1
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA
DE
PÓS
GRADUAÇAO
EM
CLÍNICA
VETERINÁRIA
E
REPRODUÇÃO ANIMAL
WILLIAM RENATO DA SILVA MENDES
RESISTÊNCIA IN VITRO AOS ANTIMICROBIANOS DE ISOLADOS DE
Staphylococcus sp. ASSOCIADOS A DERMATITES CANINAS
NITERÓI
2011
2
WILLIAM RENATO DA SILVA MENDES
RESISTÊNCIA IN VITRO AOS ANTIMICROBIANOS DE ISOLADOS DE
Staphylococcus sp. ASSOCIADOS A DERMATITES CANINAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de concetração: Clínica e
Reprodução Animal
ORIENTADOR: PROF. DR. WALTER LILENBAUM
CO-ORIENTADORA: PROFa. DRa. CARLA DRAY MARASSI
NITERÓI
2011
3
WILLIAM RENATO DA SILVA MENDES
RESISTÊNCIA IN VITRO AOS ANTIMICROBIANOS DE ISOLADOS DE
Staphylococcus sp. ASSOCIADOS A DERMATITES CANINAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de concetração: Clínica e
Reprodução Animal
Aprovada em de fevereiro de 2011
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof. Dr. Walter Lilenbaum – orientador
Universidade Federal Fluminense
_____________________________________________________
Profa. Dra. Flavya Mendes de Almeida
Universidade Federal Fluminense
_____________________________________________________
Profa. Dra. Marcia Giambiagi de Marval
Universidade Federal do Rio de Janeiro
NITERÓI
2011
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, por todo seu apoio e suporte
para a realização de um grande sonho em minha vida.
Agradeço por toda a confiança em mim depositada, todos os
ensinamentos ministrados, todo o suporte em minha pesquisa
e pela orientação sempre segura e bem direcionada.
À Profa. Dra. Carla Dray Marassi pela coorientação de meu
estudo, pelo carinho e amizade.
À Profa. Dra. Renata Rabello pelos ensinamentos transmitidos
e por todo o apoio que me deu para a realização deste
trabalho.
À amiga e professora Flávia Clare, que me contagiou com seu
entusiasmo e profissionalismo, mostrando-me um caminho a
seguir na vida. Sinto orgulho de ter sido seu aluno e de ser seu
amigo.
À amiga Flávia Tavares que sempre reconheceu meu potencial
profissional, por todas as oportunidades profissionais que me
proporcionou e por sua amizade.
A toda equipe do Laboratório de Bacteriologia Veterinária da
UFF, incluindo todos que passaram por lá no período em que
foi feito meu estudo e que de alguma forma colaboraram com a
minha formação e com a minha pesquisa. Agradeço em
especial a Bruno de Araújo Penna, Luciana Fonseca Sobral,
Sabrina Alves Thomé, Camila Hamond, Gabriel Martins, Denis
Otaka, Cinthia Jardim, Nielly Salomão e Priscila da Silva Pinto.
À toda minha família, por sempre terem me apoiado em todas
as etapas de minha vida e por acompanharem de perto a
minha caminhada, me incentivando e vibrando com as
conquistas.
Aos amigos que acompanharam de perto os novos desafios
que a vida vem me apresentando, me incentivando e
acreditando em minha capacidade de lutar e vencer.
5
À Profa Dra Ana Ferreira, coordenadora do programa de Pósgraduação em Clínica e Reprodução Animal.
Aos companheiros de turma de mestrado que dividiram comigo
essa etapa de nossas vidas.
Aos animais que fizeram parte deste estudo.
À técnica de laboratório Eliane pelo auxílio no desenvolvimento
do projeto.
À CNPQ e CAPES pelo apoio financeiro.
A todos que de alguma forma contribuíram com este trabalho.
6
SUMÁRIO
Lista de tabelas. p. 8
Lista de figuras e anexos. p.9
Resumo. p. 10
Abstract. p. 11
1. INTRODUÇÃO. p 12
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA. p. 14
2.1 O GÊNERO Staphylococcus sp. p. 14
2.1.1. Características gerais. p. 14
2.1.2. Mecanismos de Agressão. p. 14
2.1.2.1. Enzimas extracelulares. p. 15
2.1.2.2. Exotoxinas. p. 16
2.1.2.3. Adesinas. p.18
2.1.3. Epidemiologia. p 18
2.2. PIODERMITES POR Staphylococcus sp. p. 20
2.3. DIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES POR Staphylococcus sp. p. 26
2.4. RESISTÊNCIA AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS. p. 28
3. OBJETIVOS p. 36
3.1 OBJETIVO GERAL. p. 36
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS p.36
4. MATERIAL E MÉTODOS. p. 37
4.1. DESENHO DO ESTUDO. p. 37
4.2. ANIMAIS. p. 37
4.3. AMOSTRAS. p. 38
4.4. PROCESSAMENTO BACTERIOLÓGICO. p. 38
4.4.1 Cultura bacteriana. p. 38
7
4.4.2 Identificação bacteriana. p. 39
4.5. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA). p. 39
4.6 QUESTIONÁRIOS. p. 40
4.6.1 Ficha Clínica de atendimento dermatológico p.40
4.6.2 Questionário do proprietário p.41
4.7 DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS PRIMÁRIAS APRESENTADAS PELOS
ANIMAIS DOS QUAIS FORAM COLETADAS AS AMOSTRAS p.41
4.8 ESTATÍSTICA p.43
5. RESULTADOS p.44
5.1 DISTRIBUIÇÃO DE ESPÉCIES p.44
5.2 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS p.44
5.3 QUETIONÁRIOS p.55
6. DISCUSSÃO p.59
7. CONCLUSÕES p.75
8. OBRAS CITADAS p.79
8
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -
Distribuição das amostras de estafilococos obtidos de 72 amostras de
secreção dérmica de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil (20092010). p. 46
TABELA 2 -
Padrão de resistência das amostras de estafilococos obtidas de 72
amostras de secreção dérmica de cães da cidade do Rio de Janeiro,
Brasil (2009-2010). p. 47
TABELA 3 -
Padrão de resistência das espécies de staphylococci isoladas de
piodermite de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010).
p.48,49
TABELA 4 -
Resistência das amostras bacterianas por espécie de estafilococos
coagulase positivo obtidas de 72 amostras de secreções dérmicas de
cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010). p. 53
TABELA 5 -
Resistência das amostras bacterianas por espécie de estafilococos
coagulase negativo obtidas de 72 amostras de secreções dérmicas
de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010). p. 54
TABELA 6 -
Alterações clínicas e sua associação aos estafilococos de piodermites
de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil. p. 57
TABELA 7 -
Fatores relativos aos proprietários de cães da cidade do Rio de
Janeiro associados à transmissão zzonótica de cepas MRS. p.58
9
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 - Algorítmo diagnóstico para as doenças alérgicas. p. 42
ANEXOS
ANEXO I – Ficha clínica de atendimento dermatológico. p. 77
ANEXO II – Ficha do proprietário. p. 78
1
0
RESUMO
Membros do gênero Staphylococcus são amplamente disseminados em
caninos e podem ser agentes de pneumonias, dermatites, piodermites, furunculoses,
abscessos, conjuntivites, otites e infecções do trato urinário. O presente estudo se
propôs a avaliar o padrão de susceptibilidade aos antimicrobianos das espécies de
estafilococos isoladas de amostras clínicas de 72 cães acometidos por piodermite.
Amostras foram processadas por métodos bacteriológicos correntes, identificadas
por provas bioquímicas e testadas quanto à susceptibilidade à 16 antimicrobianos.
As espécies coagulase-positivas (CoPS) foram mais frequentemente isoladas, tendo
sido obtidas em 38 (52,8%) animais. Dentre estas, a espécie mais frequente foi S.
pseudintermedius (n=17), seguida de S. intermedius (n=16) e S. aureus (n=cinco).
Já as espécies coagulase-negativas (CoNS) foram isoladas de 34 (47,2%) animais e
se distribuíram entre S. schleiferi schleiferi (n=23), S. simulans (n=seis) e S.
epidermidis (n=cinco). Um total de 90,3% das amostras clínicas apresentou
resistência à pelo menos um agente antimicrobiano e multiresistência (a três classes
de antimicrobianos) foi observada em 53 (73,6%) amostras. Nenhuma amostra
apresentou resistência a todos os antimicrobianos testados. O agente antimicrobiano
para o qual se apresentou a maior resistência (73,6%) foi o sulfametoxazol
associado à trimetoprina e aquele para o qual se observou a menor resistência foi a
rifampicina (2,8%). Cepas de estafilococos resistentes à meticilina (MRS) foram
isoladas em 16 (22,2%) amostras clínicas. O presente estudo reforça a importância
das espécies coagulase-negativas como agentes etiológicos de infecções tópicas
caninas. Infecções causadas por CoNS estão mais associadas a cães que
apresentam dermatite atópica e as causadas por CoPS a cães com hipotireoidismo.
Palavras-chave: Staphylococcus, antimicrobianos, resistência, piodermite, cães.
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ABSTRACT
Members of the Staphylococcus genus are often found on healthy and diseased
dogs, producing a variety of infections, including pneumonia, pyoderma, furuncles,
abscesses, conjunctivitis, otitis externa and urinary tract infection. The purpose of
this study was to evaluate the antimicrobial resistance of Staphylococci obtained
from 72 canine hosts with pyoderma. Samples were processed for isolation of
Staphylococcus. Colonies in pure culture were subjected to standard bacteriological
procedures, including determining whether isolates were susceptible to 16
antimicrobial agents. Overall, coagulase positive species were the most frequently
isolated, being obtained from 38 (52,8%) animals. Among those species S.
pseudintermedius was the most isolated (n=17), followed by S.intermedius (n=16)
and S. aureus (n=five). The coagulase negative species were isolated from 34
(47,2%) animals, distributed among S. schleiferi schleiferi (n=23), S. simulans (n=six)
and S. epidermidis (n=five). Resistance of isolates to antibiotics was common,
90,3% of the samples were resistant to at least one drug, and 73,6 % of the isolates
were multiresistant. No sample was resistant to all antimicrobials tested. The
antimicrobial agent that presented the largest resistance was trimethoprimsulphamethoxazole (73,6%) and the less resistant was rifampin (2,8%). Methicillinresistant Staphylococcus strains were isolated from 16 (22,2%) samples. This study
highlights the importance of coagulase-negative strains in its etiology and reports
alarming antimicrobial resistance of Staphylococcus isolated from canine hosts.
Infections caused by CoNS are more associated with dogs with atopic dermatitis
and those caused by CoPS with dogs with hypothyroidism.
Keywords: Staphylococcus, antimicrobial agents, pyoderma, dog.
1. INTRODUÇÃO
Espécies do gênero Staphylococcus estão amplamente disseminadas,
podendo ser considerados epidemiologicamente cosmopolitas. São membros
residentes da microbiota normal da pele e das mucosas de humanos, mamíferos e
aves. Estão ainda frequentemente envolvidos em grande variedade de infecções,
tais
como
pneumonias,
dermatites,
piodermites,
furunculoses,
abscessos,
conjuntivites, otites e septicemia. O potencial zoonótico dos estafilococos vem sendo
amplamente estudado e existem relatos de transmissão entre cães e seus
proprietários.
Microrganismos multiresistentes a antibióticos são conhecidos desde a
década de 1960 e atualmente representam grande problema para a Saúde Pública.
Muitos destes microrganismos têm padrões de susceptibilidade aos antimicrobianos
bastante variáveis, principalmente em função da troca de material genético e em
especial pela transferência de plasmídeos que contêm genes que conferem às
bactérias resistência a diferentes antimicrobianos. Desde a introdução de drogas
antimicrobianas na prática da medicina veterinária moderna, os microrganismos
evoluíram em resposta a essa pressão. O uso indiscriminado de drogas
antimicrobianas, frequentemente prescritos por clínicos de pequenos animais sem a
prévia realização de cultura bacteriana ou de testes de susceptibilidade aos
antimicrobianos (TSA), também tem contribuído para o aparecimento de cepas
multirresistentes.
Dentre estes, Staphylococcus sp. vem se destacando pelo aumento de sua
frequência
problemática
como
em
causa
de
unidades
infecções nosocomiais, representando crescente
de
saúde
e
em
comunidades
do
mundo
13
inteiro. Estirpes de estafilococos cada vez mais resistentes aos diversos
antimicrobianos disponíveis têm estimulado a comunidade científica a buscar
novas terapias que possam combater a infecção por este agente.
A piodermite é uma das infecções mais comuns que acometem os cães
e seu tratamento geralmente envolve agentes antimicrobianos. Membros do
gênero Staphylococcus sp. são comumente isolados da pele de cães sadios ou
doentes e as espécies coagulase positivas do grupo Staphylococcus
intermedius (S. pseudintermedius e S. intermedius), membros comuns da
microbiota da pele de cães, estão entre os principais agentes envolvidos nos
casos de piodermite canina. Espécies coagulase negativas vêm apresentando
um envolvimento cada vez maior nas piodermites caninas, enfatizando a sua
importância como agentes de infecções estafilocócicas na pele dos cães.
Por se tratarem de agentes oportunistas, normalmente é necessário
algum fator predisponente tais como traumatismos (feridas de pele), infecções
associadas
(demodiciose,
dermatofitose) ou
outras
condições
clínicas
(seborréia, disfunções da glândula tireóide e/ou adrenal, imunossupressão)
para desencadear uma infecção estafilocócica.
Este trabalho tem como objetivo caracterizar amostras bacterianas do
gênero Staphylococcus sp. obtidos a partir de amostras clínicas de cães
acometidos por dermatites segundo a distribuição por espécies e ao perfil de
susceptibilidade in vitro aos antimicrobianos, identificar associações entre as
amostras clínicas de estafilococos e condições associadas às dermatites
observadas e identificar associações entre os microrganismos isolados dos
cães acometidos de piodermites com os fatores de risco para transmissão
zoonótica.
Para tanto foram selecionadas amostras clínicas de cães acometidos por
dermatites diversas, apresentando como doença secundária a piodermite a fim
de se obterem as amostras de estafilococos necessárias ao desenvolvimento
deste estudo.
14
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. O GÊNERO Staphylococcus
2.1.1. Características Gerais
Membros
do
gênero
Staphylococcus
pertencem
à
família
Staphylococcaceae, possuem metabolismo anaeróbio facultativo, são imóveis e
catalase-positivos. São mesófilos, podendo crescer em temperaturas entre 18 a
40ºC, têm tamanhos variando de 0,5 a 1,5µm de diâmetro, sendo Gram
positivos (BIBERSTEIN e HIRSH, 2003; COX, 2006).
Uma importante modificação na taxonomia do gênero foi recentemente
adotada: uma nova espécie foi descrita, S. pseudintermedius (DEVRIESE et
al., 2005). A espécie S. intermedius, quando descrita por Devriese e Hájek
(1980), foi de extrema utilidade por possibilitar sua separação de S. aureus,
evitando assim importante equívoco epidemiológico, já que ambas são
coagulase positivas.
2.1.2. Mecanismos de Agressão
O conhecimento sobre a fisiopatogenia das infecções estafilocócicas
ainda é limitado, com exceção das causadas por S. aureus, porém sabe-se que
a virulência das cepas está diretamente relacionada à presença de cápsula,
toxinas e enzimas extracelulares que produzem uma grande variedade de
efeitos biológicos no hospedeiro após a invasão tecidual (COX, 2006). Dentre
15
os principais mecanismos de agressão incluem-se a produção e liberação de
enzimas extracelulares, adesinas, cápsula e toxinas. Assim, já foram descritas
lipases, estearases, desoxirribonucleases, hialuronidase, fosfolipase, catalase,
e β-lactamase, além da estafiloquinase, um potente ativador de plaminogênio,
e leucocidinas, que lisam leucócitos e macrófagos (TODAR, 2005). Algumas
amostras mais virulentas produzem ainda hemolisinas, que interferem na
resposta quimiotáxica das células de defesa, e coagulase, que é um dos mais
importantes fatores de agressão dos estafilococos e pode ser utilizada para a
diferenciação e identificação de espécies patogênicas (BIBERSTEIN e HIRSH,
2003).
2.1.2.1. Enzimas extracelulares
A coagulase é uma enzima codificada pelo gene coa, o qual parece
estar presente em todas as cepas coagulase positivas. A atividade da
coagulase consiste na conversão do fibrogênio em fibrina pelo complexo
denominado estafilotrombina, formado pela ligação da enzima com a
protrombina (ARVIDSON, 2000). Porém o papel dessa enzima no curso das
infecções por membros do gênero Staphylococcus sp. ainda não está
totalmente estabelecido. Uma possível função desta enzima seria a proteção
do microrganismo contra a resposta de defesa do hospedeiro pela formação de
coágulo de fibrina ao redor do foco de infecção (BIBERSTEIN e HIRSH, 2003).
Em um estudo in vivo, que utilizou um modelo animal para pneumonia, cepas
mutantes deficientes na produção dessa enzima se mostraram menos
virulentas que as cepas selvagens (SAWAI et al., 1997).
A estafiloquinase ou fibrinolisina é um ativador do plasminogênio
codificada pelo gene sak. Seu possível papel em um processo infeccioso seria
facilitar a liberação e movimentação do microrganismo preso em coágulos de
fibrina ou abscessos envolvidos por fibrina, contribuindo assim para
disseminação deste pelo hospedeiro (ARVIDSON, 2000).
Outra enzima extracelular que tem importante papel na disseminação
dos estafilococos pelo organismo do hospedeiro é a hialuronidase, que tem
como função hidrolisar o ácido hialurônico, que é um importante componente
da matriz extracelular (ARVIDSON, 2000).
16
Já a nuclease, também chamada de nuclease estafilococica ou nuclease
A, é uma enzima que hidrolisa as pontes de fosfodiésteres de fita simples e
duplas de RNA e DNA. Membros do gênero estafilococos também produzem e
liberam proteases, que são enzimas proteolíticas, as quais se dividem em três
famílias: serinas, cisteínas e metaloproteases. A serina protease é uma enzima
sintetizada na forma de proenzima cuja ativação se dá pela ação de uma
metaloprotease.
Essa
enzima
pode
promover
a
sobrevivência
e
a
disseminação das bactérias pela inativação de proteínas importantes do
hospedeiro, como imunoglobulinas (ARVIDSON, 2000). Foi recentemente
sugerido que a serina protease tenha um papel importante na transição do
fenótipo adesivo para o invasivo entre as células de estafilococos, devido à
degradação de proteínas de superfície celular bacteriana e proteínas de ligação
como a fibronectina (McGAVIN et al., 1997; KARLSSON e ARVIDSON, 2002).
Com relação à cistina protease, pouco se sabe sobre o seu papel na
patogênese das infecções estafilocócicas (ARVIDSON, 2000; KARLSSON e
ARVIDSON, 2002). Já as funções das metaloproteases são de clivar inibidores
de proteínas plasmáticas, ativar a protrombina no plasma humano e afetar a
ativação
de
linfócitos B
e T e
consequentemente
a produção de
imunoglobulinas in vitro (KARLSSON e ARVIDSON, 2002).
2.1.2.2. Exotoxinas
Membros do gênero Staphylococcus produzem diversas toxinas que
participam de diferentes síndromes clínicas (COX, 2006). As exotoxinas
produzidas pelos estafilococos se dividem em hemolisinas, leucotoxinas e
toxina superantigênicas (toxinas pirogênicas constituídas por enterotoxinas e
toxina da síndrome do choque tóxico e toxinas exfoliativas) (BOHACH e
FOSTER, 2000; FITZGERALD et al., 2003).
São
conhecidos quatro
tipos de
hemolisinas produzidas pelos
estafilococos: α-hemolisina, β-hemolisina, γ-hemolisina e δ-hemolisina. A αhemolisina, além de lise celular ou necrose por formação de poros na
membrana das células alvo, tem a capacidade de induzir apoptose em células
endoteliais, inclusive após a invasão (MENZIES e KOURTEVA, 2000). Pode
ainda ativar fosfolipases e o metabolismo do acido aracdônico, gerando
17
leucocidinas e leucotrienos, o que resulta em efeitos vasoativos que aumentam
a letalidade direta em células endoteliais pela hemolisina (BOHACH e
FOSTER, 2000). A β-hemolisina é uma esfingomielinase neutra que tem
capacidade de lisar eritrócitos. Mas esta atividade varia dependendo da
espécie do hospedeiro, já que a sensibilidade a esta hemolisina depende da
concentração de esfingomielina presente na membrana do eritrócito, o que
varia entre as espécies hospedeiras, sendo os eritrócitos de ovinos, caprinos e
bovinos especialmente mais sensíveis (BOHACH e FOSTER, 2000). A βhemolisina também apresenta efeito leucotóxico, reduzindo a viabilidade de
células polimorfonucleares e mononucleares (MARSHALL et al., 2000). A δhemolisina apresenta efeito citotóxico para eritrócitos e outras células por
danos a membrana, que aparentemente ocorrem pela formação de canais na
membrana (BOHACH e FOSTER, 2000). Já a γ-hemolisina, que tem a
capacidade de destruir eritrócitos, monócitos, macrófagos e outros leucócitos
polimorfonucleares de mamíferos, consiste em uma toxina bi-componente.
Cada um desses componentes tem uma ação, que vão agir em sinergismo
ativando canais de cálcio e formando poros transmembranais permeáveis a
cátions monovalentes na célula alvo (BOHACH e FOSTER, 2000; KANEKO e
KAMIO, 2004).
Além da γ-hemolisina, outras toxinas formadoras de poros, compostas
por duas subunidades, fazem parte da família das leucotoxinas e são a
leucocidina Panton-Valentine e a LukED. O mecanismo de ação destas
leucotoxinas é o mesmo descrito acima para a γ-hemolisina, sendo as
principais células alvo os polimorfonucleares, os macrófagos e os monócitos
(BOHACH e FOSTER, 2000; KANEKO e KAMIO, 2004; VON EIFF et al., 2004).
Dentre as toxinas superantigênicas, as enterotoxinas são responsáveis
principalmente
por intoxicações alimentares.
Uma de
suas principais
características é o fato de serem toxinas termoestáveis, o que facilita a sua
presença em alimentos já cozidos. Já a toxina da síndrome do choque tóxico,
que inicialmente foi denominada de exotoxina C pirogênica estafilocócica, é a
principal toxina associada com a síndrome do choque tóxico em seres
humanos. Este é caracterizado por febre alta, eritema difuso, hipotensão, além
de no mínimo três sistemas orgânicos acometidos (BOHACH e FOSTER, 2000;
DINGES et al., 2000). As toxinas exfoliativas são as responsáveis pela
18
síndrome da pele escaldada, que se caracteriza pela formação de bolhas na
pele e perda de camadas da epiderme. Até o momento, quatro tipos dessa
toxina já foram descritos: ETA, ETB, ETC e ETD.
2.1.2.3. Adesinas
Várias proteínas produzidas pelo gênero Staphylococcus sp. têm sido
estudadas devido ao seu potencial papel na patogênese de processos
infecciosos. Muitas delas são denominadas adesinas, pois estão relacionadas
com o processo de adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro, pela
sua ligação com componentes da matriz extracelular e a proteínas solúveis de
membrana (TODAR, 2005). A primeira delas é a proteína A (SpA), que é
conhecida por sua capacidade de se ligar à porção constante (Fc) da
imunoglobulina, inibindo assim a opsonização.
Outras adesinas que os estafilococos apresentam são as proteínas de
ligação a fibronectina FnBPA e FnBPB, codificadas pelos genes fnbA e fnbB,
que mediam a aderência do microrganismo às células do hospedeiro por meio
de ligação destas com a fibronectina, presente na matriz extracelular (HÖÖK;
FOSTER, 2000). Além de seu papel na aderência ao tecido, as bactérias
podem ainda ser internalizadas por fagócitos pela interação complexa entre as
células bacterianas e do hospedeiro (DZIEWANOWSKA et al., 2000).
A proteína de ligação ao colágeno produzida por algumas cepas de
estafilococos permite a aderência bacteriana ao tecido colagênico. A
importância dessa proteína na patogênese tem sido estudada usando-se
modelos animais. Esses estudos demonstraram a importância dessas adesinas
no curso da infecção (HÖÖK e FOSTER, 2000). Já as proteínas de ligação ao
fibrinogênio, também denominadas de “fator de clumping”, apresentam a
capacidade de coagular o plasma sanguíneo por meio da ligação ao
fibrinogênio (HÖÖK e FOSTER, 2000).
2.1.3. Epidemiologia
Os estafilococos são residentes normais da microbiota da pele e das
mucosas de humanos e animais (LILENBAUM et al., 2000; HOEKSTRA e
19
PAULTON 2002; ROUGIER et al., 2005; MORRIS et al., 2006; COX, 2006;
CASEY et al., 2007), e mesmo as espécies de estafilococos isolados de
animais clinicamente saudáveis são potencialmente patogênicas (COX, 2006).
Segundo Rosser Jr. (2008), entre bactérias residentes da pele canina incluemse os Staphylococcus coagulase-negativos – CoNS - (S. epidermidis, S. cohnii,
S. schleiferi schleiferi, S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus, S. captis,
S. warmeri, S. xylosus, S. simulans e S. scuri) e os coagulase-positivos – CoPS
- (S. intermedius, S. pseudintermedius, S. aureus, S. schleiferi coagulans).
Lilenbaum e colaboradores (2000) reportaram S. epidermidis e S. aureus como
as espécies mais freqüentes em dermatologia canina, seguidas de S. simulans,
S. intermedius, S. haemolyticus e S. saprophyticus.
Além de serem residentes normais de pele e mucosas, membros deste
gênero estão comumente envolvidos numa grande variedade de doenças dos
animais (LILENBAUM et al., 2000; HOEKSTRA; PAULTON, 2002), e sua
presença em infecções de animais já era relatada em 1947 (MORRISON et al.,
1961). A apresentação clínica mais comum nas infecções por estafilococos em
cães é a foliculite superficial (PYNCHBECK et al.,2006). Ainda podem ocorrer
pneumonias, piodermites, furunculoses, abscessos, conjuntivites, infecções do
trato urinário, otites e septicemia (LILENBAUM et al., 2000; HOEKSTRA;
PAULTON, 2002; GANIERE et al., 2005; ROUGIER et al., 2005; LING, 2000
COHN et al., 2003; BUBENIK et al., 2007).
Segundo Biberstein e Hirsch (2003), dentre as várias espécies deste
gênero, quatro delas merecem destaque na clínica de pequenos animais: S.
aureus, S. pseudintemedius, S. epidermidis e S. schleiferi. S. aureus está
freqüentemente associado a infecções supurativas e é reconhecido como
membro residente da microbiota cutânea de humanos e animais (KLOOS,
1995; HOEKSTRA; PAULTON, 2002; CASEY et al., 2007), enquanto S.
pseudintermedius é um residente normal da pele canina saudável (ROSSER
JR, 2008), mas também é sabidamente o principal agente envolvido em
infecções da pele de cães e gatos (BIBERSTEIN et al., 1984; COX et al., 1988;
DEVRIESE, 1990; GANIERE et al., 2005; ROSSER JR, 2008; DEVRIESE et
al., 2009). S. epidermidis é membro da microbiota normal de algumas
superfícies corpóreas dos animais, mas é pouco relatado como agente
causador de doenças em pequenos animais, embora tenha sido identificado
20
como responsável por diversas infecções profundas, em especial em animais
imunocomprometidos (LILENBAUM et al., 2000), em particular nas infecções
adquiridas nosocomialmente (KONNEMAN, 2006). Já a espécie coagulasepositiva S. schleiferi coagulans e a coagulase-negativa S. schleiferi schleiferi já
foram isoladas de pele de cães com piodermite e otite recorrentes (MAY et al.,
2005; ROSSER JR., 2008).
As espécies coagulase-positivas são predominantes nas infecções da
pele dos cães (PRESCOTT et al., 2002; GANIERE et al., 2005). Cox (2006)
afirmou que S. pseudintermedius (então conhecido como S. intermedius) é a
espécie predominante na microbiota bacteriana da pele de cães, e SaijonmaaKoulumies e Lloyd (2002) dizem
que filhotes caninos adquirem
S.
pseudintermedius de suas mães em até oito horas após seu nascimento, sendo
as mucosas oral e nasal os principais focos de colonização. Está bem
documentado que as regiões mucocutâneas oral, nasal e anal servem como
reservatório para colonização por S. pseudintermedius no cão. Além destes, a
orelha é outro sítio de onde o S. pseudintermedius pode ser isolado com
freqüência. Estes locais servem como sítios carreadores para a semeadura
para o resto da pele e pelo pela atividade normal de “grooming” (MAY, 2005).
Estudos recentes demonstraram que as espécies coagulase-negativas
também devem receber atenção no que diz respeito à sua importância clínica
(GRIFFETH et al., 2008; MORRIS et al., 2006), devido ao seu potencial
patogênico não só em humanos (KLOSS e BANNERMAN, 1994; HUEBNER e
GOLDMAM, 1999) assim como em animais, como S. schleiferi schleiferi em
cães (FRANK et al., 2003; MAY et al., 2005) e S. felis em gatos (PATEL et al.,
2002; LILENBAUM et al., 2000). Lilenbaum e colaboradores (2000) relataram
que os Staphyloccocus coagulase-negativos foram as espécies que mais
frequentemente estavam envolvidas com casos de otites externas em cães,
representando 61,3% dos 65 espécimes isolados no estudo.
2.2. PIODERMITES POR Staphylococcus sp.
A microbiota da pele é reconhecida como um importante fator no
entendimento das doenças bacterianas da pele de cães e gatos (LILENBAUM
et al., 1998; COX, 2006). Diferentes estudos têm demonstrado que espécies de
21
Staphylococcus são comumente isoladas da pele de cães sadios ou doentes
(LILENBAUM et al., 2000; NAGASE et al., 2002; HAUSCHILD e WOJCIK,
2007), sendo S. pseudintermedius a principal espécie bacteriana responsável
por casos de infecções cutâneas nos cães (SCOTT et al., 2001; ROSSER JR.,
2008). Intorre e colaboradores (2007) citam que S. pseudintermedius e S.
schleiferi são os agentes etiológicos mais comuns da piodermite canina. Hoje,
sabe-se que a infecção por S. pseudintermedius cria um microambiente
favorável à invasão tecidual por bactérias Gram negativas, especialmente por
bactérias de outros gêneros, como Proteus mirabilis, Pseudomonas sp e
Streptococcus sp (CONCEIÇÃO, 2005).
S. schleiferi coagulans foi isolado pela primeira vez do meato externo do
conduto auditivo de cães em 1990 (IGIMI et al., 1990); foi ainda citado por
Holm e colaboradores (2002), que relataram ser esta subespécie a mais
freqüente em cães com piodermite e otite externa recorrentes, mas também já
tendo sido isolada de episódios de primeira ocorrência de piodermite em cães.
Frank e colaboradores (2003), citam o primeiro isolamento de S. schleiferi
schleiferi de casos de piodermite canina, identificando variantes resistentes à
meticilina. Já Rosser Jr (2008), cita o envolvimento de ambas as subespécies
de S. schleiferi como agentes etiológicos de piodermites recidivantes e
freqüentemente resistentes à meticilina.
Por se tratarem de agentes oportunistas, normalmente é necessário
algum fator predisponente tais como traumatismos (feridas de pele), infecções
associadas
(demodicose,
dermatofitose)
ou
outras
condições
clínicas
(seborréia, disfunções da glândula tireóide e/ou adrenal, imunossupressão)
para desencadear uma infecção estafilocócica (COX, 2006).
A piodermite é a principal doença dermatológica do cão e o tratamento
normalmente envolve o uso de medicamentos antimicrobianos (GANIERE et
al., 2005). As piodermites podem ser classificadas de acordo com a
localização, profundidade da infecção, se é primária ou secundária ou, ainda,
de acordo com o tipo de microrganismo invasor (INTORRE et al., 2007). A
despeito destas várias classificações existentes, o esquema que considera a
profundidade da infecção parece ser o mais útil do ponto de vista clínico, uma
vez que permite inferências terapêuticas e prognósticas (CONCEIÇÃO, 2005).
A profundidade da infecção é provavelmente determinada pela gravidade da
22
depressão da imunidade induzida pela causa subjacente e, este fator permite a
proliferação estafilocócica em nível de superfície cutânea, promovendo primeiro
a colonização e depois a infecção (LLOYD, 2007).
Portanto, de acordo com este esquema elas podem se dividir em três
tipos: as infecções bacterianas da superfície, as piodermites superficiais e as
piodermites profundas.
As infecções bacterianas de superfície afetam somente a parte
superficial da epiderme, sendo limitadas à região interfolicular, normalmente
não formam pústulas, são causadas por uma mudança na condição presente
em nível de superfície cutânea que determina uma degradação da função de
barreira superficial, promovendo uma proliferação bacteriana e tendo como
efeito importante o prurido (LLOYD, 2007). São elas a dermatite úmida aguda
(ou dermatite piotraumática ou mancha quente) e a dermatite das dobras
cutâneas (ou intertrigo) (ROSSER JR, 2008; LLOYD, 2007; CONCEIÇÃO,
2005).
A dermatite úmida aguda (mancha quente) é desencadeada por um
autotraumatismo na pele devido a um processo pruriginoso e/ou doloroso
subjacente (ROSSER JR, 2008), o dano é conseqüência da transferência da
microbiota oral sobre a cútis degradada, por ocasião do mordiscamento e
lambedura
da
lesão.
Os
microrganismos
envolvidos
geralmente
são
representantes típicos da microbiota oral, sendo isolados predominantemente
os estafilococos patogênicos, como S. pseudintermedius (LLOYD, 2007).
Geralmente se apresenta como uma lesão única alopécica circunscrita,
eritematosa, espaçada e erosiva com um fino filme exsudativo sobre a
superfície e geralmente a lesão é dolorosa (ROSSER JR, 2008).
Já a dermatite de dobra cutânea é uma dermatite friccional que ocorre
em áreas onde duas superfícies cutâneas ficam intimamente apostas (SCOTT
et al., 2001). Essas dobras mucocutâneas criam um ambiente úmido, escuro e
aquecido, com má circulação do ar, o que promove o crescimento bacteriano
ou levedural e inflamação subseqüente (ROSSER JR, 2008). Raças como o
Buldogue inglês ou o Shar Pei Chinês, por possuírem dobras mais
proeminentes, são predispostas a sofrerem dessa doença (SCOTT et al.,
2001). O intertrigo se caracteriza por inflamação e exsudação leve e a área
pode freqüentemente ser fétida (ROSSER JR., 2008). Os estafilococos
23
patogênicos tendem a predominar, porém agentes Gram negativos podem
estar presentes, além da levedura Malassezia pachydermatis. O microrganismo
promove a irritação da cútis e o ato de coçar ou lamber contribui para a criação
de um círculo vicioso, perpetuando a infecção (LLOYD, 2007).
As piodermites superficiais são infecções bacterianas que envolvem a
epiderme e o epitélio folicular. São caracterizadas pela formação de pústulas
onde a função de barreira cutânea e a imunidade estão comprometidas de tal
forma que permite não só a proliferação microbiana, assim como a invasão da
epiderme e, incluem: impetigo, piodermite mucocutânea, piodermite superficial
extensiva e a foliculite bacteriana superficial (ROSSER JR, 2008; LLOYD,
2007).
O impetigo é mais observado em cães jovens antes da puberdade e
pode ser resultado de uma enormidade de fatores contribuintes, tais como
desnutrição, ambiente sujo e infecção por ecto ou endoparasitos (ROSSER JR,
2006) e não se trata de uma afecção contagiosa (SCOTT et al., 2001).
Lloyd
(2007) cita que é uma doença encontrada tipicamente em cães adolescentes e
que é causada provavelmente devido ao desequilíbrio hormonal causado pelo
amadurecimento do cão e, que esta condição nos cães jovens envolve os
estafilococos patogênicos. Em cães adultos os principais acometidos são os
que apresentam uma importante doença de base como hiperadrenocorticismo,
diabetes melito, hipotireoidismo ou outras doenças debilitantes (SCOTT et al.,
2001). Nestes casos se observa uma síndrome mais grave que pode envolver
bactérias Gram negativas, como Pseudomonas sp e E. coli (LLOYD, 2007).
Caracteriza-se por pústulas subcorneais que acometem de modo esparso
áreas da pele com pelos (SCOTT et al., 2001) e ocorre especialmente nas
regiões abdominal ventral e inguinal, além de ocasionalmente observarem-se
pústulas na região axilar (ROSSER JR, 2008). Primariamente são encontradas
pequenas pústulas superficiais que não envolvem o folículo piloso, não são
dolorosas e rompem-se com facilidade, não sendo acompanhadas de prurido
(SCOTT et al., 2001).
A piodermite mucocutânea ocorre em cães tipicamente nos lábios e na
comissura ao redor da boca. Cães de qualquer idade, raça e sexo podem ser
acometidos e a primeira mudança notada é a tumefação e eritema simétrico
dos lábios, especialmente nas comissuras, resultante da hiperplasia com
24
formação de pústulas e crostas superficiais, seguido de erosão (SCOTT et al.,
2001). Pode ter aparência de pápula e pústula e, em alguns casos, pode haver
a presença de piodermite profunda, algumas vezes associada a hemorragias
(LLOYD, 2007).
A foliculite superficial ocorre quando a proliferação bacteriana nos
folículos pilosos conduz à formação de pústula no interior do próprio folículo e
na epiderme folicular (LLOYD, 2007) e pode ser primária ou secundária, sendo
que no primeiro caso ela é induzida por estafilococos coagulase-positivos; já no
caso da secundária, que é muito mais comum, ela está associada a um
problema subjacente persistente ou recorrente que altera a resistência da pele
às infecções, sendo necessário nesse caso a identificação da causa primária
para o correto tratamento (ROSSER JR, 2008). Na maioria dos casos a
foliculite superficial em cães é causada por S. pseudintermedius, apesar de
outras espécies estafilocócicas poderem estar envolvidas. Os microrganismos
penetram por trauma estando associados a pelos sujos, tosa deficiente,
seborréia, infestação parasitária, fatores hormonais, irritantes locais ou alergias
(SCOTT et al., 2001). Inicialmente aparece com apresentação semelhante ao
impetigo, com pústulas especialmente distribuídas nas regiões abdominal e
inguinal, no entanto as pústulas se estendem freqüentemente a região axilar e
ao tórax ventrolateral (ROSSER JR, 2008). A característica primária da
foliculite, independente da causa, é a formação de pústula inflamatória mínima
com a haste do pelo protusada a partir do centro. Porém, tal característica pode
ser difícil de ser identificada no paciente, porque são lesões transitórias,
especialmente quando o paciente tem prurido (SCOTT et al., 2001). As lesões
mais comumente observadas são pápulas foliculares, que podem ou não ser
crostosas, colaretes epidérmicos, hiperpigmentação, escoriação e alopecia. As
lesões papulares ou pustulares resultantes são caracterizadas tipicamente por
prurido e o dano autoinfringido pode conduzir à furunculose (LLOYD, 2007).
Áreas anulares de alopecia, eritema, caspas, crostas e hiperpigmentação – as
assim chamadas lesões de olho de boi ou em alvo, circundadas por colarete
epidérmico – são altamente sugestivas (LLOYD, 2007; SCOTT et al., 2001). A
formação desta alteração pode estar associada à secreção de uma toxina
esfoliativa por parte de S. pseudintermedius e a atividade secretória desta
toxina difere entre clones distintos deste microrganismo. É possível que uma
25
lesão que se estenda de uma piodermite superficial difusa esteja associada a
clones de alta capacidade secretora (LLOYD, 2007).
Por sua vez as piodermites profundas são aquelas infecções bacterianas
que envolvem os tecidos mais profundos que o folículo piloso, envolvendo,
além da epiderme, a derme e muitas vezes o tecido subcutâneo. Podem ser
localizadas ou generalizadas e se manifestam quando ocorre uma redução
acentuada da imunidade e da função de barreira cutânea, sendo as principais a
foliculite bacteriana profunda e furunculose (incluindo a podal e a mentoniana),
celulite, foliculite piotraumática, piodermite dos calos de apoio, piodermite do
Pastor Alemão e abscessos subcutâneos (ROSSER JR, 2008; LLOYD, 2007;
CONCEIÇÃO, 2005; SCOTT et al., 2001).
A foliculite profunda é uma infecção do folículo piloso, que se inicia
como uma foliculite superficial, que leva ao rompimento do folículo produzindo
furunculose e celulite, podendo até causar septicemia (ROSSER JR, 2008). Em
geral, é uma conseqüência da extensão da piodermite superficial, mas pode
ainda estar associada a uma outra infecção que cause um dano cutâneo ou
deprima a imunidade. O trauma da lesão superficial pode levar à fratura do
folículo piloso com escape do microrganismo infectante para a derme (LLOYD,
2007). As hastes pilosas soltas e a queratina folicular podem levar a uma
reação de corpo estranho e inflamatória piogranulomatosa na derme,
promovendo a infecção e inibindo a atividade antimicrobiana pelas células
hospedeiras. A sintomatologia é semelhante à da foliculite superficial, porém
com maior intensidade dos sinais clínicos, apresentando prurido mais
exacerbado, dor e linfadenopatia periférica. Também podem ocorrer sinais de
enfermidade sistêmica (anorexia, depressão, perda de peso), além de febre
(LLOYD, 2007; ROSSER JR, 2008). O diagnóstico se baseia na presença de
grande lesão papular ou nodular infectada, freqüentemente associada à
hemorragia ou presença de trajeto fistuloso. Nesta infecção granulomatosa
podem estar envolvidos uma grande variedade de microrganismos e é sempre
importante identificar o agente responsável, pois é comum a presença de
microrganismos infectantes múltiplos (LLOYD, 2007). Na piodermite profunda,
recorrente ou crônica, também pode haver bactéria secundária invasora,
especialmente Pseudomonas spp, Proteus spp e Escherichia coli, podendo
ainda ter como patógenos oportunistas adicionais bactérias anaeróbicas, como
26
Bacteroides spp, Peptostreptococcus spp, Fusobacterium spp, Porphyromonas
spp e Clostridium spp (ROSSER JR, 2008).
Nem todos os casos de dermatite piotraumática (dermatite úmida aguda
ou manchas quentes) respondem rápida e completamente ao tratamento.
Alguns casos evoluem para ulceração superficial, foliculite profunda, supurativa
e necrosante, com furunculose ocasional. Clinicamente a lesão é espessada,
em forma de placa e rodeada por pápulas e pústulas satélites e inúmeros
cocos Gram positivos profundamente nos folículos. Já os abscessos
subcutâneos são raros nos cães, mas ocorrem mais frequentemente em gatos
devido às feridas por mordidas, dentes supurados ou corpos estranhos
(SCOTT et al., 2001).
2.3. DIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES POR Staphylococcus sp.
Os procedimentos para colheita de amostras clínicas podem ser feitos
de diferentes formas, devendo ser usados aqueles que garantam maior chance
de isolamento do agente e diminuam o risco de contaminação (KONEMAN, et
al., 2006). Aspirados de lesões fechadas, como abscessos e otites em estágio
avançado, devem ser colhidos após uma limpeza suave e o exsudato aspirado
com seringas estéreis ou colhido com swabes com cuidado para tocar o
mínimo possível na pele (COX, 2006). Infecções como otite externa,
conjuntivite e furunculose podem ter suas secreções colhidas com o auxílio de
swabes estéreis da lesão, sendo que no caso da otite deve se dar preferência
pelo material da porção horizontal do conduto auditivo (SCOTT et al., 2001;
COX, 2006). No caso de infecções do trato urinário, o método de cistocentese
é o mais indicado e as amostras de urina devem ser acondicionadas de forma
a minimizar o risco de contaminação, devendo ser encaminhadas prontamente
ao laboratório para processamento imediato (BARTGES, 2006).
Infecções
por
Staphylococcus
podem
ser
presumidamente
diagnosticadas com a realização de um esfregaço do material clínico e
coloração pelo método de Gram (COX, 2006). Após a bacterioscopia
presuntiva, as amostras são semeadas em meios de cultura enriquecidos,
sendo que os mais frequentemente utilizados para o isolamento de
27
Staphylococcus sp. são Agar sangue, Agar manitol salgado e Agar tripticasesoja. O Agar manitol salgado ou meio de Chapman é o mais comumente
utilizado para isolamento e identificação dos Staphylococcus. É um meio de
cultura sólido com propriedades seletiva e indicadora. Sua seletividade deve-se
à alta concentração de Cloreto de sódio (7,5%), que inibe o crescimento de
outras espécies bacterianas no meio, enquanto a atividade de indicador é dada
por possuir manitol em sua composição; este carboidrato é consumido apenas
por algumas espécies de Staphylococcus (manitol-positivas), que quando
fermentam manitol tornam o pH do meio ácido, mudando a coloração do meio
de cultura, através de um indicador de pH - o vermelho de fenol (BIBERSTEIN
e HIRSCH, 2003). Após o isolamento, as amostras são identificadas de acordo
com provas bioquímicas ou por métodos moleculares.
Métodos moleculares têm sido utilizados para estudos epidemiológicos
sobre membros do gênero Staphylococcus sp. A maioria dos estudos tem
utilizado metodologias que se baseiam na comparação de perfis de banda de
DNA em géis de agarose ou amido, assim como a análise do DNA polimórfico
amplificado randomicamente pela reação em cadeia de polimerase (RAPDPCR – random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction)
(SAIJONMAA-KOULUMIES et al., 2003), a análise do perfil eletroforético de
isoenzimas (MLEE – multilocus enzyme electrophoresis) (BARRS et al., 2000),
e a análise de perfis de fragmentação de DNA por digestão enzimática por
eletroforese
em
gel
de
campo
pulsado
(PFGE
–
pulsed-field
gel
electrophoresis) (SAZAKI et al., 2007a).
Martineau e colaboradores (2001) desenvolveram um ensaio espécieespecifico para staphylococci baseado na identificação do gene tuf, que
mostrou boa sensibilidade e especificidade para identificação das 70 espécies
do gênero Staphylococcus sp. isolados de amostras clínicas humanas.
Recentemente, um estudo com amostras clínicas obtidas de cães comparou
métodos genotípicos e fenotípicos de identificação de staphylococci isolados de
amostras de secreção auricular e secreção dérmica de cães e concluiu que os
métodos moleculares baseados na amplificação de uma sequência de 16S
rDNA produzem resultados mais confiáveis que métodos bioquímicos rápidos
de identificação (JOUSSON et al., 2007).
28
Baseado em identificação molecular, uma importante modificação na
taxonomia do gênero foi recentemente adotada: uma nova espécie foi descrita,
S. pseudintermedius (DEVRIESE et al., 2005). Posteriormente os isolados
fenotipicamente identificados como S. intermedius foram reclassificados
através de analise molecular filogenética por sequenciamento parcial dos
genes sodA e hsp60 (SASAKI et al., 2007b).
2.4. RESISTÊNCIA AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
Desde a introdução dos agentes antimicrobianos, as taxas de
mortalidade por infecções bacterianas têm diminuído drasticamente. Apesar
disso, o surgimento de cepas resistentes também acompanhou a velocidade
com que novos agentes antimicrobianos foram surgindo e cepas com
resistência múltipla estão emergindo, dificultando o tratamento dessas
infecções (SMITH e JARVIS, 1999; VAN DEN BOOGAARD e STOBBERINGH,
2000).
As infecções causadas por membros do gênero Staphylococcus são
rotineiramente tratadas com uso de antibióticos e, consequentemente, a
resistência às drogas tem sido um achado cada vez mais comum (PRESCOTT
et al., 2002). A resistência aos agentes antimicrobianos dos membros desse
gênero que causam infecções de pele, otites e infecções do trato urinário em
pacientes caninos aumentou substancialmente nos últimos anos (MAY, 2006).
Muitos microrganismos do gênero Staphylococcus têm padrões variáveis
de susceptibilidade aos antimicrobianos, principalmente pela troca de material
genético, em especial de plasmídeos que transferem genes que conferem às
bactérias resistência aos diferentes antimicrobianos (HOEKSTRA; PAULTON,
2002; MALIK et al., 2005). Desde a introdução de drogas antimicrobianas na
prática da medicina moderna, Staphylococcus evoluíram em resposta a essa
pressão (MORRIS et al. 2006). O uso indiscriminado de antimicrobianos,
frequentemente determinado por clínicos de pequenos animais, médicos e
dentistas sem cultura bacteriana prévia ou teste de susceptibilidade aos
antimicrobianos (TSA), também têm contribuído para o surgimento de cepas
multirresistentes (HOEKSTRA e PAULTON, 2002; PRESCOTT et al., 2002;
MORRIS et al., 2006).
29
Em 1944 a penicilina foi introduzida na terapia de doenças infecciosas
bacterianas, sendo que nesta ocasião mais de 94% das amostras de S. aureus
eram susceptíveis a esta droga. Todavia, hoje em dia mais de 80% das cepas
do gênero Staphylococcus sp. são produtoras da betalactamase, uma enzima
que confere resistência a esse agente antimicrobiano (LEONARD e MARKEY,
2007). Em 1945, Cephalosporium acremonium foi isolado da água de esgoto
sem tratamento e a primeira cefalosporina foi derivada desse fungo, a
Cefalosporina C. Embora as penicilinas e cefalosporinas ainda sejam os
agentes antimicrobianos β-lactâmicos mais comumente utilizados, muito
progresso foi feito no desenvolvimento de novos agentes desse grupo. Mais
notadamente, esses incluem os inibidores da β-lactamase (ex. ácido
clavulânico), os carbapenens (ex. imipenem), e os monobactamas (ex.
aztreonam) (VANDEN e RIVIERE, 2001).
Os
agentes
antimicrobianos
β-lactâmicos
exercem
seus
efeitos
bactericidas impedindo a síntese da parede celular bacteriana e rompendo a
sua integridade, ligando-se a uma série de enzimas, conhecidas como
proteínas de ligação de penicilina, que estão envolvidas nos estágios finais da
síntese da parede celular (VANDEN e RIVIERE, 2001). A susceptibilidade a
esses agentes é determinada por fatores independentes, como a produção de
β-lactamase e afinidade da proteína de ligação de penicilina aos β-lactâmicos,
sendo que a produção da enzima β–lactamase é notadamente o principal
mecanismo de resistência à droga (VANDEN e RIVIERE, 2001).
A meticilina, um agente do grupo das penicilinas resistentes à
penicilinase (β–lactamase), foi primeiramente introduzida nos últimos anos da
década de 1950 para o tratamento de infecções causadas por estafilococos
resistentes à penicilina (LEONARD e MARKEY, 2007). Contudo, já no ano de
1961 reportou-se resistência a este agente antimicrobiano e na década de
1970 as cepas de estafilococos resistentes à meticilina (methicillin resistant
staphylococci – MRS) já emergiam como um importante problema nos Estados
Unidos e no resto do mundo. Os MRSA são microrganismos emergentes e
mundialmente disseminados, sendo responsáveis por inúmeras infecções
nosocomiais (CADDICK et al., 2006). Nos anos 80, as cepas de MRSA já
estavam disseminadas e na maioria das vezes eram resistentes a múltiplas
30
drogas, sendo muitas vezes sensíveis somente à vancomicina (LIVERMORE,
2000).
Devido à alta frequência com a qual S. intermedius e S. aureus
produzem β -lactamase, as penicilinas não são mais uma escolha racional para
o tratamento das piodermites. Contudo, a escolha empírica de um antibiótico βlactâmico é sempre apropriada quando se quer tratar infecções de pele em
cães. Esta classe de droga exibe um espectro largo de atividade e baixa
toxicidade para o hospedeiro, sendo efetivas para a maior parte dos
estafilococos, por serem bactericidas e a resistência a estas drogas terem seu
desenvolvimento lento. Apesar de os antibióticos β-lactâmicos continuarem
sendo efetivos quando usados apropriadamente, a prática de se prescrever
dosagens por períodos de tempo insuficientes deve ser desencorajada devido
ao aumento da incidência das infecções por CoNS que tendem ser
mutiresistentes às drogas e à emergência das cepas resistentes à meticilina,
portanto, nestes casos uma investigação meticulosa de tratamentos prévios ,
incluindo dosagens e duração da terapia, deve ser considerada (MAY, 2005).
Cepas exibindo resistência à meticilina podem parecer susceptíveis aos
antibióticos β-lactâmicos in vitro mas são na verdade resistentes à classe
inteira desta droga in vivo. È importante estar ciente deste fato, pois a maioria
dos laboratórios de microbiologia não altera os laudos para refletir este
aspecto, logo se faz crucial o uso do perfil de susceptibilidade à oxacilina ou
meticilina para guiar a interpretação dos resultados (MAY, 2005).
Staphylococus aureus resistente à meticilina (MRSA) é, atualmente, um
dos microrganismos mais estudados, visto a sua importância em Saúde Pública
e distribuição mundial. No Brasil, diversos relatos de isolamento destas cepas
foram citados nos últimos 20 anos. Sader e colaboradores registraram em 1993
prevalência de cerca de 70% entre Staphylococcus aureus isolados em alguns
hospitais da região metropolitana de São Paulo (SADDER et al., 1993). Já
Caiaffa e colaboradores (1994), concluíram que, no Hospital das Clínicas da
FMUSP, 40% dos S. aureus isolados de pacientes ambulatoriais e 70% dos
isolados de pacientes internados foram resistentes à meticilina e, em 2007,
MRSA foi isolado em um hospital em Porto Alegre (MACHADO et al., 2007).
A ocorrência de animais domésticos portadores e infectados com
MRSA tem sido relatada em vários países e espécies animais (LEONARD e
31
MARKEY, 2008), principalmente em cães (WEESE et al., 2007). Existem
também vários relatos de colonização e transmissão de S. aureus, incluindo
MRSA, entre cães e seus proprietários (MANIAN, 2003). Esses relatos geraram
uma preocupação com o papel de cães como possíveis reservatórios de MRSA
na comunidade. Apesar de pouca atenção ter sido dada a resistência à
meticilina em S. intermedius (MRSI) e S. schleiferi (MRSS), esta tem sido
relatada em ambas as espécies.
Acredita-se que este aumento possa ser
devido à prática de se tratar otites e piodermites em cães e gatos de forma
empírica (MORRIS et al, 2006). Frank e colaboradores (2003) citam que S.
schleiferi isolado da pele de cães é frequentemente resistente à meticilina e,
que como a maioria dos animais com otite apresentam concomitantemente
piodermite, a frequente exposição aos vários antimicrobianos utilizados para o
tratamento das piodermites faz com que S. schleiferi isolados da orelha dos
cães tenha um grande potencial de desenvolver resistência. Lilenbaum e
colaboradores relataram presença de isolados MRS em saliva de gatos sadios
(1998) e de casos de otite canina (2000).
Apesar de estes microrganismos serem resistentes à ação das
penicilinases, as penicilinas semi-sintéticas apresentam afinidade a uma
proteína denominada de: “proteína de ligação às penicilinas” (penicillin-binding
protein), conhecidas como PBP2a ou PBP2’. Esta proteína é codificada pelo
gene mecA, que confere às bactérias uma resistência a todos os antibióticos
β-lactâmicos e seus derivados. Este gene é carreado em um elemento genético
específico
móvel
estafilocócico
(staphylococcal
casette
chromossome,
SSCmec (ROBINSON e ENRIGHT, 2004).
Aminoglicosideos constituem uma classe de compostos antimicrobianos
produzidos por cepas de Streptomyces spp., Micromonospora spp. e Bacillus
spp. que têm ampla aplicação na medicina veterinária (RIVIERE e SPOO,
2001a). Os aminoglicosídeos exercem sua ação antibacteriana pela ligação
irreversível a uma ou mais proteínas receptoras na subunidade 30S do
ribossoma bacteriano, interferindo, por isso, em vários mecanismos no
processo de translação do mRNA (RIVIERE e SPOO, 2001a). A maioria dos
agentes antimicrobianos que interferem na síntese protéica é bacteriostática,
mas os aminoglicosídeos são bactericidas. Isso acontece por que esses
agentes causam tanto a leitura incorreta pelo ribossoma como a interferência
32
com a iniciação da replicação do DNA (RIVIERE e SPOO, 2001a). A
resistência à estreptomicina, neomicina e canamicina é um fenômeno comum
em patógenos animais (PRESCOTT et al., 2000). Uma grande variedade de
genes codifica para resistência aos aminoglicosídeos e a presença de
acetiltransferases, nucleotidiltransferases e fosfotransferases tem sido descrita
em estafilococos (SHAW et al. 1993). Genes de resistência a esses agentes
antimicrobianos como aadE, sat4 e aphA-3, que conferem resistência a
bactérias para estreptomicina, estreptotiricina e neomicina respectivamente, já
foram identificados em isolados de S. pseudintermedius obtidos de cães
(BOERLIN et al., 2001).
As sulfonamidas potencializadas continuam sendo uma opção razoável
para o tratamento de infecções bacterianas da pele em pequenos animais
causada por estafilococos. Os CoNS assim como os estafilococos resistentes à
meticilina continuam sensíveis à esta classe de antibióticos. É importante
diferenciar entre sulfonamidas e aquelas que foram potencializadas, ou
combinadas com trimetropim ou ormetropim, quando se for escolher uma droga
desta classe, porque geralmente a resistência é apresentada quando se
emprega sulfonamidas isoaldas. As sulfonamidas isoladas são bacteriostáticas
enquanto que as potencializadas são bactericidas, por isso devem ser
escolhidas quando se trata infecções mutirresistentes ou com resistência à
meticilina (MAY, 2005).
As sulfonamidas são agentes antimicrobianos que necessitam que as
bactérias sintetizem de forma intracelular seu próprio acido fólico para serem
terapeuticamente eficazes (SPOO e RIVIERE, 2001a). O mecanismo de ação
das sulfonamidas se dá pela interferência na produção normal do RNA, da
síntese protéica e dos mecanismos de replicação microbiana, por inibição do
metabolismo intermediário interferindo na produção do ácido fólico (conversão
do
ácido
para-amino
benzóico
em
diidropteroato),
enquanto
as
diaminopirimidinas interferem nas últimas etapas dessa cascata metabólica por
impedirem a produção de ácido tetraidrofólico (SPOO e RIVIERE, 2001a). A
superprodução do ácido p-aminobenzoico, que está associado a uma mutação
cromossomial (sulA), é o mecanismo molecular pelo qual a bactéria adquire
resistência às sulfonamidas (MALIK et al., 2005). Já o mecanismo pelo qual as
33
bactérias adquirem resistência ao trimetoprim é pela produção de dihidrofolato
redutases com baixa afinidade ao trimetoprim (MALIK et al., 2005).
Os agentes antimicrobianos macrolídeos constituem um grupo de
compostos estruturalmente semelhantes, a maior parte dos quais derivados de
várias espécies de bactérias Streptomyces originárias do solo. Macrolídeos são
medicamentos amplamente utilizados em veterinária para o tratamento de
infecções
causadas por
S.
pseudintermedius
resistentes à
penicilina
(PRESCOTT et al., 2000) e à espiramicina (PEDERSEN e WEGENER, 1995,
PELLERIN et al., 1998). A ação antibacteriana dos macrolídeos é devida à
inibição da síntese protéica pela ligação à subunidade ribossômica 50S dos
microrganismos procariotas inibindo a translocação do tRNA do sítio aceptor de
aminoácido, que impede a adição de novas ligações peptídicas e assim evita a
síntese de novas proteínas dentro da célula microbiana (PAPICH e RIVIERE,
2001a). A resistência dos estafilococos aos macrolídeos é causada
principalmente por metilases, que causam uma modificação em um sitio
específico, mas transporte ativo e inativação por ação enzimática também já
foram reportados (SCHWARZ e NOBLE, 1999). A modificação em um sítio
específico é o mecanismo mais comum e envolve a demetilação de resíduos
de adenina no sitio 23S rRNA (WERCKENTHIN et al., 2001). Quatro genes
responsáveis pela formação da rRNA metilase (erm) são ermA, ermB, ermC e
ermF, tendo todos já sido identificados em Staphylococci isolados de origem
animais (SCHWARZ e BLOBEL, 1990; EADY et al., 1993; LODDER et al.,
1996,1997; WERCKENTHIN e SCHWARZ, 2000).
Eritromicina e azitromicina são os macrolídeos mais utilizados, sendo
seu uso limitado devido à sua natureza bacteriostática e a freqüência de
resistência. A eritromicina, quando utilizada em infecções estafilocócicas, é
conhecida por induzir resistência a múltiplas famílias de antibióticos,
principalmente as lincosamidas (JENNINGS et al., 2003).
Lincosamidas apresentam mecanismo de ação bastante semelhante aos
macrolídeos e tem sido usadas também com menor freqüência, devido à
resistência alta apresentada pelos estafilococos a esta classe de drogas. A
lincomicina e a clindamicina representam as lincosamidas mais eficientes
contra os isolados de estafilococos. A resistência à lincomicina começou a ser
notada a partir do final dos anos 1980. Já a clindamicina é bacteriostática em
34
doses baixas, mas bactericida em doses maiores como as indicadas para o
tratamento da osteomielite (MAY, 2005).
A mupirocina é um agente antimicrobiano que apresenta espectro de
ação principalmente contra bactérias Gram positivas como staphylococci e
streptococci, sendo ocasionalmente utilizada no tratamento de piodermite
canina causada por cepas MRS (WERCKENTHIN et al., 2001). Seu
mecanismo de ação é competitivo, inibindo a síntese de isoleucil tRNA e
consequentemente prevenindo a incorporação do aminoácido isoleucina na
cadeia de polipeptídeos em formação, finalmente resultando na quebra da
biosíntese de proteínas (MALIK et al., 2005). A resistência a essa droga pode
ser a altas ou moderadas concentrações do antimicrobiano, dependendo da
localização do gene mupA, plasmideal ou cromossomial, sendo que
staphylococci resistentes a altas concentrações de mupirocina normalmente
carregam esse gene em plasmídeos (MALIK et al., 2005).
O cloranfenicol é ocasionalmente utilizado em cães e gatos e seu
mecanismo de ação é devido a inibição de síntese protéica por uma
interferência na atividade da peptidiltransferase na subunidade 50S do
ribossoma, que está próximo do local de ação dos macrolídeos (PAPICH;
RIVIERE, 2001a). Já foram descritos quatro mecanismos de ação pelos quais
as bactérias adquirem resistência ao cloranfenicol, sendo que o mais
importante é mediado por plasmídeo devido a presença do gene cat, que
codifica a enzima cloranfenicol acetiltransferase, a qual catalisa uma reação
que modifica os grupos hidroxil (SCHWARZ e NOBLE, 1999;
PAPICH e
RIVIERE, 2001a).
As fluoroquinolonas são os agentes antibacterianos sintéticos mais
recentemente
introduzidos
na
medicina
veterinária,
primeiramente
a
enrofloxacina. Desde então houve uma grande quantidade de pesquisas nessa
classe de fármacos para compreender melhor seu mecanismo de ação,
espectro antimicrobiano, farmacocinética e uso clínico em ampla variedade de
espécies animais (PAPICH e RIVIERE, 2001b). São bactericidas por inibirem a
replicação do DNA bacteriano, agindo na subunidade A da DNA-girase e na
topoisomerase IV, sendo esta segunda enzima a mais importante nas bactérias
Gram positivas como estreptococos e estafilococos (FERRERO et al., 1995). A
enrofloxacina e a marbofloxacina vem sendo usadas extensivamente no
35
tratamento de piodermite causadas por S. pseudintermedius (PARADIS et al.,
1990; IHRKE, 1996; KOCH e PETERS 1996; IHRKE et al., 1999). Resistência
às quinolonas é desenvolvida por mutações cromossomiais mediadas por
enzimas (DNA girase e/ou topoisomerase IV) ou por redução do acumulo
intracelular através de bombas de transporte ativo (GANIERE et al. 2005).
A resistência microbiana a estas drogas desenvolve-se pela mutação do
gene gyrA, que codifica a subunidade A da enzima DNA-girase (MALIK et al.,
2005). Uma mutação no resíduo serina-83 é uma das mais comuns, mas no
mínimo outras dez mutações adicionais no gene foram identificadas como
causadoras de resistência (FERRERO et al., 1995). Mutações no gene parC,
que codificam a topoisomerase IV, também foram relatadas e normalmente
exercem um importante mecanismo de resistência quando são encontradas em
associação com a mutação do gene gyrA (PAPICH e RIVIERE, 2001b). O
aparecimento de resistência a esta classe de agentes antimicrobianos tornouse um problema não só na medicina humana como também na medicina
veterinária, principalmente na prática clínica de pequenos animais. Assim,
muitos pesquisadores vem sugerindo que a pressão antibiótica crescente
devida à prescrição aumentada venha selecionando as bactérias resistentes
(PAPICH e RIVIERE, 2001b). A resistência já foi comprovada nos estafilococos
de origem canina, com prevalência de 2% em isolados de amostras de
piodermite (GANIERE et al., 2005).
36
3.
3.1
OBJETIVOS
Objetivo geral
Caracterizar isolados do gênero Staphylococcus sp. obtidos a partir
de amostras clínicas colhidas de cães acometidos por dermatites segundo a
distribuição por espécies e ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos.
3.2
Objetivos específicos
 Determinar a ocorrência de espécies de estafilococos a partir de 72
amostras clínicas de cães de diferentes raças e idades, machos ou
fêmeas, acometidos por dermatite.
 Avaliar a sensibilidade a antimicrobianos destas amostras clínicas.
 Identificar associações entre as espécies de estafilococos e condições
associadas à dermatite.
 Avaliar o potencial de transmissão zoonótica de MRS entre cães e seus
proprietários e vice-versa.
37
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
Foram estudados 72 cães adultos, machos ou fêmeas, com diagnóstico
clínico de piodermite realizado por veterinários, no período de julho de 2009 a
julho de 2010 na cidade do Rio de Janeiro. De cada animal foi colhida uma
amostra de secreção dérmica (pústula) para processamento bacteriológico.
Essas amostras foram submetidas à identificação bioquímica e classificadas
quanto às espécies, assim como ao teste de susceptibilidade aos
antimicrobianos.
Adicionalmente,
uma
ficha
clínica
de
atendimento
dermatológico foi preenchida para cada animal além de um questionário ao
proprietário visando identificar possíveis fatores associados à infecção dérmica.
4.2 ANIMAIS
Foram estudadas amostras obtidas de 72 cães adultos, com idade
variando de 1 a 14 anos, 29 machos e 43 fêmeas, de diversas clínicas da
cidade do Rio de Janeiro. Estes animais não poderiam ter menos de 1 ano de
idade e nem terem sido tratados com antibióticos nos 30 dias antes da coleta
das amostras. De acordo com a avaliação e exame clínico realizado por
médicos veterinários clínicos de pequenos animais, os cães encaixavam-se
nos critérios propostos.
Nos animais com diagnóstico clínico de piodermite, a presença de
sinais clínicos compatíveis com dermatite tais como dor local, prurido, eritema e
38
descamação do epitélio constituíam os critérios de inclusão, devendo estar
presentes no mínimo 2 destes sinais clínicos.
4.3 AMOSTRAS
Para estudo dos casos de piodermite, a secreção dérmica foi colhida
com auxílio de swabes estéreis, após higienização com álcool 70° no entorno
do local escolhido para amostragem, dando-se preferência para pústulas ainda
não rompidas, independente de sua localização anatômica. No caso da pústula
já se encontrar rompida, a coleta foi feita debaixo das crostas. Fez-se ainda
coleta de lesões mais profundas por aspiração por agulha fina.
As amostras clínicas dos cães que atenderam aos critérios de inclusão
foram
enviadas
para
exame
de
cultura
bacteriológica
e
testes
de
susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA) ao laboratório de Bacteriologia
Veterinária da Universidade Federal Fluminense. Todas as amostras foram
enviadas sob refrigeração e processadas em até 24 horas após a coleta.
4.4 PROCESSAMENTO BACTERIOLÓGICO
4.4.1 Cultura bacteriana
Ao chegarem ao laboratório todas as amostras foram analisadas por
microscopia direta, após a realização de um esfregaço do material clínico e
coloração pelo método de Gram. Com ou sem a visualização de cocos Gram
positivos na bacterioscopia, as amostras foram semeadas em caldo BHI
(Merck) para enriquecimento primário, por 24 horas a 37ºC. As amostras que
apresentaram crescimento sugestivo de Staphylococcus sp. no enriquecimento
(coloração de Gram, morfologia das colônias) foram então semeadas em meio
Agar manitol salgado (Agar Chapman - Merck) e incubados a 37ºC por 24/48h,
para adequado crescimento bacteriano e visualização das colônias isoladas. A
metodologia para isolamento de bactérias Gram negativas e anaeróbicas não
foi adotada.
Essas amostras bacterianas isoladas foram submetidas às provas
bioquímicas para identificação de espécies.
39
4.4.2 Identificação bacteriana
As 72 amostras bacterianas isoladas e presuntivamente identificadas
como membros do gênero Staphylococcus sp. foram identificadas com base
nas características coloniais, morfo-tintoriais, produção de pigmento e provas
bioquímicas diversas (MAC FADDIN, 1997; BANNERMAN, 2003) e de acordo
com o Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (HOLT et al., 1994).
Foram empregadas as seguintes provas de identificação:
a) Provas para confirmação de Gênero: prova da catalase, prova OF
(fermentação/oxidação) da glicose em meio Hugh e Leifson, resistência à
Bacitracina 0,04UI. O halo de inibição considerado para resistência a
bacitracina foi menor ou igual a 10mm (BAKER et al., 1986).
b) Provas para identificação especial: teste da coagulase in vitro com
plasma de coelho em tubo, produção de acetoína, urease (Difco), resistência à
novobiocina
(Pimenta
Abreu),
teste
da
deoxiribonuclease
(BBL),
descarboxilação da arginina e ornitina e produção da enzima pirrolidonil
arilamidase, além da fermentação aeróbica de sacarose, D-manose, Dcelobiose, D-xilose, L-arabinose, rafinose, D-trealose, maltose e D-manitol –
Chapman (Merck).
4.5 TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA)
A susceptibilidade aos agentes antimicrobianos foi determinada através
do método de difusão em ágar segundo as recomendações do Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI), sendo utilizada uma mescla dos
protocolos humano e veterinário (CLSI, 2010; CLSIVET, 2008).
Suspensões bacterianas em solução salina estéril (0,9%), ajustadas em
turvação equivalente ao grau 0,5 da escala de McFarland e obtidas a partir de
colônias isoladas após o crescimento em Agar Chapman durante 24 horas à
40
37º C em aerobiose. As suspensões foram semeadas numa placa contendo o
meio Agar Muller Hinton (Muller Hinton Agar, Difco) para a realização do TSA
pelo método de difusão de discos. Os discos dos agentes microbianos foram
depositados com o auxílio de uma pinça e as placas incubadas à 35º C por 24
horas em aerobiose.
Resumidamente, pequenos discos de papel de filtro impregnados com
concentrações conhecidas e pré-definidas (concentração plasmática que a
droga alcança após administração sistêmica) de antimicrobianos foram
colocados eqüidistantes na superfície do meio. Após o período de incubação,
os diâmetros dos halos de inibição de crescimento foram medidos para
interpretação dos resultados. Os microrganismos foram alocados nas
categorias: resistente, intermediário ou sensível, de acordo com os critérios
interpretativos do CLSI/CLSIVET (2010/2008).
Os agentes antimicrobianos testados foram: clindamicina (2 µg),
eritromicina (15µg), tobramicina (10µg), oxacilina (1µg), cefoxitina (30µg),
enrofloxacina (5µg), gentamicina (10µg), penicilina (10 UI), clotrimazol (25µg),
nitrofurantoína (300µg), tetraciclina (30µg), doxiciclina (30µg), rifampicina
(30µg), cloranfenicol (30µg), ciprofloxacina (5µg) e norfloxacina (10µg).
Os discos de eritromicina e clindamicina foram posicionados lado a lado
separados por uma distância de 15 a 26 mm, para a realização do Teste do
Halo “D” ou Teste de resistência induzida à clindamicina, onde amostras
resistentes à eritromicina e sensíveis ou intermediárias à clindamicina, irão
formar um halo em forma da letra “D”, indicando resistência induzida à
clindamicina.
A multiresistência foi definida no presente estudo como a resistência a
três ou mais classes de agentes antimicrobianos, assim como em outros
estudos (HOEKSTRA; PAULTON, 2002; GANIERE et al., 2005; PENNA et al.,
2009a).
4.6 QUESTIONÁRIOS
4.6.1 Ficha clínica de atendimento dermatológico
41
Nesta ficha constavam dados de resenha do animal, dados do
proprietário, queixa principal, tratamentos prévios efetuados (antibióticos, antihistamínicos e corticóides), tempo de tratamento, qual a droga utilizada, a dose
empregada e o resultado (nem todos os proprietários sabiam informar com
precisão), rotina de banhos com os produtos utilizados, frequência e data do
último banho, presença ou não de ectoparasitas, preenchimento de mapa
lesional com descrição das lesões e suas topografias, suspeita clínica do
médico veterinário, data e método de colheita da amostra e outras observações
julgadas necessárias pelo médico veterinário.
Um dos objetivos específicos deste estudo procurava identificar
associações entre os isolados estafilocócicos e condições associadas à
dermatite observada. Foi instituída uma ficha de atendimento dermatológico
(anexo I) e os dados desta ficha foram cruzados de forma a se verificar-se as
possíveis associações significantes. As seguintes associações de dados foram
feitas para isso: microrganismo isolado versus cada doença presente,
microrganismo isolado versus antibiótico utilizado e tempo de tratamento
versus antibiótico utilizado.
4.6.2 Questionário do proprietário
Neste buscou-se informações referentes aos fatores associados à
possível transmissão zoonótica de cepas resistentes à meticilina entre os
proprietários e seus cães. As perguntas feitas foram: Se o animal teve contato
com profissionais que trabalhassem em unidades de saúde (animal ou
humana) ou creche (crianças com menos de cinco anos de idade) nos últimos
seis meses. Se o animal teve contato com crianças menores de cinco anos que
frequentassem creches nos últimos seis meses. Se o animal teve contato nos
últimos seis meses com paciente internado em hospital. Se o animal teve
contato nos últimos seis meses com pessoas em tratamento com antibióticos.
4.7 DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS PRIMÁRIAS APRESENTADAS
PELOS ANIMAIS DOS QUAIS FORAM COLETADAS AS AMOSTRAS
42
Neste estudo foram coletadas amostras de animais apresentando as
seguintes doenças: hiperadrenocorticismo, hipotireoidismo, dermatite atópica,
dermatose responsiva a hormônio sexual, dermatite seborréica, demodiciose,
mastocitoma, carcinoma mamário, adenite sebácea e dermatofitose.
De uma forma geral, o diagnóstico é baseado no histórico, sinais clínicos
e exclusão dos diagnósticos diferenciais. Para o diagnóstico do hipotireoidismo
foi verificada a resposta à suplementação com hormônio tireoidiano (FRANK,
2006) e valores de T4 livre por diálise inferiores a 0,8ng/dL (FELDMAN, 2004 ).
Para o hiperadrenocorticismo, foi feito o teste de supressão por baixa dose
(0,01mg/kg) de dexametasona. Já para a dermatite atópica, foi utilizado o
Algoritmo diagnóstico (MEDLEAU; NHILICA, 2009) descrito a seguir (Quadro 1)
Quadro 1: Algorítmo diagnóstico para as doenças alérgicas:
História e sinais clínicos sugestivos de dermatite atópica, identificar e controlar fatores
perpetuantes, incluindo piodermite, malasseziose, otite externa, demodiciose e doenças
crônicas da pele. Identificar e tratar o cão para dermatite alérgica a pulgas e escabiose
se indicado.
Na reavaliação, ainda há prurido residual, Se na reavaliação não há prurido residual, o
cão tinha dermatite alérgica à pulgas,
determinar se esse é sazonal ou nãoescabiose, DAC sazonal,. Manter o controle
de pulgas e monitorar a recorrência de
sazonal.
prurido.
Se o prurido é não sazonal, o cão tem uma Se o prurido é sazonal, o cão tem ou uma
hipersensibilidade alimentar, DAC ou DAC sazonal ou uma hipersensibilidade à
dermatite por contato (rara). Para distinguir picada de insetos.(incomum)
entre
elas,
estabelecer
a
dieta
hipoalergênica por quatro a doze semanas
Resolução do Não
houve
prurido, o cão melhora,
o
tem
cão tem DAC
hipersensibili
dade
alimentar
Fonte: Medleau; Hnilica (2009)
Melhora
parcial
do
prurido,
hipersensibili
dade
alimentar
com DAC
43
No que se refere ao diagnóstico da dermatose responsiva a hormônio
sexual
foram
realizados
testes
endócrinos,
medindo
o
teor
de
estrógenos/progesterona no sangue.O diagnóstico da dermatite seborréica, foi
realizado pela avaliação dos sinais clínicos e exame histopatológico. Já para o
diagnóstico da Demodiciose, realizou-se microscopia (raspado de pele
profundo) para visualização de Demodex canis.O mastocitoma e o carcinoma
mamário
tiveram
seu
diagnóstico
realizado
com
auxílio
de
exame
histopatológico, assim como a adenite sebácea. Para o diagnóstico de
dermatofitose, realizou-se cultura fúngica em meios de Sabouraud e Mycosel.
4.8 Estatística
Os dados foram analisados quanto à sua significância pelo teste do Quiquadrado (X2), tendo sido encontrados resultados significantes para p<0,05.
44
5. RESULTADOS
5.1 DISTRIBUIÇÃO DE ESPÉCIES
O total de amostras bacterianas oriundas de secreções dérmicas
confirmadas como pertencentes ao gênero Staphylococcus sp. após serem
submetidas aos testes de identificação especial foi de 72. De cada um dos
animais que apresentaram sintomatologia sugestiva de piodermite foi obtida
uma amostra bacteriana.
As espécies coagulase-positivas foram as mais freqüentemente
isoladas, tendo sido obtidas a partir de 38 (52,8%) amostras bacterianas.
Dentre as amostras coagulase-positivas a espécie mais frequente foi S.
pseudintermedius (44,8%) seguida de S. intermedius (42,1%) e S. aureus
(13,1%). Já as espécies coagulase-negativas foram isoladas de 34 (47,2%)
amostras e se distribuíram entre S. schleiferi schleiferi (67,7%), S. epidermidis
(14,7%) e S. simulans (17,6%), conforme a tabela 1 (p. 46).
5.2 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Resistência aos antimicrobianos foi um achado freqüente e 65 (90,3%)
amostras bacterianas apresentaram resistência a pelo menos um agente
antimicrobiano. Multiresistência também foi um achado freqüente, sendo que
53 (73,6%) amostras bacterianas foram multiresistentes. Nenhuma amostra
bacteriana apresentou resistência a todos os antimicrobianos testados. Nove
amostras bacterianas apresentaram resistência induzida à clindamicina. Já em
45
relação às classes de agentes antimicrobianos, nenhuma amostra bacteriana
foi resistente a todas as classes testadas. O padrão de resistência de todas as
amostras bacterianas de estafilococos obtidos de amostras clínicas de cães é
demonstrado nas tabelas 2 e 3 (p. 47-9).
46
Tabela 1 – Distribuição das amostras clínicas de estafilococos obtidas de 72
amostras de secreções dérmicas de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil
(2009-2010).
Espécie
Nº de Amostras
%
S. pseudintermedius
17
23,6
S. intermedius
16
22,3
S. aureus
05
6,9
Subtotal CoPS
38
52,8
S. schleiferi schleiferi
23
31,9
S. simulans
06
8,4
S. epidermidis
05
6,9
Subtotal CoNS
34
47,2
Total
72
100,0
CoPS: Staphylococcus coagulase positivos; CoNS: Staphylococcus coagulase negativos
47
Tabela 2: Padrão de resistência das amostras bacterianas de estafilococos
obtidas de 72 amostras de secreções dérmicas de cães da cidade do Rio de
Janeiro, Brasil (2009-2010).
N0 resistentes
% resistentes
Clindamicina
46*
63,9
Eritromicina
45
62,5
Rifampicina
2
2,8
Cloranfenicol
12
16.7
Sulfametoxazol+trimetoprim
53
73,6
Enrofloxacina
18
25,0
Ciprofloxacina
20
27,8
Norfloxacina
19
26,4
Gentamicina
13
18,0
Tobramicina
9
12,5
Penicilina
41
56,9
Oxacilina
18
25,0
Cefoxitina
13**
18,0
Tetraciclina
26
36,1
Doxiciclina
7
9,7
6
8,3
Agente Antimicrobiano
Quinolonas
Aminoglicosídeos
Beta-Lactâmicos
Tetraciclinas
Nitrofurantoína
*- nove amostras com resistência induzida; **- Todas as amostras estão incluídas na oxacilina.
48
Tabela 3: Padrão de resistência das espécies de staphylococci isoladas de piodermite de cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil
(2009-2010).
Microrganismo
Resistência (%)
Padarão de resistência antimicrobiana , n(Nº amostras clínicas)
S. pseudintermedius
14/17 (82,3%)
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, CIP, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, ERI,
SUT, GEN, PEN, OXA, CFO, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1); CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP,
NOR ,TET (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, PEN (1); CLI, ERI, CLO, SUT, PEN, TET (2); CLI, ERI, SUT, PEN, TET, DOX (1);
SUT, CIP, GEN, PEN (1); CLI, ERI, SUT, NIT (1); CLI, ERI, SUT, PEN (1); SUT, TET (1); SUT (1)
S. intermedius
15/16 (93,7%)
CLI,ERI,CLO,SUT,ENO,CIP,NOR,PEN,OXA (1);CLI,ERI,SUT,ENO,CIP,NOR,GEN,PEN,TET(1);
CLI, ERI, SUT,ENO, CIP,NOR, PEN, TET(1); CLI, ERI, SUT, CIP, NOR, PEN, OXA, TET(1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR,
PEN(2); CLI, ERI, SUT, NIT, PEN, OXA, TET(1); CLI, ERI, CLO,SUT, PEN, TET(1); CLI, ERI, SUT, PEN, OXA, CFO(1); CLI, ERI,
CLO, SUT, PEN(1); CLI, ERI, SUT, PEN(1); CLI, ERI, CIP(1); SUT, PEN(1); SUT(1); ENO(1)
S. aureus
5/5 (100%)
CLI, ERI, CLO, NOR, GEN, OXA CFO (1); CLI, ERI, SUT, NOR, GEN, TET (1); RIF, SUT, NOR, PEN, OXA, DOX (1), CLI, ERI,
SUT, PEN (1), SUT, TOB (1)
Sub total CoPS
34/38 (89,4%)
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, CIP, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, ERI,
SUT, GEN, PEN, OXA, CFO, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1); CLI, ERI,
CLO,SUT,ENO,CIP,NOR,PEN,OXA (1); CLI, ERI, SUT,ENO,CIP,NOR,GEN,PEN,TET(1); CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR ,TET
(1); CLI, ERI, SUT,ENO, CIP,NOR, PEN, TET(1); CLI, ERI, SUT, CIP, NOR, PEN, OXA, TET(1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR,
PEN(3); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, PEN(2); CLI, ERI, SUT, NIT, PEN, OXA, TET(1); CLI, ERI, CLO,SUT, PEN, TET(3); CLI,
ERI, SUT, PEN, OXA, CFO(1); RIF, SUT, NOR, PEN, OXA, DOX (1); CLI, ERI, SUT, PEN, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, NOR,
GEN, TET (1); CLI, ERI, CLO, SUT, PEN(1); CLI, ERI, SUT, PEN(4); SUT, CIP, GEN, PEN (1); CLI, ERI, SUT, NIT (1); CLI, ERI,
CIP(1); SUT, TET (1); SUT, PEN(1); SUT, TOB (1); SUT(2); ENO(1)
S. schleiferi schleiferi
21/23 (91,3%)
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN,OXA, TET (1); CLI, ERI, SUT, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO,TET,DOX (1), CLI,
ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET, DOX (1), CLI, ERI, CLO,
SUT, GEN, PEN, OXA, CFO, TET (1), CLI, ERI, SUT, ENO, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, NIT, ENO, CIP, PEN,
OXA, CFO (1); CLI, ERI, CLO, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, TET (1); SUT, ENO,
CIP, NOR (1); CLI, ERI, PEN, OXA (1); CLI, ERI, SUT (2); RIF, SUT, PEN (1); SUT, CIP, NOR (1); CLI, ERI, CFO (1); SUT, PEN,
TET (1); ERI, SUT (1); SUT, NIT (1); ENO (1)
48
49
S. simulans
6/6 (100%)
CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1); CLI, ERI, NIT, PEN, TET (1); CLI, ERI, TOB, PEN, TET (1); SUT, NIT, PEN,
OXA, CFO (1), CLI, ERI, TET (1); SUT, TOB, PEN (1)
S. epidermidis
4/5 (80%)
CLI, ERI, SUT (1); SUT (2); CLI (1)
Subtotal CoNS
31/34 (91,1%)
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN,OXA, TET (1); CLI, ERI, SUT, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO,TET,DOX (1), CLI,
ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET, DOX (1); CLI, ERI, CLO,
SUT, GEN, PEN, OXA, CFO, TET (1), CLI, ERI, SUT, ENO, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, NIT, ENO, CIP, PEN,
OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1); CLI, ERI, CLO, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, GEN, TOB,
PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, NIT, PEN, TET (1); CLI, ERI, TOB, PEN, TET (1); SUT, NIT, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT,
TET (1); SUT, ENO, CIP, NOR (1); CLI, ERI, PEN, OXA (1); CLI, ERI, SUT (3); RIF, SUT, PEN (1); SUT, CIP, NOR (1); CLI, ERI,
CFO (1); SUT, PEN, TET (1); CLI, ERI, TET (1); SUT, TOB, PEN (1); ERI, SUT (1); SUT, NIT(1); SUT (2); CLI (1); ENO (1)
Total
65/72 (90,2%)
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN,OXA, TET (1); CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, TET, DOX (1); CLI,
ERI, SUT, CIP, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, ERI, SUT, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO,TET,DOX (1), CLI, ERI, CLO,
SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, GEN, PEN, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, GEN, PEN,
OXA, CFO, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1); CLI, ERI, CLO,SUT,ENO,CIP,NOR,PEN,OXA (1);
CLI, ERI, SUT,ENO,CIP,NOR,GEN,PEN,TET(1); CLI, ERI, CLO, SUT, GEN, PEN, OXA, CFO, TET (1), CLI, ERI, SUT, ENO, GEN,
TOB, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, NIT, ENO, CIP, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, TOB, PEN, TET (1);
CLI, ERI, CLO, SUT, ENO, CIP, NOR ,TET (1); CLI, ERI, SUT,ENO, CIP,NOR, PEN, TET(1); CLI, ERI, SUT, CIP, NOR, PEN, OXA,
TET(1); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, PEN(3); CLI, ERI, SUT, ENO, CIP, NOR, PEN(2); CLI, ERI, SUT, NIT, PEN, OXA, TET(1);
CLI, ERI, CLO, PEN, OXA, CFO, TET (1); CLI, ERI, CLO,SUT, PEN, TET(3); CLI, ERI, SUT, PEN, OXA, CFO(1); RIF, SUT, NOR,
PEN, OXA, DOX (1); CLI, ERI, SUT, PEN, TET, DOX (1); CLI, ERI, SUT, NOR, GEN, TET (1); CLI, GEN, TOB, PEN, OXA, CFO (1);
CLI, ERI, CLO, SUT, PEN(1); CLI, ERI, NIT, PEN, TET (1); CLI, ERI, TOB, PEN, TET (1); SUT, NIT, PEN, OXA, CFO (1); CLI, ERI,
SUT, PEN(4); SUT, CIP, GEN, PEN (1); CLI, ERI, SUT, NIT (1); CLI, ERI, SUT, TET (1); SUT, ENO, CIP, NOR (1); CLI, ERI, PEN,
OXA (1); CLI, ERI, CIP(1); CLI, ERI, SUT (3); RIF, SUT, PEN (1); SUT, CIP, NOR (1); CLI, ERI, CFO (1); SUT, PEN, TET (1); CLI,
ERI, TET (1); SUT, TOB, PEN (1); SUT, TET (1); SUT, PEN(1); SUT, TOB (1); ERI, SUT (1); SUT, NIT(1); SUT(4); ENO(2); CLI (1)
CLI- clindamicina, ERI- eritromicina, RIF- rifampicina, CLO- cloranfenicol, SUT-sulfametoxazol+trimetropim, NIT- nitrofurantoína, ENO- enrofloxacina, CIPciprofloxacina, NOR- norfloxacina, GEN- gentamicina, TOB- tobramicina, PEN- penicilina, OXA- oxacilina, CFO- cefoxitina, TET- tetraciclina, DOX- doxiciclina
49
50
No que se refere à susceptibilidade do total de amostras de Staphylococcus de
origem canina para cada classe de antimicrobianos testada, verificou-se que a
resistência à classe dos inibidores do ácido fólico foi um achado comum,
principalmente perante o sulfametoxazol+trimetropim (73,6%, sendo 31 CoPS e
22 CoNS). Dos agentes antimicrobianos testados, os mais eficientes nos testes
de susceptibilidade in vitro foram a rifampicina (classe das ansamicinas) com
somente duas amostras bacterianas resistentes (2,8%, sendo um CoPS e um
CoNS) e nitrofurantoína com seis amostras bacterianas resistentes (8,3%,
sendo dois CoPS e quatro CoNS).
Resistência à classe dos lincosamídeos e macrolídeos foi analisada
conjuntamente uma vez que foi efetuado o teste de indução de resistência à
clindamicina, onde 46 (63,9%) amostras se mostraram resistentes à
clindamicina (26 CoPS e 20 CoNS) e 45 (62,5%) amostras resistentes à
eritromicina (26 CoPS e 19 CoNS). Já a classe dos aminoglicosídeos
apresentou padrão de resistência bastante baixo, estando neste estudo
representada pela gentamicina com 13 isolados (18,0 %, sendo seis CoPS e
sete CoNS) e a tobramicina com nove amostras bacterianas resistentes
(12,5%, sendo quatro CoPS e cinco CoNS).
Já em relação à classe das fluoroquinolonas, os três antibióticos
testados apresentaram resultados bem parecidos no que diz respeito ao
padrão de resistência, com 18 amostras bacterianas resistentes a enrofloxacina
(25%, sendo 10 CoPS e oito CoNS), 19 isolados resistentes a norfloxacina
(26,4%, sendo 13 CoPS e seis CoNS) e 20 isolados resistentes a ciprofloxacina
(27,8%, sendo 13 CoPS e sete CoNS).
Os antibióticos testados da classe das tetraciclinas apresentaram padrão
de resistência bem distintos, uma vez que a tetraciclina teve 26 amostras
bacterianas resistentes (36,1%, sendo 14 CoPS e 12 CoNS) e a doxiciclina
obteve um resultado bem inferior com sete amostras bacterianas resistentes (
9,7%, sendo cinco CoPS e duas CoNS).
Outra classe que apresentou padrão de resistência bastante distinto foi a
das penicilinas, com 41 amostras bacterianas resistentes a penicilina (56,9%,
sendo 24 CoPS e 17 CoNS), 18 amostras bacterianas resistentes a oxacilina
(25,0%, sendo 8 CoPS e 10 CoNS) e 13 amostras bacterianas resistentes à
cefoxitina (18,0%, sendo 5 CoPS e 8 CoNS).Já os fenicóis, aqui representados
51
pelo cloranfenicol, tiveram 12 amostras bacterianas resistentes (16,7%, sendo
oito CoPS e quatro CoNS).
Ao se analisar a resistência para cada classe de antibiótico por espécie
de estafilococos presente, conforme tabelas 4 e 5 (p. 53-4), verificou-se que
dentre os S. pseudintermedius, 12 amostras bacterianas foram multiresistentes
(70,5%), 14 amostras foram resistentes à classe dos inibidores do ácido fólico
(82,3%), 11 amostras às classes dos lincosamídeos e macrolídeos (64,7%), 10
amostras à penicilina (58,8%) e nove à tetraciclina (52,9%), sendo que destas
duas também eram resistentes à doxiciclina. Apresentando padrão de
resistência bem inferior verificou-se as fluoroquinolonas com seis amostras
(35,2%), os aminoglicosídeos com cinco amostras (29,4%) e os fenicóis com
três amostras (17,6%). Somente duas amostras eram MRS e quatro foram
sensíveis a todos os agentes antimicrobianos testados.
Já dentre os S. intermedius, 12 amostras apresentaram mutiresistência
(75%), 13 apresentaram resistência aos inibidores do ácido fólico (81,2%), 12
às classes dos macrolideos e lincosamideos (75%), 10 à penicilina (62,5%),
seis amostras resistentes às fluoroquinolonas (37,5%) e três aos fenicóis
(18,7%). Somente uma amostra foi sensível à gentamicina e à nitrofurantoína,
quatro amostras eram MRS e somente uma amostra foi sensível a todos os
antibióticos testados.
Com
relação
aos
S.
aureus,
quatro
amostras
apresentaram
multiresistência (80%), três eram resistentes às classes dos macrolídeos e
lincosamídeos, dos inibidores do ácido fólico e às fluoroquinolonas (60%), duas
reisitentes à classe dos aminoglicosídeos e à penicilina (40%), duas eram MRS
e nenhuma foi sensível a todos os agentes antimicrobianos testados.
Ao agrupar-se os CoPS observamos que das 38 amostras clínicas, 34
apresentavam resistência a pelo menos um dos agentes antimicrobianos
testados (89,4%), sendo 28 multiresistentes (73,6%), 29 foram resistentes à
classe dos inibidores do ácido fólico (76,3%), 26 às classes dos macrolídeos e
lincosamídeos (68,4%), 19 à penicilina (50%), 14 às fluoroquinolonas e
tetraciclina (36,8%), 10 aos aminoglicosídeos (26,3%), oito aos fenicóis (21%),
oito amostras eram MRS e quatro foram sensíveis a todos os agentes
antimicrobiandos testados.
52
Dentre os S. schleiferi schleiferi, que foi a espécie mais frequentemente
isolada, 18 apresentaram multiresistência (78,2%), 16 eram resistentes à
classe dos inibidores do ácido fólico (69,5%), 15 às classes dos macrolídeos e
lincosamídeos (65,2%), 12 foram resistentes à penicilina (52,1%), sete eram
resistentes às classes das fluoroquinolonas e aminoglicosídeos (30,4%), quatro
à classe dos fenicóis (17,3%) e duas à nitrofurantoína (8,7%), sete eram MRS e
duas amostras foram sensíveis a todos os agentes antimicrobianos testados.
Já dentre os S. simulans, todas as amostras eram multiresistentes, cinco
eram resistentes à penicilina (83,3%), quatro eram resistentes às classes dos
macrolídeos e lincosamídeos e à tetraciclina (66,6%), três à classe dos
aminoglicosídeos (50%), uma amostra resisitente às fluoroquinolonas e
inibidores do ácido fólico (16,6%) e uma amostra era MRS.
E dentre os S. epidermidis, somente uma amostra era multiresistente,
uma se mostrou sensível a todos os antibióticos testados, três eram resistentes
à classe dos inibidores do ácido fólico e duas eram resistentes à classe dos
lincosamídeos.
Já ao se agrupar os CoNS, verificou-se que das 34 amostras clínicas, 31
eram sensíveis a pelo menos um tipo de agente antimicrobiano (91,1%), sendo
24 multiresistentes (70,5%), 21 eram resistentes às classes dos macrolídeos e
lincosamídeos (61,7%), 17 à penicilina (50%), 16 aos inibidores do ácido fólico
(47%), 11 à tetraciclina (32,3%), 10 aos aminoglicosídeos (29,4%), nove às
fluoroquinolonas (23,6%), quatro às clases dos fenicóis e nitrofurantoína
(12,9%) e oito eram MRS.
53
Tabela 4: Resistência das amostras bacterianas por espécie de estafilococos
coagulase positivo obtidas de 72 amostras de secreções dérmicas de cães da
cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010).
Classe e/ou
S.
S.
S.
CoPS
agente
pseudintermedius
intermedius
aureus
(%)
antimicrobiano
(%)
(%)
(%)
Inib. Ác. fólico
82,3
81,2
60,0
76,3
Lincosamídeos e
64,7
75,0
60,0
68,4
Penicilina
58,8
62,5
40,0
50,0
Tetraciclina
52,9
31,2
20,0
36,8
Fluoroquinolona
35,2
37,5
60,0
36,8
Aminoglicosídeos
29,4
6,2
40,0
26,3
Fenicóis
23,5
18,7
20,0
21,0
Oxacilina
11,7
25,0
40,0
21,0
Nitrofurantoína
5,8
6,2
-
5,2
Rifampicina
-
-
20,0
2,6
macrolídeos
54
Tabela 5: Resistência das amostras bacterianas por espécie de estafilococos
coagulase negativo obtidas de 72 amostras de secreções dérmicas de cães da
cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010).
Classe e/ou
S. schleiferi
S. simulans
S.
CoNS
agente
schleiferi (%)
(%)
epidermidis
(%)
antimicrobiano
(%)
Inib. Ác. fólico
69,5
16,6
60,0
47,0
Lincosamídeos e
65,2
66,6
40,0
61,7
Penicilina
52,1
83,3
-
50,0
Tetraciclina
30,4
66,6
-
32,3
Fluoroquinolona
30,4
16,6
-
23,6
Aminoglicosídeos
30,4
50,0
-
29,4
Fenicóis
17,3
-
-
12,9
Oxacilina
30,4
16,6
-
23,5
Nitrofurantoína
8,7
33,3
-
11,7
Rifampicina
4,3
-
-
2,9
macrolídeos
55
5.3 QUESTIONÁRIOS
No que se refere aos resultados obtidos na ficha clínica dermatológica
dos animais estudados, observou-se que a alteração mais freqüentemente
associada à piodermite foi a dermatite atópica (55,2%), seguida de
hipotireoidismo
(19,7%)
e
hiperadrenocorticismo
(7,9%).
Menos
freqüentemente, foram observados casos de dermatite seborréica (3,9%),
dermatose responsiva a hormônio sexual (3,9%), neoplasia (um mastocitoma e
um carcinoma mamário – 2,6%), dermatofitose (1,3%), demodiciose (1,3%),
adenite sebácea (1,3%) e foliculite bacteriana superficial (1,3%). Quatro
animais apresentavam doenças concomitantes, um animal apresentava
dermatite atópica com mastocitoma, um hipotireoidismo com carcinoma
mamário, um hipotireoidismo com adenite sebácea e um hiperadrenocorticismo
com foliculite, conforme tabela 6 (p.57).
Não se observou diferença estatisticamente significativa entre CoPS
(52,8%) ou CoNS (47,2%) na etiologia da piodermite secundária de cães
acometidos por infecções dermatológicas.
A distribuição das amostras bacterianas no que se refere à produção de
coagulase foi similar entre os animais com alterações dérmicas, com exceção
dos animais acometidos de dermatite atópica, que apresentaram um maior
número de infecção causada por CoNS (61,9%). Nestes animais, verificou-se
uma frequência maior (p<0,05) de CoNS do que de CoPS. De forma similar, no
que se refere ao hipotireoidismo as infecções foram mais frequentemente
causadas por CoPS (73,3%; p<0,05), conforme tabela 6 (p. 57).Não se
observou resultados estatísticos significativos para as demais doenças.
No que se refere aos dados coletados no questionário do proprietário,
observou-se que, das 16 amostras bacterianas classificadas como MRS, 11
(68,7%) foram isoladas de animais cujos proprietários apresentavam algum dos
fatores de risco. Dentre estes, o fator mais freqüentemente associado foi de
proprietários que são profissionais de saúde, seguido de proprietários em
tratamento com antibiótico e crianças com menos de cinco anos que
freqüentam creches e proprietário profissional de creche e proprietário
56
internado em hospital nos últimos seis meses (9,1% cada), conforme tabela 7
(p. 58). Ao analisar-se individualmente cada fator não foi possível comprovar
significância estatística; entretanto, ao considerar-se o grupo de proprietários
que apresentavam algum dos fatores de risco, verifica-se que seus cães
apresentavam maior frequência de MRS (p<0,01) do que nos cães cujos
proprietários não apresentavam tais fatores.
57
Tabela 6: Alterações clínicas e sua associação aos estafilococos isolados de
piodermites em cães da cidade do Rio de Janeiro, Brasil (2009-2010).
Total
%
CoPS (%)
CoNS (%)
Dermatite atópica
42
55,2
16 (38,1)
26 (61,9)
Hipotireoidismo
15
19,7
11 (73,3)
4 (26,6)
Hiperadrenocorticismo
6
7,9
4 (66,6)
2 (33,4)
Dermatite seborréica
3
3,9
2 (66,6)
1 (33,4)
Dermatose resp. a horm. sexual
3
3,9
1 (33,4)
2 (66,6)
Neoplasia*
2
2,6
0
2 (100)
Dermatofitose
2
2,6
2 (100)
0
Demodiciose
1
1,3
1 (100)
0
Adenite sebácea
1
1,3
1 (100)
0
Foliculite bacteriana superficial
1
1,3
1 (100)
0
Total
76
100
39 (51,3)
37 (48,7)
CoPS: Staphylococcus coagulase positivos; CoNS: Staphylococcus coagulase negativos
* um mastocitoma e um carcinoma mamário
58
Tabela 7: Fatores relativos aos proprietários de cães da cidade do Rio de
Janeiro associados à possível transmissão zoonótica de cepas MRS
Fator de risco
Nº de
Animais
proprietários
com MRS
%
com fatores de
risco
associado
Profissional de saúde
6
5
83,3
Profissional de creche
1
1
100
Crianças em creche
3
2
66,7
Paciente hospitalizado
5
1
20
Paciente em Tratamento
3
2
66,7
TOTAL
18
11
61,1
59
6. DISCUSSÃO
Membros do gênero Staphylococcus são constituintes da microbiota
normal do ouvido, da pele e das mucosas oral, nasal e genital de caninos
(COX, 2006). Desta forma, o isolamento de membros desse gênero não indica
obrigatoriamente que seja o agente etiológico de um quadro infeccioso em
questão. A fim de evitar tal equivoco, critérios de inclusão rigorosos foram
utilizados na seleção de espécimes a serem estudados e apenas isolados
obtidos em cultura pura foram incluídos no presente estudo. Portanto, levandose em conta estes aspectos assume-se que os 72 isolados de Staphylococcus
sp. obtidos realmente representavam o agente infeccioso determinante dos
casos clínicos de infecção dermatológica presente. Estudos anteriores
(HOEKSTRA; PAULTON 2002; GANIERE et al., 2005; MORRIS et al., 2006,
PENNA et al., 2009b) conduzidos em diversos países corroboram este dado,
demonstrando a importância de membros deste gênero como agente etiológico
das infecções dermatológicas em cães.
Dos 72 isolados de Staphylococcus obtidos, as espécies coagulase
positivas foram isoladas de 38 amostras clínicas de infecções dérmicas.Vários
estudos já demonstraram o papel dessas espécies nestes tipos de infecções
(PRESCOTT et al., 2002; GANIERE et al., 2005, PENNA et al., 2009b).De um
modo geral, as espécies coagulase-positivas foram levemente predominantes
(52,8%) em relação às espécies coagulase-negativas (47,2%), o que está de
acordo com o relatado em outros países e no Brasil (PRESCOTT et al., 2002;
HOEKSTRA; PAULTON, 2002; GANIERE et al., 2005; MORRIS et al., 2006,
PENNA et al., 2009b). Os resultados próximos (encontrados neste estudo)
60
demonstram
que
cães
acometidos
por
afecções
dermatológicas
têm
piodermite, independentemente de ser causada por CoPS (52,8%) ou CoNS
(47,2%).
No que se refere à distribuição por espécies no grupo dos CoPS, a
predominância do grupo S. intermedius (SIG) sobre S. aureus também não foi
surpreendente, visto que este grupo é reconhecidamente o principal causador
das infecções de pele em cães (BIBERSTAIN et al., 1984; LILENBAUM et al.,
2000; LING, 2000; HOEKSTRA; PAULTON, 2002; GANIERE et al., 2005;
PENNA et al., 2009a), mesmo porque as espécies presentes neste grupo são
integrantes da microbiota normal da pele (LILENBAUM et al., 2000; SCOTT et
al., 2001; GANIERE et al., 2005; ROSSER JR, 2006; PENNA et al., 2009b).
Portanto, a predominância desse grupo em amostras de secreção dérmica no
presente estudo não foi um resultado inesperado. Vale ressaltar que o número
baixo de S. aureus neste estudo, sugere que nossas amostras eram adaptadas
ao cão, não tendo sido originadas de contaminação do proprietário uma vez
que nos humanos, em contraste com os cães, geralmente há uma presença
maior de S. aureus nas infecções de pele (FOSTER, 2009).
Membros das espécies coagulase-positivas de staphylococci são
sabidamente mais virulentos. A presença de diversos fatores de agressão e da
própria enzima coagulase confere a estas espécies maior capacidade de
determinar infecções, mesmo com nenhuma ou pouca influência de fatores
predisponentes. Dessa forma, sua predominância como agentes de infecções
em caninos não foi um fato inesperado.
Em relação à distribuição por espécies no grupo dos CoNS, estes
representaram 47,2 % das amostras deste estudo, havendo uma grande
ocorrência de S. schleiferi schleiferi (31,9% das amostras), um resultado
inesperado, pois em nenhum outro estudo se obteve uma quantidade tão
grande de amostras desta espécie. Foram encontrados ainda S. simulans
(8,4%) e S. epidermidis (6,9%).
A alta ocorrência de coagulase-negativos foi um achado inesperado e
sugere um papel importante destes microrganismos na etiologia das infecções
tópicas caninas, o que com frequência vinha sendo subestimado. Esse fato já
foi relatado em outros estudos que evidenciaram presença importante de
estafilococos coagulase negativos causando infecções de pele (LILENBAUM et
61
al., 2000; MAY et al., 2005; ROSSER JR., 2008, PENNA et al., 2009b). É
importante ressaltar que essas espécies representaram 47,2% dos isolados do
presente estudo, um percentual bastante elevado já que nenhum dos cães do
estudo se encontrava hospitalizado, reconhecidamente um fator predisponente
para infecções determinadas por esses microrganismos oportunistas.
Desde 2003, que o envolvimento de S. schleiferi schleiferi já vem sendo
relatado como agente etiológico de piodermite canina em vários países,
incluindo o Brasil (FRANK et al., 2003; MAYet al., 2005; IN TORRE et al., 2007,
ROSSER JR, 2008; PENNA et al., 2009b), tendo sido isolado tanto de primeiro
episódio de piodermite, assim como de casos recidivantes.
S. epidermidis é um membro da microbiota da superfície corporal de
pequenos animais. Apesar de esta bactéria ter sido raramente citada como
agente etiológico de doenças de pele em pequenos animais, tem sido
identificada como responsável por diversas infecções profundas, especialmente
em animais imunocomprometidos (PENNA et al., 2009b). Lilenbaum e
colaboradores (2000), em um estudo com população de mesma região
isolaram 25% de amostras clínicas desta espécie, um resultado bem superior
ao encontrado no presente estudo. Por outro lado, Penna e colaboradores
(2009b), obtiveram resultados bem próximos (7,9%) dos do presente estudo
(6,9%). Estes mesmos estudos citam ainda o envolvimento de S. simulans em
15,9% (LILENBAUM et al., 2000) e 7,9% (PENNA etal., 2009b) das infecções
tópicas caninas, estes resultados estão bem próximos aos encontrados neste
estudo (8,4%).
A resistência aos antimicrobianos é um fato que já vem sendo relatado
há várias décadas, desde o aparecimento das penicilinas na década de 1940,
quando a euforia pelo seu surgimento destas para o tratamento de doenças
infecciosas causadas por bactérias foi logo frustrada pelo aparecimento de
cepas resistentes (TENOVER, 2006).
A resistência aos antibióticos tem se tornado cada vez mais comum
nos estudos sobre susceptibilidade de microrganismos a esses agentes, sendo
um achado frequente. No presente estudo 65 (90,3%) dos isolados
apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano, assim como
a multiresistência também foi um achado comum, estando presente em 53
(73,6%) dos isolados. Estudos mais antigos relataram frequência bastante
62
inferior de multiresistência entre cepas de estafilococos, como por exemplo,
51,3% (HOEKSTRA e PAULTON 2002); e um estudo mais atual feito por
Penna e colaboradores (2010) em população da mesma região demonstrou
resultados superiores, onde todos os isolados apresentaram resistência a pelo
menos um agente antimicrobiano e multiresistência em 86,5% dos isolados.
Staphylococci têm apresentado um rápido desenvolvimento de resistência aos
agentes antimicrobianos, o que, associado aos achados do presente estudo,
pode indicar que essa tendência também ocorre em isolados de estafilococos
de origem canina (MORRIS et al., 2006; PENNA et al., 2010). É importante
salientar que as amostras foram obtidas de diversas clínicas veterinárias da
cidade do Rio de Janeiro e em alguns animais a enfermidade era de natureza
crônica ou recidivante. Portanto, não se pode negligenciar a possibilidade dos
animais já terem recebido tratamento prévio com agentes antimicrobianos. Tal
fato pode ter contribuído para a alta frequência de cepas multirresistentes no
presente estudo. A pressão antibiótica sobre os agentes infecciosos
bacterianos, que propicia a seleção de cepas resistentes aos agentes, é um
fator que sabidamente contribui para o surgimento cada vez mais frequente de
cepas multirresistentes (PAPICH e RIVIERE, 2001b).
O agente antimicrobiano ao qual os microrganismos apresentaram
maior taxa de resistência neste estudo foi sulfametoxazol associado ao
trimetoprim. Esse fato foi observado em 53 dos 72 isolados (73,6%) e está de
acordo com estudos desenvolvidos em outros paises como 77,4% na Austrália
(BARRS et al., 1995) e 74,4% no Canadá (HOEKSTRA; PAULTON 2002).
Esse agente antimicrobiano já foi mundialmente utilizado num passado recente
em muitos casos de primeiro episódio de piodermite (CARLOTTI, 1996;
DOWLING, 1996) e a resistência a essa droga tem crescido rapidamente, já
que em 1983 a resistência reportada era de apenas 2% (ROHRICH et al.,
1983).
Atualmente é uma droga bastante utilizada para o tratamento de
diversas infecções em cães.
A resistência às classes dos lincosamídeos e macrolídeos foi também
bastante alta. Um total de 46 amostras (63,9%) foi resistente a clindamicina e
45 (62,5%) a eritromicina. Outros estudos demonstraram resistência de
staphylococci à eritromicina, com valores variando entre 7,8% no Japão, 10%
na Austrália e 21% nos Estados Unidos da América (HAUSCHILD e WÓJCIK,
63
2007), e até 82,1% no Brasil (PENNA et al., 2009b). Devido à boa absorção
oral, distribuição tissular na pele e alta concentração intracelular, macrolídeos e
lincosamídeos são considerados opções razoáveis para a primeira linha de
tratamento das piodermites causadas por staphylococci em cães (CARLOTTI,
1996; DOWLING, 1996; NOLI; BOOTHE, 1999). Apesar deste fato, nos casos
de piodermite recidivante seu uso é bastante limitado por um alto nível de
resistência, além da resistência cruzada entre estas duas classes de agentes
antimicrobianos
(PELLERIN
et
al.,
1997).
A
utilização
de
agentes
antimicrobianos da classe dos macrolídeos na prática de dermatologia de
pequenos animais, especialmente na dermatologia canina vem crescendo nos
últimos anos (MALIK, et al 2005). Devido a isso, staphylococci têm sido
descritos como cada vez mais resistentes a altas concentrações dos agentes
da classe dos macrolídeos (COX et al., 1984; KRUSE et al., 1996).
Os aminoglicosideos vêm sendo amplamente utilizados no tratamento de
diversos tipos de infecções caninas (MALIK et al., 2005). A resistência aos
aminoglicosídeos, representados neste estudo pela tobramicina e gentamicina,
foi baixa.
Em relação à gentamicina, somente 13 dos 72 isolados se
mostraram resistentes (18%). Na década de 1970 a gentamicina era
considerada uma droga extremamente eficiente no tratamento de otite externa
canina, quando era reportado apenas 5,6% de resistência (BLUE; WOOLEY
1977). Mais recentemente, estudos demonstravam 3,7% de resistência a esse
agente em 1998, nos EUA (COLE et al., 1998) e 15,9% no ano 2000
(LILENBAUM et al., 2000) em população similar à estudada neste momento, o
que mostra uma pequena evolução dos níveis de resistência à esta droga. O
uso desta classe de agentes antibióticos para o tratamento das piodermites é
bastante limitado, uma vez que eles requerem administração parental e estão
associados à nefrotoxicidade quando utilizados por períodos longos (CODNER,
1988).
O uso dos agentes antimicrobianos da classe das fluoroquinolonas na
medicina veterinária tem aumentado muito nos últimos dez anos (PAPICH e
RIVIERE, 2001) e, este fato tem contribuido para o aumento da resistência à
esta classe de antibióticos (WALKER e THORNSBERRY, 1998). As
fluoroquinolonas
são
recomendadas
principalmente
para
a
terapia
antimicrobiana em infecções mistas, em piodermites recidivantes, piodermites
64
crônicas, piodermite profunda com tecido de cicatrização extenso ou quando o
tratamento se mostra refratário aos antibióticos de primeira geração (IHRKE et
al.,
1999).
Nesta
classe,
os
três
agentes
antimicrobianos
testados
apresentaram resultados similares entre si. Um total de 18 (25%) amostras
bacterianas se mostraram resistentes à enrofloxacina, enquanto 19 (26,4%) à
norfloxacina e 20 (27,8%) à ciprofloxacina. Ganiere e colaboradores (2005), em
um estudo desenvolvido na França, verificaram níveis bastante reduzidos de
resistência a essa classe (2%).
A produção da enzima β-lactamase é o principal mecanismo de
resistência pelo qual os estafilococos se tornam capazes de resistirem à ação
dos antibióticos da classe das penicilinas (MALIK et al., 2005). Neste estudo
foram testados três agentes antimicrobianos da classe das penicilinas, que
apresentaram resultados bem distintos, com 56,9% de resistência à penicilina,
25% à oxacilina e 18% à cefoxitina.Tal discrepância entre drogas da mesma
classe não pode ser considerada surpreendente, visto que as duas últimas
drogas são resistentes à ação da β-lactamase. A alta resistência observada à
penicilina pode ser justificada pela produção desta enzima, o que já foi
demonstrado em até 62% das amostras bacterianas de S. pseudintermedius
de origem canina (GANIERE et al., 2005).
De acordo com o CLSI (2010) e CLSIVET(2008), cepas penicilinaresistentes e oxacilina-suscetíveis são resistentes a outras penicilinas
penicilinase-estáveis mas suscetíveis a outros β-lactâmicos. Staphylococci
resistentes à oxacilina são resistentes a todos os agentes antimicrobianos
disponíveis atualmente, com exceção das novas cefalosporinas com atividade
anti-MRSA. Assim, resistência ou suscetibilidade a uma gama ampla de
agentes antimicrobianos β-lactâmicos pode ser deduzida ao se testar a
oxacilina e/ou cefoxitina (no caso de CoPS) ou cefoxitina (no caso de CoNS)
(CLSI, 2010). Bemis e colaboradores (2009) citam que a utilização somente
dos discos de cefoxitina para testar a resistência do S. pseudintermedius
(CoPS) aos β-lactâmicos, pode subestimar o número de amostras clínicas
resistentes, recomendando a utilização dos discos de oxacilina. Considerandose apenas as recomendações para detecção de resistência à oxacilina do
CLSIVET (2008), os resultados poderiam ser diferentes uma vez que não se
recomenda ainda a utilização dos discos de cefoxitina para os CoNS. Ao
65
verificar-se índices de resistência à oxacilina em animais da mesma região,
verifica-se um claro aumento da resistência com o passar dos anos. Assim, se
em 2000 tal índice era de 4,6% (LILENBAUM et al. 2000), em 2008 já havia
sido reportado como 19,5% (PENNA et al., 2009b). Em um estudo retrospectivo
conduzido nos Estados Unidos, observou-se que a resistência à oxacilina
aumentou substancialmente entre os anos de 2001 e 2005 (JONES et al.,
2006). Cepas resistentes à oxacilina (MRS) em amostras de origem canina já
foram relatadas em vários paises (MORRIS et al., 2006; WEESE et al., 2007;
HANSELMAN et al., 2008) e representam importantes microrganismos
emergentes e mundialmente disseminados, responsáveis por graves infecções
nosocomiais (MANGENEY et al., 2002; CADDICK et al., 2006).
Cefalexina e amoxicilina associada ao ácido clavulânico são drogas das
mais utilizadas na dermatologia clinica veterinária e a resistência a elas tem
sido pouco descrita, a não ser em casos de cepas MRS (PRESCOTT et al.
2002; GANIERE et al. 2005).
A classe das tetraciclinas foi representada neste estudo pela tetraciclina
e
a
doxiciclina,
que
apresentaram
36,1%
e
9,7%
de
resistência,
respectivamente. Níveis de resistência variando de 30 a 55% foram relatados
em muitos estudos em vários países ( MEDLEAU et al., 1986, NOBLE; KENT,
1992; LLOYD et al., 1996; GANIERE et al., 2005) e, consequentemente, as
tetraciclinas não têm sido recomendadas para o tratamento das piodermites em
cães (CODNER, 1988; CARLOTTI, 1996, DOWLING, 1996). Segundo o CLSI
(2010) e CLSIVET (2008), organismos que são suscetíveis à tetraciclina são
também
considerados
suscetíveis
à
doxiciclina,
contudo,
alguns
microrganismos que apresentem padrão intermediário ou resistente à
tetraciclina podem ser suscetíveis à doxiciclina. A tetraciclina não vem sendo
muito utilizada sistemicamente devido a seus efeitos hepato e nefrotóxicos,
além de incompatibilidade química com diversas outras drogas, sendo utilizada
na dermatologia de pequenos animais principalmente em apresentações
tópicas (VIANA, 2007). Já a doxiciclina tem sido bastante utilizada como droga
de escolha para o tratamento da erlichiose em cães e não é usualmente
indicado para o tratamento das infecções dérmicas (BIRCHARD; SHERDING,
2008).
66
Representando a classe dos fenicóis, o cloranfenicol apresentou
resistência em 16,7% das amostras. O cloranfenicol tem sido utilizado muito
raramente para o tratamento das piodermites caninas (GANIERE et al., 2005).
Pellerin e colaboradores (1997), encontraram 40% de resistência à esta droga
em um estudo feito na França, um resultado bem mais alto que o encontrado
neste estudo. Já Vanni e colaboradores (2009), em um estudo feito na Itália
encontraram resistência em 14,9% das amostras clínicas, resultados bem
semelhantes aos nossos. Em função de sua toxicidade seu uso não é
recomendado na clínica de pequenos animais pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (VIANA, 2007). Na clínica dermatológica tal droga
encontra-se presente em diversas formulações de uso tópico.
A rifampicina, da classe das ansamicinas, apresentou somente 2,8% de
resistentência. Este resultado é bem semelhante ao encontrado em uma
população local (LILENBAUM et al., 2000) onde encontraram 2,3% das
amostras clínicas resistentes, o que demonstra que o padrão de resistência a
este agente antimicrobiano se manteve quase igual. É uma droga hepatotóxica
em altas doses (VIANA, 2007) e muito pouca usada em tratamentos
sistêmicos, embora seu uso em aplicações tópicas, bastante úteis em
dermatologia veterinária, possa representar uma excelente opção de
tratamento, devido ao baixo padrão de resistência encontrado.
Finalmente, a nitrofurantoína, pertencente a uma classe com o mesmo
nome, apresentou 8,3 % de resistência. Penna e colaboradores (2009b),
encontrou em seu estudo, nível bastante alto de resistência (38,5% das
amostras de infecções tópicas em população semelhante a deste estudo) à
esta droga, resultado este muito mais alto que os deste estudo. Tal droga,
tradicionalmente recomendada para o tratamento das infecções do trato
urinário, pode causar distúrbios gastrintestinais e hepatopatias, quando usada
em tratamentos longos e altas doses (VIANA, 2007).
Ao se analisarem os resultados por espécies, das 17 amostras de S.
pseudintermedius, 82,3% eram resistentes a pelo menos um dos agentes
antimicrobianos testados e a multiresistência esteve presente em 70,5% das
amostras. A resistência à classe dos inibidores do ácido fólico foi a mais alta
observada (82,3%), seguida pela classe dos macrolídeos e lincosamídeos
(64,7%) e pela penicilina (58,8%) e tetraciclina (52,9%). As classes que
67
apresentaram melhores resultados de resistência, foram as fluoroquinolonas
com 35,2%, os aminoglicosídeos com 29,4% e os fenicóis com 17,6%.
Já com relação às amostras de S. intermedius, 93,7% apresentaram
resistência a pelo menos uma dos agentes antimicrobianos testados e 75% das
amostras eram multiresistentes. Vanni e colaboradores (2009), encontraram
27% de resistência, testando 23 agentes antimicrobianos, em um estudo com
114 amostras clínicas de piodermite canina. Já em um estudo conduzido na
França em 2002, a multiresistência era de 42% (GANIERE et al., 2005). Assim
como na espécie anterior, apresentou resistência bem alta aos inibidores do
ácido fólico (81,2%), aos macrolídoes e lincosamídeos (75%) e à penicilina
(62,5%), porém apresentou apenas 25% à tetraciclina. A resistência às
fluoroquinolonas e aos fenicóis teve resultados bem similares aos da espécie
anterior (37,5% e 18,7%, respectivamente), porém, em relação à classe dos
aminoglicosídeos, a resistência foi muito mais baixa (6,25%). Cepas MRS
estiveram presentes em 25% das amostras clínicas. Estes resultados foram
bastante contrastantes com os de Ganiere (2005), que encontrou 48 % de
resistência à tetraciclina, 30% aos fenicóis, 28% aos macrolídeos e
aminoglicosídeos, 22% aos lincosamídeos, 2 % à gentamicina e enrofloxacina
e nenhuma resistência à oxacilina e inibidores do ácido fólico. Já Vanni e
colaboradores (2009) apresentaram resultados mais próximos aos deste
estudo, pois encontraram alta resistência às classes dos macrolídeos e
lincosamídeos.
Com relação aos S. aureus, 100% das amostras apresentaram
resistência a pelo menos um dos agentes antimicrobianos testados, 80%
apresentaram multiresistência. Hoekstra e colaboradores (2002) encontraram
95,5% das amostras resistentes a pelo menos uma agente antimicrobiano e
67,3% de multiresistência. Já Lilenbaum e colaboradores (2000) também
encontraram 100% das amostras resistentes a pelo menos um agente
antimicrobiano e somente 36,3 % de multiresistência. Assim como nas outras
duas espécies de CoPS presentes neste estudo, a resistência às classes dos
macrolídeos e lincosamídeos e dos inibidores do ácido fólico foi bastante alta
(60%). Em comparação, a resistência às fluoroquinolonas foi bem maior nesta
espécie (60% versus 32,5% e 37,5%), assim como em relação aos
aminoglicosídeos (40% versus 29,4% e 6,25%) e aos β-lactâmicos (40% versus
68
11,7 e 25%) e bem mais baixa em relação à penicilina (40% versus 58,8% e
62,5%). A resistência à tetraciclina teve um resultado intermediário (40%
versus 52,9% e 25%). Em um estudo feito no Canadá, 74,5% das amostras
clínicas eram resistentes à penicilina, 74,7% aos inibidores do ácido fólico,
resultados estes superiores aos deste estudo (HOEKSTRA e PAULTON,
2002). Lilenbaum e colaboradores (2000) encontraram 36,3% de resistência à
penicilina, 63,6% aos inibidores do ácido fólico e 36,3% aos aminoglicosídeos,
resultados bem parecidos com os deste estudo, com exceção do resultado dos
inibidores do ácido fólico que foi mais baixo.
Ao se analisar os CoPS, 89,4% apresentaram resistência a pelo menos
um dos agentes antimicrobianos testados e 73,6% eram multiresistentes. A
resistência à classe dos inibidores do ácido fólico foi a mais alta (76,3%),
seguida pelos macrolídeos e lincosamídeos (68,4%) e 50% à penicilina. Com
níveis de ressistência bem menores verificou-se as fluoroquinolonas e
tetraciclinas (36,8%), os aminoglicosídeos (26,3%) e aos fenicóis e βlactâmicos (21%).
A espécie mais isolada no presente estudo foi um CoNS, S. schleiferi
scheiferi (31,9%), dos quais 91,3 % apresentaram resistência a pelo menos
um dos antibióticos testados e 78,2% eram multiresistentes. Vanni e
colaboradores (2009), na Itália, encontraram 62,5% das amostras resistentes a
pelo menos um agente antimicrobiano. A maior resistência encontrada foi à
classe dos inibidores do ácido fólico (69,5%), seguida dos macrlídeos e
lincosamídeos (65,2%), penicilina (52,1%), fluoroquinolonas, aminoglicosídeos,
tetraciclina e β-lactâmicos (30,4%) fenicóis (17,3%) e nitrofurantoína (8,7%).
Como boas opções terapêuticas poderiam ser utilizados antibióticos das
classes das fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, β-lactâmicos, tetraciclinas,
fenicóis, ansamicinas e nitrofurantoína. No estudo de Vanni e colaboradores
(2009), as amostras clínicas apresentaram 37,5% de resistência à classe das
fluoroquinolonas. Outro trabalho feito na Itália, conduzido por In Torre e
colaboradores (2007), pesquisou a resistência a 16 fluoroquinolonas, tendo
encontrado resistência a 13 destes agentes antimicrobianos em 60% das
amostras.
Outra espécie de CoNS isolada no presente estudo foi S. simulans, em
que 83,3 % das amostras apresentaram resistência a pelo menos um dos
69
antibióticos testados e 100% de multiresistência. Já o padrão de resistência
desta espécie diferiu bastante da outra espécie CoNS, apresentando 83,3% de
resistência à penicilina, 66,6% aos macrolídeos, lincosamídeos e tetraciclina,
50% aos aminoglicosídeos e 16,6% às fluoroquinolonas, inibidores do ácido
fólico e β-lactâmicos. Lilenbaum e colaboradores (2000) encontraram 100%
das amostras resistentes a pelo menos um agente antimicrobiano, 71,4% de
resistência à penicilina, 85,7% aos inibidores do ácido fólico e 28,5% aos
aminoglicosídeos, resultados bem diferentes dos encontrados neste estudo.
As amostras de S. epidermidis apresentaram 20% de multiresistência e
80% das amostras se mostraram resistentes a pelo menos um dos agentes
antimicrobianos testados. Esta espécie só apresentou ressistência a três
classes de antimicrobianos, 60% à classe dos inibidores do ácido fólico, 40% à
classe dos lincosamídeos e 20 % à classe dos macrolídeos. Acredita-se que
estas amostras pertenciam à microbiota cutânea devido ao seu baixo padrão
de resistência e aos cuidados observados para a coleta. Lilenbaum e
colaboradores (2000) encontraram 90,9% das amostras resistentes a pelo
menos um agente antimicrobiano, 45,4% das amostras resistentes à penicilina,
90,9% aos inibidores do ácido fólico e 9% à tetraciclina, resultados bastante
diferentes dos encontrados neste estudo.
Já ao se analisar os CoNS, verifica-se que 91,1% eram sensíveis a pelo
menos um tipo de agente antimicrobiano, sendo 70,5% multiresistentes. A
resistência às classes dos macrolídeos e lincosamídeos foi de 61,7%, 50% à
penicilina, 47% aos inibidores do ácido fólico, 32,3% à tetraciclina, 29,4% aos
aminoglicosídeos, 23,5% às fluoroquinolonas e β-lactâmicos, 12,9% às classes
dos fenicóis e nitrofurantoína.
Ao se comparar o padrão de resistência entre os CoPS e os CoNS,
verificou-se que os CoPS são muito mais resistentes aos inibidores do ácido
fólico (76,3% nestes versus 47 % nos CoNS), apresentando ainda resistência
maior à classe das fluoroquinolonas (36,8% nestes versus 23,6% nos CoNS) e
aos fenicóis (21% nestes versus 12,9% nos CoNS). O resultado do padrão de
resistência das demais classes foi bastante similar.
Apesar
de
nossos
resultados
terem
confirmado
resistência
a
antimicrobianos normalmente utilizados para o tratamento das piodermites, os
diferentes padrões de resistência observados enfatizam a importância dos
70
testes de susceptibilidade para escolher o tratamento mais apropriado das
infecções
estafilocócicas
em
cães
e
permitir
o
uso
prudente
dos
antimicrobianos em animais de companhia.
Ao se comparar os resultados da associação dos microrganismos
isolados versus cada uma das doenças associadas encontradas, observou-se
resultado significante nos casos da dermatite atópica e do hipotireoidismo.
Comparou-se o número de cães acometidos pela dermatite atópica com o
número de cães acometidos pelas outras doenças presentes neste estudo e, a
avaliação foi feita baseada na quantidade de infecções acometidas pelas cepas
CoPS e CoNS. Verificou-se que em cães atópicos CoNS eram predominantes
(16 CoPS e 26 CoNS) enquanto em animais com outras doenças associadas
predominavam CoPS (23 CoPS e 11 CoNS) e que tal diferença era
estatisticamente significativa.
A Dermatite Atópica Canina (DAC) é uma doença de pele de caráter
genético e inflamatório (DEBOER, 2004; SOUSA; MARSELLA, 2001), na qual o
paciente torna-se sensibilizado a antígenos ambientais mediante a formação de
anticorpos IgE (GORMAN, 1997; WHITE, 1998; OLIVRY ET AL., 2001; SCOTT
et al., 2001), que causa afecção alérgica pruriginosa (OLIVRY et al., 2001).
Tem sido tradicionalmente classificada como uma reação de hipersensibilidade
do tipo I, embora a patogênese precisa ainda não tenha sido elucidada.
Inúmeros outras fatores são conhecidos como envolvidos na etiologia como
defeito
da
função
de
barreira
da
epiderme,
processamento de alérgenos pelas células de Langerhans, polarização da
respostas de citocinasaos linfócitos T, produção aumentada de IgE,
disponibilidade aumentada de mastócitos cutâneos e suscetibilidade a
infecções secundárias por bactérias e leveduras (SIMOU et al., 2005).
Piodermite, dermatite piotraumática e dermatite acral por lambedura
podem ser encontradas em até 68% dos cães atópicos (SCOTT et al., 2001).
Muitos fatores parecem afetar a patogênese da piodermite na pele atópica. É
provável que a reação de hipersensibilidade influencie, de certa forma,
os
mecanismos de defesa cutânea. Tem sido sugerido que a dermatite atópica
pode levar a alterações na barreira da epiderme, permitindo aos antígenos
estafilocócicas penetrarem na derme (GRIFFIN; DE BOER, 2001).
71
Outra possibilidade é a de que constituintes do soro passem para a
superfície da pele, tornando-se fatores de crescimento para a microbiota
cutânea. Além disso, a dermatite atópica provoca mudanças no microclima
da pele. Por exemplo, muitos cães atópicos sofrem hiperidrose e o aumento da
quantidade de suor leva a um aumento da umidade. Além disso, os
ingredientes do suor podem atuar como uma fonte de nutrientes para as
bactérias reforçando desta forma a sua proliferação (SIMOU et al., 2005).
Já é bem estabelecido que os cães e os seres humanos atópicos
transportam cargas mais elevadas de estafilococos que os indivíduos
saudáveis (MASON; LLOYD,1989). Outros estudos sugeriram que a aderência
de estafilococos aos corneócitos de cães e humanos atópicos é superior ao de
indivíduos saudáveis predispondo a pele alérgica à infecção secundária
(MCEWAN, 2000).
O sinal clínico inicial da Dermatite Atópica Canina é prurido em áreas
sem lesão visível ou com máculas eritematosas (SCOTT; MILLER; GRIFFIN,
2001). Pode ser localizado ou generalizado. O primeiro ocorre principalmente
na face, pavilhão auricular, extremidades distais dos membros (KWOCHKA,
1998; GRIFFIN; DEBOER, 2001; SCOTT et al., 2001), axilas e região inguinal
(KWOCHKA, 1998; OLIVRY; HILL, 2001b). O segundo é relatado em cerca de
40% dos cães atópicos (SCOTT et al., 2001; GRIFFIN; DEBOER, 2001). Em
virtude do prurido, pode-se observar também lambedura dos membros, atrito
da face contra o chão, lesões axilares, entre outros (THOMPSON, 1997). Estas
manifestações contribuem para o desenvolvimento de infecções e podem
originar lesões secundárias como alopecia focal ou difusa, pústulas, máculas,
edema, liquenificação, hiperpigmentação e em animais de pelame claro pode
ocorrer discromia ferruginosa devido à lambedura excessiva. As lesões
crônicas são observadas principalmente nos locais onde há prurido intenso e
repetido (WHITE, 1998; GRIFFIN; DEBOER, 2001; SCOTT et al., 2001).
Desta forma, uma provável explicação para a variação observada entre
CoPS e CoNS em animais atópicos estaria relacionada ao fato de que a atopia
tem como sinal primário o prurido, e a ação mecânica deste ato poderia gerar
soluções de continuidade na pele, fator predisponente para a colonização por
CoNS (uma vez que estes estão presentes em maior número na microbiota
72
cutânea do cão), que de outra forma não conseguiriam colonizar e instalar um
quadro infeccioso.
Existem poucos estudos com relação à colonização da pele do cão
atópico por staphylococci, sendo a maioria sobre a colonização por CoPS, por
isso, os resultados encontrados neste estudo mostraram-se surpreendentes.
Diferentemente dos resultados encontrados neste estudo, Fazakerley e
colaboradores (2009) observaram predominância de CoPS (S. intermedius) em
lesões de pele de cães atópicos.
O mesmo tipo de avaliação foi feita para o hipotireoidismo, tendo sido
encontrados 16 cães com hipotireoidismo (11 CoPS e quatro CoNS), diferença
significativa quando comparada ao conjunto de animais eutireoideos (28 CoPS
e 35 CoNS).
Os efeitos epidérmicos da deficiência do hormônio tireoidiano envolvem
anormalidades na síntese de proteínas, atividade mitótica e lipogênese.
Decréscimos nos ácidos graxos cutâneos (ácido araquidônico e ácido
gamalinolênico) têm sido relatados em cães hipotireoideos. Ácidos graxos são
importantes para a manutenção da integridade, fluidez e permeabilidade das
membranas das células epidermais. Também são importantes precursores das
prostaglandinas cutâneas (por exemplo, prostaglandina E2) e leucotrienos.
Tem sido notado que as deficiências de prostaglandinas E2 resultam em
hiperproliferação de ceratinócitos e severa descamação da pele (SCOTT et al.,
2001).
A depleção do hormônio da tireóide suprime as reações imunes humorais,
prejudica a função das células T e reduz o número de linfócitos circulantes. A
defesa cutânea local se encontra alterada no hipotireoidismo, devido aos
efeitos da queratinização e produção de sebo (PANCIERA, 2001). Todas as
formas de seborréia podem ocorrer. A seborréia ou a piodermite podem ser
focais, multifocais ou generalizadas podendo provocar prurido (NELSON e
COUTO, 2001).
As
mudanças
seborreicas
predispõem
o
animal
a
infecções
estafilocócicas secundárias ou por Malassezia pachydermathis, o que
intensifica os sinais seborréicos (SCOTT et al., 2001). Os cães hipotireoideos
ficam predispostos à infecções bacterianas recidivantes da pele como foliculite,
e furunculose (PETERSON, 2004).
73
Desta forma, uma possível explicação a variação observada entre CoPS
e CoNS em animais hipotireoideos fato é a de que estes cães, por
apresentarem metabolismo lento, com baixa produção de células de defesa e
aumento de produção sebácea na derme, têm a propensão de serem
colonizados por cepas mais virulentas de staphylococci, tais como os CoPS,
que são dotados de mais fatores de virulência, entre eles uma grande
variedade de lipases (SAIJONMA-KOULUMIES; LLOYD, 1996).
No que se refere ao questionário feito com os proprietários dos cães,
foram encontradas 16 cepas de estafilococos resistentes à meticilina e destas
11 tiveram associação com os fatores de risco que poderiam levar a uma
transmissão de uma cepa MRS dos proprietários para seus cães, tendo sido
encontrado resultado significante. Portanto, no presente estudo, a maioria das
amostras MRS foram isoladas de animais cujos proprietários apresentavam
algum fator de risco para colonização por MRS o que pode sugerir uma troca
de cepas ou genes de resistência.
Neste estudo, das 11 cepas MRS associadas aos fatores de risco, cinco
eram S. schleiferi schleiferi, três eram S. intermedius, uma era S. simulans,
uma era S. aureus e uma S. pseudintermedius.
S. intermedius (WERCKENTHIN et al., 2001), S. pseudintermedius
(DEVRIESE, 2005) e S. sclheiferi subsp. schleiferi (FRANK, 2003) têm sido
implicados em muitas infecções de pele em cães.
Atualmente, animais de estimação domiciliados são considerados e
tratados como membros da família. Esse fato permite um contato físico muito
próximo entre humanos e os animais de estimação, podendo resultar em
transmissão de bactéria, tornando-se um assunto potencial de preocupação em
saúde pública pois as bactérias de humanos podem estar causando infecções
em animais e vice-versa (GUARDABASSI et al.,2004).
Evidências de transmissão zoonótica entre proprietários e seus animais
de estimação já foram descritas para S. aureus e S. intermedius. Uma cepa
MRS de S. aureus foi isolada de uma ferida de um paciente humano, assim
como de um cão domiciliado não carreador nasal (MANIAN, 2003). S.
intermedius foi identificado como agente patogênico de uma otite externa em
humano e também foi isolado da orelha, dorso e ventre do cão no mesmo
domicílio(TANNER et al., 2000).
74
A questão da transmissão zoonótica e a preocupação com as cepas
MRS demandam uma abordagem nova ou modificada para as doenças
bacterianas de pele em pequenos animais (MAY,2006). No entanto, nenhum
estudo foi encontrado relatando a transmissão de cepas MRS de S.simulans
entre animais e seus proprietários.
Relatos destas cepas em pacientes caninos no Brasil ainda são parcos e
necessitam de atenção redobrada. Já foi relatada em outros países a presença
de portadores caninos, inclusive assintomáticos, capazes de servir como fonte
de infecção não só para outros animais como também para seres humanos
(MANIAN, 2003; VENGUST et al., 2006; BOOST et al., 2007; WEESE et al.,
2007; EPSTEIN et al., 2008).
75
7. – CONCLUSÕES
A partir do resultados do presente estudo, é possível concluir que:
•
Staphylococcus
sp.
são
importantes
agentes
de
infecções
dermatológicas caninas, confirmando assim o seu papel na clinica
médica de pequenos animais.
•
Emergência de CoNS como agentes infecciosos importantes, capazes
de causarem infecções dérmicas em pacientes caninos.
•
As
amostras
de
estafilococos
isoladas
de
infecções
dérmicas
apresentaram resistência a diferentes antimicrobianos, com alta taxa de
multirresistência.
Logo,
mostra
a
importância
dos
testes
de
susceptibilidade para escolher o tratamento mais apropriado.
•
Cães com dermatite atópica apresentaram predominantemente infecção
por CoNS, enquanto cães com hipotireoidismo por CoPS.
•
Fatores relacionados aos proprietários podem interferir na composição
da microbiota dos cães e devem ser considerados na transmissão
zoonóticas dos staphylococci.
76
ANEXOS:
77
ANEXO I:
FICHA CLÍNICA DE ATENDIMENTO DERMATOLÓGICO
Dados do animal:
Nome:
Sexo:
Espécie:
Idade:
Raça:
Peso:
Dados do proprietário:
Nome:
Telefones:
Pelagem:
Nº ficha:
Endereço:
e-mail:
Queixa principal:
Tratamentos prévios:
Antibiótico:
Sim  Não 
Quanto tempo:
Anti-histamínico: Sim  Não 
Quanto tempo:
Corticóide:
Sim  Não 
Quanto tempo:
Qual:
Resultado:
Qual:
Resultado:
Qual:
Resultado:
Banho:
Produto:
Freqüência:
Lesões secundárias:
Seborréia:SimNão
Cicatriz:SimNão
Úlcera: Sim Não
Erosão: Sim Não
Crosta: Sim Não
Mapa lesional:
Dose:
Dose:
Comercial: Sim Não
Último banho:
Presença de ectoparasitas:
Pulga:
Sim  Não 
Raspado cutâneo: Positivo  Negativo 
Lesões primárias:
Mácula: Sim Não
Vesícula:SimNão
Dose:
Mancha: Sim Não
Bolha: Sim Não
Carrapato:
Pápula: Sim Não
Nódulo: Sim Não
Colarete epidérmico: Sim Não
Hiperpigmentação: Sim Não
Hipopigmentação: Sim Não
Hiperqueratose: Sim Não
Liquenificação: Sim Não
Manipulado: Sim Não
Sim  Não 
Pústula: Sim Não
Tumor: Sim Não
Escoriação: Sim Não
Abscesso: Sim Não
Cisto: Sim Não
Comedão: Sim Não
Fissura: Sim Não
Suspeita clínica:
Colheita de material:
Data:
Método:
Observações:
Placa: Sim Não
Urtica: Sim Não
Eritema: Sim Não
Calo: Sim Não
Alopecia:SimNão
Hipotricose:SimNão
78
ANEXO II:
Questionário (proprietário do animal)
1 – Data: ____/____/_____
2 – Nome:
3 – Local de residência (Bairro):
4 – Animal (espécie/nome/local da residência):
5 – Você possui outros animais? ( ) SIM ( ) NÃO
Quantos e quais animais?
6 – Você usou antibiótico nos últimos 6 meses? ( ) SIM
Qual antibiótico? ________________________
de ___/___/___ a ___/___/___
7 – Foi hospitalizado no ano precedente? (
) NÃO
( ) NÃO
) SIM de __/__/__ a __/__/__ (
8 – Contato com paciente hospitalizado nos últimos 6 meses? ( ) SIM
NÃO de
___/___/___ a ___/___/___ Tipo de contato ________________
(
)
9 – Reside com crianças menores de 5 anos que frequentam creches ou
residiu nos últimos 6 meses? ( ) SIM ( ) NÃO
10 – Trabalha com crianças que frequentam creches ou trabalhou nos últimos 6
meses?
( ) SIM ( ) NÃO
11 – Trabalha ou faz estágio em hospital ou trabalhou ou fez estágio nos
últimos 6 meses? ( ) SIM ( ) NÃO
12 – Você tem contato domiciliar com indivíduo que trabalha em hospital ou
creche ou teve contato nos últimos 6 meses? ( ) SIM ( ) NÃO
13 – Você está com alguma lesão de pele? ( ) SIM ( ) Não
Você está tomando ou passando alguma medicação? ( ) SIM ( ) NÃO
Qual a medicação? ___________________
14 – Há alguém na família com alguma lesão de pele? ( ) SIM ( ) NÃO
79
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