Revista Brasileira de Ensino de Fı́sica, v. 36, n. 4, 4501 (2014)
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Desenvolvimento em Ensino de Fı́sica
Uma montagem experimental para a medida de fluorescência
(An experimental setup for fluorescence measurement)
J.F. Pavoni1 , W.F.P. Neves-Junior2 , M.A. Spiropulos1 , D.B. de Araújo1,3
1
Departamento de Fı́sica, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
2
Departamento de Radioterapia, Hospital Sı́rio Libanês, São Paulo, SP, Brasil
3
Instituto do Cérebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil
Recebido em 14/4/2014; Aceito em 10/6/2014; Publicado em 3/10/2014
Neste trabalho apresentamos um arranjo simples e bastante ilustrativo que utiliza materiais disponı́veis em
laboratórios de pesquisa e ensino de fı́sica para a medida da fluorescência. O fluorı́metro proposto é composto
basicamente por um sistema de iluminação duplo de leds, que excitam a amostra e produzem sua emissão. Em
seguida, uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada de um monocromador e um chopper é utilizado
para modular este sinal com uma frequência conhecida através de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em
um monocromador que é responsável pela decomposição espectral, cujos componentes são detectados com um
fotodiodo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é muito baixa, utiliza-se um amplificador lock-in para
filtrar esse sinal através do sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico. Este fluorı́metro foi testado em uma
amostra fluorescente de laranja de acridina e os resultados obtidos foram bastante semelhantes aos resultados
esperados por um fluorı́metro comercial.
Palavras-chave: fluorı́metro, fluorescência, medida da fluorescência, espectroscopia de fluorescência.
In this work we present a simple and illustrative arrangement using materials available in research and teaching laboratories to measure fluorescence. The developed fluorimeter is basically composed of a dual LED
lighting to excite the samples and produce their emission. Then, a converging lens focuses the emitted light in
the entrance of a monochromator and a chopper is used to modulate this signal with a known frequency measured by an optical coupler. After that, the light enters the monochromator that is responsible for its spectral
decomposition into components that are finally detected by an amplified photodiode. Since the intensity of the
emitted light is very low, a lock-in amplifier is used for filtering this signal by the reference signal provided by
the optical coupler. This fluorimeter was tested using an acridine orange fluorescence sample and the results
were very similar to those expected by a commercial fluorimeter.
Keywords: fluorimeter, fluorescence, fluorescence measurement, fluorescence spectroscopy.
1. Introdução
A ciência tem desvendado a estrutura da matéria
através do uso da radiação eletromagnética em técnicas
espectroscópicas [1]. Essas técnicas analisam a radiação
que é absorvida, emitida ou espalhada pela amostra
de interesse. Os dados espectroscópicos são geralmente
representados por um espectro, que é a representação
gráfica da resposta de interesse em função do comprimento de onda e que são fornecidos por aparelhos chamados espectrômetros.
Os espectrômetros são amplamente utilizados em
pesquisas fı́sicas e diversos equipamentos comerciais
estão disponı́veis nos laboratórios de pesquisa e ensino.
Eles podem apresentar diversos arranjos experimentais,
mas em geral possuem três elementos básicos: uma
1 E-mail:
jfpavoni@ffclrp.usp.br.
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fonte de radiação, um monocromador e um detector.
A maior parte destes equipamentos comerciais são fechados e, a partir da colocação da amostra, fornecem
diretamente o espectro desejado.
Neste trabalho propõem-se a construção de um
espectrômetro de fluorescência ou simplesmente um
fluorı́metro [2], utilizando soluções baratas e/ou previamente disponı́veis em laboratórios de ensino, para
que seja usado em atividades experimentais de fı́sica
moderna para ilustração de todos os passos envolvidos
na aquisição do espectro de fluorescência.
A fluorescência é um fenômeno muito estudado, pois
diversos processos e sistemas de interesse biológico envolvem moléculas que absorvem e emitem radiação na
faixa do ultravioleta e visı́vel do espectro. As medi-
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das de fluorescência de macromoléculas fornecem informações sobre: conformação, sı́tios de ligação, interações com solventes, grau de flexibilidade, distâncias
intermoleculares e coeficiente de difusão rotacional de
macromoléculas.
Como o tempo caracterı́stico envolvido no processo
de fluorescência (da ordem de 10−9 s) é comparável
com eventos relacionados à interação com o meio circundante, esta técnica é particularmente atraente para
o estudo de diversos fenômenos relacionados às propriedades biofı́sicas de moléculas biológicas. Além disso,
por ser um método extremamente sensı́vel, mesmo baixas concentrações de amostra podem ser estudadas, o
que a torna uma técnica de grande interesse para estudos quı́micos e farmacêuticos.
2.
Base teórica
Em temperatura ambiente, a maioria das moléculas
está em seu nı́vel vibracional e rotacional fundamental. Quando estas moléculas são irradiadas com fótons
de frequências apropriadas, podem absorver energia e
passar do estado fundamental para vários estados vibracionais do estado eletrônico excitado. Colisões com
outras moléculas fazem com que a molécula excitada
perca energia vibracional até alcançar o estado vibracional de menor energia dentro do estado excitado.
Como esse estado é instável, as moléculas voltam imediatamente para qualquer nı́vel vibracional do estado
eletrônico fundamental emitindo um fóton neste processo, que carrega a energia fluorescente. Por existirem diversos nı́veis vibracionais no estado fundamental,
os fótons emitidos possuem diferentes energias e consequentemente diferentes frequências. Analisando as intensidades emitidas nas diferentes frequências é possı́vel
se obter o espectro de emissão de fluorescência na espectroscopia de fluorescência [3,4].
Em geral, o fóton de emissão fluorescente carrega
menos energia que o fóton de excitação, devido às
possı́veis perdas de energia nas transições dos estados
vibracionais do estado eletrônico excitado, o que permite que os espectros de absorção e emissão sejam distinguidos. Cada molécula fluorescente possui um comprimento de onda de excitação e um comprimento de
onda de emissão caracterı́stico, sendo a distância entre eles chamada de deslocamento de Stokes (Fig. 1).
O deslocamento de Stokes é fundamental para a detecção da fluorescência, especialmente em aplicações
biológicas, uma vez que moléculas com grandes deslocamentos de Stokes tem fluorescência facilmente detectável, enquanto que a fluorescência de moléculas com
pequenos deslocamentos de Stokes é de difı́cil detecção.
3.
Montagem experimental
O esquema experimental idealizado para o fluorı́metro
a ser construı́do está ilustrado na Fig. 2. Toda a mon-
Pavoni et al.
tagem é realizada sobre um trilho para alinhamento dos
equipamentos. O fluorı́metro é composto basicamente
por um sistema de iluminação duplo de leds, que excitam a amostra e produzem sua emissão. Em seguida,
uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada
do monocromador e um chopper é utilizado para modular este sinal com uma frequência conhecida através
de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em um
monocromador, responsável pela decomposição espectral, cujos componentes são detectados com um fotodiodo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é
muito baixa, o sinal detectado ao final do experimento
é ruidoso. Assim, para melhoria dos resultados obtidos
com a obtenção apenas da componente de luz emitida
pela amostra, utilizamos um amplificador lock-in para
filtrar esse sinal através do sinal de referência fornecido
pelo acoplador ótico.
Figura 1 - O deslocamento de Stokes do espectro de excitação e
emissão em amostras fluorescentes. Na esquerda, uma molécula
com um grande deslocamento de Stokes e na direita um pequeno
deslocamento.
3.1.
Fonte de excitação da amostra e o sistema
de iluminação
A fonte de excitação da amostra do sistema proposto é
composta por dois leds azuis com espectro de emissão
apresentado na Fig. 3, este espectro foi medido com o
espectrômetro Hitachi, modelo F-7000. Estes dois leds
foram comprados como sendo iguais, no entanto pequenas diferenças foram encontradas na medida de seus
espectros de emissão.
Uma montagem experimental para a medida de fluorescência
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Figura 2 - Esquema experimental idealizado.
Figura 3 - Espectro de emissão dos dois Leds azuis utilizados no
experimento.
O sistema de iluminação foi construı́do sobre uma
base de acrı́lico em um suporte para posicionamento
sobre o trilho ótico (Fig. 4). No centro desta base foi
frezado um local para o encaixe de uma cubeta. Em
distâncias iguais e em ambos os lados da cubeta, foram
feitos dois suportes em nylon para a fixação dos leds
azuis, estes suportes possuem altura regulável através
de parafusos laterais na base de acrı́lico.
Os leds, já ligados aos fios para sua conexão com
a fonte, foram colocados dentro de tubos pintados de
preto, para condução da luz até a amostra, evitando
que ela saı́sse lateralmente pelo tubo e atrapalhasse a
detecção da fluorescência. A distância entre os leds e
a cubeta também era ajustável por parafusos, que podem ser visualizados na Fig. 4, na parte superior dos
suportes de nylon.
Figura 4 - Sistema de iluminação.
Esta geometria para iluminação da amostra foi idealizada, de maneira a maximizar e homogeneizar a excitação da amostra. Além disso, o arranjo perpendicular de excitação em relação à detecção da fluorescência
deveria evitar a detecção direta de luz proveniente dos
leds.
3.2.
Convergência do feixe de emissão da amostra
Foi utilizada uma lente para convergir o feixe de emissão
da amostra na entrada do monocromador, de modo a
maximizar a intensidade de luz (Fig. 5). Utilizamos
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uma lente convergente com uma distância focal pequena
(5 cm), de modo a diminuir distância necessária entre o
ponto de emissão da amostra e a entrada do monocromador, minimizando a perda de luz no caminho ótico.
Figura 5 - Lente convergente utilizada, fixa em um suporte.
Pavoni et al.
3.3.
Modulação do sinal para detecção
Um importante artifı́cio usado neste experimento, foi
a modulação do feixe de luz emitida pela amostra com
uma frequência conhecida. O sinal modulado foi amplificado e filtrado por um lock-in (Stanford Research
Systems modelo SR530) com base no sinal de referência
fornecido pelo acoplador ótico, o que permitiu a diminuição da interferência de fontes de luz externas no sinal
captado pelo detector.
Para a modulação foi construı́do um chopper, composto por um disco de alumı́nio fixo em um motor que
produziria a sua rotação (Fig. 6a). Na parte inferior do
chopper, através de uma haste, foi fixado um acoplador
ótico. O esquema desse sinal pode ser visualizado na
Fig. 6b. Para o chopper foi feita a conexão do motor
com a fonte geradora e para o acoplador ótico, além
da conexão com a fonte, foi feita uma saı́da direta com
cabo coaxial para o lock-in.
A frequência utilizada no chopper foi regulada em
30Hz por limitações mecânicas do motor utilizado, esta
foi a maior freqüência que era possı́vel ser mantida
estável por um bom intervalo de tempo, sem risco de danificar o motor. No entanto, idealmente, quanto maior
a freqüência, menor a influência do ruı́do rosa (ou de
1/f), e uma freqüência da ordem de 1 kHz seria suficiente para minimizar tal influência, desde que o amplificador lock-in utilizado consiga operar faixa. É importante também ressaltar que a freqüência de 60 Hz
(e seus harmônicos, e.g.: 120 Hz) de oscilação da rede
elétrica AC deve ser evitada para livrar o sinal de fontes
de luz ambiente indesejadas.
Figura 6 - a. Chopper construı́do juntamente com o acoplador ótico utilizado. b. Sinal esperado para a referência ao longo do tempo.
Uma montagem experimental para a medida de fluorescência
3.4.
4501-5
Monocromador e a seleção dos comprimentos de onda de detecção
Na montagem experimental foi utilizado um monocromador comercial (Oriel, modelo 7240) para coletar a luz
emitida pela amostra e fornecer como saı́da uma única
linha espectral para construção do espectro de emissão
da amostra (Fig. 7). As fendas utilizadas no monocromador foram construı́das utilizando lâminas de barbear
contrapostas, com uma abertura de aproximadamente
1 mm.
Figura 8 - a. O detector OPT301. b. circuito do detector. c.
resposta em função do comprimento de onda.
A corrente do fotodiodo é proporcional à potência
radiante ou fluxo (em watts) incidindo no fotodiodo.
Para um comprimento de onda de 650 nm (luz vermelha) a capacidade de resposta do fotodiodo é aproximadamente 0,47 A/W. A capacidade de resposta para
outros comprimentos de onda é mostrada em uma curva
de performance tı́pica (Fig. 8c).
Figura 7 - Monocromador utilizado.
3.5.
Sistema de detecção
O detector utilizado nesta montagem foi o OPT301 [5],
um circuito integrado opto-eletrônico contendo um fotodiodo e um amplificador de transimpedância em um
único chip isolado dieletricamente (Fig. 8a). Ele inclui
um conversor corrente-tensão que proporciona na saı́da
uma tensão proporcional à luz recebida. Além disso, o
conversor é implementado com um amplificador operacional e, portanto, também amplifica o sinal, de modo
a conseguir boa sensibilidade. Sendo assim, basta alimentar o dispositivo com duas tensões de polaridades
oposta referentes à massa, para ter um completo sensor
analógico de luminosidade (Fig. 8b). A combinação integrada de fotodiodo e amplificador de transimpedância
em um único chip elimina os problemas frequentemente
encontrados em circuitos discretos, tal como erros por
corrente de fuga, ruı́do e picos de ganho devido à perda
de capacitância.
O sistema de detecção utilizado no experimento foi
montado colocando o detector OPT301 em uma caixa
(Fig. 9). Sua alimentação foi feita com duas baterias de
9 V. Com isso foram evitadas flutuações da rede elétrica
e consequentemente algum dano no detector. Também
foi feita a ligação direta do detector com o lock-in utilizando novamente um cabo coaxial.
3.6.
Filtragem e amplificação do sinal detectado
Como já foi dito, foi utilizado um amplificador lockin para a filtragem e amplificação do sinal detectado
de emissão de fluorescência da amostra. Nesse experimento, devido à baixa intensidade de luz emitida pela
amostra e a grande interferência de fontes de luz externas, que causam um grande ruı́do no sinal medido,
a utilização de um lock-in é de essencial importância
para a qualidade dos resultados obtidos.
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Pavoni et al.
que para isso o monocromador dever estar regulado no
comprimento de onda de mais alta intensidade de fluorescência da amostra. E também é necessário muito cuidado para não desalinhar a altura da lente, bem como
sua posição lateral, ou seja, deve-se movê-la lentamente
apenas no sentido longitudinal do sistema, até encontrar a posição ideal.
3◦ ) Posicionamento do detector:
O posicionamento do detector é feito ao final do processo, para isso é ligado novamente o laser e o detector
é posicionado encostado na fenda de saı́da do monocromador. Para encontrar a posição correta do detector,
seu posicionamento é feito com ele ligado e conectado
a um osciloscópio, até que encontre-se a indicação do
sinal devido à intensidade do laser. Em seguida, o detector é conectado ao lock-in.
Na Fig. 10 temos uma visão geral de todo o experimento e a Fig. 11 apresenta em detalhes o sistema de
iluminação, a lente, o chopper e a entrada do monocromador.
Figura 9 - Sistema de detecção usando o detector OPT301. a.
visão frontal. b. visão lateral.
3.7.
Montagem do fluorı́metro
A montagem total do experimento foi feita sobre uma
bancada e em um laboratório que pudesse ser mantido
escuro durante toda a realização da medida. Esta etapa
inclui o alinhamento do sistema ótico e para isso alguns
procedimentos foram realizados:
1◦ ) Posicionamento dos componentes do sistema na
mesma altura e em linha reta:
Para alinhar a posição vertical e lateral de cada uma
das peças do sistema óptico foi ligado um laser e direcionamos seu feixe paralelamente ao eixo óptico do
sistema, passando pela altura da excitação da amostra pelos leds. Feito isso, foram posicionados cada um
dos componentes de maneira que o feixe de laser passasse por todos eles sem sofrer desvios. Ou seja, foram
alinhados o chopper de maneira que o laser passasse
exatamente pelo meio de uma das aberturas, a lente de
maneira que o laser passasse pelo seu centro e o monocromador de maneira que o laser incidisse no meio da
fenda de entrada.
2◦ ) Focalização com a lente:
A lente foi posicionada de maneira que ficasse com
seu foco na fenda de entrada do monocromador. Para
isso, o laser foi desligado, o sistema de excitação da
amostra foi ligado e, com o olho na fenda de saı́da do
monocromador foi visualizada em que posição da lente
podia-se enxergar uma maior intensidade de sinal. Note
Figura 10 - Visão geral do experimento.
Figura 11 - Detalhes do sistema de iluminação, da lente, do chopper e do monocromador.
4.
Seleção da amostra fluorescente
A escolha da amostra foi muito importante para o sucesso do experimento. Foi utilizada uma amostra com
alta emissão fluorescente e que tivesse seu espectro
Uma montagem experimental para a medida de fluorescência
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de absorção em uma região próxima a ao espectro de
emissão dos leds.
A substância escolhida foi a laranja de acridina, cuja
fórmula estrutural está indicada na Fig. 12. A presença
de anéis benzênicos na sua estrutura comprova que a
substância é fluorescente. O espectro de absorção e
de fluorescência desta amostra foram medidos em um
espectrômetro de fluorescência comercial (Hitachi, modelo F-7000) e os resultados obtidos estão indicados na
Fig. 13, esta curva de fluorescência será utilizada como
referência para a avaliação dos resultados obtidos com
o fluorı́metro montado.
Figura 14 - Espectros de absorção e de fluorescência da laranja
de acridina, juntamente com os espectros de emissão dos leds.
5.
Aquisição do espectro de fluorescência
Figura 12 - Fórmula estrutural da laranja de acridina.
Com o fluorı́metro montado e alinhado, liga-se todos os
componentes: leds, chopper, detector e lock-in e iniciase o processo de medida que consiste em variar o comprimento de onda de saı́da no monocromador e medir
a intensidade de voltagem indicada pelo lock-in, com
seu respectivo erro, que corresponde à oscilação no valor indicado. A curva de fluorescência da amostra foi
levantada duas vezes para comprimentos de onda variando de 350 a 700 nm.
6.
Resultados e discussão dos dados
A Fig. 15 apresenta as duas curvas de fluorescência levantadas utilizando o sistema desenvolvido e também
a curva esperada obtida com o fluorı́metro comercial.
Em detalhe, visualiza-se uma foto da amostra sendo
excitada com a luz azul e fluorescendo com a luz verde.
Figura 13 - Espectros de absorção e de fluorescência da laranja
de acridina.
Comparando os espectros de absorção da amostra e de emissão dos leds (Fig. 14) foi comprovado
que essa substância pode ser utilizada para medida no
fluorı́metro proposto.
A preparação da solução de laranja de acridina é
feita apenas pela sua diluição em água, a quantidade
necessária da substância é muito pequena, basta encostar o bico de um pasteur no pó e depois colocá-lo na
cubeta com água. A solução resultante fica praticamente incolor. É necessária atenção para não deixar a
solução muito concentrada, pois isso causaria um efeito
de filtro interno e toda luz fluorescente seria reabsorvida pela própria solução, deixando que a intensidade
de fluorescência medida neste caso seja muito baixa.
Figura 15 - Resultados experimentais obtidos com o sistema construı́do em comparação com a curva fluorescência obtida com o
fluorı́metro comercial. Ambas as curvas estão normalizadas.
4501-8
Pode-se notar pela Fig. 15 que os resultados obtidos concordam bastante com o resultado esperado. No
entanto, comparando as curvas obtidas com a curva esperada notamos a presença de dois picos extras, um em
torno de 450 nm e outro a 600 nm, que não fazem parte
do espectro esperado da amostra.
O primeiro pico pode ser facilmente justificado, pois
ocorre aproximadamente no pico da emissão dos leds
utilizados para excitação e, sendo assim, corresponde à
detecção de luz espalhada proveniente dos leds de excitação. Já o segundo pico, na faixa de 600 nm, pode ser
explicado pelo fato do detector OPT301 ter uma sensibilidade variável com o comprimento de onda (ver Fig.
8c). Em virtude disso, pode-se aperfeiçoar a análise dos
Pavoni et al.
resultados aplicando uma correção de forma a eliminar
a contribuição intrı́nseca da diferença de sensibilidade
do detector para os diferentes comprimentos de onda
do espectro.
Para fazer esta correção, foi extraı́da parte da curva
de sensibilidade do detector (Fig. 8c) correspondente à
faixa de comprimentos de onda de interesse. A curva
obtida foi normalizada pelo seu valor máximo e invertida para a criação da curva de correção a ser aplicada
aos resultados (Fig. 16). Com isso, multiplicando-se
a curva de correção ponto a ponto à curva experimental obtida com nosso sistema, anula-se a influência da
variação da sensibilidade do detector para os diferentes
comprimentos de onda estudados.
Figura 16 - Esquema de construção da curva de correção aplicada aos resultados.
O resultado corrigido para a medida 2, que foi a que
apresentou um pico maior próximo ao comprimento de
onda de 600 nm, são apresentados na Fig. 17. Podese notar, que após a correção, o resultado se aproxima
ainda mais da curva esperada. No entanto, foi encontrada uma contribuição ainda maior devido ao pico proveniente da luz espalhada dos leds na amostra e cubeta.
Essa contribuição poderia ser minimizada por meio de
uso de filtros após a lente convergente, mas isso poderia
também causar redução no sinal de fluorescência detectado. Outra alternativa seria o uso de um anteparo
entre o sistema de iluminação e os demais componentes
do fluorı́metro, neste anteparo deveria existir uma abertura no eixo ótico do sistema para passagem apenas da
luz resultante da fluorescência.
O segundo pico, devido à influência do detector na
medida, foi corrigido. A curva ficou também mais estreita, sendo que a região posterior ao pico se aproximou
da curva “real”, o que era de se esperar, já que o detector é mais sensı́vel na faixa do vermelho e infravermelho
próximo que na faixa do azul, onde a curva se afastou
da curva real.
Figura 17 - esultado corrigido.
A baixa resolução na seleção de comprimento de
onda provavelmente foi a razão da maior largura do
pico de fluorescência em relação ao do espectro obtido
Uma montagem experimental para a medida de fluorescência
com dispositivo comercial. Seria possı́vel melhorar a
resolução utilizando um monocromador de maior resolução e também uma fenda mais estreita, de modo a
selecionar melhor o comprimento de onda a ser medido
(estreitar a faixa de freqüência de saı́da).
Por tudo o que foi apresentado pode-se verificar
que a medida da fluorescência da amostra foi feita de
forma simples, obtendo resultados semelhantes ao de
um fluorı́metro comercial.
Uma caracterı́stica importante do arranjo apresentado é que ele não se limita aos leds azuis de excitação,
nem à laranja de acridina como substância fluorescente,
o que amplia sua aplicação prática. Outros comprimentos de onda de excitação e outras substâncias também
poderiam ser avaliados, como por exemplo, a excitação
com leds vermelhos para medida da fluorescência de um
extrato alcoólico de folhas verdes que contém clorofila.
O fluorı́metro proposto também não se restringe
apenas à medida do espectro de fluorescência, ele pode
ser aplicado para estudo de outras caracterı́sticas relacionadas ao processo de fluorescência. Dentre elas podemos destacar a supressão de fluorescência, bastandose apenas adicionar compostos supressores da fluorescência à solução estudada que alterem, por exemplo,
a sua temperatura ou o seu pH. Além disso, pode-se
avaliar também o efeito da concentração da substância
fluorescente na solução analisada e seu papel de filtro
interno da fluorescência.
7.
Conclusões
Foi apresentado um arranjo simples para a medida do
espectro de fluorescência de amostras utilizando materiais simples e/ou previamente disponı́veis em laboratórios de fı́sica. Acredita-se que o entendimento do
processo de medida é bem didático e ilustrativo bene-
4501-9
ficiando alunos de disciplinas experimentais de fı́sica
moderna no entendimento do processo de espectroscopia.
Acredita-se que, além da visualização passo a passo
da medida da fluorescência, esta montagem e análise
dos dados também proporciona aos alunos experiências
importantes como a correção dos resultados pela sensibilidade do detector, um conhecimento que pode ser
aplicado em qualquer medida realizada experimentalmente e contribui bastante para a melhoria dos resultados obtidos, sendo assim uma vivência importante para
os alunos.
Agradecimentos
Aos técnicos Eldereis de Paula, José Luiz Aziani, Nelson Nascimento Junior, Élcio Aparecido Navas Lourenço Rocha. Em especial ao professor Iouri Borissevitch pelo suporte na escolha das amostras e nas medidas de referência feitas em equipamentos comerciais.
Referências
[1] C. Raymond, Princı́pios Básicos de Espectroscopia
(Editorial AC, Libros Cientı́ficos y Técnicos, Madrid,
1983), 1a ed.
[2] J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy
(Springer, Nova Iorque, 2006), 2a ed.
[3] H.H. Jaffe and A.L. Miller, J. Chem. Educ. 43, 469
(1966).
[4] P. Elumalai., P. Atkins and J. de Paula, Atkins’ Physical Chemistry (Oxford University Press, Oxford, 2010),
9a ed.
[5] Burr-Brown Corporation, OPT-301 – Integrated Photodiode and Amplifier (Burr-Brown Corporation, Tucson, 1994).