RODRIGO CAYÔ DA SILVA
Caracterização dos Mecanismos de Resistência a Cefalosporina de
Quarta Geração e a Ertapenem em Enterobacter cloacae
subespécie cloacae Isolados em Hemoculturas
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2008
RODRIGO CAYÔ DA SILVA
Caracterização dos Mecanismos de Resistência a Cefalosporina de
Quarta Geração e a Ertapenem em Enterobacter cloacae
subespécie cloacae Isolados de Hemoculturas
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos
Pignatari
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP
Co-orientador: Dr. Rodrigo Elisandro Mendes
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro
fornecido
pelo
Conselho
Nacional
para
o
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
São Paulo
2008
ii
DA SILVA, Rodrigo Cayô
Caracterização dos Mecanismos de Resistência a Cefalosporinas de
Quarta Geração e a Ertapenem em Enterobacter cloacae subespécie
cloacae Isolados de Hemoculturas. Rodrigo Cayô da Silva - São
Paulo, 2008. xx, 138f.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Characterization of the mechanisms of resistance to
Fourth-Generation Cephalosporins and Ertapenem in Enterobacter
cloacae subspecies cloacae Isolated from Blood Cultures.
Key-words: Enterobacter subespécie cloacae, resistência bacteriana,
antimicrobianos, cefalosporinas, carbapenêmicos, biologia molecular,
hemocultura.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vincenzo de Paola
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
São Paulo
2008
iv
RODRIGO CAYÔ DA SILVA
Caracterização dos Mecanismos de Resistência a Cefalosporina de
Quarta Geração e a Ertapenem em Enterobacter cloacae
subespécie cloacae Isolados de Hemoculturas
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Prof. Dr. Carlos Alberto Pires Pereira
Titular: Profa Dra Beatriz Meurer Moreira
Titular: Profa Dra Silvia Figueiredo Costa
Suplente: Profa Dra Marinês Dalla Valle Martino
Aprovada em: ___/___/___
v
....Temos que decidir apenas o que
fazer com o tempo que nos é dado.....
J.R.R. Tolkien
vi
Dedico este trabalho aos meus queridos e amados pais, Evandro e
Elizabeth, cujo amor e carinho incondicionais permitiram a
conquista desta vitória e me fizeram sentir especial e amado.
vii
Agradeço as minhas irmãs Cida, Cristina, Alessandra e Ana
Paula (in memorian), pelo apoio e palavras de incentivo constantes
e por terem preenchido a minha vida de alegria.
viii
Agradeço a DEUS, por ter dado sentido a minha vida e por ser a
força em todos os momentos.
ix
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por ter
acreditado e confiado no meu trabalho, pelo exemplo de profissional e
honestidade e por permitir o meu crescimento como microbiologista.
Ao meu co-orientador Dr. Rodrigo Elisandro Mendes, pela paciência,
dedicação e esforço em tornar este trabalho possível. Fica aqui a minha
admiração, consideração e respeito.
A Profa. Dra. Ana Cristina Gales, pelo carinho e atenção constante, por confiar
no meu trabalho, por acreditar na minha capacidade e pelo exemplo e
determinação como microbiologista.
A Juliana Bertoli, cuja tese permitiu e inspirou a realização deste estudo.
Obrigado pela gentileza e desprendimento com que aceitou que eu desse
prosseguimento ao seu trabalho.
Aos companheiros de república Patrícia, Kelly e Paulo pela amizade,
companheirismo e convivência diária. A Patrícia, minha irmã de coração,
obrigado por me agüentar todo esse tempo e por ter dividido todos os
momentos, tristes e alegres. A Kelly, obrigado pela alegria, pela descontração
que só a baiana tem e pelas palavras de incentivo. Ao Paulo, pela admirável
inteligência inata e agradável convivência.
x
A Alinne e Loren por terem me presenteado com amizade e carinho sinceros,
que me fizeram sentir tão querido. A Alinne, obrigado pelo apoio, paciência e
por me escutar e ser sempre o ombro amigo nos momentos de desânimo e
cansaço, sempre com palavras de conforto e ânimo. A Loren, obrigado pela
sua incrível personalidade, sinceridade e companheirismo. Essas palavras são
poucas para agradecer o muito que me foi oferecido por vocês.
A Kátia, Cristina, Gildo, Renata, Ana, Fábio, Laurinha, Diva e Prof. Dr.
Sérgio Tuffik do Laboratório de Biologia Molecular da AFIP, por terem me
recebido tão bem em um momento importante desta trajetória. Queria
agradecer em especial, a Kátia, pela amizade sincera, alegria, carinho e
enorme simpatia, e por ter me ajudado tanto, sempre com boa vontade e um
sorriso no rosto.
A Fernanda Inoue e Renata Picão, por terem dividido comigo todos os
momentos desta longa caminhada, principalmente durante o estágio probatório.
A Renata, pela inteligência, profissionalismo e pela personalidade admirável. A
Fernanda Inoue, pela dedicação, sinceridade e sabedoria.
A Amilton, Adryella, Ana Paula Takano, Thaís, Paula Koga e Marco Zonta
pelo companheirismo, alegria e alto astral constantes que fizeram dessa
caminhada muito mais fácil e agradável.
A Andrea e Andréia por terem me ensinado com tanto carinho e atenção as
técnicas de diluição em ágar, extração de porinas e ponto isoelétrico. A
xi
Andrea, pela alegria, pelo seu enorme conhecimento de microbiologia clínica e
por ter sempre solucionado, com muita solicitude, as minhas dúvidas durante a
realização deste trabalho.
A Fernanda Marques, Vinícius, Bruna e Paula Ignéz, pelo carinho,
responsabilidade e comprometimento na realização do PFGE. A Fernanda
pelo entusiasmo e momentos de descontração.
A Jussimara pela atenção com que sempre me tratou desde o início e em
especial pelas dicas e conselhos nos momentos finais da conclusão deste
trabalho. A Martha pelo carinho, atenção, amizade e pelas palavras sempre
gentis e otimistas. A Soraya, pelo profissionalismo, responsabilidade e pela
ajuda na interpretação dos resultados do PFGE.
Aos amigos do Laboratório ALERTA, Adriana, Anderson, Eloiza, Danilo,
Raquel, Lorena, Paula Barbosa, Cecília e Mariana pela ajuda e momentos
de descontração. Em especial gostaria de agradecer a Adriana pela amizade,
atenção e paciência.
A Jacira, por ter me recebido de braços abertos no primeiro dia no LEMC, pelo
carinho e alto astral constantes que com certeza deixou muitas saudades e
lembranças. A Rosana, pelas boas risadas e por sempre ter me ajudado em
momentos importantes e difíceis com muito carinho e atenção. A Neide, por ter
tornado o nosso ambiente sempre tão agradável.
xii
Ao Pedro e a Miriam pelos momentos compartilhados e pelas palavras de
incentivo.
As amigas do IDIPA-Laboratórios, Agda, Mirella, Renata Volpi, Ana Paula e
Roseli pela atenção e ajuda.
A Luciana, Cristiana e Priscilla, pelo convívio, ainda que curto, mas que
foram muito especiais.
A Juliana Gugel, Itacy, Gustavo e Gabriella pelo alegre convívio durante a
pós-graduação.
A todos os professores da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal
de São Paulo, pelo aprendizado e conhecimentos adquiridos ao longo deste
trajeto.
O meu muito obrigado a todos os laboratórios (Geriatria, Nefrologia,
Retrovirologia,
Infectologia
Pediátrica,
Gastropediatria,
Micologia,
Biologia Celular, Neurologia) que gentilmente cederam aparelhos para a
realização deste estudo.
Ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, carinhosamente LEMC,
por ter se tornado um segundo lar e por ter diminuído a imensa saudade da
minha família e por que não aquelas (bactérias) cuja existência e incrível
capacidade de adaptação foram o objeto deste estudo.
xiii
SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................... XVII
ÍNDICE DE TABELAS .................................................................................... XIX
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................... XX
1 - INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 3
2.1 - Agente Etiológico.................................................................................... 3
2.2 - Epidemiologia das Infecções por Enterobacter spp................................ 6
2.2.1 - Infecções da Corrente Sangüínea por Enterobacter spp. ................ 8
2.3 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por
Enterobacter spp. ......................................................................................... 10
2.3.1 - Estrutura, Mecanismo de Ação e Espectro de Atividade das
Cefalosporinas de Quarta Geração........................................................... 11
2.3.2 - Estrutura, Mecanismo de Ação e Espectro de Atividade do
Ertapenem................................................................................................. 15
2.4 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos .................................... 19
2.4.1 - Produção de β-Lactamases ........................................................... 19
2.4.1.1 - β-Lactamases Cromossomais e Plasmidiais do Tipo AmpC .... 21
2.4.1.2 - β-Lactamases de Espectro Estendido (ESβLs)........................ 24
2.4.1.3 - Metalo-β-Lactamases (MβLs) e Carbapenemases da Classe A e
D ............................................................................................................... 26
2.4.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa ...................................... 30
2.4.3 - Hiperexpressão de Bombas de Efluxo ........................................... 32
2.4.4 - Alteração de PBPs ......................................................................... 34
xiv
3 - OBJETIVOS ................................................................................................ 36
3.1 - Objetivo Geral....................................................................................... 36
3.2 - Objetivos Específicos ........................................................................... 36
4 - MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 37
4.1 - Amostras Bacterianas........................................................................... 37
4.2 - Avaliação do Perfil de Susceptibilidade ................................................ 37
4.2.1 - Preparo do Inóculo Bacteriano....................................................... 37
4.2.2 - Difusão em Disco ........................................................................... 38
4.2.3 - Diluição em Ágar............................................................................ 38
4.3 - Avaliação da Similaridade Genética pela Técnica de Pulsed-Field Gel
Electrophoresis (PFGE) ................................................................................ 39
4.4 - Avaliação dos Mecanismos de Resistência.......................................... 42
4.4.1 - Detecção Fenotípica da Produção de β-Lactamases pela
Metodologia de Aproximação em Disco .................................................... 42
4.4.2 - Teste Fenotípico de Indução de β-Lactamase do Tipo AmpC ....... 43
4.4.3 - Teste de Hidrólise Enzimática........................................................ 44
4.4.4 - PCR para a Detecção dos Genes Codificadores de β-Lactamases45
4.4.5 - Reação de Seqüênciamento e Interpretação dos Resultados ....... 47
4.4.6 - Avaliação fenotípica da expressão de Bombas de Efluxo.............. 48
4.4.7 - Avaliação do Perfil das Proteínas de Membrana Externa .............. 48
4.4.8 - Análise dos Níveis de Transcrição dos Genes ampC, ompC e ompF
pela Técnica de PCR em Tempo Real (qRT - PCR) ................................. 50
5 - RESULTADOS............................................................................................ 53
5.1 - Perfil de Susceptibilidade aos Antimicrobianos .................................... 53
5.2 - Avaliação da Similaridade Genética pela Técnica de PFGE ................ 57
xv
5.3 - Avaliação da Produção de β-lactamases.............................................. 60
5.4 - Avaliação da Hiperexpressão de Bombas de Efluxo ............................ 63
5.5 - Avaliação do Perfil das Proteínas de Membrana Externa..................... 64
5.6 - Avaliação do taxa de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF ..... 65
6 - DISCUSSÃO ............................................................................................... 67
7 - CONCLUSÕES ........................................................................................... 86
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 88
9 - RESUMO .................................................................................................. 133
10 - ABSTRACT ............................................................................................. 135
11 - ANEXO.................................................................................................... 137
xvi
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIM - Australian Imipenemase
ATCC - American Type Cuture Collection
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
DHP-I - Deidropeptidase - I
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético
ESβL - Extended Spectrum β-Lactamase
GES - Guiana Extended Spectrum
GIM - German Imipenemase
HSP - Hospital São Paulo
IMI - Imipenem-hydrolysing β-Lactamase
IMP - Imipenemase
IS - Insertion Sequence
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
MβL - Metalo-β-Lactamase
MDR - Multi-Drug-Resistance
NMC-A - Not Metalloenzyme Carbapenemase
OMP - Outer Membrane Protein
OXA - Oxacilinase
PAβN - Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide
PBP - Penicillin Binding Protein
PCR - Polymerase Chain Reaction
xvii
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction
RND - Resistance-Nodulation-Division
SDS - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SFC - Serratia fonticola Carbapenemase
SIM - Seul Imipenemase
SME - Serratia marcescens enzyme
SPM - São Paulo Metallo-β-Lactamase
TBE - Tris-Borato-EDTA
TSB - Tryptone Soya Broth
UFC - Unidade formadora de colônia
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
UV - Ultravioleta
VIM - Verona Imipenemase
xviii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Nomeclatura, sítio de isolamento e significância clínica das espécies
de Enterobacter spp.................................................................................................. 4
Tabela 2 - Gene alvo e oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a
detecção dos genes codificadores de β-lactamases................................................. 46
Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a quantificação dos
genes ampC, ompC e ompF pela técnica de qRT-PCR...........................................
50
Tabela 4 - Perfil de susceptibilidade entre os isolados de E. cloacae pela técnica
de difusão em disco..................................................................................................
54
Tabela 5 - Perfil de susceptibilidade aos β-lactâmicos entre os isolados de E.
cloacae pela técnica de diluição em ágar.................................................................
55
Tabela 6 - Comparação dos resultados para ertapenem entre as metodologias de
difusão em disco e diluição em ágar......................................................................... 56
.
Tabela 7 - Similaridade genética e unidade hospitalar de acordo com a data de
isolamento das amostras de E. cloacae.................................................................... 59
Tabela 8 -. Resultados para a produção de β-lactamases e presença de integrons
obtidos pela técnica de PCR e seqüênciamento entre as amostras de E.
cloacae...................................................................................................................... 62
Tabela 9 - Detecção fenotípica da hiperexpressão de sistemas de efluxo
utilizando os inibidores PAβN e reserpina................................................................
64
Tabela 10 - Análise dos níveis de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF
pela técnica de qRT-PCR.........................................................................................
xix
66
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da cefepima................................................................ 12
Figura 2 - Comparação das estruturas químicas dos carbapenêmicos..................
15
Figura 3 - Placa modelo utilizada para a detecção fenotípica da produção de
ESβL ........................................................................................................................ 42
Figura 4 - Placa modelo utilizada para a detecção fenotípica da indução de
AmpC.......................................................................................................................
43
Figura 5 - Perfil de PFGE das amostras de E. cloacae........................................... 57
Figura 6 - Dendograma demonstrando o coeficiente de similaridade entre os
isolados de E. cloacae pelo programa BioNumerics................................................ 58
.
Figura 7 - Diferentes resultados positivos obtidos no teste de aproximação em
disco para a detecção fenotípica de ESβL entre os isolados de E. cloacae............ 60
Figura 8 -. Sinergismo entre o disco de imipenem e ceftazidima obtidos no teste
de indução de AmpC entre os isolados de E. cloacae............................................
61
Figura 9 - Perfil das proteínas de membrana externa (porinas) dos isolados de E.
cloacae pela técnica de SDS-PAGE........................................................................
xx
65
INTRODUÇÃO
1 - INTRODUÇÃO
Diferentes patógenos podem causar infecções nosocomiais, no entanto,
Enterobacter spp., especialmente Enterobacter cloacae subespécie cloacae,
doravante denominado no presente estudo de E. cloacae, vem adquirindo
grande importância, tornando-se um dos principais causadores de infecções
nosocomiais. As infecções associadas a estes microrganismos estão
relacionadas a uma maior morbidade, hospitalização prolongada e aumento
significativo no custo da internação.
A rapidez com que isolados de Enterobacter spp. adquirem resistência
aos antimicrobianos durante a terapia, tem se tornado cada vez mais um
desafio clínico. A constelação de mecanismos expressos por esses
microrganismos, que incluem produção de AmpC cromossomal, β-lactamases
de espectro estendido (ESβL) e recentemente a produção de metalo-βlactamases (MβL) associado a impermeabilidade de membrana externa e
hiperexpressão de bombas de efluxo, tem levado ao fenômeno de
multirresistência.
Entre as opções terapêuticas disponíveis para o tratamento de infecções
causadas por Enterobacter spp. encontram-se as cefalosporinas de quarta
geração e os carbapenêmicos, devido a sua grande estabilidade frente a
maioria das enzimas produzidas pelas bactérias Gram-negativas. Entretanto, a
emergência da resistência a estas drogas, principalmente aos carbapenêmicos,
tem restringido cada vez mais o arsenal antimicrobiano contra estes
microrganismos.
1
INTRODUÇÃO
A resistência bacteriana aos antimicrobianos tem dificultado muito o
tratamento das infecções, especialmente às adquiridas em ambiente hospitalar.
O uso desnecessário de drogas sem critérios definidos e sem análise
adequada das relações custo/benefício potencializa o surgimento de novas
resistências. Apesar de evidências indicarem que estratégias desenvolvidas
com o objetivo de reduzir o desenvolvimento da resistência bacteriana, tais
como a racionalização do uso e o rodízio de antimicrobianos, quando utilizadas
corretamente têm sido efetivas, o número de bactérias multirresistentes tem
crescido a cada dia.
Combater o uso indiscriminado de antimicrobianos e incentivar a
administração correta, por tempo adequado, tem sido um desafio permanente.
Medidas para diminuir a resistência bacteriana são fundamentais para qualquer
instituição. Para isso, se fazem necessários estudos que visem entender quais
os mecanismos estão envolvidos não somente na resistência bacteriana, como
também na diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos, além do impacto
da associação entre esses mecanismos.
Uma melhor compreensão sobre o problema da resistência aos
antimicrobianos em E. cloacae pode proporcionar melhores oportunidades de
tratamento, uma vez que o retardo na adequação da terapia está associado ao
aumento da letalidade, sobretudo em infecções nosocomiais. Sendo assim, o
presente estudo foi planejado com o intuito de caracterizar os principais
mecanismos de resistência a cefalosporina de quarta geração e a ertapenem
em E. cloacae isolados de hemoculturas no Hospital São Paulo.
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - Agente Etiológico
Os bacilos Gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae
constituem um grupo de microrganismos freqüentemente isolado de amostras
biológicas. Distribuídos amplamente na natureza, esses microrganismos são
encontrados no solo, água, plantas e no trato intestinal de seres humanos e
animais. Além disso, os membros dessa família podem estar relacionados a
qualquer tipo de processo infeccioso, podendo causar infecções até mesmo em
indivíduos hígidos, embora os pacientes imunocomprometidos ou debilitados
sejam os mais susceptíveis a adquirirem essas infecções, principalmente no
ambiente hospitalar (Konemam et al., 2001).
O gênero Enterobacter pertence à família Enterobacteriacea e pode ser
facilmente diferenciado do gênero Klebsiella por serem bacilos Gram-negativos
móveis, usualmente ornitina descarboxilase-positivas e urease negativas
(Sanders & Sanders, 1997). Como muitas cepas do gênero Enterobacter
produzem grandes quantidades de gás, durante muitos anos a espécie tipo foi
denominada Aerobacter aerogenes. A designação de gênero foi modificada
para Enterobacter por Edwards e Ewing, em 1962 (Konemam et al., 2001).
Devido à heterogeneidade genética dentro do gênero Enterobacter,
mudanças taxonômicas ocorrem freqüentemente neste grupo (Abbott, 2007).
Atualmente, o gênero Enterobacter inclui 18 espécies ou biogrupos de acordo
com a mais recente edição do Manual of Clinical Microbiology (Abbott, 2007) e
estão descritas na Tabela 1.
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1. Nomenclatura, sítio de isolamento e significância clínica das
espécies de Enterobacter spp..a
Designação Atual (Prévia)
E. aerogenes
Freqüência
Dados Clínicos
Sítio de
Significância
Infecção
++++
1
Todos os sítios
E. amnigenus biogrupo 1
E. amnigenus biogrupo 2
-
E. asburiae
++
Trato urinário,
trato respiratório,
fezes, pele e
sangue
E. cancerogenus (E. taylorae)
++
Pele, trato
respiratório, fezes
E. cloacae subsp. cloacae (E.
cloacae)
E. cloacae subsp. dissolvens (E.
dissolvens)
++++
Todos os sítios
Fonte
Ambiental
Água, solo,
esgoto, animais
e laticínios
Plantas
Água
2
Água
2
Animais e Água
1
-
Água, solo,
esgoto e carne
Doença do
caule do milho
Desconhecida
Trato urinário,
trato respiratório,
sangue e pele
3
Desconhecida
E. gergoviae
++
Trato respiratório,
trato urinário e
sangue
2
Água e
cosméticos
E. hormaechei subsp. Hormaechei
(E. hormaechei)
++
Trato respiratório,
pele e sangue
1
E. hormaechei subsp. oharae
E. hormaechei subsp. steigerwaltii
E. kobei
++
++
Desconhecida
E. ludwigii (E. cloacae)
Desconhecida
E. cowanii (P. agglomerans)
E. nimipressuralis (Erwinia)
-
E. pyrinus (Erwinia)
-
E. radicincitans
-
E. sakazakii
++
Todos os sítios
Todos os sítios
Desconhecido
Trato urinário,
trato respiratório,
sangue e fezes
1
1
Desconhecida
Desconhecido um isolado de
sapo
Plantas
Plantas
Alimentos
2
Alimentos
Doença do
Olmo
Doença das
Pereiras
Filosfera do
trigo de inverno
Trato respiratório,
pele e fluído
cérebro-espinhal
1
Desconhecida
a
Abreviações e símbolos: ++++, freqüente; ++, raro; -, não foi isolado em humanos; 1, principal
espécie patogênica ao homem; 2, raros casos de doença comprovada; 3, isolado de humanos,
significância desconhecida. Negrito indica sítios de infecção mais comuns. (Adaptado do livro
Manual of Clinical Microbiology, 9º ed - Abbott, 2007).
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Duas novas espécies, Enterobacter radicincitans isolada em plantas e
Enterobacter ludwigii isolada em humanos, foram incluídas no gênero
Enterobacter. Dois outros clusters de organismos previamente incluídos no
complexo Enterobacter cloacae são agora subespécies de Enterobacter
hormaechei. Cepas anteriormente identificadas como E. hormaechei são agora
subespécie hormaechei, e as outras duas novas subespécies criadas são
subespécie oharae e subespécie steigerwaltii. Todas as três subespécies foram
isoladas em plantas ou de diferentes sítios em humanos. Enterobacter
intermedius, que apresentou similaridade genética com Kluyvera cochleae
através do seqüênciamento do rRNA 16S, foi transferido para o gênero
Kluyvera, sendo designado Kluyvera intermedia. Enterobacter dissolvens é
agora E. cloacae subespécie dissolvens e cepas identificadas anteriormente
como E. cloacae são agora E. cloacae subespécie cloacae. E. cloacae
permanece uma espécie heterogênica com diversos grupos de DNA residindo
dentro dela, e assim como em Pantoea agglomerans, esses grupos
permanecem sem nomenclatura, uma vez que eles não são separados por
testes fenotípicos (Abbott, 2007).
Entre as espécies de Enterobacter descritas como sendo capazes de
causar doença em humanos, E. cloacae e Enterobacter aerogenes são de
longe as espécies mais freqüentemente isoladas, seguidas por Enterobacter
sakazakii. As duas primeiras podem ser facilmente diferenciadas pelos testes
da lisina e arginina e E. sakazakii pela inabilidade em fermentar o D-sorbitol
além da produção de um pigmento amarelo. As demais espécies patogênicas
como Enterobacter gergoviae e Enterobacter asburiae raramente são isoladas
de espécimes clínicos (Sanders & Sanders, 1997; Abbott, 2007).
5
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
E. cloacae e E. aerogenes encontram-se amplamente distribuídas na
água, esgoto, solo, vegetais e fazem parte da microbiota entérica comensal
(Konemam et al., 2001; Abbott, 2007). Essas espécies estão associadas a uma
variedade de processos infecciosos que afetam o trato urinário (Johansen et
al., 2006), trato respiratório (Jastrzebski et al., 2003), pele e tecidos moles
(Breathnach et al., 2006), ossos e juntas (Westbloom & Coggins, 1987),
sistema nervoso (Gallagher & Ball, 1991), além de bacteremia (Kang et al.,
2004) e meningite (Kim & Park et al., 2007).
2.2 - Epidemiologia das Infecções por Enterobacter spp.
Enterobacter spp. tem emergido como um dos principais patógenos,
principalmente E. cloacae, e esses microrganismos tem sido implicados em
uma gama de síndromes clínicas, ocasionalmente mimetizando aquelas
tradicionalmente associadas com outros agentes infecciosos mais fáceis de
serem tratados. Embora infecções adquiridas na comunidade possam ocorrer,
a maioria das infecções causadas por este microrganismo é nosocomial. Estas
infecções podem ser adquiridas tanto de fontes endógenas como de fontes
exógenas, devido a natureza ubíqua deste microrganismo (Sanders & Sanders,
1997).
Surtos por Enterobacter spp. são freqüentemente reportados em
unidades pediátricas, unidades de terapia intensiva, unidades de queimados,
unidades oncológicas e, geralmente, estão relacionados com soluções
intravenosas
contaminadas,
derivados
do
sangue,
água
destilada,
endoscópios, mãos de profissionais de saúde, água para hidroterapia,
estetoscópios, swabs de algodão, soluções lipídicas e instrumentos usados
6
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
para monitorar a pressão intra-arterial (Gonçalves et al., 2000; Stenhouse,
1992; Struelens et al., 1993; Thomas et al., 1993; Mirza et al., 1994; Wagner et
al., 1994; Kuboyama et al., 2003; Dantas et al., 2006). Entretanto, a maioria das
infecções causadas por Enterobacter spp. adquiridas no ambiente hospitalar
estão relacionadas a uma fonte endógena através da colonização prévia do
trato gastrintestinal e de outros sítios (Sanders & Sanders, 1997).
Os principais fatores de risco associados à aquisição de infecções por
Enterobacter spp. são: hospitalização prolongada, principalmente em UTI;
doença de base grave, especialmente processos oncológicos, queimaduras e
diabetes; imunossupressão por qualquer causa; prematuridade ou baixo peso
ao nascer e uso de procedimentos invasivos (catéter venoso central, tubos
endotraqueais e cateteres urinários) (Sanders & Sanders, 1997). Além disso, o
fator individual mais freqüentemente associado ao aumento do risco de
aquisição de infecção por Enterobacter spp. é o uso prévio de antimicrobianos,
principalmente cefalosporina de amplo espectro (Lee et al., 2002; Ye et al.,
2006).
Uma análise da freqüência dos principais patógenos de acordo com o
programa SENTRY no período de janeiro de 1997 a dezembro de 2006 na
América Latina demonstrou que E. cloacae foi o sexto patógeno mais comum
isolado de infecções da corrente sangüínea (3,74% de todos os isolados), mas
também o sexto patógeno mais comum em infecções do trato urinário (2,19%),
o oitavo de infecções do trato respiratório (3,09%) e o sétimo de infecções de
pele e tecido moles (4,11%) (Cayô et al., 2007). Desde que pacientes em
unidades de cuidados especiais apresentam maior risco de aquisição de
infecções por Enterobacter spp., estas unidades devem ser analisadas
7
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
separadamente dos demais setores do hospital para a análise do aumento da
importância desses microrganismos como patógenos nosocomiais (Sanders &
Sanders, 1997). Dessa forma, E. cloacae foi o sexto mais isolado em unidades
pediátricas (3,54%) e o oitavo mais isolado em unidades de terapia intensiva
(3,59%). A freqüência de E. aerogenes variou de décimo primeiro (trato
respiratório) a décimo quinto patógeno mais comum em isolados de infecções
de pele e tecido moles e infecções do trato urinário (Cayô et al., 2007).
2.2.1 - Infecções da Corrente Sangüínea por Enterobacter spp.
De todas as síndromes clínicas, as infecções da corrente sangüínea têm
sido estudadas mais freqüentemente e com grande interesse, sendo
importantes causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Essas
infecções estão entre as dez causas de morte mais freqüentes nos Estados
Unidos e estima-se que ocorram aproximadamente 250.000 casos de infecções
da corrente sanguínea nosocomiais anualmente (Wenzel, 2002). De acordo
com estudos recentes a incidência dessas infecções varia de 1% em unidades
de terapia intensiva (Warren et al., 2001) a 36% em transplantados de medula
óssea (Collin et al., 2001).
As taxas de bacteremia são em torno de 1/1000 admissões em hospitais
universitários ou terciários, sendo de duas a três vezes maiores em unidades
especializadas, tais como unidades oncológicas, e de duas a três vezes
menores em hospitais comunitários. Embora as taxas sejam baixas na
comunidade, o problema é significante e crescente (Sanders & Sanders, 1997).
Bacteremia por Enterobacter spp. ocorre mais comumente em homens
em uma proporção de 1,3 a 2,5:1,0, sendo o sexo predominante tanto em
8
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
crianças como em adultos, e, como na maioria das bacteremias, ocorre mais
freqüentemente em extremos de idade, ou seja, em neonatos e idosos. E.
cloacae é a espécie mais predominante (46-91% dos isolados) seguido por E.
aerogenes (9-43%). Entre as bacteremias causadas por Enterobacter spp., 14
a 53% destas são polimicrobianas (Sanders & Sanders, 1997).
Dados do programa SENTRY demonstram que Enterobacter spp. foi o
quinto patógeno mais comum em infecções da corrente sangüínea no período
de 1997 a 1999 no Brasil (Sader et al., 2001) e o sétimo mais freqüente neste
sítio de infecção nos hospitais europeus (Fluit et al., 2001).
Acredita-se que infecções causadas por isolados de Enterobacter spp.
resistentes aos antimicrobianos, principalmente as infecções da corrente
sangüínea, resultam em uma alta mortalidade, hospitalização prolongada e
conseqüentemente um aumento nos custos com o paciente quando comparado
com isolados sensíveis (Chow et al., 1991; Cosgrove et al., 2002; Kang et al.,
2004). Entretanto, Blot e colaboradores (2002) relataram que a resistência
antimicrobiana em bacteremias nosocomiais causadas por bactérias Gramnegativas, incluindo Enterobacter spp. não afeta o seguimento clínico em
pacientes críticos. Fatores que poderiam estar associados a uma maior
mortalidade entre esses pacientes seriam as condições clínicas e a severidade
da doença de base (Kim et al., 2003; Kang et al., 2004; Lin et al., 2006), a
terapia empírica inadequada (Ye et al., 2006), o atraso na adequação da
terapia e remoção do foco infeccioso, além de fatores como virulência e
resistência (Lee et al., 2002; Kang et al., 2004) do patógeno causador da
infecção.
9
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Alguns estudos têm demonstrado que o uso prévio de cefalosporinas de
amplo espectro (terceira geração) é um fator de risco para infecção da corrente
sangüínea por Enterobacter spp. (Lee et al., 2002; Kang et al., 2004; Ye et al.,
2006), além de propiciar a emergência da resistência a estes agentes (Kaye et
al., 2001).
O uso da associação entre aminoglicosídeos e cefalosporinas de amplo
espectro seria uma opção no tratamento de bacteremias por Enterobacter spp.
com a finalidade de evitar o surgimento da resistência às cefalosporinas.
Entretanto, os dados na literatura permanecem controversos (Chow et al.,
1991; Jacobson et al., 1995; Kaye et al., 2001). Outra possibilidade seria a
associação entre quinolonas e cefalosporinas de amplo espectro. Embora Kaye
e colaboradores (2001) tenham demonstrado que essa associação pode levar
a uma redução do risco para a emergência de resistência às cefalosporinas em
Enterobacter spp., alguns autores relatam que a exposição prévia às
fluoroquinolonas está relacionado ao isolamento de organismos resistentes a
essas drogas (White et al., 1997; Talon et al., 2000).
2.3 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções
por Enterobacter spp.
As opções terapêuticas disponíveis para o tratamento de infecções
causadas por Enterobacter spp. incluem penicilinas, cefalosporinas de terceira
e quarta geração, aztreonam, carbapenêmicos e fluoroquinolonas. Os
aminoglicosídeos são freqüentemente utilizados em regimes combinados aos
β-lactâmicos na tentativa de se evitar o desenvolvimento de resistência
10
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
bacteriana. A monoterapia com aminoglicosídeos é raramente utilizada
(Hardman et al., 2000).
2.3.1 - Estrutura, Mecanismo de Ação e Espectro de Atividade
das Cefalosporinas de Quarta Geração
Desde a sua introdução na prática clínica na década de 60, as
cefalosporinas têm se tornado importantes agentes dentro da terapêutica
antimicrobiana
com
uso
disseminado
devido
as
suas
atividades
farmacocinéticas favoráveis (Marshall & Blair, 1999). Ao longo dos anos,
modificações na estrutura básica levaram a evolução das gerações das
cefalosporinas, as quais são classificadas de acordo com o espectro de
atividade (Fung-Tomc, 1997).
As cefalosporinas de primeira geração apresentam boa atividade contra
organismos
Gram-positivos.
As
cefalosporinas
de
segunda
geração
apresentam uma atividade melhorada contra patógenos Gram-negativos e
alguma cobertura contra anaeróbicos. Algumas cefalosporinas de terceira
geração apresentam boa atividade contra patógenos Gram-negativos, incluindo
Pseudomonas aeruginosa, mas possuem uma fraca atividade contra patógenos
Gram-positivos. Por outro lado, outras cefalosporinas de terceira geração não
são ativas contra P. aeruginosa, mas apresentam boa atividade contra
patógenos Gram-positivos. Nota-se que as primeiras gerações apresentam
atividade limitada tanto contra organismos Gram-positivos como Gramnegativos (Kessler, 2001).
As cefalosporinas de quarta geração (cefepima e cefpiroma) não
possuem os problemas apresentados pelas primeiras gerações. Elas
11
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
demonstram boa atividade tanto contra patógenos Gram-negativos como
Gram-positivos. A cefepima, também conhecida como Maxipime®, Maxcef®,
Cepimax® e Cepimex® é uma cefalosporina parenteral e difere das
cefalosporinas de terceira geração por apresentar um nitrogênio quaternário
(N-metilpirrolidina) carregado positivamente na posição 3 (Figura 1) do núcleo
das cefalosporinas, dando a ela uma propriedade de zwitterion, moléculas que
apresentam pólos positivos e negativos (Okamoto et al., 1994; Kessler, 2001).
Esta mudança é responsável pelo aumento da permeabilidade da cefepima
através da membrana plasmática das bactérias Gram-negativas, sendo de 5 a
6 vezes maior quando comparada às cefalosporinas de terceira geração (Sader
& Jones, 1995). O grupo 2-aminotiazolil-acetamida na cadeia ao lado da
posição 7 com uma substituição alfa-oximino (Figura 1) aumentou a
estabilidade contra β-lactamases, prevenindo que essas enzimas se liguem ao
núcleo central. As vantagens estruturais da cefepima renderam a molécula um
aumento na sua afinidade pelas PBPs (Penicillin-Binding Proteins), que são o
sítio alvo das cefalosporinas (Okamoto et al., 1994; Kessler, 2001).
Figura 1. Estrutura química da cefepima (adaptado do artigo de Kessler, 2001).
12
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As cefalosporinas, como os demais β-lactâmicos agem interferindo na
síntese do peptídeoglicano, que é um componente essencial da parede celular
bacteriana. A atividade da cefepima, como de todos os β-lactâmicos, é
dependente de sua afinidade pelos membros de uma série de enzimas
(transpeptidases ou PBPs) envolvidas na síntese do peptídeoglicano, e fatores
que influenciam o acesso a estas enzimas. A ligação covalente entre o grupo
amida presente no anel β-lactâmico das cefalosporinas e as PBPs fazem com
essas enzimas se tornem inativas, conseqüentemente inibindo a síntese da
parede celular bacteriana (Fontana et al., 1996).
A cefepima se liga com grande afinidade a PBP 3 das bactérias Gramnegativas, mas de alguma forma única ela também se liga com uma relativa
alta afinidade a PBP 2. A ligação as PBPs 1A e 1B tem sido observada em
concentrações facilmente alcançadas em tecidos humanos (Fontana et al.,
1996). Alta afinidade por mais de uma dessas três classes de PBPs de alto
peso molecular está associada a uma rápida morte bacteriana (Fontana et al.,
1996; Gould, 1999).
A carga positiva na posição 3 orienta a molécula de cefepima de tal
forma que ela consegue passar pelas porinas, que são proteínas de membrana
externa, mais rapidamente. Uma penetração mais rápida permite uma maior
concentração do antimicrobiano no espaço periplásmico das bactérias Gramnegativas, aumentando o acesso as PBPs (Hancock & Bellido, 1992; Nikaido et
al., 1990; Hancock & Bellido, 1996; Gould, 1999).
A cefepima apresenta atividade in vitro similar a cefotaxima e ceftriaxona
contra
Staphylococcus
aureus
sensíveis
a
oxacilina
e
Streptococcus
pneumoniae sensível, intermediário e resistente às penicilinas. Apresenta
13
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
também boa atividade similar àquela apresentada pela ceftazidima contra
patógenos Gram-negativos, incluindo P. aeruginosa. Não apresenta atividade
contra Enterococcus faecalis, Clostridium difficile, S. aureus resistentes a
oxacilina (ORSA) e apresenta pouca atividade contra as espécies de
Bacteroides (Okamoto et al., 1994; Chapman & Perry, 2003). Este
antimicrobiano é estável contra a maioria das β-lactamases mediadas por
cromossomo ou plasmídeos, e é pouco indutor de AmpC. Como resultado,
cefepima mantém atividade contra enterobactérias que são resistentes as
cefalosporinas de terceira geração, como os mutantes desreprimidos de
Enterobacter spp, sendo uma das drogas de escolha utilizadas no tratamento
das infecções causadas por este patógeno. Além disso, cefepima pode ser
hidrolisada pelas β-lactamases de espectro estendido - ESβLs, mas em uma
freqüência bem menor do que as cefalosporinas de terceira geração (Cunha &
Gil, 1995; Chapman & Perry, 2003).
Com as doses diárias usuáis, a cefepima tem demonstrado bons
resultados no tratamento de infecções do trato respiratório inferior, infecções
urinárias, infecções de pele e tecidos moles, e em infecções severas, incluindo
aquelas associadas a bacteremia (Barradell & Bryson, 1994; Cunha & Gil,
1995; Wynd & Paladino, 1996). Ela apresenta também uma tolerabilidade
similar às demais cefalosporinas parenterais, e os efeitos adversos mais
comuns são: dor de cabeça (2,4%), náusea (1,8%), rash (1,8%) e diarréia
(1,7%) (Barradell & Bryson, 1994; Okamoto et al., 1994).
A neurotoxicidade associada com cefepima é outro evento adverso
conhecido, mas possivelmente subestimado em pacientes com distúrbios
renais (Abanades et al., 2004; Bragatti et al., 2005; Lam & Gomolin, 2006),
14
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
embora já tenha sido relatado também em indivíduos com função renal normal
(Maganti et al., 2006). Mesmo sendo um quadro severo, a maioria dos casos é
reversível após a retirada do antimicrobiano.
2.3.2 - Estrutura, Mecanismo de Ação e Espectro de Atividade
do Ertapenem
Os β-lactâmicos tem sido amplamente prescritos no tratamento de
infecções nos últimos 60 anos devido a sua excelente eficácia, segurança e
tolerabilidade. Entre as diferentes classes de β-lactâmicos, a classe dos
carbapenêmicos é a mais potente e a que apresenta o mais amplo espectro de
atividade antimicrobiana. Atualmente quatro carbapenêmicos estão disponíveis
para o uso clínico: imipenem, meropenem, ertapenem e recentemente o
doripenem (Zhanel et al., 2007; Nicolau, 2008). As estruturas químicas do
imipenem, meropenem e ertapenem estão demonstradas na Figura 2.
a.
Radical Trans-1hidroxietil
Radical 1β-metil
b.
c.
Substituição metaácido benzóico
Figura 2. Comparação das estruturas químicas dos carbapenêmicos: a. imipenem, b.
meropenem, c. ertapenem (adaptado dos artigos de Shah & Issacs, 2003 e Hammond, 2004).
15
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Imipenem, o primeiro carbapenêmico utilizado na prática clínica, é coadministrado com cilastatina, um inibidor da deidropeptidase-I (DHP-I), enzima
humana localizada nos túbulos renais capaz de inativar o imipenem (Zhanel et
al., 2007). Os demais carbapenêmicos desenvolvidos subseqüentemente
(meropenem, ertapenem e doripenem) apresentam um radical 1β-Metil (Figura
2b-c), que protege o grupo carbonil β-lactâmico reduzindo assim a hidrólise
catalisada pela DHP-I. Dessa forma esses agentes são administrados sem a
associação com a cilastatina (Hammond, 2004).
A estabilidade dos carbapenêmicos frente às β-lactamases é devida
primariamente ao radical trans-1-hidroxietil e a sua justaposição única no grupo
carbonil β-lactâmico (Figura 2a-c). Diferente das penicilinas e cefalosporinas
que apresentam um radical cis na posição correspondente, o radical trans-1hidroxietil nos carbapenêmicos se estende abaixo do plano do anel β-lactâmico
(Hammond, 2004).
As β-lactamases, que contém um resíduo de serina no sítio ativo, utiliza
a reatividade química intrínseca dos β-lactâmicos para inativá-los. A enzima
associa-se não covalentemente ao anel β-lactâmico, e então o radical hidroxila
livre do resíduo de serina presente no sítio ativo da enzima ataca o anel βlactâmico, formando uma ligação covalente acil-éster. A hidrólise do éster
formado libera a enzima ativa e os antimicrobianos hidrolisados e inativados
(Livermore, 1995). O radical trans-1-hidroxietil retira a molécula de água do
sítio ativo necessária para uma hidrólise enzimática eficiente, estabilizando a
enzima acilada e inativa. Entretanto, a capacidade dos carbapenêmicos de
manterem a estabilidade frente as β-lactamases não se estende as
16
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
carbapenemases, entre elas as metalo-β-lactamases (MβLs) (Hammond,
2004).
O ertapenem (Invanz®) é um carbapenem 1-β-metil administrado como
agente único tanto pela via intravenosa como intramuscular (Shah & Isaacs,
2003). Embora o ertapenem mantenha as características dos carbapenêmicos
anteriores, ele difere dos demais membros da classe pela inclusão de uma
substituição meta de um radical de ácido benzóico (Figura 2c). Esta
substituição possui um papel chave nas propriedades antibacterianas e
farmacológicas do ertapenem. Com essa mudança, o anel aromático aumentou
de peso molecular (497 daltons) e na lipofilicidade da molécula, e o ácido
carboxílico, ioniza a molécula a um pH fisiológico, resultando na carga negativa
apresentada pelo ertapenem. Isto resultou em um composto que se liga mais
facilmente às proteínas do plasma humano quando comparados aos
carbapenêmicos anteriores. Por exemplo, o ertapenem apresenta uma ligação
de aproximadamente 95% as proteínas do plasma contra 20% do imipenem
(Hammond, 2004). Este aumento na ligação as proteínas do plasma permite a
administração de uma dose única diária de 1g de ertapenem comparado as
três e quatro doses diárias usadas para o meropenem e imipenem,
respectivamente (Cunha, 2002; Livermore et al., 2003).
Ertapenem é rapidamente bactericida. Em Escherichia coli, ertapenem
se liga as PBPs 1a, 1b, 2, 3, 4 e 5, tendo alta afinidade pelas PBPs 2 e 3 (Shah
& Isaacs, 2003). Similar ao imipenem e meropenem, ertapenem apresenta uma
ampla atividade antimicrobiana, incluindo patógenos Gram-positivos e Gramnegativos aeróbicos e anaeróbicos. Em contraste aos carbapenêmicos
anteriores, o ertapenem apresenta atividade limitada contra P. aeruginosa e
17
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Acinetobacter spp., além de não apresentar atividade contra Enterococcus spp.
e Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) (Livermore et al.,
2003; Zhanel et al., 2005).
O uso parenteral do ertapenem está aprovado e tem um papel
importante
no
tratamento
de
pneumonias
adquiridas
na
comunidade
associadas a patógenos típicos e de particular valor no tratamento de infecções
polimicrobianas, tais como infecções intra-abdominais complicadas, infecção
pélvica aguda, infecções complicadas de pele e tecidos moles e infecções
urinárias complicadas, especialmente aquelas onde enterobactérias e bactérias
anaeróbicas estão envolvidas (Keating & Perry, 2005; Burkhardt et al., 2007).
Os efeitos adversos mais comuns associados ao ertapenem são diarréia,
complicações devido à infusão, náusea, dor de cabeça, vaginites, flebites ou
tromboflebites e vômitos (Curran et al., 2003).
Está claro que os carbapenêmicos não podem mais ser considerados
como uma classe homogênea. Pensando nisso, Shah & Isaacs (2003)
propuseram uma nova classificação para os carbapenêmicos, baseada no
espectro microbiológico. Estão incluídos no grupo 1 os carbapenêmicos com
limitada atividade contra os não fermentadores, e indicados para o tratamento
de infecções comunitárias. O ertapenem é o único membro deste grupo até o
momento. O grupo 2 abrange os carbapenêmicos com atividade contra os não
fermentadores e, portanto indicados para o tratamento de infecções
nosocomiais. Pertencem a este grupo o imipenem, meropenem e recentemente
o doripenem, que apresenta uma melhor atividade contra P. aeruginosa
quando comparado ao imipenem e meropenem (Jones et al., 2004). O grupo 3
inclui
os
carbapenêmicos
com
atividade
contra
os
MRSA.
Nenhum
18
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
carbapenêmico com esse espectro de ação está aprovado para uso em
humanos.
2.4 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos
Os β-lactâmicos são os agentes antimicrobianos mais freqüentemente
utilizados na prática médica. A resistência a esses agentes dramaticamente
dificulta o tratamento e aumenta a morbidade e os custos com o paciente
(Charrel et al., 1996). A resistência bacteriana aos β-lactâmicos pode estar
relacionada com qualquer uma das etapas envolvidas no mecanismo de ação
desses antimicrobianos, sendo três os mecanismos básicos descritos: I degradação do antimicrobiano pela produção de β-lactamases; II - diminuição
da concentração do antimicrobiano relacionado à impermeabilidade de
membrana externa ou pela hiperexpressão de bombas de efluxo; III - alteração
do sito alvo (PBPs).
2.4.1 - Produção de β-Lactamases
A emergência da resistência aos β-lactâmicos começou antes mesmo do
primeiro β-lactâmico, a penicilina, ser desenvolvido (Bradford, 2001). A primeira
β-lactamase foi identificada em E. coli antes do desenvolvimento da penicilina
para uso na prática clínica (Abraham & Chain, 1988). As β-lactamases são a
principal causa de resistência bacteriana aos β-lactâmicos e tem sido objeto de
extensas investigações microbiológicas, bioquímicas e genéticas (Bush et al.,
1995).
19
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As β-lactamases são enzimas que catalisam a hidrólise do anel βlactâmico,
tornando-os
inativos,
podendo
estar
localizadas
no
DNA
cromossômico bacteriano, ou em plasmídeos ou transposons. Algumas dessas
enzimas utilizam íons de zinco como cofatores enzimáticos, enquanto a grande
maioria opera via produção de ésteres de serina (Livermore, 1995). A
quantidade de enzima produzida, a habilidade dessa enzima em hidrolisar o βlactâmico e a velocidade com que o antimicrobiano penetra na célula são
fatores que irão influenciar no nível da resistência. Essas enzimas são
produzidas por inúmeras espécies bacterianas, tanto Gram-positivas como
Gram-negativas, diferindo quanto as suas estruturas e localizações. Nas
bactérias Gram-positivas, as β-lactamases são secretadas no meio extracelular
e, portanto são menos ativas que as enzimas produzidas pelas bactérias Gramnegativas, que se encontram estrategicamente no espaço periplásmico, onde
podem alcançar altas concentrações agindo de modo mais eficaz sobre os βlactâmicos, antes desses atingirem o seu sítio alvo, as PBPs (Livermore, 1993).
Nos últimos 20 anos, novos antimicrobianos resistentes a ação
hidrolítica das β-lactamases têm sido desenvolvidos. Entretanto, com o uso
clínico de cada nova classe, novas β-lactamases emergem causando
resistência a estes antimicrobianos. Presumidamente, a pressão seletiva do
uso indiscriminado de novos antimicrobianos no tratamento de infecções tem
selecionado novas variantes de β-lactamases (Bradford, 2001).
Embora novas β-lactamases têm sido descobertas nos últimos anos, a
classificação proposta por Bush, Jacoby e Medeiros (1995) ainda é a mais
utilizada, combinando aspectos estruturais e funcionais das β-lactamases.
Outra importante classificação é aquela descrita por Ambler (1980), na qual as
20
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
β-lactamases foram agrupadas em 4 classes (A, B, C e D), levando em
consideração as suas seqüências de aminoácidos.
2.4.1.1 - β-Lactamases Cromossomais e Plasmidiais do Tipo
AmpC
As β-lactamases do tipo AmpC pertencem ao grupo 1 de Bush (Bush et
al., 1995) e a classe molecular C de Ambler (Ambler, 1980), sendo encontradas
tanto no cromossomo bacteriano como em plasmídeos. As enzimas
cromossomais pertencentes a este grupo já foram descritas em uma variedade
de microrganismos, principalmente nos membros do grupo CESP (Citrobacter
freundii,
Enterobacter
spp.,
Serratia
marcescens,
Providencia
stuartii,
Pseudomonas aeruginosa e Morganella morganii), podendo ser induzíveis ou
não (Philippon et al., 2002).
O aumento da expressão de AmpC pode ocorrer em função do
antimicrobiano agir como indutor da produção dessa enzima. Alguns βlactâmicos como a cefoxitina e o imipenem são potentes agentes indutores,
podendo aumentar de 100 a 600 vezes a expressão dessas β-lactamases
(Jones, 1998). A afinidade pelas PBPs 1a, 4, 7a, e 7b é a principal diferença
entre indutores fortes e fracos, sendo que a ligação a PBP 4 e/ou 7 parece
iniciar a indução das β-lactamases do tipo AmpC. Quando os antimicrobianos
indutores são retirados, a produção pode voltar a níveis basais (Sanders et al.,
1997).
Entre as espécies do gênero Enterobacter, E. gergoviae e alguns
isolados de E. sakazakii expressam AmpC em níveis muito baixos e não é
induzível, o que explica a grande sensibilidade dessas espécies a ampicilina,
21
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
cefalosporinas antigas e cefoxitina. Entretanto, em outras espécies como E.
cloacae subespécie cloacae, E. aerogenes e alguns isolados de E. sakazakii
essas enzimas são induzíveis, levando a resistência intrínseca a esses
antimicrobianos (Jacobs et al., 1995).
Três proteínas (AmpD, AmpG, e AmpR) foram descritas no mecanismo
de indução das β-lactamases cromossomais do tipo AmpC (Jacobs et al., 1995;
Normark et al.,1995; Kuga et al., 2000). AmpD é uma recente N-acetilmuramilL-alanina amidase que participa na reciclagem intercelular dos fragmentos de
peptídeoglicano (Holtje et al., 1994; Jacobs et al., 1994). A AmpD degrada o
tripeptídeo 1,6-anhidro-N-acetilmurâmico (tripeptídeo 1,6-anhMurNac) para
liberar o tripeptídeo L-Ala-D-Glu-meso-ácido diaminopimélico (meso-DAP) para
direta utilização na construção de novos peptídeoglicanos (Jacobs et al., 1994;
Jacobs et al., 1995). Mutação no gene ampD que resulta na expressão de βlactamases, mesmo na ausência de um indutor, coincide com o acúmulo do
tripeptídeo 1,6-anhMurNac (Jacobs et al., 1995). A inativação da proteína
AmpD leva a uma hiper-produção semi-constitutiva ou hiperinduzida de AmpC
em E. cloacae subespécie cloacae (Ehrhardt et al., 1996). Por outro lado,
AmpD-mutantes com níveis elevados de expressão de β-lactamases mostram
um dos três fenótipos conhecidos (hiperinduzido, desreprimido, e parcialmente
desreprimido), os quais estão associados com diferentes mutações ou, talvez,
dependam da regulação de genes desconhecidos (Stapleton et al., 1995).
AmpG é uma proteína transmembrana envolvida na permeabilidade do
tripeptídeo
N-acetilglucosamina(GluNac)-1,6-anhMurNac.
Esta
proteína
primariamente afeta o D-pentapeptídeo (pentapeptídeo dissacarídico; GluNac1,6-anhMurNac-L-Ala–D-Glu-meso-Dap-D-Ala-D-Ala),
um
muropeptídeo
22
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
periplasmático que é convertido em uma molécula sinalizadora citoplasmática
para indução de β-lactamases (Dietz et al., 1997). Sem o gene ampG, nem a
indução e nem os altos níveis de expressão de β-lactamases é possível
(Korfmann & Sanders, 1989; Dietz et al., 1997).
A proteína AmpR atua como um ativador transcricional pela ligação na
regiões do DNA localizada imediatamente upstream da região promotora do
gene ampC (Jacobs et al., 1997). Na ausência de um β-lactâmico indutor,
AmpR reprime a síntese de β-lactamases em 2,5 vezes, enquanto que a
expressão é induzida de 10 a 200 vezes na presença do β-lactâmico indutor
(Lindberg & Normark, 1987).
β-lactamases
do
tipo
AmpC
induzível
conferem
resistência
às
penicilinas, inclusive as associações com inibidores de β-lactamases
(sulbactam, tazobactam e ácido clavulânico), cefalosporinas de 1º, 2º e 3º
gerações, e aos monobactâmicos (aztreonam), principalmente quando ocorre
mutação no gene ampD, que normalmente previne altos níveis de expressão
dessas β-lactamases. Embora as cefalosporinas de quarta geração (cefepima e
cefpiroma) apresentem estabilidade frente a AmpC, alguns relatos têm
demonstrado que a hiper-produção de AmpC, devido a mutações no gene
repressor ou mutações no gene ampC (Morosini et al., 1998; Barnaud et al.,
2001; Vakulenko et al, 2002; Barnaud et al., 2004), associado a outros
mecanismos de resistência podem levar a altos níveis de resistência (MIC ≥ 32
µg/ml) a estes antimicrobianos (Piddock & Traynor, 1991; Charrel et al, 1996;
Fung-Tomc et al., 1996) e a diminuição de sensibilidade ou resistência aos
carbapenêmicos em Enterobacter spp..
23
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Em 1990, Papanicolaou e colaboradores descreveram uma enzima
localizada em um plasmídeo com 90% de similaridade como o gene ampC de
E. cloacae, dando início a um novo grupo de enzimas pertencentes a classe C
conhecidas como AmpC plasmidiais. Essas enzimas já foram descritas em todo
o mundo, sendo encontradas principalmente em K. pneumoniae, K. oxytoca,
Salmonella spp., Proteus mirabilis e E. coli. As AmpC plasmidiais apresentam o
mesmo espectro de ação das AmpC cromossomais. Até o momento já foram
descritas nove tipos: BIL-1, CMY (36 variantes), FOX, MOX, LAT, ACT, ACC,
MIR-1 e DHA (Philippon et al., 2002). Já foram descritas as seguintes variantes
de AmpC plasmidiais em Enterobacter spp.: CMY-2 (Su et al., 2006), CMY-10
(Kim et al., 2006), DHA-1 (Su et al., 2006) e LAT-2 (Gazouli et al., 1996).
Relatos demonstraram que a associação da produção de AmpC plasmidial com
perda de porina resultou na resistência aos carbapenêmicos em K.
pneumoniae (Bradford et al., 1997) e E. coli (Stapleton et al., 1999).
2.4.1.2 - β-Lactamases de Espectro Estendido (ESβLs)
As β-lactamases de espectro estendido (ESβLs) apresentam uma serina
no seu sítio ativo e representam o maior grupo de β-lactamases estudadas
atualmente (Bush et al., 1995; Bradford, 2001). Descritas inicialmente em K.
pneumoniae e E. coli, as ESβLs se disseminaram para as demais espécies de
enterobactérias, sendo encontradas também em P. aeruginosa (Bradford,
2001). Os genes que codificam as ESβLs estão localizados em grandes
plasmídeos que também podem codificar resistência aos aminoglicosídeos,
tetraciclina, cloranfenicol, e trimetoprim/sulfametoxazol (Winokur et al., 2001).
24
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Isso explica a multirresistência verificada muitas vezes em bactérias produtoras
de ESβLs.
Entre as ESβLs, as enzimas do tipo TEM (161 variantes) e SHV (105
variantes) são derivadas das β-lactamases do tipo TEM-1, TEM-2 e SHV-1 e
juntamente com CTX-M (69 variantes) pertencem ao grupo 2be de Bush (Bush
et al., 1995) e a classe molecular A de Ambler (Ambler, 1980). As enzimas do
tipo CTX-M, que hidrolizam preferencialmente cefotaxima, apresentam pouca
similaridade (40%) com as enzimas do tipo TEM e SHV, e são mais
encontradas em Salmonella enterica serovar Typhimurium e em E. coli. As
enzimas do tipo OXA (127 variantes) não apresentam similaridade genética
com as demais ESβLs e pertencem ao grupo 2d de Bush (Bush et al, 1995) e a
classe molecular D de Ambler (Ambler, 1980). Hidrolizam muito bem oxacilina,
fato este que deu origem ao nome do grupo e são mais freqüentes em P.
aeruginosa (Bradford, 2001). Outras variantes de ESβLs também já foram
descritas em diferentes organismos como BES (Serratia marcences), FEC-1 (E.
coli), CME-1 (Cryseobacterium meningosepticum), PER (3 variantes - P.
aeruginosa e Salmonella enterica), SFO (E. cloacae), TLA (E. coli) e VEB (6
variantes - E. coli), sendo pouco freqüentes (Bradford, 2001).
As ESβLs conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo
espectro e ao aztreonam, mas não são ativas contra os carbapenêmicos e as
cefamicinas (cefoxitina e cefotetan) (Bradford, 2001). Entretanto, tem sido
relatado que isolados produtores de ESβLs com perda de porina podem se
tornar resistentes as cefamicinas (Pangon et al., 1989; Martinéz-Martinéz et al.,
1996). Além disso, a expansão do sítio ativo que permite a estas enzimas um
25
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
aumento da atividade contra as cefalosporinas de amplo espectro resulta no
aumento da sensibilidade aos inibidores de β-lactamases (Bradford, 2001).
Embora a AmpC cromossomal seja a principal causa de resistência aos
β-lactâmicos nas espécies de Enterobacter (Livermore & Brown, 2001),
recentemente, têm-se demonstrado que cada vez mais esses microrganismos
podem adquirir e expressar genes que codificam a produção de ESβLs (Morris
et al., 2003; Ma et al., 2005; Schlesinger et al., 2005; Szabó et al., 2005;
Hoffmann et al., 2006; Liu et al., 2007; Moriguchi et al., 2007, Perili et al., 2008).
A vantagem competitiva do Enterobacter spp. na aquisição de ESβLs não é
clara, apesar de que a combinação entre AmpC desreprimida e as ESβLs
podem levar a resistência às cefalosporinas de quarta geração (Bell et al,
2003).
Testes fenotípicos para a detecção de ESβL, como disco-aproximação e
disco combinado, em microrganismos produtores de AmpC cromossomal, é
difícil e depende da taxa de produção da AmpC. Como as enzimas do grupo C
não são inibidas pelos inibidores de β-lactamases, muitas vezes os resultados
obtidos podem ser falso-negativos, já que as metodologias mais utilizadas
utilizam estes inibidores. Sendo assim, várias metodologias têm sido propostas
para a detecção de ESβLs em bactérias produtoras de AmpC cromossomal,
entre elas o Enterobacter spp. (Pitout et al., 2003; Stürenburg et al., 2004).
2.4.1.3 - Metalo-β-Lactamases (MβLs) e Carbapenemases da
Classe A e D
Apesar da resistência aos carbapenêmicos ser um evento raro entre as
enterobactérias (Sader et al., 2003; Cayô et al., 2007), este fenótipo de
26
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
resistência, especialmente devido à produção das metalo-β-lactamases (MβLs),
tem sido cada vez mais relatado nesses microrganismos (Galani et al., 2007;
Castanheira et al., 2007). Entretanto, enterobactérias carreando genes
codificadores de MβLs nem sempre são resistentes aos carbapenêmicos
(Walsh et al., 2005).
As MβLs são enzimas pertencentes ao grupo 3 de Bush (Bush et al.,
1995) e a classe molecular B de Ambler (Ambler, 1980) e hidrolisam todos os
β-lactâmicos comercialmente disponíveis, a exceção do aztreonam (Walsh et
al., 2005). Essas enzimas caracterizam-se por necessitarem de dois íons
divalentes, usualmente zinco, como co-fator para a atividade catalítica, por
terem a mesma estrutura tridimensional e por apresentarem resíduos
conservados, os quais são responsáveis pela interação da enzima com cátions
divalentes (Murphy et al., 2003). Além disso, essas enzimas são inibidas pelo
ácido etilenodiaminoacético (EDTA) ou por compostos derivados do ácido
tiolático (ácido mercaptopropiônico), não sofrendo ação dos inibidores das
serino-β-lactamases, como o ácido clavulânico (Andrade et al., 2007).
As MβLs são divididas em intrínsecas, ou seja aquelas enzimas que
normalmente
são
mediadas
por
cromossomo,
como
a
L1
em
Stenotrophomonas maltophilia (Walsh et al., 1994) e adquiridas. As MβLs
adquiridas são encontradas em estruturas genéticas que fornecem mobilidade
ao gene, fazendo com essas enzimas possam de disseminar para diferentes
espécies bacterianas (Mendes et al., 2006). Atualmente são conhecidas seis
tipos de MβLs aquiridas: IMP com 23 variantes (Osano et al., 1994), VIM com
18 variantes (Lauretti et al., 1999), SPM-1 (Toleman et al., 2002), GIM-1
27
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(Castanheira et al., 2004), SIM-1 (Lee et al., 2005) e mais recentemente a AIM1 (Yong et al., 2007).
As MβLs aquiridas são codificadas por cassetes gênicos localizados no
cromossomo ou plasmídeo bacteriano. No entanto, com exceção da enzima
SPM-1, que é codificada por um gene localizado em plasmídeo, as demais
MβLs aquiridas são codificadas por genes localizados em integrons de classe 1
(Walsh et al., 2005; Mendes et al., 2006). Integrons de classe 1 são elementos
genéticos constituídos de uma região conservada 5’, formada por um gene
intl1, uma região promotora e um sítio de recombinação (attl1) e uma região 3`,
que geralmente é composta do gene qacEΔ1 conjugado ao gene sul1, sendo
que esses genes codificam resistência a compostos de amônio quaternário e
sulfonamidas, respectivamente. Na região upstream ao gene intl1, integrons
apresentam uma região promotora, a qual é responsável pela expressão dos
cassetes gênicos inseridos entre as regiões conservadas (Bennett, 1999;
Mendes et al., 2006).
Embora seja um evento raro, isolados de Enterobacter spp. produtores
de MβLs tem sido relatados, sendo descritas até o momento as seguintes
variantes: IMP-1 (Shibata et al., 2003), IMP-4 (Peleg et al., 2005), IMP-8 (Yan
et al., 2002), VIM-1 (Castanheira et al., 2007), VIM-2 (Jeong et al., 2003), VIM-4
(Luzzaro et al., 2004), VIM-5 (Gacar et al., 2005).
A resistência aos carbapenêmicos em enterobactérias também pode ser
causada pelas carbapenemases da classe A ou em raras ocasiões pelas
carbapenemases da classe D ou carbapenemases do tipo OXA. Estão
incluídas no grupo das carbapenemases da classe A (Ambler, 1980) ou grupo
2f de Bush (Bush et al., 1995) as enzimas do tipo GES (9 variantes), KPC (4
28
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
variantes), SME (3 variantes), IMI, NMC-A, SFC-1 (Walther-Rasmussen &
Hoiby, 2007). Anteriormente, as enzimas do tipo GES foram classificadas como
sendo pertencentes ao grupo das ESβLs (grupo 2be de Bush), entretanto após
a descrição de GES-2 em P. aeruginosa, que apresentava atividade contra
imipenem, este grupo foi transferido para o grupo 2f (Queenan & Bush, 2007).
Outra enzima que foi incluída neste grupo foi a SHV-38 (Poirel et al., 2003),
que apresenta uma pequena atividade contra o imipenem, diferindo-se apenas
por uma substituição da SHV-1 (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007). Entre
estas enzimas, já foram descritas em Enterobacter spp. as seguintes variantes:
GES-7 (Giakkoupi et al., 2000), KPC-2 (Marchaim et al., 2008), KPC-3
(Deshpande et al., 2006), KPC-4 (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007). Já as
variantes IMI-1, IMI-2 e NMC-A somente foram descritas em isolados de
Enterobacter spp. (Pottumarthy et al., 2003; Yu et al., 2006).
As carbapenemases da classe D (Ambler, 1980), também chamadas de
carbapenemases do tipo OXA, diferente das oxacilinases de espectro
estendido (ESβL), na sua grande maioria foram descritas em Acinetobacter
baumannii (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2006). Até hoje somente duas OXA
com
atividade
contra
os
carbapenêmicos
foram
encontradas
em
enterobactérias, a OXA-23 e a OXA-48, em Proteus mirabilis e K. pneumoniae,
respectivamente (Bonnet et al., 2002; Poirel et al., 2004).
Assim como as demais carbapenemases, as OXA não conferem altos
níveis de resistência em enterobactérias. Poirel e colaboradores (2004a)
descreveram um isolado de K. pneumoniae que expressava OXA-48 e que
apresentava CIM de 64 µg/ml para imipenem. Entretanto, quando o gene da
OXA-48 foi transferido para uma cepa de E. coli transconjugante, a CIM para
29
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
imipenem foi de apenas de 2 µg/ml. Eles observaram que, na cepa selvagem
de K. pneumoniae, a expressão da OXA-48 era aumentada por uma seqüência
de inserção (IS) chamada de IS1999 associada a perda de uma proteína de
membrana externa (porina) de 36 kDa, demonstrando que somente a produção
da
carbapenemase
não
é
suficiente
para
conferir
resistência
aos
carbapenêmicos em enterobactérias.
2.4.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa
Bactérias Gram-negativas apresentam uma membrana externa, que é
uma estrutura membranosa presente externamente à membrana citoplasmática
e a camada de peptídeoglicano. A principal função da membrana externa é
atuar como uma barreira permeável que elimina os compostos tóxicos à célula
que existem no meio externo. O fato desta membrana excluir compostos
lipofílicos e grandes (> 600 daltons), muitos antimicrobianos tem pouca
atividade contra bactérias Gram-negativas, embora eles sejam ativos contra as
bactérias Gram-positivas. Muito deste fluxo através da membrana ocorre por
meio de canais formados por proteínas (Nikaido, 1994).
Para muitos antimicrobianos, um grupo de proteínas de membrana
externa, conhecidas como porinas, capazes de formar canais constituídos de
água no seu interior, é o principal meio de transporte através da membrana
bacteriana (Nitzan et al., 2002). As porinas ou OMPs (do inglês outer
membrane protein) são geralmente divididas em duas classes: porinas não
específicas, que permitem a difusão de moléculas hidrofílicas abaixo de um
certo tamanho, e porinas específicas, as quais facilitam a difusão de substratos
específicos (Nikaido, 1994).
30
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O tamanho, a carga e a hidrofobicidade dos β-lactâmicos interferem na
sua capacidade de atravessar os canais de uma porina. Sendo assim,
moléculas de alto peso molecular, moléculas carregadas negativamente e
lipofílicas apresentam dificuldade na entrada da célula bacteriana. Por outro
lado, moléculas pequenas, zwiterions ou com características hidrofílicas,
apresentam rápida penetração, como a cefepima e o imipenem (Nikaido, 1994).
Isso explica a sensibilidade do E. cloacae ao imipenem, na presença de
resistência às cefalosporinas de terceira geração, uma vez que o imipenem
apresenta uma maior capacidade de acesso, mediada pelo trânsito rápido,
provavelmente, por meio de diversos canais de porinas (Pechere, 1991).
As porinas podem aumentar ou diminuir as taxas de penetração dos
antibióticos β-lactâmicos na célula bacteriana (Nitzan et al., 2002) e diferenças
na permeabilidade da membrana externa variam de acordo com cada
microrganismo (Parr et al., 1987; Yamazaki et al., 1989).
A alteração das proteínas de membrana externa associada à expressão
da atividade de cefalosporinases é freqüentemente detectada em isolados
clínicos resistentes de Enterobacter spp.. Entre as enterobactérias, a perda de
porina é especialmente alto em E. aerogenes (Malléa et al., 1998; Charrel et
al., 1996), sendo que duas porinas (Omp35 e Omp36), relacionadas à
sensibilidade aos β-lactâmicos, estão bem caracterizadas neste microrganismo.
A porina Omp35 está intimamente relacionada à família OmpF das
enterobactérias, enquanto a Omp36 pertence ao grupo de porinas similares à
OmpC. A caracterização funcional da Omp35 mostrou que a atividade do
imipenem e cefepima são apenas fracamente afetadas comparadas aos
antimicrobianos com moléculas grandes e carregadas negativamente (Bornet
31
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
et al., 2004; Thiolas et al., 2004). Portanto, a presença da porina Omp35 na
bactéria esta associada à sensibilidade aumentada às grandes cefalosporinas
carregadas negativamente como a ceftriaxona. Observações similares têm sido
reportadas com a OmpK35 e OmpK36 de K. pneumoniae (Martinéz-Martinéz et
al., 1996; Doménech-Sanchez et al., 2003).
A resistência aos carbapenêmicos em Enterobacter spp. geralmente é
uma combinação da produção de carbapenemase específica e da perda de
porina (Tzouvelekis et al., 1992; Bornet et al., 2000), embora a associação com
bombas de efluxo também tenha sido relatado. Dados de Yigit e colaboradores
(2002) sugerem que a resistência ao imipenem em E. aerogenes está
associada primariamente à ausência da expressão de análogos das porinas
OmpC (42-kDa) e OmpF (39-kDa), o que também resulta na redução da
sensibilidade ao meropenem e à cefepima.
2.4.3 - Hiperexpressão de Bombas de Efluxo
Bombas de efluxo são genes e proteínas presentes em todos os
organismos. Em bactérias, os genes codificadores dessas bombas estão
localizados no cromossomo ou em elementos genéticos móveis, como
plasmídeos. Sabe-se que em bactérias, esses genes podem conferir
diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos; entretanto, essa diminuição
nem sempre resulta em resistência. As bombas de efluxo podem ser
específicas para um determinado substrato ou pode transportar uma gama de
compostos estruturalmente diferentes (incluindo antimicrobianos de diferentes
classes). Essas bombas que transportam muitos compostos podem estar
associadas à multirresistência antimicrobiana (Piddock, 2006).
32
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Enquanto a família de bombas de efluxo RND (do inglês resistancenodulation-division)
de
bactérias
Gram-negativas
podem
acomodar
β-
lactâmicos, existem poucos relatos onde essas bombas estejam implicadas na
resistência aos β-lactâmicos in vitro ou in vivo. Em P. aeruginosa, a
hiperexpressão do sistema de efluxo MexAB-OprM está associada na
resistência ao meropenem. A resistência ao imipenem foi caracterizado em
isolados
de
P.
aeruginosa
hiperexpressando
a
bomba
MexEF-OprN.
Entretanto, neste caso a resistência aos carbapenêmicos estava associado a
perda da porina OprD, que é a principal porta de entrada desses
antimicrobianos (Poole, 2005).
Em enterobactérias, o sistema de efluxo mais estudado, principalmente
em E. coli, é o sistema AcrAB-TolC (Pradel et al., 2002). Esse sistema assim
como os demais da família RND estão relacionados ao fenômeno MDR (do
inglês multi-drug-resistance) e que restringe a concentração intracelular de
vários antimicrobianos, incluindo β-lactâmicos, tetraciclinas, cloranfenicol,
aminoglicosídeos e quinolonas (Piddock, 2006). O fenômeno de MDR é
resultado de vários mecanismos de resistência, que incluem produção de
enzimas, modificações do sítio alvo do antimicrobiano, alteração das porinas e
indução de bombas de efluxo (Gayet et al., 2003).
Em E. aerogenes, assim como em outras enterobactérias, tem sido
descrito que alguns componentes da regulação da cascata do sistema MDR,
por um lado, regulam negativamente a expressão de porinas não específicas
da membrana externa como a OmpF, e por outro lado, induzem a superprodução da bomba de efluxo AcrAB-TolC (Chollet et al., 2004), a qual está
33
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
associada a resistência às quinolonas em E. aerogenes e E. cloacae (Linde et
al., 2002; Mahamoud et al., 2006).
A análise da seqüência dos genes envolvidos no sistema AcrAB-TolC
em E. cloacae demonstrou uma alta similaridade com o mesmo sistema em E.
aerogenes. No mesmo estudo, verificou-se que a deleção do gene acrA, um
dos componentes do sistema AcrAB-TolC, mostrou uma relação deste sistema
no fenômeno de MDR em E. cloacae. Entretanto, testes com inibidores de
bombas de efluxo, demonstraram que outros sistemas de efluxo talvez possam
ter um papel na resistência antimicrobiana (Pérez et al., 2007).
2.4.4 - Alteração de PBPs
As PBPs são o sítio alvo dos β-lactâmicos e estão relacionadas a
síntese do peptídeoglicano, principal componente da parede celular bacteriana.
A afinidade dos β-lactâmicos a estas proteínas é bem variada e mutações
podem alterar a sua estrutura levando a uma baixa afinidade de ligação aos βlactâmicos ou a produção de PBPs suplementares que também podem
apresentar baixa afinidade. A mudança na conformação das PBPs leva a
resistência aos β-lactâmicos (Zapun et al., 2008).
A resistência aos β-lactâmicos devido a alteração de PBPs, embora
possa ocorrer, apresenta uma importância secundária frente aos demais
mecanismos de resistência em bactérias Gram-negativas, uma vez que esses
mecanismos atuam em fases anteriores a ligação do β-lactâmico ao seu sítio
alvo, através de hidrólise enzimática ou impedindo a sua entrada na célula, que
pode ocorrer tanto pela perda de porinas como pela hiperexpressão de bombas
de efluxo. A alteração das PBPs apresenta um papel importante na resistência
34
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
aos β-lactâmicos em bactérias Gram-positivas, como Staphylococcus aureus e
Streptococcus pneumoniae (Smith & Klugman, 2005).
35
OBJETIVOS
3 - OBJETIVOS
3.1 - Objetivo Geral
¾ Caracterizar os mecanismos de resistência a cefalosporinas de
quarta-geração
e
a
ertapenem
em
Enterobacter
cloacae
subespécies cloacae isolados de hemoculturas no Hospital São
Paulo.
3.2 - Objetivos Específicos
¾ Avaliar o perfil de susceptibilidade entre os isolados de E.
cloacae;
¾ Detectar e caracterizar a presença de possíveis β-lactamases;
¾ Avaliar fenotipicamente a hiperexpressão de sistemas de efluxo;
¾ Avaliar o perfil de proteínas de membrana externa bacteriana;
¾ Avaliar a taxa de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF;
¾ Avaliar a similaridade genética entre as amostras estudadas.
36
MATERIAL E MÉTODOS
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Amostras Bacterianas
Foram selecionadas para o estudo 11 amostras de E. cloacae isoladas
de hemoculturas de pacientes internados no Hospital São Paulo, entre janeiro
de 2003 e março de 2004, e previamente categorizadas como resistentes a
cefepima pela metodologia de Etest (Da Silva, 2005). Os dados clínicos dessas
amostras encontram-se em anexo (Anexo I). Todas as amostras estavam
bancadas em caldo tríptico de soja (TSB - Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com
glicerol 15% a -20ºC no banco de microrganismos do Laboratório Especial de
Microbiologia Clínica - LEMC. As amostras tiveram a confirmação do gênero e
da espécie pelo sistema Vitek (Biomeriux Vitek Inc., Hazelwood, MO).
4.2 - Avaliação do Perfil de Susceptibilidade
O perfil de susceptibilidade das 11 amostras de E. cloacae foi avaliado
pela técnica de difusão em disco para as diferentes classes de antimicrobianos
e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) para os β-lactâmicos foram
obtidas pela técnica de diluição em ágar.
4.2.1 - Preparo do Inóculo Bacteriano
Após o crescimento em placas de ágar sangue por 18 horas, para a
garantia da viabilidade e da pureza das amostras, com o auxílio de alça de
semeadura, 3 a 5 colônias isoladas de cada amostra de E. cloacae foram
transferidas para tubos contendo 4 ml de salina (NaCl - Sigma, St. Louis, MO).
A suspensão bacteriana foi homogeneizada e a turvação medida em
37
MATERIAL E MÉTODOS
turbidímetro digital (Baxter®, Sacramento, EUA), para a obtenção de uma
concentração bacteriana em torno de 1,5 x 108 unidades formadoras de
colônias (UFC)/ml correspondente a 0,5 da escala de MacFarland (CLSI,
2006).
4.2.2 - Difusão em Disco
Após o preparo do inóculo (item 4.2.1), a semeadura das amostras de E.
cloacae foi feita em placa de ágar Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) com auxílio de swab estéril. O perfil de sensibilidade foi realizado
utilizando
discos
piperacilina/tazobactam
de
amoxacilina/ácido
(110µg),
cefoxitina
clavulânico
(30µg),
ceftriaxona
(30µg),
(30µg),
cefotaxima (30µg), ceftazidima (30µg), cefepima (30µg), aztreonam (30µg),
imipenem (10µg), meropenem (10µg), ertapenem (10µg), amicacina (30µg),
cloranfenicol (30µg), ciprofloxacina (5µg), sulfametoxazol/trimetoprim (25µg) e
tetraciclina (30µg) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra). As placas foram incubadas
em aerobiose a 37ºC por 18 a 24 horas. Após este período, a leitura foi feita e
os halos de inibição interpretados de acordo com os critérios de sensibilidade
para enterobactérias estabelecidos pelo CLSI (CLSI, 2007).
4.2.3 - Diluição em Ágar
As CIMs foram obtidas pela metodologia de diluição em ágar seguindo
as recomendações do CLSI (CLSI, 2006) para os seguintes β-lactâmicos e
respectivas diluições: cefotaxima (0,03-256 µg/ml), ceftazidima (0,03-256
µg/ml), cefepima (0,03-256 µg/ml), imipenem (0,03-32 µg/ml), meropenem
(0,03-32 µg/ml) e ertapenem (0,03-32 µg/ml). Esta metodologia foi realizada
38
MATERIAL E MÉTODOS
por meio da incorporação de concentrações seriadas e logarítmicas do
respectivo antimicrobiano em placas individuais de Petri contendo ágar MüellerHinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra). Cada placa representava uma única
concentração do antimicrobiano. Foram testadas diferentes concentrações,
variando de acordo com o antimicrobiano testado.
Após a preparação e diluição do inóculo (item 4.2.1), foi feita uma nova
diluição 1:10, e em seguida as amostras bacterianas foram inoculadas
simultaneamente sobre a superfície do ágar utilizando o multi-inoculador, o
qual dispensa de 1 a 3 μl contendo aproximadamente o inóculo final de 1 x 104
UFC/ml. As placas inoculadas foram incubadas por 18-24 horas, a 35°C. Após
este período, a CIM foi determinada como a menor concentração de
antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano (CLSI, 2006).
Como controle de qualidade dos testes de susceptibilidade foram
utilizadas
as
cepas
da
American
Type
Culture
Collection
(ATCC):
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli ATCC 25922. As
amostras foram classificadas como sensíveis (S), intermediárias (I) ou
resistentes (R) aos antimicrobianos testados, de acordo com os pontos de corte
estabelecidos pelo CLSI (CLSI, 2007).
4.3 - Avaliação da Similaridade Genética pela Técnica de
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Para a avaliação da similaridade genética entre as amostras de E.
cloacae incluídas neste estudo, foi utilizada a análise do DNA cromossômico
após digestão enzimática (Tenover et al., 1995). Para cada amostra foi
preparada uma suspensão bacteriana em tubos contendo 4 ml de TSB (Oxoid,
39
MATERIAL E MÉTODOS
Basingstoke, Inglaterra). Após 18-24 horas de incubação a 37°C, os tubos
foram centrifugados por 15 minutos. Em seguida, o centrifugado foi diluído em
1 ml de solução salina (NaCl - Sigma, St. Louis, MO) e transferido para um tubo
de microcentrífuga de peso conhecido. Os tubos foram centrifugados a 15.000
rpm utilizando microcentrífuga Centrimícro® (Fanem, São Paulo, Brasil) por
aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado
e descartado. Com a finalidade de se determinar o peso do centrifugado, os
tubos foram novamente pesados. O centrifugado foi diluído em salina na
proporção de 1:1 (o volume da salina em µl foi equivalente ao peso do
centrifugado em µg). Um volume de 5 µl desta suspensão foi transferido para
outro tubo, onde foi acrescentado 300 µl da solução tampão TEN (Tris 100 mM;
pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM; água destilada). Essa nova solução foi
homogeneizada e misturada com 340 µl de agarose low melt (FMC, Rockland,
USA) para a formação de pequenos blocos de géis contendo o DNA
cromossômico (plugs). Os blocos foram incubados por um período mínimo de 5
horas em solução EC (Tris 6 mM; pH 7,5; NaCl 1 M; EDTA 0,01 mM; Brj 58
0,5%; Sarcosil 0,5%; Deoxicolato 0,2% e água destilada) a 37ºC. Em seguida
os plugs foram incubados a 50ºC, em 2 ml de solução ES (EDTA 0,4 M; pH 9,3;
Sarcosil 1,0%) contendo 20 mg/ml de proteinase K (Invitrogen, Germany) numa
proporção de 1:1 (2 mg de proteinase K para 2 ml de ES), durante 12 horas.
Após este período de incubação, os blocos foram lavados 4 vezes com solução
CHEF-TE (Tris 0,1 M; pH 7,5; EDTA 0,1 M) e armazenados nessa solução até
serem submetidos a digestão enzimática.
Foram realizados 4 lavagens de 60 minutos cada com tampão DNS
(MgCl 1 M; Tris 1 M; pH 8.0; água destilada) antecedendo a digestão
40
MATERIAL E MÉTODOS
enzimática. O DNA bacteriano foi digerido utilizando 10U por amostra da
enzima de restrição SpeI (New England Biolab, Inc., Beverly, Mass, USA), e
incubado por 12-18 horas à temperatura de 37ºC. A eletroforese foi realizada
em gel de agarose a 1%, em TBE 0,5x (Tris 0,089 M, Ácido Bórico 0,089 M e
EDTA 0,002 M), no sistema CHEF-DR III (BioRad Laboratories, Califórnia,
EUA) à temperatura de 13oC e utilizando corrente elétrica de 200 volts (6
V/cm). Os padrões de variação de corrente elétrica (switch time) variaram de 5
a 60 segundos e a corrida eletroforética durou 23 horas. O gel foi corado com
brometo de etídio 0,08 μl/ml por uma hora, descorado em água destilada por
mais uma hora e fotografados sob luz UV.
De acordo com os critérios de Tenover e colaboradores (1995) foram
consideradas
idênticas
todas
as
amostras
que
apresentaram
perfil
eletroforético idêntico entre todas as bandas. Foram consideradas semelhantes
(subtipos) e pertencentes a um mesmo clone as amostras que apresentaram
diferenças no perfil eletroforético de até seis bandas. As amostras que
apresentaram sete ou mais bandas discordantes foram consideradas amostras
distintas. Além disso, fotos obtidas dos géis de PFGE foram analizadas pelo
programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Em todas
as imagens, a definição de bandas foi realizada automaticamente pelo
programa e depois conferida individualmente, por comparação visual. O
coeficiente de similaridade utilizado foi o coeficiente de Dice (Dice, 1945). O
dendograma foi construído utilizando o algorítimo de análise filogenética
UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method using arithmetic averages) (Sneath
& Sokal, 1973). Os valores de otimização e tolerância utilizados para o conjunto
de isolados foram de 1,0 e 2,0%, respectivamente. Amostras com coeficiente
41
MATERIAL E MÉTODOS
de similaridade acima de 80% foram consideradas como pertecentes ao
mesmo clone (cluster).
4.4 - Avaliação dos Mecanismos de Resistência
4.4.1 - Detecção Fenotípica da Produção de β-Lactamases pela
Metodologia de Aproximação em Disco
Todas as amostras foram submetidas à técnica de aproximação em
disco modificada a partir da metodologia descrita por Jarlier e colaboradores
(1988), para a detecção fenotípica da produção de ESβL. Após o preparo do
inóculo bacteriano (item 4.2.1), os testes fenotípicos foram realizados conforme
as recomendações do CLSI para teste de difusão em disco (CLSI, 2007).
Discos de cefepima (30 µg), ceftriaxona (30 µg), aztreonam (30 µg) e
ceftazidima (30 µg) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) foram dispostos de 15 a 25
mm (centro a centro) do disco de amoxacilina/ácido clavulânico (30 µg),
colocado no centro da placa, conforme ilustrado na Figura 3.
CRO
CAZ
AMC
15-25 mm
FEP
Figura 3. Placa modelo utilizada para a detecção
fenotípica da produção de ESβL. Abreviações:
CAZ - ceftazidima; CRO - ceftriaxona; FEP -
ATZ
cefepima;
ATZ
-
aztreonam;
AMC
-
amoxacilina/ácido clavulânico.
42
MATERIAL E MÉTODOS
A visualização de distorções nos halos ou formação de zonas fantasmas
para qualquer um dos substratos utilizados foi considerada como resultado
positivo. Como controles positivos e negativos foram utilizados cepas de
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 e Klebsiella pneumoniae ATCC 10031,
respectivamente.
4.4.2 - Teste Fenotípico de Indução de β-Lactamase do Tipo
AmpC
Para a avaliação fenotípica da indução da β-lactamase do tipo AmpC
entre as amostras de E. cloacae foi realizada o teste de indução modificado a
partir da metodologia descrita por Dunne e Hardin (2005). Em placas de ágar
Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), como descrito no item 4.2.1,
foram dispostos discos de imipenem (10 µg) e cefoxitina (30 µg), dois fortes
indutores de AmpC, a uma distância de 15 a 25 mm (centro a centro) do disco
de ceftazidima (30 µg), como mostrado na Figura 4. O achatamento do halo de
ceftazidima foi considerado como resultado positivo.
IPM
FOX
CAZ
15-25 mm
Figura 4. Placa modelo utilizada para a
detecção fenotípica da indução de AmpC.
Abreviações:
CAZ
-
ceftazidima;
FOX
-
cefoxitina; IMP - imipenem.
43
MATERIAL E MÉTODOS
4.4.3 - Teste de Hidrólise Enzimática
O teste de hidrólise teve como objetivo principal à detecção da atividade
enzimática nas amostras analisadas. Depois de isoladas as amostras, 10 colônias
foram inoculadas em 10 mL caldo de TSB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com 4
μg/mL de ceftazidima. Os tubos ficaram incubados na estufa a 37°C por 18 horas
sob agitação. A suspensão bacteriana foi transferida para um tubo cônico e
passou por uma centrifugação de 15 minutos à 3.000 rpm. Em seguida, o
sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em 1 ml de Solução de
Hidrólise (Tris-HCL 1 mM e ZnSO4 1 mM). As amostras suspensas foram
ultrasonicadas com 4 ciclos de 30 segundos e o produto sonicado foi transferido
para tubo de microcentrífuga e, então, centrifugado por 3 minutos à 4ºC e 13.000
rpm (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Germany). O sobrenadante
(extratos brutos de proteínas) foi transferido para um novo tubo e as amostras
mantidas no gelo até o momento do ensaio (Bradford et al., 1994).
Uma solução de cefepima em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0 foi utilizada
como substrato. Quando colocada em espectrofotômetro, esta solução teve
uma absorbância de aproximadamente 1,5 a 2 unidades em comprimento de
260 nm. Para o teste, colocou-se 900 μl desta solução em uma cubeta de
quartzo onde foram adicionados 100 μl do extrato bruto de β-lactamase. O
monitoramento da absorbância da solução foi realizado por 1 minuto em
espectrofotômetro. Presença da diminuição da absorbância foi considerada
resultado positivo para a produção de β-lactamases. Uma solução de ácido
clavulânico também foi preparada, como descrita anteriormente, para a
detecção da produção de possíveis ESβLs. 100 μl dessa solução foi misturada
a 800 μl de solução de cefepima e em seguida adicionada 100 μl do extrato
44
MATERIAL E MÉTODOS
bruto de β-lactamase. Ausência da dimuição da absorbância na presença do
ácido clavulânico foi considerado como teste confirmatório da presença de
ESβLs.
4.4.4 - PCR para a Detecção dos Genes Codificadores de βLactamases
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi aplicada para
confirmar a presença ou ausência dos genes que codificam as β-lactamases.
As amostras foram cultivadas em ágar nutriente (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) contendo de 0,5 µg/ml de ceftazidima e, após isolamento de
colônias puras, 3 a 5 colônias de cada amostra foram transferidas para um tubo
de microcentrífuga contendo 200 µl de água destilada estéril. Esta suspensão
foi utilizada diretamente para a etapa de amplificação do DNA. Em fluxo
laminar, foi preparada uma solução mãe (master mix) contendo: H2O
deionizada
estéril,
tampão
MgCl2
1,5mM,
tampão
NH4Cl
50mM,
desoxinucleotídeo trifosfato 0,2mM (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 2,5
unidades/L de Taq DNApolimerase e iniciadores de reação na concentração de
2 µM.
Foram utilizados iniciadores de reação para a detecção dos genes
codificadores das seguintes β-lactamases: ESβLs (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M,
blaBES); MβLs (blaIMP, blaVIM, blaSPM), enzimas da Classe A (blaKPC, blaGES); e
AmpC plasmidiais (blaCMY-1, blaCMY-2, blaDHA, blaFOX), como mostrado na Tabela
2.
45
MATERIAL E MÉTODOS
Tabela 2. Gene alvo e oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a
detecção dos genes codificadores de β-lactamases.
Gene Alvo
blaTEM
blaSHV
blaCTX-M
blaBES
blaIMP
blaVIM
blaSPM
blaKPC
blaGES
blaCMY-1
blaCMY-2
blaDHA
blaFOX
Iniciador
Seqüência (5' - 3')
TEM F
ATGAGTATTCAACATTTCCG
TEM R
CTGACAGTTACCAATGCTTA
SHV F
GGTTATGCGTTATATTCGCC
SHV R
TTAGCGTTGCCAGTGCTC
CTX-M F
CGCTTTGCGATGTGCAG
CTX-M R
ACCGCGATATCGTTGGT
BES F
GGCGCAATACAACGAAGG
BES R
ATCTTGCAGTACCAGTCG
IMP F
TGAGCAAGTTATCTGTATTC
IMP R
TTAGTTGCTTGGTTTTGATG
VIM F
TTATGGAGCAGCAACGATGT
VIM R
CAAAAGTCCCGCTCCAACGA
SPM F
CGCTGCGAACGTGAGTGTAA
SPM R
CGATCGCGGCCTATGTTTGA
KPC F
TCGCTAAACTCGAACAGG
KPC R
TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC
GES F
TCACGCACTATTACTGGC
GES R
TATTTGTCCGTGCTCAGG
CMY-1 F
CGACAATCCATCCTGTGG
CMY-1 R
CCAACTGCGCCAGGATG
CMY-2 F
TCGTTATGCTGCGCTCTG
CMY-2 R
GGACAGGGTTAGGATAGC
DHA F
CACTGATTTCCGCTCTGC
DHA R
AGCCTGTGCAGCTTTGAC
FOX F
ATGCAACAACGRCGTGC
FOX R
TCACTCGGCCAACTGACTCAG
Para a detecção da produção de β-lactamases do tipo oxacilinases foi
utilizado
a
metodologia
de
PCR-multiplex
descrita
por
Woodford
e
colaboradores (2006). Todos os primers utilizados foram desenhados no
Laboratório Alerta e posteriormente encaminhados para síntese (IDT Integrated DNA Tecnologies Inc., Coralville, EUA). A solução-mãe foi mantida a
aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação 19 μl foram
46
MATERIAL E MÉTODOS
transferidos para cada tubo de amplificação, contendo 1 μl da suspensão
celular.
As condições para amplificação do DNA foram: denaturação a 94ºC por
10 minutos, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto,
72ºC por 1 minuto. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a
72ºC. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado foi feita
em eletroforese em gel de agarose a 1% e visualização sob luz ultra-violeta.
Além da detecção de β-lactamases, foi realizado também PCR para a
detecção de integrons entre os isolados de E. cloacae, utilizando os primers Int F
(5’-CCGTAGAAGAACAGC-3’) e Qac R (5’-GTTGCGATTACTTCG-3’). As
condições para amplificação do DNA foram: denaturação a 94ºC por 10
minutos, seguidos por 36 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 52ºC por 30
segundos, 72ºC por 10 minutos. A etapa de extensão final foi realizada por 10
minutos a 72ºC.
4.4.5 - Reação de Seqüênciamento e Interpretação dos
Resultados
Os produtos de PCR obtidos foram purificados a partir do gel de agarose
com o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Alemanha), conforme as
instruções do fabricante. O DNA obtido foi quantificado utilizando o
espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible (Termo Spectronic, Cambridge,
Inglaterra) e, então, quantidades necessárias foram submetidas à reação
preparatória para o seqüênciamento com o kit Big Dye Terminator Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA). Após o término da reação
de PCR, o produto foi precipitado para a eliminação dos d-dNTPs marcados
47
MATERIAL E MÉTODOS
não incorporados à reação. Após a precipitação e lavagem com etanol, o
produto foi ressuspenso em polímero TSR e colocado no aparelho ABI PRISM
310, Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Califórnia). As
seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas foram
analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR,
Madison, WI) e então submetidas a comparação com bases de dados
genéticos
disponíveis
na
internet
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
e
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
4.4.6 - Avaliação fenotípica da expressão de Bombas de Efluxo
Para avaliação fenotípica da presença de bombas de efluxo, CIMs foram
determinadas para os antimicrobianos cefepima, imipenem, meropenem e
ertapenem, nas mesmas concentrações citadas no item 4.2.3, ao ágar MüellerHinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) na ausência e na presença dos
inibidores de bomba de efluxo reserpina e fenilalamida arginina β-nafitilamida PAβN (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, EUA), em concentrações fixas
de 20 e 25 µg/ml, respectivamente (Gayet et al., 2003). A diminuição da CIM ≥
2 diluições para a associação β-lactâmico/inibidor em relação à CIM do βlactâmico sozinho foi considerada indicativa da hiperexpressão de bomba de
efluxo, segundo a metodologia de diluição em ágar (CLSI, 2006).
4.4.7 - Avaliação do Perfil das Proteínas de Membrana Externa
Com auxílio de uma alça estéril e em fluxo laminar, de 3 a 5 colônias
bacterianas foram inoculadas em 5 ml de caldo TSB (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) acrescido de 0,5 µg/ml de ceftazidima e incubadas sob leve agitação
48
MATERIAL E MÉTODOS
a 37°C por 18 a 20 horas. Após este período, em fluxo laminar, 5 ml desta
cultura foi transferido para outro tubo contendo 45 ml de TSB, o qual foi
incubado por 4 a 5 horas a 37°C. Em seguida as células bacterianas foram
centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida
foi descartado o sobrenadante e o centrifugado ressuspenso em 5 ml de TrisHCl 30 mM pH 8.0. Após a suspensão das células, as mesmas foram
centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos, suspensas novamente em 5 ml de
Tris-HCl 30 mM pH 8.0 e lisadas por sonicação (6 pulsos de 10 segundos
cada) em sonicador XL2000 Ultrasonic Cell Disruptor-Fisher (Scientific
International Inc.). Durante o processo as amostras foram mantidas em gelo.
Em seguida, a suspensão de células foi centrifugada a 8.000 rpm por 25
minutos a 4°C para a remoção dos debris celulares. O sobrenadante foi
submetido à centrifugação de 38.200 rpm por 34 minutos a 4°C, em
ultracentrífuga Hitachi Himac CP85β utilizando o rotor fixo P55AT (Hitachi Koki
Corp. Tokio, Japão). Em seguida, o precipitado foi suspenso em 1 ml de TrisHCl 30mM pH 8.0 e, após a suspensão, 100 μL de sarcosil a 20% foi
adicionado para que as OMPs fossem precipitadas. Após cuidadosa agitação,
este precipitado foi incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em
seguida, foi realizada uma nova etapa de centrifugação a 38.200 rpm por 34
minutos a 22°C e, finalmente, o precipitado suspenso em 100 μL de água
deionizada. Os preparados protéicos foram submetidos à análise do perfil de
proteínas de membrana externa pela técnica de SDS-PAGE.
Na técnica de SDS-PAGE, as amostras e os padrões de peso molecular
foram aplicadas no gel de dodecil sulfato de sódio (SDS), contendo 12%
(pt/vol) de acrilamida (SDS-PAGE 12%). A eletroforese foi realizada a 40 volts
49
MATERIAL E MÉTODOS
por 2 horas no sistema V-16 Vertical Gel Electrophoresis System (Gibco BRL
Life Technologies, Rockville, MD, EUA). Após a corrida eletroforética, o gel foi
corado durante uma hora com coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich Corp., St
Louis, EUA). Como descorante foi utilizado ácido acético a 10%. A análise do
gel foi feita com o programa Gel Doc-Quantity one (BioRad, California, EUA).
4.4.8 - Análise dos Níveis de Transcrição dos Genes ampC,
ompC e ompF pela Técnica de PCR em Tempo Real (qRT PCR)
A técnica de qRT-PCR foi utilizada para a quantificação dos níveis de
transcrição dos genes ampC, ompC e ompF, com o intuito de verificar
alterações da permeabilidade de membrana externa (expressão das porinas
OmpC e OmpF) e a hiperexpressão de β-lactamase cromossomal do tipo
AmpC. Para a realização das reações foram utilizados os inciadores mostrados
na Tabela 3:
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a quantificação
dos genes ampC, ompC e ompF pela técnica de qRT-PCR. .
Gene Alvo Iniciador
ampC
ompC
ompF
Seqüência (5' - 3')
AmpC F
TGGCAGCCGCAGTGGAAGC
AmpC R ATAGGGCATGCCAGAAGGTTTGA
OmpC F
ACTTCGGCCTGCGTCCATCC
OmpC R TAGTAAGTCGCACCCACATCAACAT
OmpF F
CGGCGCGACTTACTACTTCA
OmpF R ATGCCCAGCTTGTTGTCGTCTTTCA
50
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras bacterianas foram cultivadas por 18-24 horas em caldo TSB
(Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), posteriormente diluídas em uma cultura fresca
1:100 e incubadas a 37ºC até a fase exponencial de crescimento (0,6 de
absorbância), medido em espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible (Termo
Spectronic, Cambridge, Inglaterra). Um volume de 1 ml da cultura bacteriana foi
centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4°C e o centrifugado resultante foi
mantido congelado a -70 ºC, se necessário para posterior utilização. O
centrifugado foi lavado com 500 µl de água destilada estéril e centrifugado a
13.000 rpm por um minuto. Para a ressuspensão do centrifugado foram
utilizados 100 µl de TE e em seguida tratada com 2 µl de lisozima (20 mg/ml).
A extração do RNA total foi feita com a utilização do kit RNeasy Mini Kit
(Invitrogen, Califórnia, EUA) como descrito pelo fabricante. O DNA genômico
foi eliminado utilizando DNase I (Rnase-Free Dnase Set - QIAGEN, Hilden,
Germany). Para a síntese do DNA complementar (cDNA) foram utilizados 20
ng do RNA total medido em espectrofotômetro a um comprimento de onda
igual a 260 nm e o Kit High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems,
Califórnia, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. A PCR
quantitativa foi processada em termociclador CFD-3220 DNA Engine Opticon 2
Two-Color Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, Califórnia, EUA) numa
reação contendo 10 µM/µl de inciadores específicos para cada gene, SYBR
Green Master Mix (Applied Biosystems), Taq Dna Polimerase (Invitrogen) e o
produto da reação de síntese de cDNA 1:10. Foi realizado um ciclo de 15
minutos a 50ºC, 5 minutos a 95ºC para a desnaturação e 40 ciclos de
amplificação por 20 segundos a 95ºC, anelamento por 20 segundos a 52ºC e
extensão por 1 minuto a 72ºC. As taxas de transcrição dos respectivos genes
51
MATERIAL E MÉTODOS
foram comparados ao gene de referência que codifica a porção da subunidade
16S do RNA ribossomal (rrsE). Avaliações comparatórias foram realizadas
entre as amostras bacterianas do estudo frente a cepa sabidamente sensível
aos β-lactâmicos de estudo, sendo utilizada a cepa de E. cloacae 13.412.
52
RESULTADOS
5 - RESULTADOS
5.1 - Perfil de Susceptibilidade aos Antimicrobianos
Como observado na Tabela 4, todas as amostras de E. cloacae
estudadas foram resistentes a cefoxitina, cefalosporinas de terceira geração
(ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima), cefepima, aztreonam e as associações
com inibidores de β-lactamases (piperacilina/tazobactam e amoxacilina/ácido
clavulânico) pela técnica de difusão em disco. Somente imipenem e
meropenem apresentaram 100% de atividade entre os β-lactâmicos estudados.
Entretanto, 72% (n=8) das amostras foram resistentes a ertapenem, sendo que
das três amostras restantes, duas apresentaram resistência intermediária.
Entre as demais classes de antimicrobianos avaliadas, uma alta taxa de
resistência também foi observada para ciprofloxacina (100%), amicacina
(63,4%) e sulfametoxazol/trimetoprim (63,4%). Entre os isolados testados,
100% foram resistentes a tetraciclina, e destes 45,45% (5/11) foram também
resistentes ao cloranfenicol.
53
RESULTADOS
Tabela 4. Perfil de susceptibilidade entre os isolados de E. cloacae pela técnica
de difusão em disco.
Categoria de Sensibilidadea
Amostras
AMC TZP FOX CRO CTX CAZ FEP ATM IMP MER ERT AK CIP SXT TE C
10.480
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
R
R
R
R
13.501
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
S
R
R
R
S
13.550
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
S
R
R
R
S
14.008
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
R
R
R
S
11.235
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
R
R
R
R
S
20.096
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
R
R
R
R
10.831
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
I
R
R
S
R
R
10.833
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
I
R
R
S
R
R
12.035
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
S
R
I
R
S
11.334
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
S
R
I
R
S
11.297
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
R
R
R
R
a. Critério de interpretação dos halos de inibição de acordo com o CLSI (2007); Estão
quadriculados os resultados sensíveis e intermediários. Abreviações: AMC - amoxacilina/ácido
clavulânico; TZP - piperacilina/tazobactam; CTX - cefotaxima; CAZ - ceftazidima; FEP cefepima; IMP - imipenem; MER - meropenem; ERT - ertapenem; AK - amicacina; CIP ciprofloxacina; SXT - sulfametoxazol/trimetoprim; TE - tetraciclina; C - cloranfenicol.
CIMs foram obtidas pela técnica de diluição em ágar para os βlactâmicos cefotaxima, ceftazidima, cefepima, imipenem, meropenem e
ertapenem estão demonstradas na Tabela 5:
54
RESULTADOS
Tabela 5. Perfil de susceptibilidade aos β-lactâmicos dos isolados de E.
cloacae pela técnica de diluição em ágar.
Amostras
10.480
13.501
13.550
14.008
11.235
20.096
10.831
10.833
12.035
11.334
11.297
CIM (μg/mL)
CTX
CAZ
FEP
IMP
MER
ERT
>256
>256
>256
0,5
0,5
4
>256
256
256
0,5
0,5
8
>256
>256
256
1
1
8
>256
256
256
0,25
0,25
4
>256
128
256
0,25
0,12
2
>256
256
256
0,25
0,25
4
256
128
256
0,25
0,25
4
>256
128
256
0,25
0,25
8
>256
256
256
0,25
0,5
4
>256
>256
256
0,25
0,25
4
>256
256
32
0,25
0,25
4
a. Abreviações: CTX - cefotaxima; CAZ - ceftazidima; FEP - cefepima; IMP - imipenem; MER meropenem; ERT - ertapenem.
Alto grau de resistência a cefotaxima (CIM50, > 256 µg/ml), ceftazidima
(CIM50, 256 µg/ml) e cefepima (CIM50, 256 µg/ml) foram observados entre as
amostras de E. cloacae isoladas de hemoculturas no Hospital São Paulo. Os
carbapenêmicos imipenem (CIM50, 0.25 µg/ml) e meropenem (CIM50, 0.25
µg/ml) mantiveram excelente atividade contra os isolados de Enterobacter
resistentes aos demais β-lactâmicos. Como demonstrado pela técnica de
difusão em disco, foi observada uma diminuição da sensibilidade ao ertapenem
(CIM50, 4 µg/ml) entre os isolados de E. cloacae. Entre os 11 isolados, 7
(63,6%) apresentaram resistência intermediária ao ertapenem (CIMs, 4 µg/ml),
3 (27,3%) foram resistentes (CIMs, 8 µg/ml) e 1 isolado (9,1%), apesar de
55
RESULTADOS
sensível, apresentou CIM (2 µg/ml) no limite da sensibilidade, de acordo com
os pontos de corte padronizados pelo CLSI (2007).
Comparando
os
resultados
obtidos
para
ertapenem
nas
duas
metodologias aplicadas (Tabela 6), entre as sete amostras que apresentaram
resistência intermediária na diluição em ágar (CIM, 4 µg/ml), seis (85,7%)
apresentaram halos de inibição (15 mm) correspondentes a categoria de
resistência pela difusão em disco. Por outro lado, a amostra 10.833,
considerada resistente (CIM, 8 µg/ml) pela diluição em ágar, apresentou halo
de inibição correspondente a categoria intermediário na difusão em disco.
Apenas quatro amostras (13.501, 13.550, 11.235 e 10.831) apresentaram
concordância entre as duas metodologias utilizadas.
Tabela 6. Comparação dos resultados para ertapenem entre as metodologias
de difusão em disco e diluição em ágar.
Amostras
Difusão em disco
Diluição em ágar
Halo (mm)
Categoriaa
CIM (µg/ml)
Categoriaa
10.480
15
R
4
I
13.501
15
R
8
R
13.550
15
R
8
R
14.008
15
R
4
I
11.235
20
S
2
S
20.096
15
R
4
I
10.831
16
I
4
I
10.833
16
I
8
R
12.035
15
R
4
I
11.334
15
R
4
I
11.297
15
R
4
I
a. Categoria de sensibilidade interpretada de acordo com o CLSI (2007).
56
RESULTADOS
5.2 - Avaliação da Similaridade Genética pela Técnica de PFGE
A análise pela técnica de PFGE demonstrou uma variabilidade genética
entre os 11 isolados de E. cloacae, como mostrado na Figura 4.
λ
1
2
3
4
5
6
λ
7
8
9
10
11
λ
12
Figura 5. Perfil de PFGE das amostras de E. cloacae. Amostra 1 - 10.833, Amostra 2 - 10.831,
Amostra 3 - 20.096, Amostra 4 - 11.334, Amostra 5 -12.035, Amostra 6 - 13.501, Amostra 7 13.550, Amostra 8 - 11.235, Amostra 9 - 10.480, Amostra 10 - 14.008, Amostra 11 - 11.297 e
Amostra 12 - 20.027 (amostra sensível); λ - Padrão de peso molecular.
As amostras 10.480, 20.096, 11.334, 12.035 e 14.008 apresentaram o
mesmo perfil de PFGE e foram incluídas no padrão A. O mesmo ocorreu entre
as amostras 10.831 e 10.833, que foram incluídas no padrão B (Tabela 7). Pelo
número de diferenças encontradas nos perfis de bandas, as demais amostras
foram consideradas como sendo subtipos de um mesmo padrão (C), sendo
classificados como C1 (amostras 11.235 e 11.297), e C2 (amostra 13.550 e
13.501).
57
RESULTADOS
A análise do dendograma (Figura 6) a partir do gel de PFGE, pelo
programa BioNumerics, demonstrou a presença de 3 clusters com coeficiente
de similaridade acima de 80% entre os isolados de E. cloacae resistentes a
cefepima e a ertapenem.
65
70
75
80
85
90
95
100
10.480
11.334
Padrão A
100
12.035
89.3
14.008
77.8
Padrão B
20.096
10.831
92.3
64.3
10.833
Padrão C
96
93.8
89.6
11.235
11.297
13.501
13.550
Figura 6. Dendograma demonstrando o coeficiente de similaridade entre os isolados de E.
cloacae pelo programa BioNumerics. Os círculos em vermelho demonstram os clusters que
apresentaram coeficiente de similaridade maior que 80%.
Os dados obtidos corroboram com a análise utilizando os critérios de
Tenover e colaboradores (1995), onde também foram encontrados três padrões
de PFGE. Embora o padrão A tenha apresentado um coeficiente de
similaridade de 89,3%, quatro dos cinco isolados pertencentes a esse cluster
foram totalmente idênticos pelo BioNumerics. O padrão B apresentou um
coeficiente de similaridade de 92,3%. O padrão C, que apresentou 2 dois
subtipos (C1 e C2), apresentou um coeficiente de similaridade de 89,6%, sendo
58
RESULTADOS
que entre os dois isolados pertencentes ao subtipo C1 (11.235 e 11.297) foi
observado um coeficiente de similaridade de 96%.
Como mostrado na Tabela 7, a maioria das amostras de E. cloacae
analisada foi isolada de pacientes internados na UTI Geral (6/11, 54,5%),
sendo que pelo menos uma amostra por padrão de PFGE foi encontrada nesta
unidade hospitalar. Os padrões B e C2 somente foram encontrados na UTI
Geral em períodos específicos. O padrão A foi o mais prevalente (5/11, 45,4%),
sendo encontrado em diferentes unidades durante o período de estudo,
sugerindo sua disseminação no Hospital São Paulo. O subtipo C1 diferente do
subtipo C2 foi encontrado também na enfermaria do 11º andar, e um período
de sete meses separou o isolamento dos dois subtipos.
Tabela 7. Similaridade genética e unidade hospitalar de acordo com a data de
isolamento das amostras de E. cloacae.
Amostra
PFGE
Unidade Hospitalar
Data do Isolamento
10.480
A
Cirurgia Gástrica
30/1/2003
10.833
10.831
B
B
UTI Geral
UTI Geral
28/2/2003
2/3/2003
20.096
A
Enfermaria 11º andar
1/4/2003
11.235
C1
UTI Geral
12/6/2003
11.297
C1
Enfermaria 11º andar
17/6/2003
11.334
A
Cirurgia Cardíaca
23/6/2003
12.035
13.501
13.550
14.008
A
C2
C2
A
UTI Geral
UTI Geral
UTI Geral
Neurocirurgia
2/9/2003
13/2/2004
13/2/2004
16/4/2004
59
RESULTADOS
5.3 - Avaliação da Produção de β-lactamases
Todas as 11 amostras apresentaram resultados positivos para ESβL no
teste de aproximação em disco. Cefepima e aztreonam foram os melhores
substratos e 15 mm a melhor distância para a detecção de ESβL entre os
isolados de E. cloacae, como mostrado na Figura 7.
Figura 7. Diferentes resultados positivos (zonas fantasmas indicadas pelas setas em branco)
obtidos no teste de aproximação em disco para a detecção fenotípica de ESβL entre os
isolados de E. cloacae. Siglas: AMC - amoxacilina/ ácido clavulânico, CAZ - ceftazidima, CRO ceftriaxona, FEP - cefepima, ATM - aztreonam.
Diferente do teste fenotípico para detecção de ESβL, todas as amostras
apresentaram resultados negativos no teste de indução de AmpC, como
mostrado na Figura 8. Entretanto, todas as amostras foram resistentes a
60
RESULTADOS
cefoxitina (Tabela 4), sendo um indício da produção de AmpC. Um fato
interessante foi o sinergismo observado entre imipenem e ceftazidima para
todas as amostras de E. cloacae (Figura 8). Este fato já era esperado, uma vez
que o imipenem atua como inibidor de ESβL da mesma forma que o ácido
clavulânico. O mesmo não foi observado para cefoxitina.
Figura 8. Sinergismo entre o disco de imipenem e ceftazidima (distorções do halo para CAZ
indicadas pelas setas em branco) obtidos no teste de indução de AmpC entre os isolados de E.
cloacae. Siglas: CAZ - ceftazidima, CFO - cefoxitina, IPM - imipenem.
Todas as amostras de E. cloacae apresentaram resultados positivos no
teste de hidrólise enzimática. A hidrólise da solução de cefepima, na presença
61
RESULTADOS
dos extratos brutos das β-lactamases, foi visualizada através da diminuição da
absorbância do antimicrobiano em questão. Em contraste, a solução de
cefepima na presença do ácido clavulânico, não apresentou diminuição da
absorbância quando adicionado os extratos das β-lactamases.
Pela técnica de PCR, o gene blaTEM foi detectado em todas as amostras
analisadas, e dessas, seis amplificaram também para o gene blaCTX-M como
mostrado na Tabela 8.
Tabela 8. Resultados para a produção de β-lactamases e presença de
integrons obtidos pela técnica de PCR e seqüênciamento entre as amostras de
E. cloacae.
Amostras
PCR
Seqüênciamentoa
Presença de Integron
de classe 1
10.480
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
13.501
blaTEM
TEM-like
+
13.550
blaTEM
TEM-like
+
14.008
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
11.235
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
20.096
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
12.035
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
11.334
blaTEM, blaCTX-M
TEM-like, CTX-M-2
+
11.297
blaTEM
TEM-like
+
10.831*
10.833*
a. Resultados parciais, *não apresentaram amplificação para nenhum dos primers utilizados,
incluindo os primers para a porção 16s ribossomal.
Não foi verificado a presença de genes codificadores de MβL,
carbapenemases da classe A e D, bem como AmpC plasmidiais para nenhuma
das amostras de E.cloacae analisadas. As amostras 10.831 e 10.333, embora
62
RESULTADOS
tenham apresentado teste de hidrólise e aproximação em disco positivos para a
produção de ESβL, não foi verificado produto de PCR de tamanho compatível
aos de interesse. Entretanto, a PCR também foi negativa quando utilizados
iniciadores para o gene da porção 16s ribossomal, demonstrando presença de
inibidores
de
reação
nessas
amostras.
Foram
então
testadas
duas
metodologias de extração de DNA diferentes, mantendo-se o mesmo resultado.
A PCR, a partir dos iniciadores IntF e qacR, verificou-se a presença de
integrons em todas amostras analisadas (Tabela 8). O seqüênciamento das
porções iniciais dos produtos de reação confirmou a presença de integrons de
classe 1. Embora a seqüência completa dos genes das β-lactamases
encontradas (CTX-M e TEM) não tenha sido concluída, o seqüênciamento dos
primeiros 400 a 600 pb confirmou os resultados obtidos na PCR. A comparação
das seqüências parciais dos genes encontrados com o banco de dados
disponível, demonstrou uma grande similaridade com os genes blaTEM-like e
blaCTX-M-2.
5.4 - Avaliação da Hiperexpressão de Bombas de Efluxo
Nenhuma redução significativa (≥ 2 diluições) na concentração inibitória
mínima foi observada para cefepima e para os carbapenêmicos, imipenem,
meropenem e ertapenem na presença dos inibidores de bomba de efluxo
reserpina (20 μg/ml) e PAβN (25 μg/ml), como mostrado na Tabela 9. Esses
resultados demonstram a ausência de hiperexpressão de sistemas de efluxo ou
que a hiperexpressão desses sistemas não está relacionada a resistência a
cefepima e a diminuição da sensibilidade a ertapenem nas amostras de E.
cloacae.
63
RESULTADOS
Tabela 9. Detecção fenotípica da hiperexpressão de sistemas de efluxo
utilizando os inibidores PAβN e reserpina.
Amostras
PAβN
(25 µg/ml)
Ausência de inibidor
Reserpina
(20 µg/ml)
FEP
IMP MER ERT
FEP
IMP MER ERT IMP MER ERT
10.480
>256
0,5
0,5
4
>256
0,5
0,5
4
1
0,5
4
13.501
256
0,5
0,5
8
256
0,5
0,5
8
0,25
0,5
8
13.550
256
1
1
8
256
1
1
4
1
0,5
8
14.008
256
0,25
0,25
4
256
0,25
0,25
2
0,25
0,25
4
11.235
256
0,25
0,12
2
256
0,12
0,12
2
0,25
0,25
1
20.096
256
0,25
0,25
4
256
0,25
0,25
4
0,25
0,25
4
10.831
256
0,25
0,25
4
128
0,25
0,5
8
0,25
0,5
4
10.833
256
0,25
0,25
8
128
0,25
0,25
8
0,25
0,25
8
12.035
256
0,25
0,5
4
256
0,5
0,5
4
0,25
0,5
4
11.334
256
0,25
0,25
4
128
0,25
0,5
4
0,25
0,5
4
11.297
32
0,25
0,25
4
32
0,25
0,25
4
0,25
0,25
4
5.5 - Avaliação do Perfil das Proteínas de Membrana Externa
A análise do perfil das proteínas de membrana externa pela técnica de
SDS-PAGE (Figura 8) demonstrou que entre as amostras de E. cloacae não
houve alteração do perfil das porinas de 35 kDa e 36 kDa, relacionadas as
famílias de porinas não específicas (OmpC e OmpF), quando comparadas a
amostra sensível 10.834 (CIM para cefepime de 0,05 µg/ml). Embora para a
amostra 11.235 (coluna 5 - Figura 9) não tenha sido visualizada a porina de 36
kDa, quando repetida a extração para essa amostra, foi possível a visualização
da mesma, demonstrando que não houve perda da expressão dessa porina.
Entretanto, uma porina de aproximadamente 43 kDa (seta em vermelho Figura 9) foi visualizada para o controle sensível e não foi observada em
nenhuma das amostras resistentes.
64
RESULTADOS
λ’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
λ’’
66 kDa
45 kDa
36 kDa
Figura 9. Perfil das proteínas de membrana externa (porinas) dos isolados de E. cloacae pela
técnica de SDS-PAGE. Amostras: 1 (10.834 - controle sensível), 2 (10.831), 3 (12.035), 4
(10.833), 5 (11.235), 6 (11.334), 7 (13.501), 8 (13.550) 9 (10.480), 10 (11.297), 11 (20.096) e
12 (14.008) - λ’ - Padrão de peso molecular baixo, λ’’ - Padrão de peso molecular
5.6 - Avaliação do taxa de transcrição dos genes ampC, ompC
e ompF
Para a análise dos níveis de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF
foram selecionadas uma amostra correspondente a cada padrão caracterizado
pela técnica de PFGE (item 5.2), sendo elas: 10.480 (A),10.831 (B), 13.550
(C2) e 11.235 (C1); e uma amostra de E. cloacae, 13.412, sensível a cefepima
(CIM, 0,06 μg/ml). Quando comparados os níveis de transcrição do gene ampC
entre as quatro amostras testes e a amostra sensível, verificou-se que todas as
amostras resistentes, independentemente do padrão analisado, apresentavam
taxa de transcrição entre 3,2 a 6,4 x103 vezes maior em relação ao controle
sensível, como mostrado na Tabela 11.
65
RESULTADOS
Tabela 10. Análise dos níveis de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF
pela técnica de qRT-PCR.
Gene Alvo
Amostra
Expressão Relativa/
gene alvo vs gene de
referênciab
Cta
Taxa de
Expressãoc
10.480
6.452,8
15,43
3,42E-04
13.550
4.264,2
14,94
2,26E-04
11.235
3.283,0
17,00
1,74E-04
10.831
3.962,3
15,82
2,10E-04
13.412
1
27,62
5,30E-08
ompC
10.480
17,8
12,46
2,62E-03
13.550
0,7
16,08
1,02E-04
11.235
2,7
15,77
4,02E-04
10.831
23,7
11,81
3,48E-03
13.412
1
16,15
1,47E-04
ompF
10.480
436,3
17,43
6,85E-05
13.550
31,1
20,45
4,89E-06
11.235
39,2
21,43
6,16E-06
10.831
783,4
16,63
1,23E-04
13.412
1
26,04
1,57E-07
a. Ct (cycle threshold) representa a média dos valores das triplicatas; b. Expressão relativa = 2ΔΔT
, onde T = Ctgene alvo-Ctgene de referência; c. Média entre a expressão relativa do gene alvo (ampC,
ompC e ompF) nas amostras testes vs o controle sensível (13.412).
ampC
Embora
as
amostras
analisadas
tenham
apresentado
uma
hiperexpressão do gene ampC, as mesmas não apresentaram diminuição da
expressão dos genes ompC e ompF, a exceção da amostra 13.550 que
apresentou uma pequena diminuição da expressão de ompC em relação ao
controle sensível. Entretanto, não foi observado diminuição da expressão para o
gene ompF para essa mesma amostra.
66
DISCUSSÃO
6 - DISCUSSÃO
E. cloacae tem sido associado a uma vasta gama de síndromes clínicas,
incluindo infecções do trato urinário, pneumonia e bacteremia (Manzur et al.,
2007). Esse microrganismo está entre os agentes etiológicos mais comuns
associados às infecções nosocomiais (Pessoa-Silva et al., 2004), e possui a
capacidade de desenvolver rapidamente resistência durante a terapia
antimicrobiana (Chow et al., 1994), o que está associado ao aumento da
morbidade, mortalidade, bem como com os gastos com o paciente (Kang et al.,
2004).
A caracterização dos mecanismos de resistência, entre as 11 amostras
de E. cloacae isoladas de hemoculturas no Hospital São Paulo avaliadas neste
estudo, demonstrou que a produção de ESβL (blaTEM-like e blaCTX-M) associada à
desrepressão do gene ampC foram os responsáveis pelos altos níveis de
resistência às cefalosporinas de terceira geração e à cefepima (CIM50, 256
μg/ml). Além disso, a produção dessas β-lactamases foi responsável pela
resistência ao aztreonam e às associações com inibidores de β-lactamases
(amoxicilina/ácido clavulânico e piperacilina/tazobactam). Esses dados estão
de acordo com estudos anteriores, os quais demonstraram que as CIMs para
cefepima entre isolados de E. cloacae que apresentavam AmpC desreprimida
associada a produção de ESβL eram extremamente superiores (CIM90, >256
μg/ml) aos isolados que somente apresentavam o gene AmpC desreprimido
sem a presença de ESβL (CIM90, 1.5 μg/ml) (Gottlieb & Wolfson, 2000).
Co-resistência as cefalosporinas de terceira e quarta geração,
amicacina, sulfametoxazol/trimetoprim e ciprofloxacina foi observada nos
67
DISCUSSÃO
isolados de E. cloacae estudados, comprometendo a terapia empírica das
infecções causadas por estes microrganismos. Este resultado é semelhante
àqueles relatados anteriormente (Winokur et al., 2001; Cayô et al., 2008), os
quais
demonstraram
que
organismos
que
expressam
ESβL
são
freqüentemente resistentes a outros agentes antimicrobianos, uma vez que os
mecanismos de resistência a esses agentes são codificados por genes
localizados em plasmídeo que também carream genes codificadores de ESβLs.
Embora a resistência as quinolonas geralmente seja causada por mutação em
genes de localização cromossômica; alguns estudos descreveram baixos
níveis de resistência a estes antimicrobianos mediada por plasmídeos
(Martinez-Martinez et al., 1998; Linde et al., 2002; Wang et al., 2004; Robicsek
et al., 2006).
Pouco se conhece sobre a incidência de ESβL em Enterobacter spp.
devido ao teste fenotípico para ESβL em enterobactérias ser comumente
realizado pelos laboratórios clínicos somente para E. coli e Klebsiella spp. (Ho
et al., 2005). Além disso, para os testes que dependem de um sinergismo entre
o ácido clavulânico e as cefalosporinas de terceira geração, a detecção de
ESβL em Enterobacter spp. é prejudicada devido a interferência da produção
de AmpC, que não é inibida pelo ácido clavulânico (Pitout et al., 2003). Desde
que microrganismos produtores de AmpC podem ser reservatórios para ESβL,
é importante que os laboratórios de microbiologia clínica sejam capazes de
detectar a produção de ESβL nestes microrganismos (Levison, 2002).
Embora o CLSI (CLSI, 2007) tenha padronizado teste para a detecção
de ESβL em E. coli, K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Proteus mirabilis, este
teste muitas vezes não é aplicável para outros gêneros. Além disso, estudo
68
DISCUSSÃO
anterior demosntrou que o teste de aproximação em disco tradicional, o cartão
para a detecção de ESβL do VITEK® e as fitas de Etest® com associações
entre cefalosporinas de terceira geração e ácido clavulânico falharam na
detecção de isolados de C. freundii, E. cloacae, E. aerogenes, S. marcescens,
Morganella morganii e Providencia stuartii produtores de ESβL (Spanu et al.,
2002).
Um estudo conduzido por Schwaber e colaboradores (2004) avaliou a
utilidade das recomendações do CLSI na identificação de ESβL em 640
isolados de enterobactérias excluindo as amostras de E. coli e Klebsiella spp..
Dos 355 isolados que apresentaram resultados positivos no teste de triagem
para ESβL baseados na CIM para ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona,
cefpodoxima e aztreonam, apenas 2,2% foram positivos no teste confirmatório
(PCR). Entre os 340 isolados que foram positivos no teste fenotípico para
ESβL, mas que não apresentaram diminuição da CIM na presença do ácido
clavulânico,
aproximadamente
80%
obtiveram
perfil
de
sensibilidade
compatível com a produção de AmpC (altas CIMs para cefalosporinas e
cefoxitina e baixos CIMs para cefepima). É possível que a produção de AmpC
possa ter mascarado a produção de ESβL nestes isolados, embora as baixas
CIMs para cefepima fale contra a presença de vários tipos de ESβLs, tais como
CTX-M e algumas enzimas do tipo TEM e SHV, desde que essas enzimas
possuem atividade hidrolítica contra cefepima (Yu et al., 2002).
Além disso, a alteração da permeabilidade de membrana externa
(porinas) pode levar a resultados falso-positivos quando são utilizadas as
recomendações do CLSI para a detecção de ESβL (Schwaber et al., 2004).
Rasheed e colaboradores (1997) descreveram uma alteração no perfil de
69
DISCUSSÃO
porinas associado à produção de uma β-lactamase não-ESβL que produzia um
fenótipo ESβL falso-positivo. Inversamente, é concebível que a perda ou
diminuição da expressão das porinas possa mascarar o efeito do ácido
clavulânico em um isolado produtor de ESβL por não permitir a entrada de
quantidades suficientes de cefalosporina no interior da bactéria, de modo que o
efeito do sinergismo não seja evidente entre o antimicrobiano e o inibidor
(Pangon et al., 1989).
Um estudo desenvolvido por Mimoz e colaboradores (2000) demonstrou,
em modelos animais infectados, a eficácia e a estabilidade de cefepima contra
isolados de E. cloacae apresentando desrepressão do gene ampC. Em um
outro estudo, Zhang e colaboradores (2001) avaliaram 55 isolados de E.
cloacae apresentando AmpC induzível e verificaram que 96,4% eram sensíveis
a cefepima. Já Naumiuk e colaboradores (2001) avaliaram a atividade da
cefepima por difusão em disco contra isolados de E. cloacae produtores e não
produtores de ESβL apresentado o gene ampC desreprimido. Entre os 23
isolados de E. cloacae produtores de ESβL, oito foram categorizados como
resistentes a cefepima, cinco como intermediários e 10 como sensíveis. Entre
os isolados não produtores analisados, dois foram resistentes, um intermediário
e 67 sensíveis. Foi verificado também que todas as amostras que não eram
produtoras de ESβL apresentaram halo para cefepima maior que 26 mm.
Com o intuito de melhorar a detecção de ESβL em isolados de
Enterobacter spp., estudos têm recomendado o uso de cefepima em
substituição às usuais cefalosporinas de terceira geração (Tzelepi et al., 2000,
Pitout et al., 2003). Tzelepi e colaboradores (2000) demonstraram que o uso do
disco de cefepima aumentou a sensibilidade do teste de aproximação em disco
70
DISCUSSÃO
com cefalosporinas de amplo espectro para E. cloacae e E. aerogenes de 16
para 61%, quando os discos foram aplicados a uma distância de 30 mm (centro
a centro) do disco de amoxacilina/ácido clavulânico, e de 71 para 90% quando
os discos foram colocados mais próximos. Maior sensibilidade de cefepima
comparada as cefalosporinas de amplo espectro nos métodos de detecção
fenotípica de ESβL baseados no sinergismo com o ácido clavulânico é
esperado, uma vez que cefepima, geralmente, retém atividade contra
cefalosporinases e apresenta alta velocidade de penetração (Hancock &
Bellido, 1992).
Os resultados obtidos no presente estudo referentes à detecção
fenotípica de ESβL em E. cloacae corroboraram com os dados descritos na
literatura. Cefepima foi a única droga utilizada no teste de aproximação em
disco capaz de detectar a produção de ESβL para todas as 11 amostras
analisadas que apresentavam a desrepressão do gene ampC. Outra droga que
apresentou bons resultados foi o aztreonam. Ceftazidima e ceftriaxona, como
esperado, apresentaram os piores resultados, já que são substratos para
AmpC.
Outro fato também observado foi que a distância de 15 mm foi melhor
para a visualização e formação das zonas fantasmas. O contrário foi observado
para a distância de 25 mm. Como as amostras analisadas eram resistentes a
cefepima, esperava-se que a menor distância analisada fosse a ideal para o
sinergismo entre os discos de amoxicilina/ácido clavulânico e de cefepima.
Esses resultados indicam que a freqüência de ESβL pode facilmente ser
subestimada em populações de Enterobacter spp. caracterizadas pela alta
prevalência de mutantes desreprimidos. Para tais situações, a inclusão de
71
DISCUSSÃO
cefepima no teste de aproximação em disco pode aumentar a acurácia na
detecção de ESβL nestas espécies.
Embora a presença de ESβL em isolados de E. cloacae apresentando o
gene ampC desreprimido provavelmente não altere a terapia das infecções
causadas por estes patógenos, uma vez que os carbapenêmicos são as drogas
de escolha para o tratamento de infecções graves (Tenover et al., 1999), a
cefepima, que é uma das opções para o tratamento de infecções causadas por
mutantes AmpC desreprimidos, pode ser afetada pela co-produção de ESβL.
Além disso, a identificação da produção de ESβL é de grande valor
epidemiológico, desde que Enterobacter spp. pode servir como reservatório
dessas β-lactamases para as outras enterobactérias (Bush, 1996).
Enquanto comum em E. coli e K. pneumoniae, os genes que codificam
ESβL têm se disseminado para as outras enterobactérias, embora de acordo
com alguns autores isto pareça ser pouco freqüente (Bell et al., 2003).
Entretanto, cada vez mais tem sido relatada a presença de genes codificadores
dessas β-lactamases em amostras de Enterobacter spp. isoladas em diferentes
regiões geográficas como: CTX-M-10 e TEM-24 na Espanha (Cantón et al.,
2002); SHV-12 na Coréia (Lee et al., 2003; Pai et al., 2004); CTX-M-like e SHVlike na Alemanha (Hoffmann et al., 2006); IBC-1 na Grécia (Giakkoupi et al.,
2000); SHV-2 na Nigéria (Aibinu et al., 2003); TEM-24, TEM-80 TEM-121 na
França (Arpin et al., 2002; Dumarche et al., 2002; Poirel et al., 2004); CTX-M-9,
CTX-M-14, CTX-M-22 e TEM-141 na China (Chanawong et al., 2002, Liu et al.,
2007); TEM-26 no Reino Unido (Hibbert-Rogers et al., 1995); SHV-7 nos
Estados Unidos (Levison et al., 2002); SHV-like no México (Silva et al., 1999);
TEM-149 na Itália (Perilli et al., 2008a); TEM-10 e TEM-116 em Portugal
72
DISCUSSÃO
(Machado et al., 2007); TEM-24 na Bélgica (Goethaert et al., 2006); SHV-12 em
Israel (Schlesinger et al., 2005); SHV-12 e CTX-M-15 na Argélia (Labadene et
al., 2008). No Brasil já foram identificadas CTX-M-8 (Bonnet et al., 2000) e
CTX-M-16 (Bonnet et al., 2001).
A presença de ESβL em Enterobacter spp. é inesperada, devido a
grande facilidade deste gênero em gerar mutantes produtores de AmpC
desreprimida. Entretanto, algumas espécies de Enterobacter, como E.
sakazakii, não se adaptam rapidamente à indução ou desrepressão de AmpC
cromossomal. Como a resistência relacionada a AmpC não é esperada nestas
espécies menos freqüentes, a produção de ESβL pode constituir a principal
estratégia de resistência às cefalosporinas de amplo espectro neste grupo
(Negri & Baquero, 1998; Negri & Baquero, 1999).
Se um plasmídeo carreador de ESβL está no ambiente, e a sua
expressão é de menor custo energético do que a hiper-produção da enzima
cromossomal, então há uma clara oportunidade para a aquisição de
plasmídeos carreadores de ESβL. Além disso, como na maioria das vezes
esses plasmídeos carream genes de resistência a outras classes de
antimicrobianos, torna-se extremamente vantajoso para a bactéria adquiri-los
(Negri & Baquero, 1998; Negri & Baquero, 1999).
A quantificação da expressão gênica por qRT-PCR demonstrou que
todos os isolados de E. cloacae analisados no presente estudo apresentavam
desrepressão do gene ampC, variando a expressão de 3,2 a 6,4 x 103 vezes
maior do que no controle sensível. Embora não tenha sido verificado perda ou
diminuição da expressão das principais porinas OmpC (35 kDa) e OmpF (36
kDa), para quase todas as amostras, alguns estudos têm demonstrado que a
73
DISCUSSÃO
perda de porinas associadas a hiper-produção de AmpC pode levar a altos
níveis de resistência a cefepima (CIM ≥32 µg/ml) em Enterobacter spp. (Charrel
et al., 1996; Fung-Tomc et al., 1996; Thiolas et al., 2004; Fernández-Cuenca et
al., 2006). Estudos posteriores serão necessários para avaliar se a
desrepressão do gene ampC verificada nestas amostras estão relacionas a
mutações nos genes controladores ampD (Korfmann et al., 1989), ampR
(Korfmann et al., 1991) e ampG (Kuga et al., 2000) ou mutações pontuais no
próprio gene ampC.
Barnaud e colaboradores (2001) descreveram um evento genético no
qual resultou na deleção de seis aminoácidos no gene ampC de um isolado
clínico de E. cloacae. Esta deleção combinada a hiper-produção de AmpC
conferiu altos níveis de resistência a cefepima (CIM, 256 µg/ml). Outros dois
estudos descreveram quais mutações pontuais (substituições V-298-E ou L293-P) selecionadas in vitro em E. coli carreando o gene ampC de E. cloacae
pode levar a este fenótipo (Morosini et al., 1998; e Vakulenko et al., 2002).
Substituições e deleções idênticas e localizadas na mesma região foram
descritas in vivo em E. cloacae por Barnaud e colaboradores (2004), sugerindo
que esta região gênica é um potencial hot spot para o desenvolvimento de
resistência a cefepima. Em um outro estudo, uma nova AmpC cromossomal foi
descrita em E. cloacae apresentando similaridade com MIR-1 de K.
pneumoniae. Este isolado apresentava altos níveis de resistência (>256 µg/ml)
para cefoxitina, ceftazidima e cefotaxima, mas mantinha sensibilidade a
cefepima (CIM, 0,5 µg/ml) (Conceição et al., 2004).
Entre os antimicrobianos testados, os carbapenêmicos, imipenem e
meropenem, foram os únicos que apresentaram 100% de atividade frente as
74
DISCUSSÃO
amostras de E. cloacae produtoras de ESβLs e hiper-produtoras de AmpC.
Esse resultado já era esperado, uma vez que não foram encontrados genes
codificadores de MβLs, bem como genes codificadores das carbapenemases
da classe A e D. Além disso, já foi demonstrado anteriormente que imipenem e
meropenem apresentam excelente atividade frente isolados produtores de
ESβL e AmpC, sendo na maioria das vezes os antimicrobianos de escolha para
o tratamento de infecções causadas por estes patógenos (Zhanel et al., 2007).
Um estudo conduzido por Sader e colaboradores (2003), onde foram
avaliadas 48.440 amostras de enterobactérias isoladas na América Latina,
demonstrou que a resistência a imipenem e a meropenem ainda é um evento
muito raro nesta região. Neste estudo o perfil de sensibilidade aos
carbapenêmicos foi de 99,9%. Outros estudos, em diferentes regiões
geográficas também demonstraram uma excelente atividade de imipenem e
meropenem frente aos isolados de enterobactérias (Kholy et al., 2003; Kirby et
al., 2006).
Embora ainda pouco freqüente, a resistência aos carbapenêmicos,
imipenem e meropenem, já foi descrita em Enterobacter spp., na maioria das
vezes relacionada a produção de carbapenemases (Giakkoupi et al., 2000; Yan
et al., 2002, Jeong et al., 2003; Pottumarthy et al., 2003; Gacar et al., 2005;
Peleg et al., 2005; Deshpande et al., 2006; Yu et al., 2006; Castanheira et al.,
2007; .Galani et al., 2007; Marchaim et al., 2008). Um estudo de Luzzaro e
colaboradores (2004) relataram a presença do gene blaVIM-4 carreado por um
plasmídeo conjugativo em um isolado de E. cloacae, provavelmente adquirido
de uma amostra de K. pneumoniae que também apresentava o mesmo
plasmídeo.
75
DISCUSSÃO
Recentemente, alguns estudos tem relatado a presença de MβLs e
ESβLs, geralmente pertencentes ao grupo SHV, em um mesmo plasmídeo
conjugativo em isolados de Enterobacter spp., conferindo resistência a todos os
β-lactâmicos, o que compromete o tratamento das infecções causadas por
estes microrganismos (Ikonomidis et al., 2007; Biendo et al., 2008; Perilli et al.,
2008b).
Além da produção de carbapenemases, outros mecanismos associados
ou não, como a impermeabilidade de membrana externa e hiperexpressão de
efluxo têm sido descritas como sendo responsáveis pela resistência ou
diminuição de sensibilidade aos carbapenêmicos, principalmente imipenem, em
Enterobacter spp. (Hopkins & Towner, 1990; Leying et al., 1991; Charrel et al.,
1996; Mallea et al., 1998; Bornet et al., 2004; Thiolas et al., 2005). Nos últimos
anos, o uso de novas cefalosporinas combinando uma eficiente difusão através
das porinas e a estabilidade frente a inativação enzimática levaram a uma
inesperada e grave conseqüência: a seleção de bactérias Gram-negativas com
modificações na permeabilidade de membrana (Dé et al., 2001). Tais
modificações podem envolver alterações na expressão das porinas, com ou
sem um mecanismo de efluxo ativo associado.
Alguns estudos têm caracterizado aminoácidos específicos importantes
na estrutura e função destas proteínas (Saint et al., 1996; van Gelder et al.,
1997; Simonet et al., 2000). Mutações nestes aminoácidos podem diminuir em
grande parte a difusão através das porinas em alguns isolados clínicos (Dé et
al., 2001). Dé e colaboradores (2001) descreveram uma porina semelhante a
OmpF de E. coli em um isolado clínico de E. aerogenes. Ao comparar com a
ATCC 13.048, foi verificado que na amostra clínica o transporte através desta
76
DISCUSSÃO
porina se apresentava 70% menor que na cepa selvagem, além de ser três
vezes mais seletiva para cátions. Neste estudo as CIMs para as cefalosporinas
variaram de 64 µg/ml para cefepima a >512 µg/ml para ceftazidima e para os
carbapenêmicos as CIMs foram de 4 µg/ml. Quando inserido um plasmídeo
contendo o gene ompF de E. coli, as CIMs para a cefepima e ceftazidima caiu
para <1 e 16 µg/ml, respectivamente. Para os carbapenêmicos, não houve
alteração na CIM para o meropenem que se manteve em 1 µg/ml, enquanto
que para imipenem houve uma diminuição de 1 para 0,25 µg/ml na CIM.
Em um outro estudo, Yigit e colaboradores (2002) verificaram que a
resistência ao imipenem (CIM, 16 µg/ml) em um isolado de E. aerogenes
estava primariamente associada à perda da expressão de duas porinas de 42
kDa e 39 kDa, semelhantes a OmpC e OmpF de E. coli, respectivamente. Essa
alteração na permeabilidade da membrana externa também resultou na
diminuição da sensibilidade ao meropenem (CIM, 8 µg/ml) e cefepima (CIM, 8
µg/ml). Esses resultados sugerem que imipenem, durante o seu trajeto pela
membrana externa bacteriana, pode usar várias porinas, como por exemplo,
uma proteína presente em enterobactérias do tipo D2 ou porinas não
específicas com uma relativa eficiência para a difusão (Raimondi et al., 1991).
Embora as β-lactamases cromossomais do grupo 1 de Bush ou AmpC
apresentem atividade in vitro contra as cefalosporinas de primeira, segunda e
terceira geração, além do aztreonam, vários relatos tem demonstrado que o
gene ampC na condição de desreprimido associado a impermeabilidade de
membrana externa pode levar a resistência aos carbapenêmicos em isolados
de Enterobacter spp. (Lee et al., 1991; Tzouvelekis et al., 1992; de Champs et
al., 1993; Tzouvelekis et al., 1994).
77
DISCUSSÃO
Lee e colaboradores (1991) demonstraram que os altos níveis de
resistência (CIM, 16 µg/ml) a imipenem e meropenem em um isolado de E.
cloacae estava relacionado a perda de duas porinas de 37 kDa e 38 kDa
associado a hiper-produção de AmpC. Neste estudo, a introdução de um
plasmídeo contendo o gene ampD, que reprime a expressão de ampC, resultou
na quase completa ausência da produção de AmpC e uma substancial
diminuição
na
CIMs.
Entretanto,
as
CIMs
para
os
carbapenêmicos
permaneceram 8 a 16 vezes maior do que as cepas sensíveis contendo o gene
ampD. Essa resistência “residual” foi atribuída a impermeabilidade de
membrana externa.
Embora já tenha sido comprovada a importância da impermeabilidade de
membrana externa na resistência ao imipenem em Enterobacter spp., um
estudo feito por Cornaglia e colaboradores (1995) demonstrou que os níveis de
resistência a meropenem foram mais dependentes da permeabilidade de
membrana externa, enquanto a sensibilidade a imipenem era mais dependente
da atividade de AmpC em E. cloacae.
Embora
no
presente
estudo
imipenem
e
meropenem
tenham
apresentado uma excelente atividade contra os isolados de E. cloacae
produtores de ESβL e hiper-produtores de AmpC, o mesmo não foi verificado
para ertapenem. Imipenem e meropenem foram seis vezes mais potentes
(MIC50, 0,25 µg/ml) do que o ertapenem (MIC50, 4 µg/ml) frente a estes
isolados. Entretanto, Livermore e colaboradores (2001) avaliaram a atividade
de ertapenem contra isolados produtores de diferentes β-lactamases. De
acordo com esse estudo, ertapenem apresentou MIC90 de 0,06 µg/ml contra
isolados de Klebsiella spp. produtores de ESβL comparado a 0,5 µg/ml
78
DISCUSSÃO
observado para imipenem. Além disso, contra mutantes apresentando AmpC
desreprimida as CIMs para ertapenem e imipenem foram 0,015-0,5 µg/ml e
0,25-1
µg/ml,
respectivamente.
Ertapenem,
assim
como
os
demais
carbapenêmicos, não apresentou atividade contra isolados produtores de
carbapenemases.
A diminuição da sensibilidade a ertapenem verificada nos isolados de E.
cloacae pode estar relacionada a impermeabilidade de membrana externa,
provavelmente pela perda de uma porina de 43 kDa, verificada pelo gel de
SDS-PAGE, associada a desrepressão do gene ampC. A diminuição da
expressão de OmpC verificada para a amostra 13.550 pela qRT-PCR pode
estar relacionada provavelmente ao aumento da CIM (1 μg/ml) para imipenem
e meropenem.
Um estudo realizado por Woodford e colaboradores (2007), que avaliou
a resistência ao ertapenem em amostras de Klebsiella spp. e Enterobacter spp.
isoladas na Inglaterra, concluiu que a resistência a ertapenem em Enterobacter
spp. estava provavelmente relacionada a produção de AmpC associada a
impermeabilidade de membrana externa e ou ao aumento da expressão de
efluxo, enquanto que a produção de ESβL associado aos mesmos mecanismos
eram os responsáveis pelo fenótipo de resistência em Klebsiella spp.. Foi
observado também que imipenem e meropenem eram mais ativos contra a
maioria dos isolados avaliados, quando estes apresentavam baixos níveis de
resistência a ertapenem (CIM, ≤ 2 µg/ml). Entretanto, quando os isolados
apresentavam altos níveis de resistência ao ertapenem (CIM, >16 µg/ml), uma
diminuição da atividade para os demais carbapenêmicos era observada. Por
último, eles concluíram que raramente a resistência a ertapenem é conferida
79
DISCUSSÃO
por carbapenemases verdadeiras. Esses dados corroboram com os resultados
obtidos no presente estudo, uma vez que imipenem e meropenem mantiveram
atividade frente os isolados com baixos níveis de resistência ao ertapenem.
Além disso, entre as amostras analisadas não foi observado a produção de
carbapenemases.
O ertapenem, embora apresente um expectro de atividade inferior ao
apresentado pelos demais carbapenêmicos (não apresenta atividade contra
bacilos Gram-negativos não fermentadores) ainda é uma opção no tratamento
de
infecções
causadas
por
enterobactérias
não
produtoras
de
carbapenemases, com a vantagem de ser administrado somente uma vez ao
dia (Zhanel et al., 2005). Além disso, o ertapenem pode funcionar como
marcador para a resistência a imipenem e meropenem, já que isolados
apresentando baixos níveis de resistência a ertapenem tendem a manter a
sensibilidade aos demais carbapenêmicos (Woodford et al., 2007). Outro ponto
importante é que a CIM para ertapenem é mais específica para a detecção de
algumas β-lactamases, como KPC, já que algumas vezes essas enzimas não
são capazes de conferir fenótipo de resistência a imipenem e a meropenem,
mas, ao contrário, aumentam a CIM para o ertapenem (Bratu et al., 2005;
Lamoestro et al., 2006).
As CIMs para cefepima, imipenem, meropenem e ertapenem não foram
afetadas pela presença dos inibidores de bomba de efluxo PAβN e reserpina,
sugerindo que a hiperexpressão dos sistemas de efluxo não é o principal
mecanismo envolvido na resistência a cefepima e a ertapenem nas amostras
estudadas. Alternativamente, os inibidores de bomba de efluxo utilizados
podem não ser capazes de bloquear a extrusão destes antimicrobianos nas
80
DISCUSSÃO
amostras analisadas, o que justificaria os resultados obtidos. Outro ponto a ser
discutido seria a concentração do inibidor utilizada (20 µg/ml para reserpina e
25 µg/ml para PAβN). Talvez concentrações maiores do inibidor pudessem ter
maior efeito na detecção de efluxo ativo para os β-lactâmicos testados. Na
literatura a concentração de PAβN utilizada para diferentes microrganismos
variou de 20 a 50 µg/ml (Szabó et al., 2006; 2006; Pérez et al.,2007).
Embora não tenha sido verificada alteração das CIMs para os βlactâmicos testados na presença dos inibidores de efluxo, todas as 11
amostras estudadas foram resistentes à tetraciclina e destas cinco foram
resistentes inclusive ao cloranfenicol, cuja resistência também já foi descrita
como sendo relacionada aos sistemas de efluxo (Chevalier et al., 2004). Estes
dados estão de acordo com um estudo prévio (Gayet et al., 2003), no qual dois
isolados de E. aerogenes resistentes a cefepima, na presença do PAβN, não
apresentaram alteração na CIM para esta droga. Entretanto, ambas as
amostras apresentaram diminuição da CIM para cloranfenicol na presença do
mesmo inibidor.
A importância dos sistemas de efluxo, como o já estudado AcrAB-TolC,
na resistência aos β-lactâmicos ainda não está clara. Bornet e colaboradores
(2003) demonstraram um aumento da expressão do gene acrA em isolados
resistentes de E. aerogenes. Embora neste estudo tenha sido verificado que o
sistema AcrAB-TolC não participa diretamente da resistência ao imipenem, pois
não houve diminuição da CIM do imipenem na presença do PAβN, esse
antimicrobiano
poderia
estar
envolvido
na
seleção
de
cepas
que
hiperexpressam sistemas de efluxo, responsáveis pela resistência a outras
81
DISCUSSÃO
classes de antimicrobianos, como tetraciclina, cloranfenicol e norfloxacina
(Bornet et al., 2003).
Outros dois trabalhos demonstraram a importância do gene ramA e do
operon mar no fenômeno da multirresistência em E. aerogenes (Chollet et al.,
2002; Chollet et al., 2004). A hiperexpressão do gene ramA ativa a expressão
do operon mar que diminui a expressão das porinas e aumenta a expressão
dos sistema de efluxo AcrAB-TolC. Além disso, foi demonstrado que o gene
ramA sozinho é capaz de induzir a cascata MDR (MultiDrug Resistant) na
ausência do operon mar. Como esses genes diminuem a permeabilidade de
membrana externa, regulando a expressão das porinas, eles podem também
contribuir com a diminuição da sensibilidade ao imipenem como demonstrado
pelo estudo de Chollet e colaboradores (2002).
Embora não tenha sido observada diminuição da expressão das porinas
OmpC e OmpF para a maioria das amostras de E. cloacae do presente estudo,
já foi descrito que a diminuição da expressão de OmpF e OmpD associada a
sistemas de efluxo pode conferir resistência a ertapenem em E. cloacae (Szabó
et al., 2006). Szabó e colaboradores (2006) descreveram uma amostra de E.
cloacae que apresentava uma expressão das porinas OmpD e OmpF de 11 e
55 vezes menor, respectivamente, comparado ao controle sensível. Além
disso, foi observada uma diminuição das CIMs para ertapenem, meropenem e
ciprofloxacina na presença do inibidor PAβN.
Entretanto, algumas considerações devem ser feitas. Primeiro, o isolado
analisado apresentava CIM > 32 µg/ml, muito acima das CIMs observadas para
os 11 isolados do presente estudo (CIMs de 2-8 µg/ml); segundo, não foi
mencionado a taxa de expressão do gene ampC, embora tenha sido descrita a
82
DISCUSSÃO
presença de quatro β-lactamases (TEM-1, SHV-7, SHV-30 e MIR). Além disso,
a concentração de PAβN utilizada (40 µg/ml) foi muito superior à utilizada no
presente estudo (25 µg/ml).
Embora a hiper-produção de AmpC associada a uma provável perda de
uma porina de 43 kDa seja o principal mecanismo responsável pelos baixos
níveis de resistência a ertapenem, alguns relatos tem demonstrado que a
produção de CTX-M associada a impermeabilidade de membrana (diminuição
ou perda da Ompk35 e OmpK36) pode conferir resistência a ertapenem em
Klebsiella spp (Elliott et al., 2006; Lee et al., 2007; Martinez-Martínez, 2008).
Entretanto, não foi verificada nenhuma diferença no perfil de sensibilidade para
ertapenem entre os isolados produtores de CTX-M e os não produtores,
demonstranto que a produção de CTX-M não possui um papel importante na
diminuição da sensibilidade a ertapenem em Enterobacter spp. como em
Klebsiella spp..
Talvez essa diferença esteja relacionada as porinas utilizadas nestes
dois microrganismos pelo ertapenem. Enquanto que em Klebsiella ssp. duas
principais porinas OmpK35 e OmpK36 estão relacionadas a resistência aos
carbapenêmicos, em Enterobacter spp., a resistência aos carbapenêmicos tem
sido relacionada à perda de diferentes porinas, cujos pesos moleculares
variaram de 35 kDa a 43 kDa. Além disso, a prevalência de ESβL é muito maior
em Klebsiella spp. que em Enterobacter spp. Aliada a isso, a desrepressão do
gene ampC em Enterobacter spp. confere um importante papel na resistência
aos beta-lactâmicos não podendo ser subestimada nestes microrganismos.
A análise da similaridade genética pelo PFGE demonstrou que não
houve uma disseminação de um mesmo clone entre as amostras de E. cloacae
83
DISCUSSÃO
multirresistentes isoladas de hemoculturas no Hopital São Paulo. Essa
variabilidade sugere que ocorreu uma pressão seletiva nessas amostras de
modo que apresentassem o mesmo fenótipo de resistência. Sendo assim, é
necessária e importante uma política do uso de antimicrobianos dentro do
ambiente hospitalar com a finalidade de restringir a seleção de isolados
resistentes.
Como observado por Da Silva (2005), que avaliou a adequação da
terapia entre esses isolados, o uso prévio de cefalosporinas (principalmente
ceftriaxona) está relacionado a emergência da resistência em E. cloacae. FungTomc e colaboradores (1996) relataram que ceftriaxona pode induzir a
desrepressão do gene ampC mais frequentemente do que as outras
cefalosporinas. Isto justificaria os altos níveis de expressão de AmpC
verificados nos isolados de E. cloacae avaliados no presente estudo. Estes
dados estão de acordo com relatos anteriores que também demonstraram a
relação entre o uso de cefalosporinas de amplo espectro e o surgimento de
resistência em Enterobacter spp. (Chow et al., 1991; Kaye et al., 2001; Lee et
al., 2002; Muller et al., 2004; Stearne et al., 2004).
Da Silva (2005) verificou também que além da antibióticoterapia
empírica prévia com cefalosporinas, os pacientes que apresentaram infecções
por estes microrganismos, em sua maioria, eram de alto risco para adquirir
infecções por organismos resistentes, já que apresentavam doenças de base
graves, o que pode ter influenciado nas altas taxas de mortalidade verificado
neste grupo (45,45%). Além disso, a maioria dos pacientes estava internado
em unidades de terapia intensiva e em unidades cirúrgicas o que proporciona
84
DISCUSSÃO
maior número de procedimentos invasivos, e aumento nos dias de internação
(Da Silva, 2005).
O presente estudo demonstrou a complexidade dos mecanismos
expressos por E. cloacae e os altos níveis de resistência que esses
mecanismos associados podem conferir nestes microrganismos. Cada vez
mais têm sido descritos isolados de Enterobacter spp. multirresistentes,
principalmente E. cloacae e E. aerogenes, causando surtos em ambientes
nosocomiais. A terapia disponível para o tratamento desses microrganimos se
torna limitada, sendo necessária a utilização de carbapenêmicos. Entretanto, a
pressão
seletiva
pode
levar
a
emergência
da
resistência
a
estes
antimicrobianos. A polimixina B geralmente é a última opção para o tratamento
dessas infecções. Embora não haja uma padronização pelo CLSI (2007) para o
teste de polimixina B para enterobactérias, estudos de vigilância têm
demonstrado altas CIMs (CIM ≥ 8µg/ml) a este antimicrobiano em isolados de
Enterobacter spp. (Cayô et al., 2007), o que torna mais preocupante a
emergência da resistência aos carbapenêmicos entre esses patógenos.
Estudos posteriores serão realizados no intuito de investigar o contexto
genético destas amostras, como o seqüênciamento dos integrons de classe 1,
bem como a caracterização molecular da porina de 43 kDa e a sua importância
na resistência a ertapenem nos isolados de E. cloacae avaliados no presente
estudo.
85
CONCLUSÕES
7 - CONCLUSÕES
¾ Os altos níveis de resistência observado para cefepima e para as
demais cefalosporinas estão relacionados à produção de duas βlactamases TEM-like e CTX-M associada a hiper-produção de AmpC;
¾ A desrepressão do gene ampC associada a perda de uma porina de 43
kDA provavelmente está relacionada a diminuição da sensibilidade a
ertapenem. O mesmo não foi verificado para as proteínas de membrana
externa de 35 kDa e 36 kDa;
¾ A ausência da diminuição da expressão dos genes ompC e ompF e da
hiperexpressão de sistemas de efluxo podem estar relacionados a
manutenção da sensibilidade ao meropenem e imipenem;
¾ Co-resistência entre cefalosporinas, monobactâmicos, fluoroquinolonas,
aminoglicosídeos,
sulfametoxazol/trimetoprim,
tetracicilina
e
cloranfenicol foi observada entre os isolados de E. cloacae produtores
de ESβL;
¾ Nenhuma redução na concentração inibitória mínima foi observada para
cefepima e para os carbapenêmicos na presença dos inibidores de
bomba de efluxo reserpina e PAβN;
86
CONCLUSÕES
¾ Cefepima foi o melhor antimicrobiano testado para a detecção da
produção de ESβL, no teste de aproximação em disco, entre os isolados
de E. cloacae apresentando desrepressão do gene ampC;
¾ Não
foi
observado
um
único
perfil
clonal
entre
os
isolados
multirresistentes de E. cloacae isoladas de hemoculturas no Hospital
São Paulo. Entretanto, todas as amostras foram incluídas em 3 grupos
clonais, evidêciando a importância da transmissão cruzada de cepas de
micrororganismos na disseminação da resistência.
87
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132
RESUMO
9 - RESUMO
Introdução: A hiper-produção de AmpC associada a impermeabilidade de
membrana externa em Enterobacter spp. pode contribuir no fenótipo de
resistência a cefalosporinas de quarta geração e aos carbapenêmicos. O
objetivo do estudo foi caracterizar os mecanismos de resistência a cefepima e
a ertapenem em 11 amostras de E. cloacae subespécie cloacae isoladas de
hemoculturas no Hospital são Paulo. Materiais e Métodos: O perfil de
sensibilidade foi avaliado por disco difusão e pela técnica de diluição em ágar,
de acordo com o CLSI. A análise das proteínas de membrana externa (OMPs)
foi realizada pela técnica de SDS-PAGE. A similaridade genética foi avaliada
pela técnica de PFGE e o coeficiente similaridade entre os padrões de PFGE
obtidos foi calculado pelo programa Bionumerics. Os isolados foram também
testados contra cefepima, ertapenem, imipenem e meropenem na presença e
na ausência dos inibidores de bomba de efluxo PAβN (25 μg/ml) e reserpina
(20 μg/ml), pela técnica de diluição em ágar. Foram realizados testes de
hidrólise, disco-aproximação para a detecção fenotípica de ESβL e testes de
indução para a detecção de AmpC induzida. A presença de genes
codificadores de ESβL, carbapenemases e AmpC plasmidiais foram avaliados
pela técnica de PCR e confirmadas por seqüênciamento, bem como a
presença de integrons. Os níveis de expressão de ampC, ompC e ompF foram
medidos pela PCR em tempo real. Resultados: Todos os isolados de E.
cloacae subespécie cloacae foram resistentes às cefalosporinas, aztreonam,
associações com inibidores de β-lactamases, tetraciclina, ciprofloxacina e
amicacina por disco difusão. A técnica de diluição em ágar demonstrou altas
133
RESUMO
CIMs para cefotaxima (CIM50, > 256 µg/mL), ceftazidima (CIM50, 256 µg/mL) e
cefepima (CIM50, 256 µg/mL). Todos os isolados foram sensíveis a imipenem
(CIM50, 0.25 µg/mL) e meropenem (CIM50, 0.25 µg/mL). Entretanto, 7 isolados
apresentaram CIMs de 4 µg/ml para ertapenem, 3 isolados foram resistentes
(CIMs de 8 µg/ml) e um isolado foi sensível (CIM de 2 µg/ml). Quatro padrões
de PFGE foram encontrados entre os isolados de E. cloacae subespécie
cloacae multirresistentes. Pelo programa Bionumerics, 3 clusters foram
observados com coeficiente de similaridade acima de 80%. Todas as amostras
foram positivas para ESβL no teste de hidrólise e no disco aproximação. Os
resultados da PCR apresentaram amplificação para blaTEM e blaCTX-M.
Hiperexpressão do gene ampC foi detectado em todos os isolados pela qRTPCR. Somente uma amostra apresentou uma pequena diminuição da
expressão de OmpC. Através do gel de SDS-PAGE foi observado um perda de
uma proteína de 43 kDa quando comparado ao controle sensível. Nenhuma
redução significativa nas CIMs para β-lactâmicos foi observado na presença
dos inibidores de bomba de efluxo. Conclusões: Os resultados mostraram que
a hiper-produção de AmpC associada a produção de ESBL são os
responsáveis pelos altos níveis de resistência a cefepima e a perda de uma
proteína de 43 kDa associada a hiper-produção de AmpC provavelmente foram
os responsáveis pela diminuição da sensibilidade a ertapenem verificada entre
os isolados de E. cloacae subespécie cloacae.
134
ABSTRACT
10 - ABSTRACT
Background: The overproduction of AmpC in Enterobacter spp. can contribute
to
resistance
phenotype
to
fourth-generation
cephalosporins
and
to
carbapenens. The mechanisms of resistance to cefepime and ertapenem were
studied among 11 E. cloacae subespecie cloacae clinical isolates from blood
cultures isolated at São Paulo Hospital. Methods: Susceptibility testing by disk
diffusion and agar dilution techniques was performed according to CLSI.
Analysis of outer membrane protein (OMP) was performed by SDS-PAGE. The
genetic relatedness was evaluated by PFGE and the dendogram was obtained
by Bionumerics program. The isolates were also tested against cefepime,
ertapenem, imipenem and meropenem with and without of PAβN (25 μg/ml) and
reserpine (20 μg/ml), an efflux pump inhibitors by agar dilution. Genes for
ESβLs, carbapenemases and plamidial AmpCs were screened by PCR and
confirmed by sequencing. The expression level of ampC, ompC and ompF
genes was measured by real time PCR (qRT-PCR). Results: All isolates were
resistant to cephalosporins, aztreonam, β-lactamases association inhibitors,
tetraciclin, ciprofloxacin and amikacin, by disk diffusion. All isolates showed high
resistant phenotype to cefotaxime (MIC50, > 256 µg/mL), ceftazidime (MIC50,
256 µg/mL), and cefepime (MIC50, 256 µg/mL) but they were susceptible to
imipenem (MIC50, 0.25 µg/mL) and meropenem (MIC50, 0.25 µg/mL). Seven
isolates showed ertapenem MICs of 4 µg/ml, while other three isolates showed
MICs of 8 µg/ml and one isolate showed MIC of 2 µg/ml. Four clusters were
founded by the Bionumerics program. The PCR results showed amplification for
blaTEM and blaCTX-M. Hyperexpression of ampC was detected in all isolates by
135
ABSTRACT
qRT-PCR. Only one sample showed a decreased in the OmpC expression. The
loss of an OMP of 43 kDa was observed for all isolates in the SDS-PAGE
technicque compared to the susceptible control. No significant reduction for βlactam’s MICs was observed in the presence of PAβN. Conclusions: The
results showed that the hyperproduction of AmpC coupled with ESBL
production were responsible for the high resistant rates to cefepime. The
hyperproduction of AmpC coupled with the loss of an OMP of 43 kDa is likely to
be responsible for the reduced susceptibility to ertapenem in the E. cloacae
subespecie cloacae isolates, which seems not to be associated with efflux
systems.
136
ANEXO
11 - ANEXO
Anexo I - Dados demográficos e clínicos dos pacientes com bacteremia por E. cloacae subespécie cloacae multirresistentes.a
Nº do
paciente
1
Nº da
Iniciais
amostra
10.831
D.S.
Antibióticoterapia
pós isolamento
d
(>48hs)
Conduta
terapêutica
Óbito
CRO
CRO
Inadequada
Sim
CRO
CRO
IMP
Corrigida
Não
Inadequada
Sim
Idade/
Sexo
Doença de
Base
Infecção
Nosocomial/Co
munitária
Bacteremia
(Fonte)
74/M
TU bexiga
Nosocomial
Primária
CRO
Nosocomial
Secundária
Antibióticoterapia
b
prévia
Antibióticoterapia
c
coleta (48hs)
2
10.480
H.A.G.
49/M
Tx fígado,
Ascite
3
13.501
W.G.
76/M
Úlcera
gástrica, BCP
Nosocomial
Primária
CRO
FEP
4
13.550
R.P.S.
60/M
ICC + LMA
Nosocomial
Primária
IMP
IMP
IMP
Adequada
Sim
5
14.008
V.A.S.
27/F
6
11.334
N.O.P.
33/M
Tx cardíaco
Nosocomial
Secundária
(pulmão)
IMP
IMP
IMP
Adequada
Não
7
12.035
J.M.
65/M
BCP
Nosocomial
Secundária
(pulmão)
CRO, OXA
CRO
IMP
Corrigida
Sim
8
10.833
J.S.
34/M
Tuberculose
pulmonar
Nosocomial
Secundária
(pulmão)
VAN
VAN
IMP
Corrigida
Sim
9
11.235
C.J.S.
44/M
HDA + PNM
aspirativa
Nosocomial
Primária
CRO, CAZ, FEP
IMP
IMP
Adequada
Não
10
11.297
M.C.Q.
40/F
LMA
Nosocomial
Primária
FEP, SMX/TMP
FEP, SMX/TMP
FEP, SMX/TMP, LEV
Inadequada
Não
11
20.096
D.A.G.
77/F
Carcinoma
Peritoneal
Nosocomial
Primária
Inadequada
Não
Nosocomial
CIP
137
ANEXO
a - Adapatado da tese de mestrado de Juliana Bertoli da Silva (Da silva, 2005);
b - Utilização de algum antimicrobiano até 10 dias anteriores à coleta da hemocultura;
c - Antibióticoterapia empírica introduzida imediatamente após a suspeita de bacteremia e coleta da hemocultura;
d - Antibióticoterapia mantida ou alterada de acordo com o patógeno isolado na hemocultura (aproximadamente 48 hs após a
coleta);
Abreviaturas: Nº - número; CTX - cefotaxima; CAZ - ceftazidima; FEP - cefepima; IMP - imipenem; AK; amicacina; CRO ceftriaxona; VAN - vancomicina; OXA - oxacilina; SMX/TMP - sulfametoxazol/trimetoprim; LEV - levofloxacina; CIP - ciprofloxacina.
138
ANEXO
139