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Código: MET POA/SLAV/39/02/01
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Emissão: 24/07/2014
Método de Ensaio - MET
Determinação de proteína bruta em produtos de origem animal por acidimetria
1 Escopo
Este método tem por objetivo determinar o teor de proteína bruta de produtos de origem animal.
Aplica-se a amostras nitrogenadas de origem orgânica e inorgânica, com exceção de nitratos e
nitritos.
2 Fundamentos
O método se baseia na digestão das proteínas e outros compostos nitrogenados com ácido
sulfúrico concentrado a quente, em presença de catalisador, liberando o carbono como gás
carbônico, o hidrogênio como água e transformando o nitrogênio em amônia (NH3), que é fixado
na forma de sulfato de amônio. O sulfato de amônio resultante, na presença da solução
concentrada de hidróxido de sódio, libera amônia, que é recebida na solução de ácido bórico e
titulada com ácido sulfúrico de título conhecido. Os resultados são expressos como proteína bruta,
multiplicando-se a porcentagem do nitrogênio total por fatores específicos.
3 Reagentes, padrões e materiais
Todos os reagentes são de grau analítico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a água
utilizada nos procedimentos é destilada/deionizada, exceto quando especificada.
3.1 Reagentes
•
Ácido bórico (H3BO3);
•
Ácido clorídrico (HCl);
•
Ácido sulfúrico (H2SO4);
•
Etanol (CH3CH2OH);
•
Hidróxido de sódio (NaOH);
•
Sulfato de amônio ((NH4)2SO4);
•
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O);
•
Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) ou sulfato de potássio anidro (K2SO4);
•
Verde de bromocresol (C21H14Br4O5S);
•
Vermelho de metila (C15H15N3O2).
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3.2 Padrões
•
Carbonato de sódio (Na2CO3), material de referência.
3.3 Materiais
•
Balões volumétricos (1000 mL);
•
Bureta graduada ou titulador automático;
•
Erlenmeyers de 125 ou 250 mL;
•
Gral de porcelana com pistilo;
•
Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio);
•
Provetas de 50, 100 e 250 mL;
•
Tubos de vidro compatíveis com sistemas micro e macro-Kjeldahl.
4 Equipamentos
•
Balança analítica, com precisão mínima de quatro casas decimais;
•
Bloco digestor;
•
Destilador micro ou macro-Kjeldahl;
•
Forno-mufla.
5 Precauções analíticas
Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem representar
risco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de
proteção individual e uniforme apropriado. O preparo das soluções reagentes deve ser feito em
capela de exaustão.
Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biológico, evitando-se o
contato direto com pele e mucosas.
6 Procedimentos
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As operações deverão ser registradas no formulário “Dados brutos”, Anexo A do POP
POA/SLAV/15 “Procedimentos de rotina na análise físico-química de produtos de origem animal”.
Realizar o ensaio em duplicata.
6.1 Preparo de soluções e reagentes
6.1.1 Método micro-Kjeldahl
6.1.1.1 Mistura catalítica
Juntar dez partes de sulfato de sódio (ou potássio) anidro e uma parte de sulfato de cobre
pentahidratado. Triturar em gral, homogeneizar e armazenar em frasco identificado.
6.1.1.2 Solução de hidróxido de sódio 50% (m/v)
Em um béquer, sobre banho de gelo, dissolver lenta e cuidadosamente 500 g de hidróxido de
sódio em aproximadamente 800 mL de água. Esperar esfriar. Transferir para balão volumétrico
de 1 L e completar volume com água.
6.1.1.3 Indicador misto
Pesar 0,132 g de vermelho de metila e 0,06 g de verde de bromocresol. Dissolver em 200 mL de
álcool etílico 70% (v/v). Filtrar se necessário e guardar em frasco âmbar.
6.1.1.4 Solução de ácido bórico 4% (m/v)
Dissolver 40,00 g de ácido bórico em 800 mL de água quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,
transferir para um balão de 1000 mL, adicionar 8 mL de indicador misto e avolumar.
6.1.1.5 Solução de ácido sulfúrico 0,05 M (mol/L)
Na capela de exaustão, transferir cuidadosamente 2,70 mL de ácido sulfúrico para balão
volumétrico de 1000 mL, contendo aproximadamente 400 mL de água. Deixar esfriar e completar
o volume.
6.1.1.6 Solução hidro-alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v)
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Em um balão volumétrico de 100 mL, dissolver 0,1 g de vermelho de metila em 40 mL de etanol.
Completar o volume com água. Homogeneizar e armazenar em frasco âmbar identificado.
6.1.1.7 Solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1 M (mol/L)
Na capela de exaustão, adicionar com cuidado e lentamente pelas paredes de um balão de 1000
mL contendo 10 mL de água deionizada, 8,35 mL de ácido clorídrico, com auxílio de uma pipeta.
Completar o volume com água deionizada e transferir a solução preparada para frasco de vidro e
rotular. Essa solução poderá ser armazenada à temperatura ambiente.
6.1.2 Método macro-Kjeldahl
6.1.2.1 Mistura catalítica
Conforme item 6.1.1.1.
6.1.2.2 Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 32% (m/v)
Em um béquer, sobre banho de gelo, dissolver cuidadosamente 320 g de hidróxido de sódio em
cerca de 800 mL de água. Esfriar. Transferir para balão volumétrico de 1 L e completar volume.
6.1.2.3 Solução de ácido bórico (H3BO3) 2% (m/v)
Dissolver 20,00 g de ácido bórico em 700 mL de água quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,
transferir para um balão de 1000 mL e avolumar.
6.1.2.4 Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,05 M
Conforme item 6.1.1.5.
6.1.2.5 Solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1 M
Conforme item 6.1.1.7.
6.2 Digestão
6.2.1 Método micro-Kjeldahl
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Pesar, em balança analítica, cerca de 0,25 g de amostra em papel de pesagem e transferir para o
tubo. Adicionar aproximadamente 2,5 g de mistura catalítica e 7 mL de ácido sulfúrico. Aquecer
em bloco digestor, realizando uma rampa conforme tabela 1, até o líquido se tornar límpido e
transparente, de tonalidade azul-esverdeada. Deixar esfriar. Adicionar um pouco de água apenas
para limpar as paredes do tubo.
Tabela 1. Rampa de aquecimento para digestão de amostras para determinação de proteína
bruta (método micro-Kjeldahl).
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
1
50°C
30 minutos
2
100°C
20 minutos
3
150°C
20 minutos
4
200°C
20 minutos
5
250°C
20 minutos
6
300°C
20 minutos
7
350/420°C*
Até clarear
* Para produtos lácteos manter a 350°C; outros produtos: 420°C.
6.2.2 Método macro-Kjeldahl
Pesar aproximadamente entre 0,5 g e 1 g de amostra homogeneizada e transferir para tubo
macro-Kjeldahl identificado. Adicionar aproximadamente 5 g de mistura catalítica e 20 mL de
ácido sulfúrico concentrado.
Se a amostra for muito gordurosa, adicionar 30 mL de ácido
sulfúrico. Aquecer a 420°C até que o conteúdo dos tubos clareie por completo. Se necessário,
fazer rampa de aquecimento (tabela 2). Se, após digestão, as amostras não forem imediatamente
destiladas, adicionar 20 mL de água.
Tabela 2. Exemplo de rampa de aquecimento para digestão de amostras de leite e derivados para
determinação de proteína bruta (método macro-Kjeldahl).
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
1
150°C
15 a 20 minutos
2
300°C
15 a 20 minutos
3
400°C
20 minutos
4
420°C
Até clarear
6.3 Destilação e titulação
6.3.1 Método micro-Kjeldahl
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Levar ao destilador de nitrogênio um erlenmeyer contendo 50 mL de solução de ácido bórico 4%
com indicador misto. Acoplar o tubo de micro-Kjeldahl ao destilador.
Adicionar a solução de hidróxido de sódio 50% (aproximadamente 20 mL) até obter uma solução
de cor negra, que é indicativa da neutralização da reação.
Proceder à destilação. Recolher o volume necessário para a completa destilação da amônia.
Pode-se testar o ponto final da destilação com papel indicador de pH até que não ocorra mais
reação alcalina. A solução coletora deve ser mantida fria durante a destilação.
A titulação poderá ser realizada com solução fatorada de ácido sulfúrico 0,05 M ou de ácido
clorídrico 0,1 M.
Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.
Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digestão ou destilação
podem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.
6.3.2 Método macro-Kjeldahl
Levar os tubos ao conjunto de destilação/titulação, operando-o conforme instrução de uso.
Recolher o destilado em ácido bórico 2% (m/v) e titular. A titulação poderá ser realizada com
solução fatorada de ácido sulfúrico 0,05 M ou de ácido clorídrico 0,1 M, até indicação da viragem
pelo equipamento.
Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.
Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digestão ou destilação
podem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.
6.4 Padronização da solução titulante
A padronização da solução titulante deverá ser registrada no formulário “Padronização da solução
titulante”, Anexo D do POP POA/SLAV/09 “Controle de reagentes, preparo de soluções, curvas de
calibração e padronização de soluções titulantes”.
6.4.1 Solução de ácido sulfúrico 0,05 M
Realizar a padronização em triplicata.
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Colocar cerca de 5 g de Na2CO3 em cadinho de porcelana de 50 mL.
Comprimir a substância contra as paredes do cadinho, com uma espátula.
Aquecer a 300ºC, durante duas horas utilizando um forno mufla. Transferir o Na2CO3 para um
dessecador e deixar esfriar.
Pesar adequadamente (com ajuda de papéis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de
0,130 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de água deionizada e três gotas de solução de
vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com solução de ácido sulfúrico 0,05 M. Calcular o fator de
correção (f) utilizando a seguinte fórmula:
Onde:
m = massa (g) de carbonato de sódio;
V = volume (mL) da solução de ácido sulfúrico gasto na titulação;
M = concentração (molaridade) da solução de acido sulfúrico utilizada.
6.4.2 Solução de ácido clorídrico 0,1M
Realizar a padronização em triplicata.
O procedimento de tratamento do sal (Na2CO3) e o cálculo do fator de correção (f) deverão ser
realizados conforme o item 6.4.1.
Pesar adequadamente (com ajuda de papéis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de
0,132 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de água deionizada e uma gota de solução de
vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com solução de ácido clorídrico 0,1 M.
6.5 Teste de recuperação de nitrogênio
6.5.1 Método micro-Kjeldahl
Triturar o sulfato de amônio em gral e secar em estufa a 102ºC por quatro horas. Em um tubo de
destilação, pesar 0,15 g de sulfato de amônio. Adicionar ao tubo 2,5 g de mistura catalítica e
cerca de 7 mL de ácido sulfúrico. Levar o tubo para a digestão junto com as amostras realizando
o mesmo procedimento. Após a digestão, levar ao destilador de nitrogênio realizando o mesmo
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procedimento de uma amostra. Após a destilação, titular o recuperado e calcular o percentual de
nitrogênio recolhido (% Nr) através da seguinte fórmula:
Onde:
% Nr = percentual de nitrogênio recolhido;
V = volume gasto de solução titulante (mL);
B = volume do branco (mL);
m = massa de sulfato de amônio (g);
CT = concentração teórica (molaridade) da solução titulante;
FC = fator de correção da solução titulante
6.5.2 Método macro-Kjeldahl
Triturar o sulfato de amônio em gral e secar em estufa a 102ºC por quatro horas. Em um tubo de
destilação, pesar 0,25 g de sulfato de amônio. Adicionar 5 g de mistura catalítica e 20 mL de ácido
sulfúrico. Proceder à digestão. Destilar e titular conforme programação do equipamento (com
adição automática de água e de hidróxido de sódio). Calcular o percentual de nitrogênio recolhido
(% Nr) conforme item 6.4.1.
6.5.3 Recuperação em função da pureza do sulfato de amônio
O resultado da recuperação (% Nrec) deve ser maior que 99,5%, calculado pela seguinte fórmula:
Onde:
% Nr = percentual de nitrogênio recolhido;
% N = percentual de nitrogênio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amônio (tabela 3).
Tabela 3. Percentual de nitrogênio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amônio, para
avaliação da recuperação na determinação de proteína bruta (métodos macro e micro-Kjeldahl).
GRAU DE PUREZA
PERCENTUAL DE NITROGÊNIO
99,5%
21,09%
99,6%
21,12%
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Método de Ensaio - MET
Determinação de proteína bruta em produtos de origem animal por acidimetria
99,7%
99,8%
99,9%
21,14%
21,16%
21,18%
7 Resultados
Em casos de funcionamento inadequado do equipamento, quebra de tubos ou perda de amostra
durante a realização do ensaio, os resultados são desconsiderados e o ensaio é repetido.
Os resultados são aceitos se observadas todas as precauções analíticas e se realizados todos os
procedimentos em conformidade com este método.
7.1 Cálculos e expressão dos resultados
O resultado a ser expresso é a média das duplicatas, em g.100g-1 de proteína bruta deve ser
calculado de acordo com as fórmulas abaixo:
7.1.1 Cálculo do nitrogênio total:
Onde:
V = volume de solução titulante (mL) gasto na titulação;
B = volume gasto (mL) na titulação da prova em branco;
CT = concentração teórica (molaridade) da solução titulante;
FC = fator de correção da solução titulante;
m = massa de amostra (g).
7.1.2 Cálculo da proteína bruta (g.100g-1):
Onde:
PB = proteína bruta (g.100 g-1);
% N = nitrogênio total;
FE = fator empírico (Tabela 4).
Tabela 4. Fatores empíricos de transformação do nitrogênio em proteína, para cálculo da proteína
bruta de amostras de alimentos pelos métodos macro e micro-Kjeldahl.
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Determinação de proteína bruta em produtos de origem animal por acidimetria
ALIMENTO
FATOR EMPÍRICO
Leite e derivados
6,38
Trigo e derivados
5,83
Outros alimentos
6,25
Os cálculos são realizados através da planilha “Cálculos - Determinação de proteína bruta”
(Anexo A).
7.1.3 Relação umidade/proteína (U/P):
Onde:
Um = Umidade média (g.100g-1), determinada conforme MET POA/SLAV/27;
PBm = proteína bruta média (g.100g-1).
7.2 Validação da planilha
A planilha “Cálculos – Determinação de proteína bruta” deve ser validada conforme descrito no
POP POA/SLAV/15, através de cálculos manuais os quais devem ser registrados no formulário
“Validação de planilhas eletrônicas”, Anexo M do POP POA/SLAV/15.
8 Arquivamento dos registros
A planilha de cálculo deve se mantida protegida na pasta eletrônica “Resultados”. O formulário de
validação da planilha de cálculos deve ser arquivado conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o
formulário de padronização da solução titulante conforme POP POA/SLAV/09.
9 Referências
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Métodos analíticos físicoquímicos para controle de produtos cárneos e seus ingredientes, sal e salmoura. Instrução
Normativa nº. 20, de 21de julho de 1999. Brasília: Diário Oficial da União, Seção 1, de 27 de julho
de 1999.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução
Normativa n° 68 de 12 de dezembro de 2006. Métodos analíticos físico-químicos para
controle de leite e produtos lácteos. Brasília: Diário Oficial da União, 14/12/2006.
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10 Anexos
Anexo A MET/POA/SLAV/37/01 Planilha “Cálculos – Determinação de proteína bruta”.
11 Alterações
Substituída concentração do ácido sulfúrico de 0,1 N por 0,05 M;
Item 1: excluído “no Laboratório de Produtos de Origem Animal – POA/SLAV”;
Item 3.1: incluído “Ácido clorídrico (HCl)”;
Item 6: excluído ““Dados brutos – Determinação de proteína bruta” (Anexo A).”, incluído ““Dados
brutos”, Anexo A do POP POA/SLAV/15 - Procedimentos de rotina na análise físico-química de
produtos de origem animal”;
Item 6.1.1.5: incluído “Na capela de exaustão”;
Itens 6.3.1 e 6.3.2: incluído “ácido clorídrico 0,1 M”;
Item 6.4: incluído “A padronização da solução titulante deverá ser registrada no formulário
“Padronização da solução titulante”, Anexo D do POP POA/SLAV/09 - Controle de reagentes,
preparo de soluções, curvas de calibração e padronização de soluções titulantes”;
Itens 6.4.1 e 6.4.2: incluídos;
Item 7.1: excluído “O cálculo é realizado através das planilhas eletrônicas Cálculos –
Determinação de proteína bruta (Anexo B) disponível no computador da unidade”. Incluído “O
resultado a ser expresso é a média das duplicatas, em g.100g-1 de proteína bruta e deve ser
calculado de acordo com as fórmulas abaixo”;
Item 7.2: excluído “quinzenalmente, através de cálculos manuais que devem ser registrados no
formulário “Validação da planilha de cálculos - Determinação de proteína bruta” (Anexo C)”.
Incluído “validada conforme descrito no POP POA/SLAV/15, através de cálculos manuais os
quais devem ser registrados no formulário “Validação de planilhas eletrônicas”, Anexo M do POP
POA/SLAV15”;
Item 8: excluídos “O formulário “Dados Brutos – Determinação de proteína bruta” deve ser
arquivado na pasta “Dados Brutos” e “O formulário de “Validação da Planilha de Cálculos –
Determinação de proteína bruta” deve ser arquivado na pasta “Validação de Planilha de Cálculos”
da unidade”. Incluído “O formulário de validação da planilha de cálculos deve ser arquivado
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Método de Ensaio - MET
Determinação de proteína bruta em produtos de origem animal por acidimetria
conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o formulário de padronização da solução titulante
conforme POP POA/SLAV/09”;
Item 10: excluídos “Anexo A MET/POA/SLAV/37/01 Formulário Dados Brutos – Determinação de
proteína bruta” e “Anexo C MET/POA/SLAV/37/01 Formulário Validação da planilha de cálculos Determinação de proteína bruta”. Substituído “Anexo B” por “Anexo A”;
Anexo A: Formulário “Dados Brutos – Determinação de proteína bruta” substituído pela planilha
“Cálculos – Determinação de proteína bruta”;
Anexo B: agora Anexo A. Excluídos campos: referente a recuperação do nitrogênio e a data;
Anexo C: Formulário “Validação da planilha de cálculos - Determinação de proteína bruta”,
excluído.
Não há necessidade de complemento de relatório de confirmação de desempenho em
função das alterações realizadas.
12 Responsabilidades
O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição de
cópias, implementação, capacitação do pessoal para execução, gerenciamento de não
conformidades, análise crítica e revisão deste MET.
A UGQ é responsável pela verificação deste MET.
Elaboração/Revisão:
Aprovação:
Verificação:
Ana Paula Pereira de Melo – POA/SLAV
Cristhiane Cattani – POA/SLAV
Rosane Carlessi – UGQ
Data: 21/07/2014
Data: 21/07/2014
Data: 24/07/2014