“Aplicações Analíticas de Eletrodos
de Pasta de Carbono Quimicamente
Modificados em Soluções de
Guanina”
Robson Pinho da Silva
Orientadora: Profª Drª Sílvia Helena Pires Serrano
Laboratório de Bioeletroanalítica
Biossensores de DNA
Sensor de hibridização
Matriz para imobilização enzimática
Eletrodos Quimicamente
Modificados com DNA
Podem ser utilizados para:
 Caracterizar a
interação entre
Fármacos-DNA. Neste
caso o fármaco tem o
DNA como molécula
alvo in vivo.
 Caracterizar o
comportamento redox e
o desenvolvimento de
metodologia analítica
para quantificação de
compostos de interesse
biológico.
Brett et al. Electroanal., 8 (11) 992 - 995 (1996).
Sítios de oxidação da bases
Modificação dos Eletrodos com
DNA
Ip(adenina)
6º
DNA
degradado
Ip(guanina)
1º
2 A
DNA
Dupla
Hélice
Eletrodo
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
E/V
V.P.D. registrados com EPC/DNA.
Solução de DNA degradado 80 µg mL-1 em
tampão acetato pH 4,5. Em vermelho
branco apenas em tampão.  = 5 mV s-1,
E = 50mV, larg. de pulso = 70 ms.
Brett et al., In Comprrensive Chemical Kinetics;, Vol.37., Cap.3, pag.91 –119, R.G. Compton
e G. Hancock (Editores), Oxford University Press, Oxford, 1999 Inglaterra
Aplicações:
Identificação dos mecanismos de interação
entre intermediários de redução dos
nitrocompostos e o DNA .
Os sítios preferenciais de ataque dos
intermediários de redução dos nitrocompostos
são as bases purínicas (adenina e guanina)
Objetivos
Preparar Eletrodos Quimicamente
Modificados a partir desta bases.
Desenvolvimento
de Metodologia
Analítica
No estudo do
mecanismo de interação
com Fármacos – Bases
purínicas
Primeira base utilizada foi a Guanina
Eletrodos Quimicamente Modificados
Analitos de Interesse: NADH, NADPH, Ácido
Úrico e 8-oxo-Guanina
Moléculas que via de regra, causam
envenenamento superficial devido à adsorção
dos produtos de oxidação.
NADH e NADPH
OP
O-
O-
OP
O-
O-
NADH e NADPH:
São cofatores enzimáticos
Determinação de Atividade Enzimática.
Esclarecimento do mecanismo de Ação
Enzimática
Desenvolvimento de Biossensores para
substratos não eletroativos ou com
eletroatividade em valores extremos de
potencial
Ácido Úrico
Um dos principais produtos finais do
catabolismo de purinas (guanina e adenina)
Componente fisiológico associado aos
sintomas de algumas doenças por exemplo a
gota.
8-oxo-guanina:
O maior produto de degradação oxidativa do
Dna. Usado como traçador biológico de
estresse oxidativo.
Altos níveis dessa substâncias podem estar
associados à incidência de câncer.
Experimental
Eletrodos de trabalho:
Pasta de carbono, (EPC)
Pasta de carbono modificado em solução de
Guanina (EPC/G)
Pasta de carbono modificado em solução de
8-oxo-guanina (EPC/8-OXO).
Eletrodo de referência:
Ag/AgCl (KCl sat.)
Eletrodo auxiliar:
Pt.
Equipamentos:
Potenciostato/ Galvanostato: Eco Chemie,
Autolab, modelo PGSTAT 20 e aquisição de
dados pelo software GPS 3.1.
pH-metro: modelo 654, Eletrodo de vidro
combinado 6.0205.100 ( OE ), ambos da
Metrohm.
Modificação de eletrodos de trabalho:
Solução de Guanina 50 mM em tampão
universal pH 8,0
Solução de 8-oxo-guanina 50 mM em
tampão universal pH 8,0
12 min. de condicionamento a 0,2 V; 0,4 V
ou 1,1 V, sob agitação.
Medidas voltamétricas dos analitos
Solução tampão PIPES pH 7,0
Faixas de concentração: 15 a 824 M para 8oxo-guanina e 7,5 a 841 M para os demais.
Voltamogramas de pulso diferencial (D.P. V.)
0,0  Eapl  1,0 V
 = 5 mV s-1;
E = 50 mV
larg. de pulso = 70 ms.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Para otimização das etapas de
preparação dos Eletrodos modificados
utilizou-se como analito apenas o NADH
Ep1 60 mV
Ep2 80 mV
1 A
branco
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
EE // VV
D.P.V. registrados em solução de 420 M de NADH em PIPES pH 7,0 em
EPC/G .
(____) Modificado em solução de guanina a 0,42 V durante 12 min.;
(____) Modificado em solução de guanina a 1,1 V durante 12 min.
Silva R. P. e Serrano S. H. P., J. of Pharm. and Biom. Anal. 33, 735 – 744 (2003).
Qual a participação da
8-oxo-guanina na
modificação do
eletrodo?
c
a
b
3 A
0,2 0,4 0,6 0,8
0,2 0,4 0,6 0,8
0,2 0,4 0,6 0,8
E/V
E/V
E/V
Figura 2: V.D.P. registrados em solução de 420 M NADH em tampão PIPES
pH 7,0 com: (a) (EPC/8-oxo) modificado à 0,2 V (b) (EPC/8-oxo)
modificado à 1,1 V . (c) (EPC/g ) modificado à 1,1 V.
Como comprovar que a
superfície do eletrodo foi
totalmente modificada?
40  A
0.2
0.4
0.6
0.8
E
/ V
E / V
1.0
1.2
1.4
D.P.V. registrados em solução tampão PIPES, pH 7,0 (brancos) com: (___ ) (EPC) sem
modificação; (___ ) (EPC/G) a 1.1 V (___ ) (EPC/8-oxo) modificado a 0,2 V.; (___ ) (EPC/8-oxo)
modificado a 1,1 V; (durante 12 min.)
Guanina
Ep = 0.83 V
(2)
40  A
(1)
(3)
0.2
0.4
0.6E / V0.8
1.0
1.2
E/V
V.P.D. registrados com (EPC ) modificado em tampão HAc/NaAc, pH 4,5 branco a 1,1 V
durante 12 min. em solução: (1) tampão HAc/NaAc, pH 4,5 (2 ) 50 M solução de
guanina (5º volt.); (3) tampão HAc/NaAc, pH 4,5, após 2
G-dímero
8 -oxo-guanina
Ep = 0.90 V
(2)
Ep = 0.55 V
(1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
E
E // V
V
D.P.V. registrados em solução tampão HAc/NaAc,
pH 4,5 branco a 1,1 V durante 12 min.
com : (1) EPC modificado em Guanina 5 x 10-5 tampão HAc/NaAc, pH 4,5
(2 ) EPC modificado em Guanina 5 x 10-4 tampão HAc/NaAc, pH 4,5
O pH da solução de
Guanina influencia o
processo de
modificação do
eletrodo?
O pH da solução de Guanina influencia o processo de
modificação do eletrodo?
3 A
0.2
0.4
E/V
E/V
0.6
0.8
Figura 4: V.P.D. registrados em solução 420 M de NADH (PIPES pH 7,0)
(___) (EPC/G pH 4,5), (___) (EPC/g pH 7,0) e (___) (EPC/G pH 8,0)
14 adições no intervalo de concentração :
7,5 x 10-6 M  NADH  8,1 x 10-4 M
Em cada adição foram realizados 3 voltamogramas
EPC/G pH 8,0
5 A
EPC
5 A
0.3
0.4
0.5
0.6
E/V
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
E/V
0.7
0.8
Curvas Analíticas para NADH
A
10
8
8
6
Ip(A)
Ip(A)
B
10
4
6
4
2
2
0
0
200
400
600
[NADH] molL
-1
800
0
0
200
400
600
[NADH] molL
800
-1
Comparações entre as curvas de adição de padrão de NADH, Ip vs. [NADH] :
1a série, 2a série, 3a série e 4a série (A) (EPC); B) (EPC/G);
Faixa de concentração :
7,5 M  NADPH  810 M
EPC/G pH 8,0
EPC
5 A
5 A
0.3
0.4
0.5
0.6
E/V
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
E/V
Comparações dos V.P.D. em concentrações crescentes de NADPH em tampão
PIPES pH 7,0 : EPC e EPC/G .
9
9
A
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
B
8
Ip(A)
Ip(A)
8
200
400
600
[NADPH] molL
-1
800
0
0
200
400
600
-1
[NADPH] molL
Comparações entre as curvas de adição de padrão de NADPH,
Ip vs. [NADPH] : 1a série, 2a série, 3a série e 4a série
(A) (EPC); (B) (EPC/G);
800
Faixa de concentração :
7,5 M  Ác. Úrico  810 M
EPC/G pH 8,0
EPC
5 A
5 A
0.2
0.3
0.4
0.5
E/V
0.6
0.7
0.8
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
E/V
Comparações dos D.P.V. em concentrações crescentes de Ácido Úrico em
tampão PIPES pH 7,0 : (A) (EPC/G pH 8,0); (B) (EPC) .
Faixa de concentração :
15 M  8-oxo-guanina  840 M
EPC
EPC/G
1 A
0.2
0.4
E/V
0.6 0.2
0.4
0.6
E/V
Comparações
dos
D.P.V.
em
concentrações
crescentes
8-oxo-guanina em tampão PIPES pH 7,0 : (EPC/G) e (EPC) .
de
CONSIDERAÇÕES FINAIS
EPC/G podem ser utilizados para
determinação de NADH, NADPH, Ác.
Úrico ou 8-oxo-guanina
Comparação entre EPC/G e EPC
Analito
Sensibilidade
Lim. de Detec.
NADH
3 vezes maior
~ 2 vezes menor
NADPH
10 vezes maior
~ 4 vezes menor
Ac.úrico
2 vezes maior
~2 vezes menor
8 – 0xo
0,1 vezes maior
~2 vezes menor
A superfície modificada:
 Evita adsorção dos produtos de oxidação de
NADH e NADPH, Ácido Úrico e 8-oxo-guanina
Apresenta resultados mais reprodutíveis
 Favorece o processo de transferência de elétrons
No eletrodo modificado em guanina
o processo é controlado por difusão
B
140
140
e
A
120
120
d
100
100
Ilim / A
Ilim / A
c
80
b
60
80
e
d
60
c
40
b
20
a
20
0
0
40
a
0
10
20
30
1/2
40
1/2
 / rpm
1/2 obtido pela
50
60
0
10
20
30
1/2

40
50
60
1/2
/ rpm
Gráfico de I vs.
corrente limite dos voltamogramas cíclicos na diversas
velocidade de rotação com: (A) EPC/G (B) EPC; concentrações de NADH: (a)
0,29 mM; (b) 0,55 mM; (c) 0,78 mM, (d) 1,00 mM; (e) 1,20 mM.
A provável composição para
superfície modificadora é uma
estrutura formada por dímeros
ou trímeros formado por
guanina e 8-oxo-guanina;
(1) A. M. O. Brett, S. H. P. Serrano e J. A. P. Piedade,
“Electrochemistry of DNA”. In: Comprehensive Chemical
Kinetics - Book Series, Vol.37., Cap.3, pag.91 –119, R.G.
Compton e G. Hancock (Editores), Oxford University Press,
Oxford, 1999 Inglaterra
(2) R. Srinivasan, J. C. Murphy e R. Faichtein, J. Electroanal.
Chem, 312, 293-300 (1991).
(3)
N. J. Tao e Z. Shi, J. Phys. Chem, 98, 1464-1471 (1994).
(4)
N. J. Tao e Z. Shi, J. Phys. Chem, 98, 7422-7426 (1994)
Mecanismo de oxidação
Mecanismo de oxidação
Modificação do Eletrodo
Em potencias positivos
(+1,4V ) as bases
purínicas (guanina e
adenina) do DNA
degradado em solução
são oxidadas na
superfície do eletrodo
recoberto com filme de
DNA modificando-o de
forma permanente e
dando origem a uma
fase condutora.
Ip(adenina)

6º
Ip(guanina)
1º
2 A
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
E/V
V.P.D. registrados com EPC/DNA. Solução
de DNA degradado 80 µg mL-1 em tampão
acetato pH 4,5. Em vermelho branco apenas
em tampão.  = 5 mV s-1, E = 50mV, larg.
de pulso = 70 ms.