bc
5
6,97 ± 0,17 Bc
5
7,10 ± 0,13 Bbc
5
7,26 ± 0,01 Bab
5
7,27 ± 0,09 a
4
7,36 ± 0,03 a
4
7,39 ± 0,02 a
11 89,67 ±17,25 Aa
7
94,04 ±30,19 a
5
71,96 ± 7,80 ab
5
58,40 ± 7,75 b
5
57,42 ±12,64 b
4
52,75 ± 1,54 b
4
55,90 ± 5,53 b
10
23,99 ± 3,21 bc
7
20,94 ± 4,26 Bc
5
23,24 ± 3,85 Bc
5
25,70 ± 3,36 bc
5
25,60 ± 1,71 Bbc
4
29,28 ± 2,13 ab
4
33,30 ± 1,96 a
na coluna e maiúsculas
CESARIANA +
DEXAMETASONA
n
±S
11
7,06 ± 0,08 Bbc
10
6,99 ± 0,16 Bc
8
7,12 ± 0,10 Bb
7
7,31 ± 0,05 Aa
7
7,36 ± 0,04 a
8
7,36 ± 0,04 a
8
7,34 ± 0,05 a
11
89,85 ±13,43 Aa
10
91,02 ± 28,55 a
8
69,16 ± 6,56 b
7
56,34 ± 6,73 bc
7
53,89 ± 6,67 c
7
55, 71 ± 6,39 bc
7
56,80 ± 8,68 bc
11
24,82 ± 1,31 cd
10
21,08 ± 2,54 Bd
8
22,56 ± 3,56 Bcd
7
25,69 ± 2,69 bc
7
29,19 ± 1,68 Aab
8
30, 80± 2,41 a
8
29,70 ± 3,74 ab
na linha, diferem
79
4.2.8.1 pH
Avaliando-se os valores dispostos na tabela 18, foi possível observar
que houve diferença significativa entre o grupo I e os grupos II e III, nos
momentos M0, M15 e M60. Às seis horas, os valores de pH diferiram entre os
animais nascidos a termo e aqueles do grupo II. Contudo, entre os grupos II e
III os valores diferiram às seis horas de vida, não se notando divergência deste
momento até os 60 minutos de vida (M60).
Nos primeiros minutos de vida, o valor do pH sanguíneo dos cordeiros
apresentava-se abaixo dos limites de normalidade, com tendência à
normalização a partir das seis horas de vida nos grupos I e III. Porém, no grupo
II, os valores do pH normalizaram-se somente às 24 horas após o nascimento.
Durante a gestação e o nascimento, o animal está sujeito a baixo
suprimento de oxigênio. Os neonatos saudáveis sofrem de acidose discreta,
sendo
que
os
animais
nascidos
de
partos
laboriosos
apresentam,
invariavelmente, níveis significativamente mais baixos de pH sanguíneo
(WILSON et al., 1976, GARDINER, 1980).
Corroborando com a citação acima, os cordeiros nascidos de parto
normal (Grupo I) apresentaram discreta acidemia, enquanto os recém-nascidos
oriundos de cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III)
possuíam os mais baixos níveis.
Estes valores situados ligeiramente abaixo do normal são considerados
como quadro de acidose transitória, devido ao fato de que os cordeiros
apresentaram estes sinais nos primeiros momentos após o nascimento, com
normalização de seus valores de pH às 24 horas de vida.
80
4.2.8.2 PCO2
Os resultados obtidos (Tabela 18) no grupo I estão acima dos valores de
referência para animais adultos (SMITH, 2006), caracterizando a acidose
respiratória e metabólica transitória que os cordeiros apresentam ao
nascimento. Com o passar do tempo os teores diminuíram, aproximando-se da
normalidade. Ressalta-se que antes da realização da excisão do cordão
umbilical, os cordeiros do grupo II não se encontravam em acidose. Porém,
após a ruptura do cordão umbilical, a concentração de PCO2 elevou-se, com
concomitantemente queda do pH e aumento discreto do HCO3, pois no quadro
de acidose respiratória é de se esperar, como resposta compensatória ao baixo
pH, o aumento dos níveis de bicarbonato (HCO3) acima dos valores
considerados como normais, na tentativa de tamponamento químico do
excesso de íons de hidrogênio (GUYTON; HALL, 2002). Pode-se observar que
os valores tenderam à normalidade, embora numa taxa mais lenta, quando
comparados com os do grupo I. O mesmo aconteceu com o grupo III, apesar
de os valores ao nascimento não se mostrarem tão elevados quanto aos
observados nas amostras do grupo II.
Ao observar a tabela 18, verificou-se diferença estatística somente ao
comparar-se o grupo I com os grupos II e III, principalmente ao nascimento.
Exceto às seis horas de vida dos cordeiros, não foi possível constatar
variações significativas em seus valores nos diferentes grupos. Contudo, nos
cordeiros do grupo II, diferenças ocorreram entre os momentos M60, M12 e
M24.
4.2.8.3 BICARBONATO (HCO3)
Na espécie ovina, o bicarbonato (HCO3) varia de 20 a 25 mEq/L (SMITH,
2006). Ao compararem-se os diferentes grupos, verificou-se que o grupo I
81
diferiu dos demais nos momentos M15 e M60 e às 12 horas de vida. Exceto às
12 horas de vida, os grupos II e III não diferiram entre si.
Os valores médios apresentaram-se, de maneira geral, discreta
elevação (Tabela 18), principalmente no grupo I, decorrente da tentativa de
compensar a acidose respiratória transitória (glicólise anaeróbica) em que o
neonato se encontra na ocasião do nascimento e até quatro horas após o
parto. Porém, com o passar do tempo (M48 horas), os valores dos cordeiros do
grupo I ainda apresentavam-se ligeiramente elevados, principalmente nos
grupos II e III, por terem níveis mais elevados quando comparados aos do
grupo I.
4.2.8.4 DÉFICIT OU EXCESSO DE BASE (BE)
Os cordeiros do grupo I apresentaram déficit de base (BE) significativo,
sendo seus níveis recuperados, contudo, ao longo do tempo (Tabela 19), até
atingir, nos últimos momentos analisados, valores satisfatórios.
Tabela 19 - Medianas, mínimo e máximo dos valores de BE (mmoL/L), de
cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao
nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), bem como
às 06 horas (M6), às 12 horas (M12), às 24 horas (M24) e às 48
horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
BE (mmoL/L)
MOMENTO
NORMAL
CESARIANA +
DEXAMETASONA
CESÁRIANA
N
Md
Min-Max
N
Md
Min-Max
n
Md
Min-Max
M0
10
-1,5 Ab
-5,0 – 2,0
10
-6,0 B
-17,0 – 0,0
11
-6,0 B
-12,5 – -3,0
M15
10
0,0 Ab
-3,0 – 4,0
7
-10,0 B
-19,0 – -3,0 10
-11,8 B
-23,0 – -4,0
M60
10
3,5 Aab
-3,0 – 7,0
5
-3,0 B
-14,0 – -1,0
8
-7,1 B
-15,0 – -1,0
M6
10
1,0 b
-7,0 – 7,0
5
-2,0
-4,0 – 4,0
7
0,0
-10,7 – 3,3
M12
10
3,0 ABab
5
-1,0 B
-4,0 – 1,0
7
5,0 A
1,0 – 6,0
M24
10
5,5 a
-4,0 – 8,0
-2,0 –
10,0
4
4,5
1,0 – 7,0
8
5,8
1,5 – 10,0
M48
10
4,5 a
2,0 – 11,0
4
8,5
7,0 – 11,0
8
4,0
-1,7 - 10,0
Medianas seguidas de letras diferentes, minúscula na coluna e maiúscula na linha, diferem
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
aA,
82
Como
observado
para
outras
variáveis,
denotou-se
diferenças
estatísticas quando se comparou o grupo I com os demais, nos momentos M0,
M15 e M60. Ainda em relação aos cordeiros do grupo I, verificaram-se
diferenças às 24 e às 48 horas de vida. Divergências significativas dos valores
médios foram constatadas entre os grupos II e III, ao nascimento, aos 15 e aos
60 minutos, exceto no M12 horas, onde o grupo II diferiu do grupo III.
Os cordeiros dos grupos II e III apresentaram declínio acentuado de BE
na primeira hora de nascidos. Porém, esses valores começaram a aumentar
após as primeiras 12 horas de vida. Esses valores são condizentes com o que
foi observado por Rodrigues et al. (2007). O aumento desses valores nos
últimos momentos pode ser decorrente da recuperação do desequilíbrio ácidobásico observado ao nascimento o grupo I, cujos valores de BE tenderam a
aumentar após uma hora de vida.
4.2.9 Hemograma
4.2.9.1 Hematócrito (Ht)
Quando inicialmente descrito, o termo hematócrito (Ht) era o nome do
procedimento
utilizado
para
separar
o
sangue
em
seus
principais
componentes: concentrados de eritrócitos, camada leucocitária e plasma. Com
o uso comum do procedimento, o hematócrito começou a indicar o principal
resultado do método (STOCKHAM; SCOTT, 2011).
A anemia corresponde à diminuição da quantidade de hemácias,
resultando em menor oxigenação tecidual. A massa de hemácias é
determinada pela medição do volume globular (VG) ou do hematócrito, do teor
de hemoglobina no sangue ou da contagem de hemácias (BAKER, et al, 2006).
83
Tabela 20 –
VARIÁVEL
Média ( ) e desvio padrão (S) dos valores hematimétricos de
hematócrito (Ht), de cordeiros que nasceram de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos
(M60), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba,
SP – 2014.
MOMENTO
GRUPO I
GRUPO II
GRUPO III
N
N
n
±S
±S
±S
M0
10 48,6 ± 8,0 Aa
11
41,5 ± 3,7 Ba
11
39,3 ± 5,7 Ba
M15
10 47,6 ± 7,5 Aa
7
40,4 ± 5,3 ABa 10
37,2 ± 5,1 Bb
Ht
M60
10 47,4 ± 8,2 Aa
5
39,6 ± 6,5 Ba
8
38,0 ± 5,6 Bab
M24
10
36,9 ± 8,5 b
4
29,3 ±5,1 b
8
31,4 ± 5,1 c
M48
10
34,4 ± 8,6 b
4
26,5 ± 5,9 c
8
28,0 ± 5,4 d
aA,Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Denotou-se que o grupo de parto normal apresentou diferenças
significativas quando comparado aos grupos II e III, ao nascimento, aos 15 e 60
minutos (Tabela 20). No grupo I (parto normal), ao comparar os momentos
observou-se divergências estatísticas do M24 e M48, com os momentos
iniciais. Ao se avaliar os momentos, verificou-se diferença significativa entre os
grupos II e III, às 24 e às 48 horas. Os grupos II e III não divergiram.
É possível observar há declínio nos valores de VG em todos os grupos
(Grupo I, II e III) com o decorrer do tempo (Tabela 20), porém, apesar disso,
estes valores não chegaram ao limite inferior, de acordo com os citados por
Meyer, et. al (1995).
4.2.9.2 Hemoglobina (Hb)
A hemoglobina (Hb) tem como função transportar O 2 dos pulmões para
os tecidos (STOCKHAM; SCOTT, 2011). Os valores de referências descritos
por Meyer, et. al. ( 1995), variaram de 8 a 16 g/Dl
.
84
Tabela 21 - Médias ( ) e desvios padrões (S) dos valores hematimétricos de
Hemoglobina- Hb (g/dL), de cordeiros pertencentes aos grupos de
parto normal (Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana +
dexametasona (Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60
minutos (M60), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida (M48).
Araçatuba, SP – 2014.
VARIÁVEL
MOMENTO
GRUPO I
GRUPO II
n
n
n
±S
±S
M0
10 15,1 ± 2,5 Aa
11 13,5 ± 1,5 ABa 11
M15
10 14,9 ± 2,5 Aa
7
13,4 ± 2,0 ABa 10
Hb
M60
10 14,7 ± 2,4 Aa
5
13,0 ± 2,4 ABa
8
M24
10
11,7 ± 2,2 b
4
9,6 ± 1,7 b
8
M48
10
11,3 ± 2,9 b
4
8,8 ± 1,4 b
8
aA,
Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na
entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
GRUPO III
±S
12,1 ± 2,2 Ba
11,3 ± 1,8 Ba
11,4 ± 2,0 Ba
9,9 ± 1,9 b
9,2 ± 1,9 b
linha, diferem
Ao compararem-se os grupos em cada momento, denotou-se diferença
significativa nos três momentos iniciais (M0, M15 e M60), sendo que o grupo III
apresentou divergência estatística quando comparado ao grupo I. Na
comparação entre os momentos, constatou-se diferença entre os M24 e M48
com os três momentos iniciais, em todos os grupos. Verificou-se, também, que
os valores de Hb caíram com o decorrer, do tempo, porém não alcançaram o
limite inferior. Maior declínio destes valores foi visto nos cordeiros do grupo II
(Tabela 21).
4.2.9.3 Proteína Total
Proteínas são cadeias polipeptídicas de aminoácidos. Mais de 1.000
proteínas diferentes já foram identificadas no soro sanguíneo. A mensuração
da proteína total por refratometria tem como princípio o grau de refração de luz
em uma solução aquosa que é proporcional à quantidade de sólidos na
solução. Como a maioria dos sólidos no plasma são proteínas, o grau de
refração
da
luz
é
altamente
dependente
da
concentração
proteica
85
(STOCKHAM; SCOTT, 2011). Os valores médios de proteína total estão
dispostos na tabela 22.
Tabela 22 –
Médias ( ) e desvios padrões (S) dos valores de Proteína Total
(g/dL), de cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal
(Grupo I), cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona
(Grupo III), ao nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos
(M60), às 24 horas (M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba,
SP – 2014.
Proteína Total
MOMENTO
GRUPO I
GRUPO II
GRUPO III
n
n
n
±S
±S
±S
M0
10
4,2 ± 0,3 Ab
11
3,9 ± 0,4 ABb
11
3,8 ± 0,3 Bc
M15
10
4,3 ± 0,4 Ab
7
4,0 ± 0,3 ABb
9
3,9 ± 0,4 Bc
M60
10
4,4 ± 0,3 Ab
5
4,0 ± 0,4 Bb
8
4,2 ± 0,2 ABbc
M24
10
6,5 ± 1,1 Aa
4
5,2 ± 0,6 Ba
8
4,7 ± 0,4 Bab
M48
10
6,3 ± 0,9 Aa
4
5,2 ± 0,7 Ba
8
4,8 ± 0,6 Ba
aA,
Médias seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Ao se observar a tabela 22, constatou-se que o grupo I apresentou
diferenças significativas em relação ao grupo II, nos seguintes momentos, a
saber : M60, M24 e M48. O grupo I (parto normal) mostrou-se divergente entre
os grupo III (cesariana+dexametasona) ao nascimento, aos 15 minutos, às 24 e
às 48 horas de vida. Verificou-se, também, que os valores citados acima
(Tabela 22), encontravam-se abaixo daqueles tidos como referenciais, exceto
para aqueles do grupo I, os quais se encontravam próximos da normalidade
para a espécie. Os grupos II e III não diferiram entre si, apresentando valores
inferiores aos recomendados até o último momento estudado, indicadores de
falha de transferência de imunidade passiva, mesmo tendo sido alimentados
com colostro por meio de mamadeiras ou de sondagem.
4.2.9.4
Fibrinogênio
O fibrinogênio faz parte do grupo de proteínas conhecido como
proteínas de reação de fase aguda, produzidas pelo fígado (MEYER, 1995).
Os valores de referências encontrados são de 4,0 a 12,0 (x103/µL),
86
segundo Meyer et al. (1995). Observou-se, na tabela 23, que não houve
diferença significativa entre grupos e momentos (p > 0,05).
Tabela 23 –
Medianas dos valores de Fibrinogênio (g/dL), de cordeiros
pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana
(Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao nascimento
(M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), às 24 horas (M24) e às
48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
Fibrinogênio (g/dL)
MOMENTO
GRUPO I
GRUPO II
GRUPO III
n
Md
Min-Max
n
Md
Min-Max
n
Md
Min-Max
M0
10
<0,1
<0,1-0,20
11
<0,1
<0,1-2,00
11
<0,1
<0,1-0,20
M15
10
<0,1
<0,1-0,20
7
<0,1
<0,1-2,00
10
<0,1
<0,1-0,20
M60
10
0,2
<0,1-2,00
5
<0,1
<0,1-0,20
8
0,11
<0,1-2,00
M24
10
0,2
<0,1-6,00
4
<0,1
<0,1-0,20
8
0,20
<0,1-2,00
M48
10
<0,1
<0,1-4,00
4
0,30
0,20-2,00
8
0,20
<0,1-4,00
Medianas seguidas de letras diferentes, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
aA,
4.2.9.5
Leucócitos Totais
Tabela 24 – Medianas dos valores dos Leucócitos (x103/µL), de cordeiros
pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana
(Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao nascimento
(M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), às 24 horas (M24) e às
48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
Leucócitos (x103/µL)
MOMENTO
GRUPO I
n
Md
Min-Max
GRUPO II
n
Md
Min-Max
GRUPO III
n
Md
Min-Max
M0
10
3,1 ab
1,6 - 7,6
11
2,0
0,9 – 4,5 11
2,2
1,3 – 3,7
M15
10
2,8 ab
2,2 - 7,0
7
2,2
1,2 – 3,6 10
3,4
0,5 – 7,0
M60
10
2,3 b
1,7 - 4,2
5
2,1
2,0 - 2,9
8
2,7
1,4 – 5,5
M24
10
3,8 Aa
2,8 - 9,3
4
2,7 AB
1,7 – 3,4
8
2,4 B 1,3 - 3,7
M48
10 3,0 Aab 1,5 - 10,9
4
2,6 AB
1,7 – 2,8
8
2,1 B 1,6 – 3,0
aA,
Medianas seguidas de letras diferentes, minúscula na coluna e maiúscula na linha, diferem
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
87
Observou-se (Tabela 24) que o grupo I divergiu somente em relação aos
valores obtidos pelo grupo III, nos momentos M24 e M48. Entre os momentos,
constatou-se diferença significativa aos 60 minutos e às 24 horas.
4.2.9.6
Neutrófilos Segmentados
A principal função dos neutrófilos é a fagocitose de bactérias. Os
neutrófilos estão relacionados com as reações inflamatórias secundárias às
bactérias, doenças imunomediadas e necrose tecidual inespecífica. Os valores
de referência dos neutrófilos segmentados são de 1,0 a 5,0 µL.
Tabela 25 –
Medianas dos valores dos Neutrófilos segmentados (/µL), de
cordeiros pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I),
cesariana (Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao
nascimento (M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), às 24 horas
(M24) e às 48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
Neutrófilos segmentados (/µL)
GRUPO I
MOMENTO
Min-Max
GRUPO II
n
Md
Min-Max
GRUPO III
N
Md
n
Md
Min-Max
M0
10
0,85 A
0,25 – 4,71 11
0,20 B
0,04 – 0,92 11
0,57 AB 0,22 – 1,63
M15
10
0,88 A
0,45 – 3,87
7
0,09 B
0,02 – 1,06 10
0,63 AB
0,02 – 1,69
M60
10
0,94 A
0,37 – 2,44
5
0,25 B
0,12 – 0,80
8
0,41 AB
0,29 – 3,63
M24
10
2,23
0,21 – 5,49
4
1,76
0,82 – 2,14
8
1,22
0,39 – 2,85
M48
10
0,80
0,22 -5,12
4
1,48
0,87- 1,69
8
0,54
0,22 – 3,00
Medianas seguidas de letras diferentes, minúscula na coluna e maiúscula na linha, diferem
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
aA,
Quanto aos valores medianos do grupo I (tabela 25), verificou-se
diferença significativa somente com o grupo II, ao nascimento, aos 15 e 60
minutos, mas não entre os grupos II e III.
88
4.2.9.7 Linfócitos
Os precursores dos linfócitos se originam na medula óssea durante a
vida fetal e são influenciados em direção à função específica pelo timo, para
formar os linfócitos T ou pelo componente equivalente a Bursa de Fabricius em
cada espécie para formar os linfócitos B. No final da gestação e pósnascimento, a maioria dos linfócitos é produzida no baço, linfonodos e tecidos
linfoides associados ao intestino, estando a sua principal função relacionada às
atividades imunológicas (MEYER et al. 1995).
Tabela 26 –
Medianas dos valores dos Linfócitos (/µL),
de cordeiros
pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana
(Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao nascimento
(M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), às 24 horas (M24) e às
48 horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
Linfócitos (/µL)
MOMENT
O
GRUPO I
n
Md
M0
10
M15
Min-Max
GRUPO II
n
Md
1,76
0,93 – 2,51 11
10
1,82
0,95 – 3,09
M60
10
1,37
M24
10
1,63 A
Min-Max
GRUPO III
n
Md
Min-Max
1,75
0,68 – 4,23 11
1,70
0,36 – 2,89
7
1,82
0,20 – 3,10 10
2,42
0,01 – 5,81
0,27 – 3,04
5
1,83
1,16 – 2,73
8
2,04
0,22 – 3,74
1,14 -3,44
4
0,94 B
0,31 – 1,39
8
1,12 AB
0,60 - 1,70
M48
10
1,89 A 0,75 – 5,45 4
0,96 B
0,70 -1,01 8 1,22 AB 0,93 – 2,58
Medianas seguidas de letras diferentes, minúscula na coluna e maiúscula na linha, diferem
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
aA,
Constataram-se, na comparação entre grupos, diferenças significativas
entre os grupos I e II, somente nos momentos 24 e 48 horas de vida. Não
houve diferenças significativas entre os grupos II e III, e nem entre os
momentos.
4.2.9.8
Monócitos
Os monócitos surgem no osso da mesma célula primordial que os
granulócitos, e têm como função migrar para o interior dos tecidos e se
transformar em macrófago fixo. Este sistema mononuclear fagocitário
89
(macrófagos e monócitos do sangue), desempenha importante papel na defesa
contra microorganismos intracelulares (fungos, vírus, e certas bactérias),
segundo Meyer et al. (1995). Não se visualizou diferença significativa entre os
Grupos e entre os diferentes momentos (p > 0,05).
Tabela 27 – Medianas
dos valores dos Monócitos (/µL), de cordeiros
pertencentes aos grupos de parto normal (Grupo I), cesariana
(Grupo II) e cesariana + dexametasona (Grupo III), ao nascimento
(M0), aos 15 (M15) e 60 minutos (M60), às 24 horas (M24) e às 48
horas de vida (M48). Araçatuba, SP – 2014.
Monócitos (/µL)
MOMENTO
GRUPO I
n
Md
Min-Max
M0
10
0,03
0,00- 0,38
M15
10
0,09
0,00 – 0,23
M60
10
0,03
0,00 – 0,05
M24
10
0,04
0,00 – 0,28
M48
10
0,08
0,00 – 0,21
a A,
Medianas seguidas de letras diferentes,
entre si pelo teste de Dunn (p < 0,05).
GRUPO II
n
Md
11
0,03
7
0,00
5
0,00
4
0,02
4
0,09
minúscula na
Min-Max
GRUPO III
n
Md
Min-Max
0,00 – 0,22 11 0,04 0,00 - 0,88
0,00 – 0,09 10 0,02 0,00 – 0,58
0,00 – 0,04 8
0,02 0,00 – 1,18
0,00 – 0,31 8
0,00 0,00 – 0,05
0,00 -0,28 8
0,03 0,00 – 0,11
coluna e maiúscula na linha, diferem
4.2.10 Avaliação radiográfica pulmonar dos recém-nascidos
Ao realizar a avaliação radiográfica do grupo I (parto normal), verificouse que a maioria dos cordeiros pertencentes a este grupo apresentou aumento
da radiopacidade pulmonar de padrão alveolar localizado em lobos
diafragmáticos após o nascimento (M0); já nos momentos 24 e 48 horas estas
alterações se normalizaram. Alguns cordeiros não apresentaram quaisquer
alterações em seu padrão respiratório pulmonar. Alvares, et. al. (2012)
relataram que a hiperinsuflação compensatória do pulmão remanescente está
presente ao nascimento, sendo que as porções pulmonares colapsadas
apresentam aumento de radiopacidade com forma triangular, em pelo menos
90
uma das projeções radiográficas. É possível observar que a tendência é de que
os padrões pulmonares se normalizem, ao longo do tempo (Figura 17).
FIGURA 17 – Radiografia evidenciando padrão respiratório de cordeiros nascidos de
parto normal (Grupo I). Imagem radiográfica apresentando aumento de
radiopacidade pulmonar de padrão alveolar localizado em lobos
diafragmáticos ao nascimento (A) às 24 (B) e às 48 horas (C),
evidenciando padrão alveolar em organização.
Verificou-se aumento homogêneo de radiopacidade pulmonar nos
animais do grupo II (cesariana), obliterando a visualização da silhueta cardíaca,
sendo compatível com a presença de efusão pleural, acompanhada, também,
de dificuldade de observação das cúpulas diafragmáticas. Alguns animais
apresentaram aumento generalizado da radiopacidade pulmonar de padrão
alveolar, com a presença de broncogramas aéreos em lobos diafragmáticos,
sendo possível a visualização parcial da silhueta cardíaca e das cúpulas
diafragmáticas devido ao intenso padrão alveolar. Estes resultados são
semelhantes aos citados por Alvares et al. (2012) que relataram o aspecto
radiológico típico da Síndrome do Desconforto Respiratório (SDR) em recémnascido pré-termo, em suas primeiras horas de vida, caracterizado pelo
infiltrado retículogranular difuso distribuído uniformemente nos pulmões, com
presença de broncogramas aéreos e aumento do líquido intrapulmonar.
Radiologicamente, a SDR pode ser classificada em leve, moderada e grave. A
91
forma leve apresenta padrão reticulogranular difuso, porém permite a
visualização da silhueta cardíaca; a forma moderada apresenta maior
opacidade, com presença de broncogramas aéreos e apagamento da silhueta
cardíaca; a forma grave apresenta opacidade completa do pulmão.
É possível observar a maior opacidade após o nascimento (M0), sendo
nítida, contudo, a gradativa facilidade para visualizar as estruturas pulmonares
(Figura 17), à medida que o tempo aumenta (M24 e M48). Entretanto, ao
avaliar e comparar as figuras 17, 18 e 19, constatou-se que o grupo de parto
normal foi o que apresentou melhor visualização das estruturas, indicando que
os animais nascidos de partos eutócicos possuíam pouca quantidade de líquido
em seus pulmões, fazendo com que obtivessem melhor visualização em suas
radiografias, como também em seus parâmetros vitais, principalmente no que
tange a capacidade respiratória. Estes achados encontram-se associados,
ainda, a mais rápida recuperação destes cordeiros em relação aos dos grupos
II e III, os quais apresentavam estruturas de difícil visualização ao exame
radiográfico, devido à grande quantidade de LA em seus pulmões, com alguns
destes apresentando sinais de atelectasia pulmonar, além da síndrome do
desconforto respiratório (SDR). Tais alterações refletiram no quadro clínico
geral do animal, em virtude da maior dificuldade ao insuflar os seus pulmões,
com consequente comprometimento da capacidade respiratória destes
animais, oriundos de cesarianas (Grupo II) e de cesarianas + dexametasona
(Grupo III).
O método de eleição para o nascimento destes cordeiros provavelmente
influenciou no aparecimento das alterações ocorridas em cada grupo, já que
há, fisiologicamente, em animais que nascem de parto normal, a expulsão de
grande quantidade de LA por compressão de sua caixa torácica à medida que
o cordeiro se insinua pela pelve de suas mães, sem contar com a melhor
capacidade de absorção dos líquidos pelo próprio organismo. Assim, os
animais nascidos de parturições eutócicas têm melhor adaptação frente ao
ambiente extrauterino quando comparado com os cordeiros pertencentes aos
grupos II e III, uma vez que além de prematuros, estes foram submetidos à
92
cesariana, e mesmo tendo-se realizado a aspiração das vias aéreas
imediatamente após o nascimento, a quantidade de LA em seus pulmões
mostrou-se maior.
FIGURA 18- Radiografia torácica de cordeiros nascidos de cesarianas (Grupo II),
evidenciando aumento de radiopacidade pulmonar de padrão alveolar,
localizado em lobos diafragmático e acessório ao nascimento (A) e às
24 horas (B), com melhora acentuada do padrão alveolar. Denotar
aspecto “felpudo” da veia cava caudal às 48 horas (C).
A
B
FIGURA 19- Radiografia torácica de cordeiros nascidos de cesariana+dexametasona
(Grupo III). Imagem radiográfica apresentando presença de infiltrado
peribronquial, ao nascimento (A) e às 24 horas (B). No momento 48
horas (C) evidencia-se a veia cava caudal com aspecto “felpudo” e
manutenção do infiltrado peribronquial.
C
93
Alguns cordeiros nascidos de cesariana, cujas mães receberam
dexametasona 36 horas antes das cirurgias eletivas, apresentaram discreto
aumento de radiopacidade de padrão alveolar nos lobos diafragmático e
acessório,
com
indefinição
da
veia
cava
caudal.
Outros
possuíam
radiopacidade homogênea em cavidade torácica, com densidade de água,
obliterando a visualização da silhueta cardíaca e cúpulas diafragmáticas,
sugerindo atelectasia. Foi possível observar melhora na visualização dos
padrões pulmonares ao longo do tempo. Cabe ressaltar que os cordeiros deste
grupo apresentaram melhores resultados quando comparado aos do grupo II
(Figura 19).
94
5
CONCLUSÃO
A técnica de coloração de azul de Nilo (0,1%) não é satisfatória na
espécie ovina para predizer a maturidade fetal; a citologia pelo método
Hematoxilina – Shorr se mostra como ótimo método para prever o grau de
maturidade fetal de cordeiros, principalmente quando associado a outras
técnicas de avaliação da maturidade pulmonar e fetal; o teste de Clements
(1972) apresenta-se, de maneira geral, resultados inconstantes e não
fidedignos quando negativos, porém confiáveis quando positivos, por serem
fortes indicadores de maturidade pulmonar do feto ou do recém-nascido;
cordeiros prematuros, nascidos aos 138 dias de gestação de mães que
receberam dexametasona por via intramuscular dois dias antes da parição,
apresentam menores taxas de mortalidade e maiores níveis glicêmicos ao
nascimento do que aqueles da mesma categoria etária, oriundos de mães não
medicadas com o referido fármaco; recém-nascidos da espécie ovina
apresentam-se com acidose respiratória transitória ao nascimento, porém, de
maior duração e intensidade naqueles prematuros; cordeiros prematuros cujas
mães recebem administração de dexametasona 36 horas antes da parição
possuem maiores valores de lactato séricos aos 15 minutos de vida do que
animais nascidos a termo e prematuros, indicando hipóxia mais duradoura;
cordeiros prematuros possuem falha de transferência de imunidade passiva,
mesmo quando alimentados com colostro.
95
6
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2009.Dissertacao (Mestrado em Ciencia Animal) – Universidade Estadual
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