40ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia
ANÁLISE DE GENÓTIPOS DO GENE DA LEPTINA EM SUÍNOS E ASSOCIAÇÃO
COM CARACTERÍSTICAS PRODUTIVAS(1)
AUTORES
JANE DE OLIVEIRA PEIXOTO3, SIMONE ELIZA FACIONI GUIMARÃES5, MARIA AMÉLIA MENCK. SOARES3, PAULO
SAVIO LOPES4.DEBORA MARTINS PAIXÃO2.
1
1Financiamento: CAPES, CNPq,FAPEMIG;
2
2Estudante de graduação UFV;
3
3Estudante de pós -graduação UFV;
4
4Professor do Departamento de Zootecnia da UFV;
5
5Professor orientador(Departamento de Zootecnia UFV)
RESUMO
O objetivo deste estudo foi associar os polimorfismos detectados no gene da leptina por meio da técnica de
PCR-RFLP com características produtivas em suínos F2 originados de populações geneticamente divergentes.
Foram analisados dois polimorfismos. O polimorfismo detectado por meio da enzima de restrição BamHI no
segundo intron do gene, na posição 2411 pb. O sítio polimórfico reconhecido pela enzima Hinf I foi detectado na
posição 3469, no terceiro exon do gene da leptina. Nas análises de associação dos genótipos com
características produtivas foi usado o PROC GLM do SAS. As comparações entre as médias foram feitas pelo
teste de Tukey. Efeitos significativos dos genótipos BamHI foram observados para: espessura de toucinho na
última costela (p= 0.0004), peso de cabeça (p= 0.013), e peso do rim (p=0.003). Os genótipos da HinfI foram
significativamente associados a peso aos 21 dias (p= 0.043), consumo de ração (p=0.0077), peso do
lombo(p=0.018) e peso do bacon (p= 0.0179). As médias dos genótipos diferiram para todas as características.
PALAVRAS- CHAVE
BamHI, Cruzamento divergente, Gene candidato, Hinf I, PCR- RLFLP
TITLE
CARACTERIZATION OF SWINE LEPTIN POLYMORPHISMS AND THEIR ASSOCIATION WITH PRODUCTION
TRAITS
ABSTRACT
The objective of the present study was to investigate the association of polymorphisms in the porcine leptin gene
with productin traits. Alleles were identifield by PCR – RFLP using restrictin enzymes.It was found two
polymorphisms. BamHI polymorphysm was detected within the second intron of the leptin gene, at position 2411
bp. A polymorphic site of HinfI was observed at position 3469, in the third exon. of leptin gene.In testing the
significance of allele substitution, data analysis was performed using PROC GLM of ststistical package SAS
(1998). It was found the leptin genotypes for BamHI were associated with, Backfat thickness after last rib (
0.0004), head weight ( p= 0.013). and kidney weigth ( p=0.003). The Hinf I genotypes were associated with
Weight at 21 days ( p= 0.0179), feed intake ( p= 0.0077), loin weigth ( p= 0.018) and bacom weight ( p= 0.0179).
KEYWORDS
BamHI, Candidate gene, Divergente crossbreeding, HinfI, PCR-RFLP
INTRODUÇÃO
O ultimo avanço na suinocultura tem sido o conhecimento do genoma suíno (PEREIRA, 2000). Esforços têm
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sido direcionados para o desenvolvimento de mapas genômicos constituídos de marcadores genéticos anônimos
( geralmente microssatélites) e genes conhecidos. A maioria dos marcadores utilizados em suinocultura foi
desenvolvida usando genes candidatos, que são genes seqüenciados de função biológica conhecida e são
diretamente responsáveis pela expressão de determinada característica. Podem ser genes estruturais ou
regulatórios, como o gene da leptina. A leptina é produzida principalmente pelos adipócitos e, por meio do seu
receptor, influencia diferentes vias metabólicas para alterar o consumo de alimentos e o gasto de
energia.(CAMPFIELD et al., 1995; PELLEYMOUNTER et al.,1995). O grande efeito da leptina e de seu receptor
sobre a regulação do balanço energético e suas relações com as funções reprodutivas, fazem de seus genes
potenciais candidatos para investigação de polimorfismos associados às características produtivas
economicamente importantes.
O objetivo deste estudo foi associar os polimorfismos detectados no gene da leptina por meio da técnica de
PCR-RFLP com características produtivas em suínos F2 originados de populações geneticamente divergentes
MATERIAL E MÉTODOS
Os dados utilizados neste trabalho são provenientes de uma população segregante (F2), obtida pelo
cruzamento divergente entre matrizes comerciais e suínos nativos brasileiros. O experimento foi
conduzido na Granja de Melhoramento de Suínos do Departamento de Zootecnia da Universidade
Federal de Viçosa(UFV) e as análises foram feitas no Laboratório de Biotecnologia Animal
(LABTEC-DZO). Durante o período de experimento na granja coletou-se dados de desempenho,
carcaça e qualidade de carne. As seqüência dos pares de primers foram desenhadas a partir da
seqüência genômica do gene da leptina de suínos publicada por BIDWELL et al, 1997 (GenBank
acesso número U66254). O primeiro par de primers (Direto: 5’ GTGGGGTCCAGATATCCGTT;
Reverso: 5’ CCAGGCTAGGGGTCTAATCG) amplifica uma região de 604 nucleotídeos. O segundo
par
de
primers
(Direto:
5’
AACAGAGGGTCACCGGTTTG;
Reverso:
5’
TTTGGAAGAGCAGCTTAGCG ) amplifica uma região de 486 nucleotídeos. O diagnóstico naos
animais da geração parental dos polimorfismos Bam HI e Hinf I, foi feito por SOARES (2001).
A reação de PCR foi feita para um volume final de 20 µL c ontendo 25 ng de DNA genômico, 50 mM
de KCl, 20 mM de TRIS-Cl pH 8.3, 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 4 pmol de cada primer e 1
unidade de Taq polimerase. O programa consistiu de um passo inicial de desnaturação por 3
minutos a 95 C, seguidos de 35 ciclos de amplificação, compreendendo desnaturação das fitas a
94 C por 1 min, anelamento dos primers a 66 C por 1 min e extensão do fragmento a 72 C por
1 min com uma extensão final a 72 oC por 5 min.
Cinco microlitros do produto da reação de PCR foram digeridos com 4 unidades de Bam HI
(fragmento 1) e de Hinf I( fragmento 2) a 37oC por 2 horas. O produto da digestão foi analisado por
eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%(PAGE). Com posterior coloração por nitrato de prata.
As análises de associação dos genótipos com as características medidas foram feitas utilizando o
PROC GLM do SAS. Com o seguinte modelo animal:
As análises estatísticas para associação dos genótipos com as características avaliadas foram
feitas utilizando-se o PROC GLM do SAS, seguindo-se o modelo:
Yijkl = m + Gi + Sj + Lk + b(Cijkl – C)+ eijkl
em que:
Yijkl = característica observada no animal l, do genótipo i, sexo j, do lote k;
m = constante inerente a todas as observações;
Gi = efeito fixo do genótipo i (BB, Bb, bb ou HH, Hh);
Sj = efeito fixo do sexo j;
Lk = efeito fixo de época de nascimento k (k = 1, 2, 3, 4 e 5);
b= coeficiente de regressão linear da característica em função da covariável;
Cijkl= valor observado da covariável;
As comparações entre as médias dos genótipos foram feitas utilizando-se o teste Tukey.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
O polimorfismo gerado pela enzima de restrição Bam HI foi detectado na posição 2411 pb, no
segundo intron do gene da leptina, onde ocorreu uma transição de um T por um C. A digestão do
produto de PCR revelou dois alelos: para o alelo B o tamanho dos fragmentos, após a restrição, foi
de 540 e 64 pb, já o alelo b apresenta fragmentos com o tamanho de 493pb, 64pb e 47pb. Foram
genotipados 320 animais da geração F2. Verificou-se que 92 dos animais analisados possuíam o
genótipo B/B, 129 eram heterozigotos B/b e 38 eram homozigotos para mutação b/b. A transição de
um T por um C incluiu um sitio para enzima Hinf I na posição 3469 no terceiro exon do gene. Foram
observados dois alelos: para o alelo H o tamanho dos fragmentos foi de 400 e 91 pb, já o alelo h
apresentou fragmentos com o tamanho de 400pb, 347pb e 91pb. Foram genotipados 122 animais
da geração F2. Verificou-se que 95 dos animais analisados possuíam o genótipo H/H, 27 eram
heterozigotos H/h, homozigotos para mutação h/h não foram encontrados. Efeitos significativos dos
genótipos obtidos por meio da enzima BamHI foram observados para: espessura de toucinho na
última costela (p= 0.004), peso da cabeça (p= 0.0013), e peso do rim (p=0.003). Os animais B/B
apresentaram maiores médias para peso de cabeça e para peso do rim, enquanto o genótipo
homozigoto b/b apresentou maior média para espessura de toucinho na última costela. Os
genótipos obtidos pela digestão com a enzima HinfI foram significativamente associados a peso aos
21 dias (p= 0.043), consumo de ração (p=0.0077), peso do lombo(p<0.018) e peso do bacon (p=
0.0179). O genótipo H/H apresentou maiores médias para peso aos 21 dias e para peso de lombo.
As maiores médias para consumo de ração e peso de bacon foram encontradas no genótipo
heterozigoto H/h
Os dados obtidos neste trabalho parecem indicar que o gene da leptina é candidato a uso em
programas de melhoramento. entretanto o uso em populações comerciais, em programas de MAS
(Seleção Assistida por Marcadores) deve ser testado, pois os marcadores foram desenvolvidos em
população segregante e experimental, que apresenta características genotípicas próprias,
diferentes da base genética encontrada em linhagens comerciais. Maior número de animais está
sendo testado para cada um dos polimorfismo, visando melhor caracterizar as associações
encontradas e tambem para detectar a fase de ligação entre os sítios polimórficos, possibilitando a
análise de cada haplótipo individualmente.
CONCLUSÕES
Populações segregantes F2, construídas utilizando suínos nativos brasileiros podem ser usadas
para identificação de marcadores genômicos. Marcadores genômicos obtidos em populações
experimentais, para o gene da Leptina devem ser validados antes de serem incluídos em
programas comerciais de seleção assistida por marcadores.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. CAMPFIELD, L.A., SMITH, F.J., DEVOS, R., BURN, P. R. Recombinante mouse OB protein: evidence for a
peripheral signal linking adipocity and central neural networks. Science, v.269, p. 546-549, 1995.
2. HALAAS, J.L., MAFFEI, M., COHEN, S.L. LALONE, R.L., BURLEY, S.K.. Weight-reducing effects of the
plasma protein encoded by the obese gene. Science, v.269, p. 543-546, 1995.
3. PELLEYMOUTER, M.A., CULLEN, M.J., BAKER, M.B., COLLINS, F. . Effects of the obese gene producton
body weight regulation in ob/ob mice. Science, v.269, p. 540-543, 1995.
4. PEREIRA, J.C.C, . Melhoramento Genético Aplicado à Produção Animal. – 3.ed – Belo Horizonte: FEPMVZ
Editora, 2001.p 458
5. SAS. Institut Inc.( 1998) User’ s Guide. Statistical Analysis System.1998. Cary, NC, USA.
6. SOARES, M.A M.. [Estudo do gene da obesidade e de seu receptor em suínos. Viçosa, UFV, 2001. 108p
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(Tese de doutoramento).
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