Nome _____________________________
Seção _________
7.012 Conjunto de Problemas 5
Pergunta 1
Enquanto estudava um problema de infertilidade, você tentou isolar um gene hipotético de coelho
que seria responsável pela prolífica reprodução desses animais. Após muito esforço, você
finalmente conseguiu mapear um gene no cromossomo Y de alguns animais que pode ser
responsável pela grande fertilidade dos coelhos. Você chama esse gene de Gene de Alta
Reprodução Cromossomo – Y, ou apenas hrgY.
Você deseja testar o efeito da expressão do gene hrgY dos coelhos em camundongos. Você injeta o
fragmento linear de DNA para o gene hrgY dos coelhos em óvulos fecundados de camundongo
ainda no estágio unicelular. Esse DNA é aleatoriamente inserido no genoma dos camundongos. Os
animais resultantes das injeções bem-sucedidas possuem o gene hrgY integrado na mesma posição
do genoma em cada uma das células. Esses camundongos são chamados de “transgênicos”.
a) Qual dos dois fragmentos a seguir do genoma dos coelhos você escolheria para injetar nos
camundongos? Por quê?
promotor
DNA genômico de coelho
gene hrgY
Fragmento 1
Fragmento 2
O fragmento 1 inclui um promotor adjacente com potencial sobre outros sítios regulatórios que
podem ser reconhecidos no sistema dos camundongos.
Pergunta 1 cont.
Você injetou com sucesso o gene de coelho hrgY de 2200 bp em um óvulos fertilizados de
camundongo em estágio unicelular. Desses óvulos nasceram filhotes de camundongos e você
realiza um PCR para confirmar que esses animais carregam o gene hrgY de coelhos. Suas reações
de PCR possuem como molde, como modelo uma amostra do DNA genômico de cada um dos
filhotes de camundongo. Com os iniciadores adequados, você consegue amplificar um fragmento de
380 bp dentro de um íntron do gene hrgY de coelhos. O DNA amplificado é submetido a uma
eletroforese em gel.
b) Na faixa 1 do gel a seguir, ilustre a(s) banda(s) de DNA, caso existam, que poderia(m) ser
visualizada(s) se o DNA fosse amplificado de um camundongo portador do gene hrgY de
coelhos. Na faixa 2 do gel, ilustre a(s) banda(s), caso existam, que poderia(m) ser visualizada(s)
se o camundongo não fosse portador do gene de coelhos.
Marcadores
MW
Faixa 1
Faixa 2
c)Após realizar as reações de PCR, você encontra um camundongo portador do DNA hrgY de
coelhos. Isso é suficiente para mostrar que o gene é expresso? Caso a resposta seja negativa,
quais são as outras moléculas que você deve procurar e por quê?
Não. A presença do DNA sozinho não assegura que o gene esteja sendo transcrito ou traduzido.
Para medir a expressão do gene, é necessário procurar o mRNA ou até mesmo a proteína
codificada pelo gene.
d) Você procura por expressões do hrgY em diversos tipos de tecidos dos camundongos
transgênicos e descobre que ele é expresso apenas em um órgão desses animais – o testículo.
Mas você sabe que o gene hrgY está presente em todas as células do animal. O que pode ser
encontrado nas células testiculares que pode ser considerado como a expressão tecidual muito
específica do gene hrgY?
um ativador de transcrição que reconhece o promotor hrgY presente apenas nas células dos
testículos.
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Pergunta 2
Usando a seqüência conhecida de DNA do hrgY, é possível derivar a seqüência de aminoácidos da
proteína HrgY para obter pistas sobre a sua função. Considerando a polaridade, carga e ordem da
posição dos aminoácidos em HrgY, é possível observar a presença de um domínio transmembrana e
sítios para a glicolização.
a)
i) Quais são as principais características do domínio transmembrana? Inclua o tipo de
aminoácidos que serão encontrados em um domínio transmembrana.
Os domínios de transmembrana são compostos por aproximadamente 30 aminoácidos hidrofóbicos
contíguos que freqüentemente formam uma estrutura secundária de hélice alfa através da
membrana. Nas proteínas transmembrana que formam os canais e que, portanto, possuem
múltiplos segmentos de membrana, não é incomum que o lado da hélice alfa de frente para o canal
(ou poro hidrofílico) apresente resíduos hidrofílicos e que o lado de frente para os lipídeos na
bicamada da membrana seja composto por resíduos hidrofóbicos. Essa hélice alfa de natureza
dupla é chamada de “anfipática”.
ii) Onde é possível encontrar proteína com domínios transmembrana?
Nas membranas ex.- nuclear, plasmática, RE, Golgi, mitocôndria, etc
iii) Relacione duas funções de uma proteína de membrana em uma célula.
Proteínas estruturais, poros, canais de íons, receptores.
iv) O que é glicolização?
Adição de resíduos de açúcar
v) Em qual organela a glicolização ocorre?
Retículo endoplasmático e complexo de Golgi
b) Se houver a possibilidade de a Partícula de Reconhecimento de Sinal estar ausente em uma
célula, poderíamos esperar….
Circule uma opção
1
que as proteínas transmembrana dessa célula sejam glicolizadas?
SIM
NÃO
2
que as proteínas transmembrana sejam completamente traduzidas ?
SIM
NÃO
3
que os genes que codificam as proteínas transmembrana sejam transcritos?
SIM
NÃO
4
que as seqüências de sinais sejam clivadas?
SIM
NÃO
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que as proteínas secretadas sejam exportadas?
SIM
NÃO
3
4
Pergunta 3
Ao comparar a seqüência de aminoácidos de HrgY com outras proteínas conhecidas, é possível
observar que a proteína de HrgY apresenta uma homologia surpreendente em relação a outros
receptores de tirosina quinases.
a) Qual é a função do domínio da tirosina quinase (TK)?
Ele fosforila cadeias laterais do aminoácido tirosina em proteínas usando o gama(? ) fosfato do
ATP
Em cadeias laterais fosforiladas do aminoácido tirosina em proteínas usando a fosfatase [x] do
ATP
b) Para determinar se o domínio TK é significativo ou não para a proteína HrgY, crie uma versão
mutante do gene hrgY que codifique um domínio tirosina quinase ativo constitutivamente dentro
da proteína HrgY. Essa proteína mutante não é mais acessível as fosfatases. A proteína mutante
poderia ser encontrada em um estado
fosforilado ou não-fosforilado? (Circule uma opção).
Para descobrir o efeito que a proteína ativa HrgY pode apresentar, realize a clonagem do gene mutante hrgY em um vetor de
mamífero (um plasmídeo que pode ser replicado em células de mamíferos). Faça a “transfecção” (semelhante á “transformação” em
bactérias) das células testiculares de camundongo normais em cultura de tecido com as construções de seu vetor.
Compare as células murinas transfeccionadas que contém o vetor portador do hrgY mutante com um grupo controle de células de
camundongo que foram transfeccionadas apenas com o vetor ou com o vetor portador do gene hrgY tipo selvagem (veja a seguir). É
possível observar que as células de camundongo que sintetizam a proteína HrgY mutante mostram um impressionante aumento nos
níveis de uma outra proteína, que recebe o nome de “Proteína X”.
células normais de testículo de camundongos
Transfecção
apenas com o
vetor
Medir a
produção de
proteína
baixos
níveis de Proteína X
Transfecção com o
vetor portador do
gene hrgY selvagem
Medir a
produção de
proteína
baixos
níveis de Proteína X
Transfecção com o
vetor portador do gene
hrgY codificando um
domínio ativo de TK na
proteína HrgY
Medir a
produção de
proteína
altos
níveis de Proteína X
c) Explique, em termos gerais, como uma tirosina quinase ativa na membrana plasmática poderia
causar o aumento da Proteína X dentro da célula. Certifique-se de incluir “transcrição” em sua
resposta.
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O receptor ativado de membrana sinaliza para uma cascata de proteínas. Pode ser que ele
fosforilize outras proteínas ou que interaja por intermédio de outros mensageiros. O resultado final
é que uma dessas proteínas modificadas entra no núcleo e ou ativa diretamente a transcrição ou
ativa outros fatores de transcrição para ativar os genes.
6
Pergunta 4
Finalmente você consegue determinar que o gene hrgY incluído não possui nenhum efeito na
fertilidade dos camundongos. Apesar de ter aprendido pouco a respeito do hrgY com a sua linhagem
de camundongos transgênicos, você decide continuar seu estudo pois, nessa etapa, você já investiu
um ano de pesquisa sobre esse gene e não se sente à vontade para dar início a um projeto
completamente novo.
Em um experimento longo, você cultiva em meio de cultura células isoladas dos testículos de
camundongos transgênicos portadores do tipo selvagem do gene hrgY e mede a síntese da Proteína
X. A produção de Proteína X nessas células é bastante baixa. Entretanto, quando essas células são
cultivadas em um meio enriquecido com o soro de coelhos, você descobre que a expressão do nível
de Proteína X aumenta de forma impressionante. (Veja figura a seguir). Observação: células
normais de testículos de camundongo cultivadas em soro de coelhos não demonstram aumento nos
níveis de Proteína X (dados não fornecidos).
Isolar células de testículo de camundongos
transgênicos expressando o gene hrgY.
células de testículo de camundongos
Dividir em duas placas de Petri
Crescem na presença
do soro de coelho
Crescem sem o soro de coelho
Medir a produção de proteína X
Alta produção de Proteína X
Baixa produção de Proteína X
a) Como você explica isso?
Algum componente no soro dos coelhos está interagindo com a proteína HrgY expressa, resultando
em altos níveis de Proteína X.
b) Você já determinou que o gene hrgY está sendo expresso nos testículos dos camundongos.
Considerando o experimento descrito acima, por que motivo esse gene pode não estar afetando a
fertilidade dos camundongos?
O hrg Y (Hrg Y) sozinho não possui nenhum efeito. Provavelmente, seu ligante está presente no
soro de coelhos e, portanto, ele é ativado somente na presença desse ligante.
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Pergunta 4 cont.
Após mais alguns anos de estudo (você está agora no quarto ano do UROP), você finalmente
conseguiu purificar um componente do soro de coelhos que é capaz de induzir a expressão da
Proteína X nas células transgênicas. Você determinou que o componente é uma proteína secretada à
qual dá o nome de SecC.
c) A proteína SecC purificada do soro teria uma seqüência de sinal anexa? Por quê?
Não. Se ela foi secretada no soro, então a seqüência de sinal terá sido clivada.
d) Você acredita que a proteína SecC possui uma seqüência de sinais em qualquer etapa da síntese?
Se sua resposta for sim, quando?
Sim. Quando ela foi traduzida inicialmente. O peptídeo nascente terá como sinal uma seqüência
que é reconhecida pelo SRP, que levará esse complexo ribossomo/mensagem/peptídeo nascente
para a partícula receptora de reconhecimento de sinal SRP na membrana do RER. Nesse ponto, a
tradução continua e o SecC é translocado através da membrana do RER.
Curioso em relação ao efeito da proteína SecC nos camundongos transgênicos vivos, você insere o
gene codificando o SecC no genoma de um vírus. Você infecta o camundongo transgênico com esse
vírus, que irá se integrar ao DNA (inclusive o gene secC) no genoma de qualquer uma das células
do camundongo que ele venha a infectar.
Surpreendentemente, os camundongos transgênicos infectados com o vírus portador do gene secC
estão apresentando um aumento de fertilidade.
e) O vírus portador do gene secC precisa infectar as células dos testículos dos camundongos
transgênicos para aumentar a fertilidade? Explique sua resposta.
Não. Se a SecC é uma proteína secretada, ela será secretada de qualquer célula na qual é expressa
e será transportada através da linfa ou soro até alcançar o receptor. HrgY nos testículos (Pares
receptor/ligante são altamente específicos).
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