UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL METALOPROTEINASES DA MATRIZ 2 E 9 EM COELHOS COM CARDIOMIOPATIA INDUZIDA PELA DOXORRUBICINA Sheila Nogueira Saraiva da Silva Médica Veterinária 2014 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL METALOPROTEINASES DA MATRIZ 2 E 9 EM COELHOS COM CARDIOMIOPATIA INDUZIDA PELA DOXORRUBICINA Pós-graduanda: Sheila Nogueira Saraiva da Silva Orientador: Prof. Dr. Marlos Gonçalves Sousa Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, área Clínica Médica Veterinária. Jaboticabal – SP – Brasil Fevereiro, 2014 Silva, Sheila Nogueira Saraiva da S586 Metaloproteinases da matriz 2 e 9 em coelhos com m cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina / Sheila Nogueira Saraiva da Silva. – – Jaboticabal, 2014 xv, 41 p. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2014 Orientadora: Marlos Gonçalves Sousa Banca examinadora: Aparecido Antonio Camacho, Ronaldo Jun Yamato. Bibliografia 1. Zimografia. 2. Atividade enzimática. 3. Remodelamento. 4. Ecocardiograma. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.2:636.92 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR SHEILA NOGUEIRA SARAIVA DA SILVA – filha de Maria Neide Nogueira e de Antonio Paulo Saraiva da Silva, nascida em 29 de janeiro de 1984 na cidade de São Paulo, estado de São Paulo. Em Julho de 2009, tornou-se Médica Veterinária pela Universidade Federal do Tocantins (UFT), em Araguaína/TO. Em Janeiro de 2012 concluiu a Residência em Clínica Médica de Pequenos Animais, pela Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (UNESP), na cidade de Araçatuba/SP. Em Março de 2012, iniciou o curso de Mestrado em Medicina Veterinária, área de concentração em Clínica Médica Veterinária, junto à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP, campus de Jaboticabal, tendo, desde então, participado das atividades do Serviço de Cardiologia do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da FCAV-UNESP (2243/13). Aos que estiverem sempre ao meu lado durante esta jornada, nos melhores e piores momentos. DEDICO AGRADECIMENTOS À Deus, sobre todas as coisas. Aos meus pais, pelo amor e dedicação sempre. Ao meu orientador, Professor Marlos Gonçalves Sousa, pela oportunidade, pela orientação desde a faculdade, nas iniciações científicas, monitorias, eventos, estágios e mesmo depois de ter dito “agora chega” me acolheu e me propiciou mais esta oportunidade de aprendizado. Ao professor Aparecido Antonio Camacho, um dos grandes nomes da cardiologia veterinária, agradeço pela oportunidade de aprendizado e vivência na cardiologia. A professora Gisele F. Machado, pela oportunidade de utilizar o laboratório de Patologia Aplicada e pela paciência e ajuda ao longo de todos esses meses. Ao professor Canola, por disponibilizar o Serviço de Radiologia e o aparelho nos quais os ecocardiogramas foram feitos. Ao Fabio Nelson Gava, pelos ensinamentos, conselhos, ajuda, pelas manhãs, tardes, noites e madrugadas de experimento. Por ser amigo e parceiro durante todo esse tempo. Ao Fernando, Jorge, Edna, Bruno, que estiveram presentes ao longo das etapas do experimento, e das pizzas. Ao Guilherme Dias Melo, que tanto me ajudou ao longo dos 7 meses em que todas as etapas da zimografia davam errado. Pela ajuda, suporte, paciência e muitos esclarecimentos. Ao Roberto, que discutiu comigo cada passo do meu experimento e me ajudou a encontrar respostas. A todos os amigos da cardiologia (Cardiobrothers) Fabio, Jorge, Edna, Roberto, Evandro, Fernando, Fabrício, Rodrigo, Felipe, Ana, Rafael. Pela amizade e oportunidade de acompanhá-los nos atendimentos. Aos amigos de hoje e de sempre Janete Silva, Reinaldo Garrido, Mariana Rondelli, Tales Prado, Guto Schweigert, Ana Paula Gering, Carol Aoki, Mari Mendes, Joana Mendes, Angela Nogueira, Renato Nogueira, Taisa Rocha, Fernanda Rocha, Henrique Gomes, Silla Esse, Mariana Cardoso, Luriany Pompeo, Bia Perez, Karina Yukie, Natália Souza, Thomas Trein, Acácio Pacheco, Camila Vieira, Fernanda Tamiozzo, Renatinha Figueiredo, Luis Gustavo, Tais Nogueira, todos que com sua amizade e amor estiverem ao meu lado, perto ou longe, me apoiaram, torceram por mim, e sempre me mandaram vibrações positivas. Ao meu namorado João, pelo amor e carinho. Por estar ao meu lado nos bons e maus momentos. Por me ouvir, entender e apoiar. E por me dar chocolate na TPM. Aos amigos da Lan & House, por me receberem de braços e corações abertos. A todos os professores, funcionários, pós-graduandos e residentes do Hospital Veterinário da FCAV-UNESP- Jaboticabal, pela ajuda e amizade; A funcionária “Zezé” do Hospital Veterinário, que em momento crítico, foi prestativa e atenciosa e me ajudou. A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal e a pósgraduação, pela oportunidade; Ao biotério da UNESP- campus de Botucatu, pelo fornecimento dos animais utilizados nesse estudo; Aos meus felinos Chico e Bisca (in memorian), Binho e Pretinho. Que foram minha companhia e minha alegria, durante este período de pós-graduação. A todos os animais. Em especial aos coelhos que participaram dessa pesquisa; A todos que colaboraram de alguma forma para a realização desse trabalho. i SUMÁRIO Página LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................... ii LISTA DE TABELAS.................................................................................................. iv LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. vi RESUMO.................................................................................................................... viii ABSTRACT................................................................................................................ ix 1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 2 3. OBJETIVOS........................................................................................................... 8 3.1 Objetivos gerais........................................................................................ X 3.2 Objetivos específicos............................................................................... X 4. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 10 4.1 Laboratórios.............................................................................................. 10 4.2 Animais...................................................................................................... 10 4.3 Indução da cardiomiopatia tóxica com doxorrubicina.......................... 10 4.4 Avaliações................................................................................................. 11 4.5 Determinação da atividade enzimática das MMPs 2 e 9........................ 11 4.6 Ecocardiografia......................................................................................... 15 4.7 Análise estatística.................................................................................... 17 5. RESULTADOS....................................................................................................... 18 5.1 Indução da cardiomiopatia....................................................................... 18 5.2 Atividade plasmática das MMPs 2 e 9..................................................... 18 5.3 Correlações entre pro-MMPs 2 e 9 e parâmetros ecocardiográficos... 21 5.4 Atividade miocárdica das MMPs 2 e 9.................................................... 28 6. DISCUSSÃO........................................................................................................... X 7. CONCLUSÃO......................................................................................................... X 8. REFERÊNCIAS...................................................................................................... 30 ii LISTA DE ABREVIATURAS Amitral Velocidade máxima do fluxo transmitral no inicio da sístole atrial A’lat Velocidade anular mitral lateral máxima no inicio da sístole atrial A’sep Velocidade anular mitral septal máxima no inicio da sístole atrial AE Átrio esquerdo AE/Ao Relação átrio esquerdo aorta Ao Artéria aorta DIVEd Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole DIVEs Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole Emitral Velocidade máxima do fluxo transmitral no inicio da diástole ventricular E’lat Velocidade anular mitral lateral máxima no inicio da diástole ventricular E’sep Velocidade anular mitral septal máxima no inicio da diástole ventricular ECG Eletrocardiograma ECO Ecocardiograma FEC% Fração de encurtamento FEJ% Fração de ejeção GC Grupo controle GD Grupo doxorrubicina ICC Insuficiência cardíaca congestiva MEC Matriz extracelular MMP Metaloproteinases da matriz PLVE% Espessamento fracional da parede livre do VE PLVEd Parede livre do ventrículo esquerdo em diástole PLVEs Parede livre do ventrículo esquerdo em sístole PPE Período de pré-ejeção Pro-MMP Forma inativa/latente da MMP Slat Velocidade anular mitral lateral máxima na sístole ventricular Ssep Velocidade anular mitral septal máxima na sístole ventricular SIV% Espessamento fracional do septo interventricular SIVd Espessura do septo interventricular em diástole iii SIVs Espessura do septo interventricular em sístole SSPE Separação septal do ponto E TEI Índice de desempenho miocárdico de Tei TEVE Tempo de ejeção ventricular esquerda TIMP Inibidores teciduais das metaloproteinases TRIV Tempo de relaxamento isovolumétrico UA Unidade arbitrária VmaxAo Velocidade máxima do fluxo aórtico VmaxPulm Velocidade máxima do fluxo pulmonar iv LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 - Percentual e número absoluto de animais onde foram identificadas bandas representativas da pro-MMP-2 e proMMP-9 plasmáticas nos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014..................................................................................... Tabela 2 - 19 Valores médios, desvios-padrão, medianas e resultados da análise de variância das pro-MMPs 2 e 9 plasmáticas nos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)........................................................................................... Tabela 3 - 20 Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas em modo B e modo M no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ Tabela 4 - 22 Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler convencional no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ Tabela 5 - 24 Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler tecidual no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ Tabela 6 - 25 Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas em modo B e modo M no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ 26 v Tabela 7 - Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler convencional no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ Tabela 8 - 27 Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler tecidual no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................................................ Tabela 9 - 28 Valores médios, desvios-padrão, medianas (entre parênteses) da pro-MMP-2 miocárdica e resultado do teste T não pareado para comparação dos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)......................................... 29 vi LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 - Zimograma evidenciando a disposição das bandas da proMMP-9, pro-MMP-2 e MMP-2 no adenocarcinoma mamário canino utilizado como controle positivo, assim como no plasma de nove animais pertencentes ao grupo controle. UNESP, Araçatuba, SP (2014)................................................... Figura 2 - 19 Medianas, interquartis (25/75), valores mínimos e máximos e médias (+) das atividades plasmáticas (Unidades Arbitrárias) da pro-MMP-2 e pro-MMP-9 nos grupos controle (esquerda) e doxorrubicina (direita), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)................................................. Figura 3 - 21 Representação gráfica da correlação significativa entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs), diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole (DIVE d) e septo interventricular em sístole (SIVs) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)................ Figura 4 - 23 Representação gráfica da correlação significativa entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis período de pré-ejeção (PPE) e índice de desempenho miocárdico de Tei (TEI) em T15, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................... Figura 5 - 24 Representação gráfica das correlações significativas entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis velocidade anular mitral lateral máxima no inicio da sístole atrial (A’lat) em T0 e relação entre Emitral e E’sep (Emitral/E’sep) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)................ 25 vii Figura 6 - Representação gráfica das correlações significativas entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis espessamento fracional do septo interventricular (PLVE%) em T30 e tempo de ejeção ventricular esquerda (TEVE) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)......................................................................................... Figura 7 - 27 Medianas, interquartis (25/75), valores mínimos e máximos e médias (+) da atividade miocárdica (Unidades Arbitrárias) da pro-MMP-2 nos grupos controle e doxorrubicina. UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............................................................... Figura 8 - 29 Correlação de Pearson entre as atividades plasmática e miocárdica da pro-MMP-2 nos grupos controle (esquerda) e doxorrubicina (direita). UNESP, Jaboticabal, SP (2014)............ 29 viii METALOPROTEINASES DA MATRIZ 2 E 9 EM COELHOS COM CARDIOMIOPATIA INDUZIDA PELA DOXORRUBICINA RESUMO – A doxorrubicina é um quimioterápico bastante utilizado em pacientes oncológicos e sua cardiotoxicidade está relacionada com vários mecanismos celulares, incluindo necrose e apoptose. Estudos têm aventado a participação das metaloproteinases da matriz e seus inibidores na cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina. Assim, esta pesquisa teve como objetivo avaliar as atividades plasmática e miocárdica das metaloproteinases da matriz 2 e 9 em coelhos com cardiomiopatia por doxorrubicina, correlacionando-as com o remodelamento cardíaco que acompanha tal enfermidade. Os animais foram divididos em dois grupos: controle (n=10) e doxorrubicina (n=15). As atividades plasmática e miocárdica foram analisadas através do método de zimografia. Foram evidenciadas apenas as formas inativas das MMPs (pro-MMP) nas amostras sanguíneas analisadas. A pro-MMP-2 foi documentada no plasma dos animais controle e daqueles com cardiomiopatia por doxorrubicina em todos os momentos de avaliação. Já a pro-MMP-9 foi encontrada em algumas amostras dos grupos controle e enfermo, principalmente nos momentos de valiação T30 e T45, porém em fraca marcação. Houve diferença significativa na atividade das pro-MMPs-2 e 9 ao longo dos tempos de estudo. Os testes de correlação entre as pro-MMPs plasmática e os parâmetros ecocardiográficos evidenciaram resultados significativos. Em T0 verificou-se correlação entre A’lat e pro-MMP-2; em T15 documentaram-se correlações entre a pro-MMP-2 e os parâmetros PPE e TEI; já em T30 constatou-se correlação entre pro-MMP-9 e PLVE%; em T45, finalmente, foram observadas correlações entre pro-MMP-2 e os parâmetros DIVEs, DIVEd, SIVs e Emitral/E’sep, assim como entre pro-MMP-9 e TEVE. No miocárdio evidenciou-se apenas a proMMP-2. A atividade plasmática das MMPs, em especial a pro-MMP 2, pôde ser relacionada às alterações morfofuncionais da cardiomiopatia induzida, sendo que não houve correlação entre a atividade plasmática e miocárdica das MMPs 2 e 9, limitando a aplicabilidade de sua quantificação sanguínea como biomarcador das alterações miocárdicas atribuídas à cardiotoxicidade exercida pela doxorrubicina Palavras chave: zimografia, atividade enzimática, remodelamento, ecocardiograma. ix MATRIX METALLOPROTEINASES 2 AND 9 IN RABBITS WITH DOXORUBICIN INDUCED CARDIOMYOPATHY ABSTRACT – Doxorubicin is a chemotherapy agent frequently used in oncology patients. Its cardiotoxicity is related to several cellular mechanisms, including necrosis and apoptosis. Some studies have ascribed a role to matrix metalloproteinases and their inhibitors in the cardiotoxicity induced by doxorubicin. Therefore, this research was aimed at evaluating the plasma and myocardial activities of matrix metalloproteinases 2 and 9 in rabbits with doxorubicin-induced cardiomyopathy, searching for a correlation between them and the cardiac remodeling attributable to such disease. The animals were assigned into two groups: control (n=10) and doxorubicin (n=15). The plasmatic and myocardial activities were analyzed through the method of zymography. Only the inactive MMPs (pro-MMP) have been identified in the blood samples. The plasma pro-MMP-2 was documented in both control and doxurubicin animals from T0 to T45. On the contrary, the pro-MMP-9 was found in some samples of control and doxurubicin groups, especially at T30 and T45, although only weak bands have been demonstrated. A significant difference was shown to occur in pro-MMPs-2 and 9 along time. Correlation tests between the plasma pro-MMPs and the echocardiographic data demonstrated significant results. At T0 a correlation was found between A’lat and pro-MMP-2; at T15 correlations were documented between pro-MMP-2 and the parameters PEP and TEI; at T30 a correlation was identified between pro-MMP-9 and PLVE%; lastly, at T45 correlations have been observed between pro-MMP-2 and the parameters LVIDs, LVIDd, IVSs e Emitral/E’sep, as well as between pro-MMP-9 and LVET. Only the pro-MMP-2 was documented at the myocardium, although no significant difference between groups could be demonstrated. The plasmatic activity of the MMPs, specially the pro-MMP 2, could be related to the morphofunctional alterations of the induced cardiomyopathy, and that there was no correlation between the plasmatic and myocardic activities of the MMPs 2 and 9, disproving the applicability of its blood quantification as biomarker of the myocardial alterations atributed to the doxorrubicin exerted cardiotoxicity Key-words: zymography, enzyme activity, remodeling, echocardiogram. 1 1. INTRODUÇÃO A doxorrubicina é um quimioterápico muito utilizado em pacientes oncológicos e sua cardiotoxicidade está relacionada com vários mecanismos celulares. Tal condição se assemelha à cardiomiopatia dilatada, causando insuficiência miocárdica e dilatação cardíaca, cujas repercussões clínicas incluem insuficiência cardíaca congestiva, arritmias e até mesmo morte súbita. O desenvolvimento de insuficiência cardíaca é um processo crônico, associado com remodelamento, o qual envolve necrose e apoptose de cardiomiócitos, proliferação de fibroblastos e alteração de ambos os componentes intracelulares do miocárdio, bem como das principais proteínas estruturais da matriz extracelular (MEC). O remodelamento da MEC é atribuído a um papel crucial das metaloproteinases de matriz (MMPs). No entanto, estudos contemporâneos têm demonstrado que a MMP cliva não apenas os componentes proteícos principais do compartimento extracelular do miocárdio, mas também inúmeras proteínas do sarcômero e do citoesqueleto dentro dos miócitos cardíacos. Tanto a MMP-2 quanto a MMP-9 desempenham importante função no desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares. Assim, as MMPs vêm sendo utilizadas como marcadores de lesão tecidual e, mais recentemente, como marcador no processo de remodelamento miocárdico em cães com doença valvular mixomatosa e em humanos, nos casos de cardiomiopatia dilatada e infarto agudo do miocárdio. Outros estudos têm sido realizados para avaliar a ação das metaloproteinases da matriz e seus inibidores na cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina. 2 2. REVISÃO DE LITERATURA A doxorrubicina, também denominada adriamicina, é um fármaco do grupo das antraciclinas que está entre os quimioterápicos utilizados na medicina e na medicina veterinária para o tratamento de diferentes neoplasias malignas, especialmente tumores sólidos, leucemias e linfomas. Entretanto, possui como efeitos colaterais toxicidade que envolve alterações hematológicas, gastrointestinais, dermatológicas, renais e, principalmente, cardiocirculatórias (SPEYER et al., 1988; STEINHERZ et al., 1991; RODASKI; DE-NARDI, 2008; SANTOS et al., 2009). O efeito cardiotóxico da doxorrubicina está associado à sua concentração cumulativa, de modo que dosagens que excedem 250 mg/m² em seres humanos, 240 mg/m² em cães e 90 mg/m² em gatos desencadeiam degeneração miocárdica progressiva (SOUZA, 2004; SILVA, CAMACHO, 2005; SOUZA, CAMACHO, 2006; BRUNTON, LAZO, PARKER, 2007; RODASKI, DE-NARDI, 2008). Os mecanismos que levam ao desfecho da cardiomiopatia tóxica são complexos e ainda não estão completamente elucidados. Em 1980, Jaenke e colaboradores utilizaram coelhos para avaliar os danos causados pela doxorrubicina, estabelecendo doses máximas toleradas pela espécie. Já em 1985, Arnolda e equipe estudaram as alterações geradas pela doxorrubicina em coelhos, avaliando a ativação dos mecanismos vasoconstritores. Porém, na época em que esses estudos foram realizados, ainda não se dispunha de técnicas modernas de avaliação da anatomia e função cardíaca, como a eletrocardiografia computadorizada e o ecodopplercardiograma. Em cães, o tratamento crônico com doxorrubicina induz a insuficiência miocárdica e insuficiência cardíaca congestiva (ICC), de forma semelhante à observada em cães com cardiomiopatia dilatada (SILVA, CAMACHO, 2005). A cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina é dose-dependente e comumente se desenvolve em cães após uma dose cumulativa superior a 250 mg/m² (SUSANECK, 1983; JACOBS, 1996). Entretanto Silva (2001) demonstrou, experimentalmente, que cães desenvolvem cardiotoxicidade mesmo com doses inferiores à mencionada. Já 3 Mauldin et al. (1992) relatou a ocorrência de insuficiência cardíaca congestiva em sete cães tratados com dose cumulativa média de 150 mg/m². No cão, as manifestações atribuídas à cardiotoxicidade podem ocorrer de três maneiras: forma aguda, instantes após a administração do fármaco, com o animal apresentando anafilaxia, êmese, hipotensão e arritmias; em curto prazo, manifestada uma a duas semanas após a administração, onde o animal desenvolve emagrecimento, anorexia, alterações gastrointestinais, hipoplasia de medula óssea, atrofia linfóide e alopecia; e, finalmente, a forma mais comum, que é crônica, dose dependente, com início variável dos sinais clínicos, que incluem ICC, anormalidades eletrocardiográficas, arritmias e morte súbita (SUSANECK, 1983; PRICE, et al., 1991; MAULDIN, et al., 1992; HANAI, et al, 1996; JACOBS, 1996; TOYODA, et al., 1998). As principais alterações ecocardiográficas nos modos bidimensional e em modo-M encontradas em cães com cardiomiopatia tóxica incluem aumento no diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole e diástole e diminuição da fração de encurtamento do ventrículo esquerdo (HANAI, et al., 1996; TOYODA, et al., 1998). Silva e Camacho (2005) estudaram as alterações ecocardiográficas em cães submetidos à terapia prolongada com doxorrubicina e encontraram insuficiência sistólica, seguida de dilatação atrioventricular esquerda, aumento gradual do diâmetro e volume ventricular esquerdo ao final da sístole, além de hipocinesia do septo interventricular e parede livre do ventrículo esquerdo, os quais promoveram queda proporcional da fração de encurtamento e aumento do volume sistólico final, com consequente redução da fração de ejeção e do volume ejetado. As maiores reduções (encurtamento e ejeção) foram observadas após a administração da última dose de doxorrubicina, levando a crer que a dose total está diretamente relacionada com o grau de disfunção miocárdica. A cardiotoxicidade da doxorubicina está relacionada a vários mecanismos celulares, incluindo necrose e apoptose. Acredita-se que o acúmulo da substância nas mitocôndrias promova formação de radicais livres e reações de peroxidação. A liberação de superóxidos propicia a conversão dos ácidos graxos insaturados da membrana celular miocárdica em peróxidos lipídicos, resultando em alterações estruturais no miócito, com formação de vacúolos, degeneração mitocondrial, perda 4 dos miofilamentos e atrofia progressiva das miofibrilas. Com a liberação de citocromo C pelas mitocôndrias no citosol, ocorre ativação da caspase-9, responsável pela ativação das outras caspases, com consequente morte celular (GREEN & LEEUWENBURGH, 2002). Ademais, sabe-se que a doxorrubicina pode desencadear liberação de histamina, metabólitos do ácido araquidônico e fator de ativação plaquetário, contribuindo para progressão de lesões no miocárdio. Tais alterações resultam em dilatação cardíaca, perda da capacidade contrátil e remodelamento miocárdico (SUSANECK, 1983; TOMLINSON et al., 1985; GANZ et al., 1996; TOYODA et al., 1998; TJEERDSMA et al., 1999; SOUZA, 2007). A dilatação cardíaca que se desenvolve durante o uso prolongado da doxorrubicina altera os componentes da matriz extracelular (GOTO et al., 2003). As altas concentrações de doxorrubicina modificam a rede de colágeno e também os cardiomiócitos (DIEZ, 2010). No coração, o colágeno é a principal proteína de sustentação dessas células. Assim, quando a síntese dessa proteína predomina sob a degradação, o resultado é a fibrose. Ao contrário, quando a degradação predomina, a perda do colágeno resulta em disfunção contrátil (DIEZ, 2010). Ao avaliarem os colágenos tipo I, III e IV no coração de ratos após uma única aplicação de doxorrubicina, Dudnakova et al. (2003) constataram aumento da densidade e extensão do colágeno, indicando o desenvolvimento de fibrose difusa. Nesse mesmo estudo, observaram-se apoptose, perda focal de elementos contráteis, alterações no citoesqueleto e cardiomiócitos com núcleo penetrado por mitocôndrias, sugerindo drástica alteração na permeabilidade nuclear. As propriedades estruturais do ventrículo são determinadas não somente pelos miócitos, mas também pelo tecido conjuntivo intersticial, que é rico em colágeno fibrilar tipos I e III. Este último forma os suportes nos quais os miócitos são alinhados. Ramos de fibras colagenosas correm em ângulos retos para a conexão e alinhamento de fibras musculares cardíacas. Dessa forma, a depleção de tais suportes pode levar à dilatação cardíaca. A quantidade e o tipo de matriz extracelular podem também ter profundos efeitos nas propriedades diastólicas do miocárdio, afetando sua elasticidade e disposição fisiológica (COLUCCI, 2003). A quantidade e natureza do colágeno na matriz extracelular são determinadas pelo equilíbrio entre síntese e degradação, sendo esta última regulada pela ação 5 opositora das metaloproteinases da matriz (matrix metalloproteinases ou MMP), uma família de enzimas que degradam proteínas da matriz, bem como dos inibidores das metaloproteinases (tissue inhibitors of metalloproteinase ou TIMP), uma família de enzimas que inibem a atividade das MMPs. No miocárdio de modelos humanos e animais de insuficiência sistólica, observações ultraestruturais têm mostrado a depleção de suportes de colágeno fibrilar, que auxiliam na manutenção e alinhamento dos miócitos. Destarte, tem sido proposto que a depleção da porção do suporte de colágeno pode contribuir para a dilatação da câmara por permitir um "deslizamento" de miócitos. Esta informação é consistente com as observações de que a atividade das MMP encontra-se aumentada no miocárdio de pacientes em estágio final de insuficiência cardíaca. De modo semelhante, a atividade dos TIMPs encontra-se diminuída no miocárdio de pacientes em estágio final de insuficiência cardíaca (COLUCCI, 2003). As MMPs constituem-se de um grupo de enzimas responsáveis pela degradação dos componentes da MEC e das membranas basais (NAVARRO et al., 2006). Trata-se de endopeptidases secretadas na forma de pro-enzimas inativas, denominadas zimogênios, que são ativadas no ambiente pericelular dos tecidos por segmentação do pro-peptídeo, ou seja, por quebra de uma ligação de cisteína-Zn++ que bloqueia a reatividade do local ativo. Este processo faz com que os zimogênios (inativos) se transformem em MMPs (ativas). Cada célula expressa um tipo de complemento de MMPs e, assim sendo, as citocinas causarão efeitos diferentes sobre as células (MURPHY, 1997). As metaloproteinases são classificadas de acordo com o substrato que degradam. As colagenases que compreendem as MMPs 1, 8, 13 e 18, as gelatinases MMP-2, MMP-9 as estromelisinas MMPs 3, 7, 10, 11, 19, 20, matrilisinas MMPs 7 e 16 e as de tipo membrana MT-MMPs: MMPs 14,15, 16, 17, 24 e 25 (VISSE & NAGASE, 2003; LOFTUS & THOMPSON, 2002). 6 O esquema abaixo demonstra a forma de ativação das MMPs no tecido: Celulas inflamatórias (neutrófilos, macrófagos) Celulas de feridas (células epiteliais, fibroblastos, células vasculares endoteliais) Liberam Pro-MMPs Ativam Proteases (plasmina, neutrófilos elastase, mastócito quinase) MMPs Inativa m TIMPs TIMPS (de fibroblastos, células perivasculares, queratinócitos basais) Modificado de Cullen, 2009. Segundo Birkedal-Hansen (1993) a atividade das MMPs no substrato da matriz extracelular é regulada por quatro vias: 1) transcrição nos genes das MMPs; 2) ativação de precursores; 3) diferenças de especificidade de substrato; e 4) inibidores de MMPs. Esses inibidores teciduais de MMPs (TIMPs) são proteínas pequenas e multifuncionais que regulam ambas as funções das MMPs, o nível de sua ativação e sua habilidade de hidrolisar um determinado substrato (MURPHY, 1997; SOUSA, 2002). O equilíbrio entre a produção de MMPs e de TIMPs representa o ponto principal para manutenção da homeostase da matriz extracelular. Em seres humanos, a atividade das MMPs tem sido relacionada a importantes doenças, como destruição de articulações nos casos de artrite reumatóide, osteoartrite, aneurisma aórtico abdominal, infarto agudo do miocárdio e câncer. As MMPs também participam de processos de remodelamento normais, 7 como no desenvolvimento embrionário, na involução pós-parto do útero, na remodelação óssea, na ovulação e na reparação de feridas (NAVARRO et al., 2006). A MEC é responsável pela organização e pela integridade estrutural do miocárdio. As MMPs, por sua vez, podem degradar componentes da MEC, incluindo as fibras colágenas tipo I, II e III, gelatina, fibronectina, laminina e vitronectina. No estresse oxidativo, assim como em outros processos patológicos, pode haver desequilíbrio entre as proteases e antiproteases, resultando em alterações quantitativas e/ou qualitativas na composição da matriz. Tal condição possibilita ruptura do colágeno, com consequente dilatação e remodelamento do miocárdio (SHAKER & SOUROUR, 2010). Já se demonstrou que tanto a MMP-2 quanto a MMP-9 desempenham importante função no desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares (KIZAKE et al., 2006). Alterações nos níveis dessas metaloproteinases foram documentadas na cardiomiopatia dilatada em seres humanos (LI et al., 1998; THOMAS et al., 1998; SPINALE et al., 2000), em doenças hipertensivas utilizando ratos como modelo experimental (ROBERT et al., 1997), no infarto do miocárdio (PETERSON et al., 2000), bem como após tratamento agudo (KIZAKE, 2006) e crônico (ADAMCOVÁ et al., 2010) com doxorrubicina em ratos. Ao estudarem as MMPs 1 e 9 em cães apresentando fibrilação atrial, Zhang et al. (2008) demonstraram valores de MMP-9 significativamente maiores nos cães com arritmia do que nos animais controle. Além disso, também evidenciaram que o uso do captopril diminuiu concomitantemente o remodelamento atrial e os valores das MMPs testadas. Em um estudo relativamente recente envolvendo cães com doença valvular mitral mixomatosa, Ljugvall et al. (2011) documentaram redução da atividade plasmática da MMP-9 à medida que houve aumento no diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole, concluindo que tal avaliação pode ser útil como marcador do processo de remodelamento miocárdico em cães com tal enfermidade. No entanto, ainda que essa família de enzima seja promissora para qualificar o remodelamento cardíaco, testes que avaliam as MMPs e seus inibidores teciduais ainda se encontram em fases iniciais de desenvolvimento, havendo necessidade de pesquisas adicionais para elucidar e aprimorar o conhecimento e seu potencial como biomarcadores. Deste modo, será possível ampliar sua utilização, melhorando seu 8 custo/benefício para diagnóstico e monitoramento das terapias nos pacientes cardiopatas. Nesse contexto, o modelo de cardiomiopatia tóxica induzido pela doxorrubicina em coelhos possibilita acompanhar a evolução dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos com essa importante cardiopatia que acomete diversas espécies. 9 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivos gerais Esta pesquisa teve como objetivo estudar o remodelamento miocárdico na cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em coelhos, averiguando-se o comportamento das metaloproteinases da matriz 2 e 9 e as modificações morfofuncionais sabidamente presentes em tal modelo experimental. 3.2. Objetivos específicos Foram objetivos específicos desta pesquisa a avaliação das metaloproteinases da matriz 2 e 9 ao longo da indução da cardiomiopatia pela doxorrubicina; a determinação da correlação entre a atividade plasmática das metaloproteinases 2 e 9 e os indicadores ecocardiográficos de função sistólica e diastólica; a determinação da concentração miocárdica das metaloproteinases 2 e 9 ao término do processo de indução da cardiomiopatia em questão. 10 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Laboratórios As atividades experimentais foram realizadas nos Laboratórios de Cardiologia, Patologia Clínica e Radiologia do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Jaboticabal, SP. As metaloproteinases foram quantificadas no Laboratório de Patologia Aplicada da Faculdade de Medicina Veterinária (FMVA) da UNESP, campus de Araçatuba, SP. 4.2. Animais Foram utilizados inicialmente 25 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, adultos, machos, peso médio de 3,0±1,0 kg, provenientes de biotério especializado na criação da espécie. Os coelhos foram mantidos em gaiolas individuais, com dimensões de 80 cm x 50 cm x 35 cm, sendo oferecida ração comercial própria para a espécie e água ad libitum. Após ambientação dos animais e cuidadoso exame físico, procedeu-se a composição de dois grupos experimentais: (GC) grupo controle, com 10 animais e (GD) grupo doxorrubicina, com 15 animais. 4.3. Indução da cardiomiopatia tóxica com doxorrubicina Para indução da cardiomiopatia tóxica, foi adotado o protocolo recentemente estudado por Gava (2011). A diluição do fármaco foi realizada em capela de fluxo laminar apropriada para manejo de quimioterápicos. Todos os manipuladores utilizaram acessórios de segurança (luvas, avental, gorro e máscara) durante as manipulações e administrações do fármaco. Nenhum animal foi anestesiado durante a administração do fármaco e, para correta imobilização, utilizou-se um suporte de contenção. Inicialmente foi realizada 11 tricotomia da região auricular e posterior assepsia. Um cateter agulhado (scalp) número 21 foi inserido na veia auricular, sendo a dose total do fármaco já diluído aplicada em bolus de forma lenta. Os animais do grupo GD receberm doxorrubicina, por via intravenosa, na dose de 1 mg/kg, duas vezes por semana (segundas e quintas-feiras), por seis semanas consecutivas. Os animais do grupo GC receberam apenas solução de cloreto de sódio 0,9%, em volume semelhante àquele utilizado para aplicação da doxorrubicina em animal de peso semelhante. 4.4. Avaliações As determinações das atividades plasmáticas das metaloproteinases da matriz 2 e 9, bem como as avaliações ecocardiográficas foram realizadas nos animais de ambos os grupos, sem qualquer sedação ou anestesia, obedecendo-se aos seguintes tempos experimentais: T0: avaliação basal (antes da administração inicial da doxorrubicina); T15: quinze dias após a primeira administração da doxorrubicina; T30: trinta dias após a primeira administração da doxorrubicina; T45: quarenta e cinco dias após a primeira administração da doxorrubicina. Ao término das avaliações, os animais foram eutanasiados, obedecendo-se aos critérios éticos e técnicos descritos na Resolução 1000, de 11/05/2012, do Conselho Federal de Medicina Veterinária, visando a obtenção de amostras miocárdicas destinadas à determinação da atividade das metaloproteinases de matriz 2 e 9 no tecido cardíaco. Nesse sentido, foram coletados fragmentos de ventrículo direito, ventrículo esquerdo e septo interventricular, os quais foram acondicionados em tubos estéreis e armazenados em freezer a -80ºC até o momento do processamento. 4.5. Determinação das atividades enzimáticas das MMPs 2 e 9 Para determinação das atividades plasmáticas das metaloproteinases da matriz 2 e 9, coletaram-se amostras sanguíneas de 3 mL dos animais em cada um 12 dos tempos estudados, empregando-se tubos estéreis a vácuo contendo anticoagulante citrato. Na sequência, o material foi centrifugado, sendo o plasma transferido para tubos estéreis devidamente identificados, onde permaneceram congelados em freezer -80ºC para análise posterior. No momento das análises, as amostras de tecido cardíaco, previamente estocadas, foram descongeladas e mantidas em recipiente com gelo para que se mantivesse a temperatura de 4ºC. Os fragmentos foram então macerados em 1,0 mL de tampão de lise. O conteúdo foi coletado com pipeta e transferido para tubo eppendorf, o qual foi centrifugado a 12.000 x g por 15 minutos. Na sequência, removeu-se o sobrenadante, que foi então tranferido para novos tubos eppendorf. Para quantificação de proteínas nas amostras plasmáticas e miocárdicas foi utilizado o método do ácido bicinconínico (BCA 23225, Pierce Biotechnology). Foram pipetados 10 µL das amostras em placa de ELISA em duplicata, assim como a curva padrão também em duplicata. Adicionaram-se 200 µL da solução de trabalho (BCA Protein Assay Reagent, Pierce Biotechnology) à placa, a qual foi incubada a 37ºC por 30 minutos. Após este período, procedeu-se a leitura em espectrofotômetro com absorbância de 562 nm. A concentração de proteínas (em µg/mL) foi estimada por meio de equação de regressão, calculando-se, individualmente, a quantidade em µL de amostra suficiente para que fosse obtido 15 µg de proteína por amostra. A zimografia foi realizada segundo o método descrito por Melo et al. (2011) para o plasma e por Machado et al. (2010) para o tecido. Para tanto, empregou-se gel de zimograma (poliacrilamida) contendo 1 mg de gelatina. As amostras foram submetidas à eletroforese por 90 minutos a 150V, em tampão de corrida Tris-Glicina, pH 8,3, em temperatura de 4ºC. Na sequência, os géis foram lavados em solução Triton X-100 2,7% por 30 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, os géis foram incubado em tampão de desenvolvimento (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,2% Brij 35, pH 7,5) por 20 horas, a 37ºC. Após a incubação, procedeu-se a coloração dos géis com 0,5 gramas de azul de Comassie dissolvido em 45% de metanol, 10% de ácido acético e 45% de água destilada, seguido do procedimento de descoloração em solução de ácido acético 7%. Na sequência, os géis foram fotografados em alta resolução, empregando-se fotodocumentador (ImageQuant LAS 4000, GE), sendo as bandas analisadas por 13 densitometria para a comparação dos dados obtidos nos diferentes momentos avaliados nos grupos GC e GD. Assim, as imagens foram analisadas pelo software ImageJ 1.46r (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, EUA; http://rsb.info.nih.gov/ij), utilizando o método da densidade integrada (expresso em unidade arbitrária). Para normalização entre os géis, foi utilizada amostra de adenocarcinoma mamário canino como controle positivo das reações. 4.6. Ecocardiografia A avaliação ecocardiográfica foi realizada segundo descrição de Stypmann et al. (2007), sem empregar quaisquer substâncias tranquilizantes, sedativas e/ou anestésicas. Dessa forma, realizou-se tricotomia da região torácica e, em seguida, os animais foram submetidos à contenção física, em decúbito lateral. Foi empregado ecodopplercardiógrafo equipado com transdutor multifrequencial de 7,5-10,0 MHz, sendo os dados armazenados na memória do aparelho para realização das medidas e cálculos ao término do exame. O registro eletrocardiográfico bipolar monocanal foi realizado simultaneamente para permitir a mensuração de algumas variáveis dependentes do traçado eletrocardiográfico. A velocidade de registro das variáveis em modo-M e Doppler foi padronizada em 50 mm/s, buscando-se melhor visibilização dos pontos de mensuração, reduzindo a possibilidade de erros. Com o animal posicionado em decúbito lateral direito, localizou-se a janela paraesternal direita. A partir da visualização bidimensional do ventrículo esquerdo em eixo transversal, foram obtidas imagens em modo-M, em planos cordal e mitral, para mensuração do diâmetro interno do ventrículo esquerdo na sístole (DIVEs) e diástole (DIVEd), espessura do septo interventricular na sístole (SIV s) e diástole (SIVd), espessura da parede livre do ventrículo esquerdo na sístole (PLVEs) e diástole (PLVEd), além da separação septal do ponto E (SSPE). Ainda na mesma janela ecocardiográfica em eixo transversal, o transdutor foi inclinado dorsalmente até que se alcançasse o plano aórtico, sendo então determinados os diâmetros do átrio esquerdo (AE) e da artéria aorta (AO). Inclinando-se ainda mais dorsalmente o transdutor, foi obtida a imagem da artéria pulmonar, posicionando-se o cursor 14 distalmente às válvulas pulmonares para mensuração do pico de velocidade do fluxo transpulmônico (VmaxPulm) pelo Doppler pulsado Com o animal posicionado em decúbito lateral esquerdo obteve-se imagem apical quatro câmaras pela janela paraesternal esquerda. Foram então mensurados o pico de velocidade do enchimento ventricular esquerdo rápido (E mitral) e lento (Amitral), posicionando-se o cursor do Doppler pulsado na extremidade dos folhetos da valva mitral durante sua abertura. Na imagem apical cinco câmaras obtida pela mesma janela, mensurou-se o pico de velocidade do fluxo transaórtico (VmaxAo). Para mensuração do período de pré-ejeção (PPE), foi determinado o tempo desde a onda Q observada no traçado eletrocardiográfico simultâneo até o início do espectro aórtico. O tempo de ejeção ventricular esquerda (TEVE) foi quantificado como o tempo decorrido do início ao término do envelope espectral aórtico. O tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), por sua vez, foi obtido posicionando-se o cursor Doppler equidistante entre a via de saída do ventrículo esquerdo e o fluxo transmitral, sendo determinado o tempo decorrido do término do fluxo aórtico ao início do enchimento ventricular esquerdo rápido. A avaliação por Doppler tecidual incluiu a mensuração das velocidades anulares máximas no inicio da diástole ventricular (E’), no início da sístole atrial (A’), assim como na sístole ventricular (S). Todos os parâmetros foram quantificados com o cursor posicionado junto à inserção dos folhetos lateral (E’ lat, A’lat, Slat) e septal (E’sep, A’sep, Ssep) da valva mitral. Diversos índices ecocardiográficos foram calculados com as variáveis obtidas, incluindo fração de encurtamento (FEC%), fração de ejeção (FEJ%), espessamento fracional do septo interventricular (SIV%), espessamento fracional da parede livre do ventrículo esquerdo (PLVE%), além das relações entre AE e AO (AE/AO), Emitral e Amitral (Emitral/Amitral), Emitral e TRIV (Emitral/TRIV), E’lat e A’lat (E’lat/A’lat), Emitral e E’lat (Emitral/E’lat), E’sep e A’sep (E’sep/A’sep), Emitral e E’sep (Emitral/E’sep), além do índice de desempenho miocárdico de Tei (TEI). Para todos os parâmetros, o resultado das mensurações ecocardiográficas foi considerado como a média de três ciclos cardíacos consecutivos. Para os parâmetros Doppler, procurou-se otimizar o direcionamento do cursor por meio do 15 sinal de áudio, visando maximizar o espectro do pico de velocidade do fluxo sanguíneo e obter o som mais puro. 4.7. Análise estatística Os resultados obtidos foram avaliados segundo o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Os dados com distribuição normal foram submetidos à comparação dos tempos experimentais valendo-se de análise de variância com medidas repetidas, seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey. Por outro lado, utilizou-se o teste de Friedman, seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn, para análise temporal da atividade das MMPs nos dados com distribuição não paramétrica. Já a comparação individual dos tempos experimentais entre os grupos GC e GD baseou-se no teste de Mann-Whitney. Finalmente, a comparação entre a atividade miocárdica das MMPs nos grupos GC e GD foi feita pelo teste T não pareado. Diversas correlações foram avaliadas. A correlação entre as atividades plasmática e miocárdica das MMPs baseou-se o teste de Pearson, enquanto o teste de Spearman foi empregado para avaliar, especificamente no grupo GD, a correlação entre os valores das atividades plasmáticas das MMPs e cada um dos diversos parâmetros ecocardiográficos estudados. Todas as análises foram realizadas empregando-se o software Graphpad Prism® versão 5.0, desenvolvido pela Graphpad Software®, San Diego, EUA (2007), considerando-se P<0,05 como estatisticamente significativo. 16 5. RESULTADOS 5.1. Indução da cardiomiopatia Não houve óbito nos animais do grupo GC. No sentido contrário, houve 33% de óbito (n=5) em GD, os quais ocorreram em T30 (3 animais) e após T45 (2 animais). O processo de indução da cardiomiopatia foi realizado conforme descrito na metodologia, atingindo-se a dose cumulativa de 12mg/kg, sendo os animais submetidos à avaliação ecocardiográfica ao longo dos momentos para se constatar as alterações morfológicas e funcionais cardíacas. Ao se comparar as variáveis ecocardiográficas obtidas em modo B e modo M nos tempos T0 e T45 em GC e GD, notou-se dilatação das câmaras cardíacas apenas nos animais de GD. A comparação das variáveis entre GC e GD demonstrou diferença significativa nos parâmetros espessura do septo interventricular (4,95±0,36 cm vesus 4,19±0,17 cm), diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (9,16±0,47 cm versus 10,25±0,44 cm), espessura da parede livre em sístole (4,37±0,09 cm versus 3,45±0,14 cm), fração de encurtamento (38,26±1,45% versus 21,36±0,76%), além da fração de ejeção (71,86±1,73% versus 47,14±1,34%). 5.2. Atividades plasmáticas das MMPs 2 e 9 A avaliação dos zimogramas evidenciou presença apenas das formas inativas das MMPs (pro-MMP) em todas as amostras plasmáticas estudadas. A figura 1 ilustra a disposição das bandas coradas, evidenciando a comparação de algumas amostras com tecido oriundo de adenocarcinoma mamário canino utilizado como controle positivo. A pro-MMP-2 plasmática foi identificada em 100% das amostras de GC e GD entre T0 e T30. Entretanto, em T45 esteve presente em apenas 90% dos animais de GC e 83,3% dos indivíduos com cardiomiopatia (Tabela 1). A tabela 1 também evidencia que, em GD, a pro-MMP-9 plasmática esteve ausente em T0, presente em 8,3% das amostras em T15, presente em 91,7% em T30 e em 60% dos animais em T45. De forma semelhante, nos animais de GC a pro-MMP-9 esteve presente em 17 10% dos coelhos em T0, ausente em T15, presente em 50% das amostras em T30 e em 80% em T45. No entanto, embora estivessem presentes, as bandas relativas à pro-MMP-9 apresentaram-se fracamente marcadas em ambos os grupos, tendo valores próximos a zero (Tabela 2). Pro-MMP-9 Pro-MMP-2 MMP-2 Figura 1 – Zimograma evidenciando a disposição das bandas da pro-MMP-9, proMMP-2 e MMP-2 no adenocarcinoma mamário canino utilizado como controle positivo, assim como no plasma de nove animais pertencentes ao grupo controle. UNESP, Araçatuba, SP (2014) Tabela 1 - Percentual e número absoluto de animais onde foram identificadas bandas representativas da pro-MMP-2 e pro-MMP-9 plasmáticas nos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável Grupos Pro-MMP-2 Tempos T0 T15 T30 T45 GC 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) 90% (9/10) Plasmática GD 100% (12/12) 100% (12/12) 100% (12/12) 83,3% (10/12) Pro-MMP-9 GC 10% (1/10) 0% (0/10) 50% (5/10) 80% (8/10) Plasmática GD 0% (0/12) 8,3% (1/12) 91,7% (11/12) 58,3% (7/12) A análise das atividades plasmáticas das pro-MMPs pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk evidenciou distribuição não normal em todos os dados, à exeção da pro-MMP-2 do GC. Dessa forma, optou-se por calcular as médias e 18 desvios-padrão, além das medianas dos resultados das atividades plasmáticas das pro-MMPs, obtidos como unidades arbitrárias (Tabela 2). A figura 6 também ilustra medianas, interquartis (25/75), valores máximos e mínimos, além das médias das atividades plasmáticas das pro-MMP 2 e 9 ao longo dos momentos estudados, nos grupos GC e GD. A análise temporal da pro-MMP-2 resultou em diferença significativa entre T15 e todos os tempos estudados no GC. Para GD, houve diferença entre T0 e T30, bem como entre T30 e T45. Já a avaliação da pro-MMP-9 ao longo dos tempos demonstrou diferença estatística entre T15 e T45 no GC, bem como entre T0 e T30 no GD. Ao se comparar os resultados obtidos entre os grupos em cada tempo individualmente, constatou-se diferença significativa na atividade plasmática da proMMP-2 em T15 e T30. Conforme arrolado na Tabela 2, a atividade plasmática da pro-MMP-9 não apresentou variação significativa entre grupos. Tabela 2 - Valores médios, desvios-padrão, medianas e resultados da análise de variância das pro-MMPs 2 e 9 plasmáticas nos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável Pro-MMP-2 Plasmática Pro-MMP-9 Plasmática Grupos GC GD GC GD Tempos T0 T15 T30 T45 1,520,26 0,450,27 1,210,37 1,240,76 (1,50)Aa (0,45)Ba (1,20)Aa (1,15)Aba 1,500,48 1,100,29 0,910,15 1,591,59 (1,45) Aa (1,15) ABb 0,0080,029 0,000,00 (0,00)ABa (0,00)Aa 0,000,00 0,0080,02 (0,00) Aa (0,00) ABa (0,90) Bb (1,80)Aa 0,0500,090 0,1070,125 (0,00)ABa (0,09)Ba 0,0920,067 0,0650,074 (0,10)Ba (0,05)ABa P 0,0003 0,0010* 0,0004* 0,0005* * Teste de Friedman (os dados de pelo menos um dos tempos de avaliação não passou no teste de normalidade de Shapiro-Wilk). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha: diferença significativa (P<0,05) entre momentos de avaliação (Teste de Dunn). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna: diferença significativa (P<0,05) entre grupo controle e grupo doxorrubicina (Teste Mann-Whitney). 19 Figura 2 – Medianas, interquartis (25/75), valores mínimos e máximos e médias (+) das atividades plasmáticas (Unidades Arbitrárias) da pro-MMP-2 e pro-MMP-9 nos grupos controle (esquerda) e doxorrubicina (direita), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). 5.3. Correlações entre pro-MMPs 2 e 9 e parâmetros ecocardiográficos As atividades plasmáticas das pro-MMPs 2 e 9 foram correlacionadas com os diversos parâmetros ecocardiográficos obtidos ao longo dos tempos estudados no GD. Especificamente para a pro-MMP-9, as correlações foram realizadas apenas em T30 e T45, tendo em vista a inexistência ou o baixo percentual de animais onde tal metaloproteinase inativa foi identificada em T0 e T15. Considerando-se que as proMMPs 2 e 9 apresentaram distribuição não normal em GD, as correlações foram realizadas empregando-se o teste de Spearman. Na tabela 3 estão arrolados os coeficientes de correlação (r) e os valores de P relativos às correlações entre a pro-MMP-2 plasmática e as variáveis ecocardiográficas derivadas do modo B e modo M. Foram identificadas correlações positivas significativas com os parâmetros DIVEs e DIVEd em T45. Também foi constatada correlação negativa significativa com SIVs em T45. Sendo que, no 20 momento 45 é que os parâmetros ecocardiográficos demonstram o remodelamento cardíaco dos animais induzidos. Esta correlação pode demonstrar que a Pro-MMP 2 ainda que na sua forma latente, esteve aumentada no momento de maior lesão ao miocárdio. Na figura 3 estão ilustradas as correlações significativas entre pro-MMP-2 e tais variáveis ecocardiográficas. Tabela 3 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas em modo B e modo M no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável T0 T15 T30 T45 r P r P r P r P DIVEs 0,1578 0,6192 -0,2572 0,4197 0,2599 0,4145 0,6273 0,0462* DIVEd 0,0212 0,9477 -0,3195 0,3112 0,2047 0,5233 0,7110 0,0211* SIVs 0,5018 0,0965 0,1163 0,7189 -0,5054 0,0936 -0,6469 0,0432* SIVd 0,1294 0,6885 -0,0914 0,7775 -0,3477 0,2680 -0,4499 0,1920 PLVEs 0,4171 0,1773 0,3113 0,3246 -0,1776 0,6013 -0,3240 0,3610 PLVEd -0,3369 0,2842 0,3029 0,3386 -0,4593 0,1330 0,1715 0,6357 SSPE 0,2687 0,4528 -0,5371 0,1094 0,3030 0,3947 -0,5958 0,1191 AE/Ao 0,5442 0,0674 -0,1865 0,5829 0,4509 0,1412 0,2635 0,4620 FEC% -0,0355 0,9129 0,0107 0,9737 -0,4284 0,1647 -0,1483 0,6825 FEJ% -0,1009 0,7550 0,0107 0,9737 -0,3784 0,2251 -0,2321 0,5187 SIV% 0,1044 0,7467 0,4243 0,1692 -0,2219 0,4882 -0,4405 0,2026 PLVE% 0,3180 0,3705 -0,1632 0,6315 0,2863 0,3670 -0,3387 0,3383 * Correlação significativa (P<0,05) 21 DIVEs x MMP-2 miocárdica - INDUZIDOS - T45 16 DIVEs (mm) 14 12 10 8 6 1.0 1.5 2.0 2.5 MMP-2 plasmática (UA) DIVEd x MMP-2 miocárdica - INDUZIDOS - T45 3.0 SIVs x MMP-2 miocárdica - INDUZIDOS - T45 6 20 4 16 SIVs (mm) DIVEd (mm) 18 14 2 12 10 8 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 1.0 MMP-2 plasmática (UA) 1.5 2.0 2.5 3.0 MMP-2 plasmática (UA) Figura 3 – Representação gráfica da correlação significativa entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs), diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole (DIVEd) e septo interventricular em sístole (SIVs) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). A tabela 4 lista os resultados das correlações entre pro-MMP-2 plasmática e os parâmetros ecocardiográficos obtidos por Doppler convencional. Nota-se correlação negativa significativa com as variáveis PPE e TEI em T15. A representação gráfica dessas correlações significativas pode ser observada na figura 4. Na tabela 5 estão descritos os coeficientes de correlação e valores de P obtidos entre pro-MMP-2 e os parâmetros ecocardiográficos obtidos por Doppler tecidual. Em T0 houve correlação negativa com a variável A’lat, enquanto em T45 identificou-se correlação positiva com a relação Emitral/E’sep. Tais correlações significativas podem ser observadas na figura 5. 22 Tabela 4 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler convencional no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). T0 Variável T15 T30 T45 r P r P r P r P Emitral 0,0318 0,9218 0,3167 0,3725 -0,6135 0,0592 0,4852 0,1855 Amitral -0,1057 0,7570 0,0408 0,9110 -0,4814 0,1589 0,2383 0,5368 Emitral/Amitral -0,0716 0,8343 0,5739 0,0828 -0,3870 0,2693 0,0385 0,9217 VmaxPulm 0,0954 0,7680 -0,3311 0,3199 -0,1610 0,6171 -0,2769 0,4387 VmaxAo -0,1484 0,6453 -0,2052 0,5445 0,2004 0,5323 0,1505 0,6780 PPE -0,3515 0,3537 -0,6949 0,0176* -0,1199 0,7414 -0,6605 0,1063 TEVE -0,2706 0,4208 0,5736 0,0650 -0,2266 0,5290 -0,4705 0,1699 TRIV -0,4931 0,1233 0,0326 0,9241 0,3472 0,3256 -0,4247 0,2211 TEI 0,0874 0,7984 -0,6902 0,0187* 0,1573 0,6642 -0,0815 0,8228 Emitral/TRIV 0,1471 0,6659 -0,0696 -0,2517 0,4829 0,4512 0,2229 0,8587 * Correlação significativa (P<0,05) TEI x MMP-2 plasmática - INDUZIDOS - T15 PPE x MMP-2 plasmática - INDUZIDOS - T15 1.0 60 0.8 PPE (ms) Índice de Tei 40 20 0.6 0.4 0.2 0 0.0 0.5 1.0 MMP-2 plasmática (UA) 1.5 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 MMP-2 plasmática (UA) Figura 4 – Representação gráfica da correlação significativa entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis período de pré-ejeção (PPE) e índice de desempenho miocárdico de Tei (TEI) em T15, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). 23 Tabela 5 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler tecidual no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). T0 Variável T15 T30 T45 r P r P r P r P E’lat -0,4369 0,1555 0,6190 0,0603 0,0815 0,8382 -0,1384 0,7029 A’lat -0,6732 0,0164* 0,3586 0,3089 -0,4328 0,2182 -0,0753 0,8362 Slat -0,5617 0,0573 -0,0313 0,9317 -0,0627 0,8633 -0,6135 0,0592 E’lat/A’lat 0,3183 0,3132 0,4699 0,1706 0,4746 0,1657 -0,1617 0,6776 Emitral/E’lat 0,2910 0,3589 -0,1501 0,6790 -0,4705 0,1699 0,3827 0,2751 E’sep 0,2929 0,3555 0,2959 0,4394 -0,5365 0,1099 -0,3638 0,3013 A’sep 0,2758 0,3856 0,0609 0,8763 -0,2045 0,5709 0,2611 0,4661 Ssep 0,4228 0,1709 0,0348 0,9291 0,3661 0,2982 -0,4671 0,1735 E’sep/A’sep -0,0772 0,8116 0,3671 0,3311 -0,2720 0,4472 -0,3830 0,2746 Emitral/E’sep -0,1215 0,7068 0,1218 0,7548 -0,2800 0,4333 0,7917 0,0110* * Correlação significativa (P<0,05) Emitral / Eseptal x MMP-2 plasmática - INDUZIDOS - T45 Alateral x MMP-2 plasmática - INDUZIDOS - T0 15 10 10 6 Emitral / Esep Alat (cm/s) 8 4 5 2 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 MMP-2 plasmática (UA) 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 MMP-2 plasmática (UA) Figura 5 – Representação gráfica das correlações significativas entre a atividade plasmática da pro-MMP-2 e as variáveis velocidade anular mitral lateral máxima no inicio da sístole atrial (A’lat) em T0 e relação entre Emitral e E’sep (Emitral/E’sep) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). 24 No tocante à pro-MMP-9 plasmática, houve correlação negativa significativa com as variáveis PLVE% em T30 (Tabela 6) e TEVE em T45 (Tabela 7). Essas correlações significativas encontram-se ilustradas na figura 6. A tabela 8, por sua vez, traz os coeficientes de correlação encontrados entre pro-MMP-9 e os parâmetros ecocardiográficos obtidos por Doppler tecidual, cujos resultados não foram significativos. Tabela 6 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas em modo B e modo M no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável T30 T45 r P r P DIVEs 0,2625 0,4354 -0,2143 0,6445 DIVEd 0,3364 0,3118 -0,2523 0,5852 SIVs 0,2877 0,3910 -0,1982 0,6700 SIVd 0,2625 0,4354 -0,1428 0,7599 PLVEs -0,2796 0,4339 -0,5357 0,2152 PLVEd 0,4977 0,1192 -0,4286 0,3374 SSPE 0,1427 0,7150 0,2236 0,7177 AE/Ao -0,0592 0,8627 -0,1786 0,7016 FEC% -0,2671 0,4271 0,2523 0,5852 FEJ% -0,3126 0,3492 0,2143 0,6445 SIV% 0,0911 0,7899 -0,1071 0,8191 PLVE% -0,6970 0,0171* 0,0000 1,000 * Correlação significativa (P<0,05) 25 Tabela 7 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler convencional no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). T30 Variável T45 r P r P Emitral -0,0669 0,8641 0,0286 0,9571 Amitral 0,0335 0,9319 -0,7714 0,0724 Emitral/Amitral 0,1088 0,7805 0,2571 0,6228 VmaxPulm -0,3143 0,3465 0,3928 0,3833 VmaxAo 0,1777 0,6012 0,5357 0,2152 PPE 0,4435 0,2318 0,5798 0,2278 TEVE 0,0000 1,0000 -0,8214 0,0234* TRIV 0,3598 0,3415 0,3063 0,5040 TEI 0,3667 0,3317 0,7500 0,0522 E/TRIV -0,2000 0,6059 -0,3714 0,4685 * Correlação significativa (P<0,05) PLVE% x MMP-9 plasmática - INDUZIDOS - T30 TEVE x MMP-9 plasmática - INDUZIDOS - T45 180 60 160 PLVE% (%) TEVE (ms) 40 20 140 120 100 0 0.00 0.10 0.20 0.30 MMP-9 plasmática (UA) 80 0.00 0.10 0.20 MMP-9 plasmática (UA) 0.30 Figura 6 – Representação gráfica das correlações significativas entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis espessamento fracional da parede livre do VE (PLVE%) em T30 e tempo de ejeção ventricular esquerda (TEVE) em T45, no grupo doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). 26 Tabela 8 – Resultados da correlação de Spearman entre a atividade plasmática da pro-MMP-9 e as variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler tecidual no grupo doxorrubicina (GD), ao longo dos momentos estudados. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável T30 T45 r P r P E’lat -0,1928 0,6198 -0,2143 0,6445 A’lat -0,1856 0,6325 -0,0714 0,8790 Slat 0,1171 0,7640 -0,3214 0,4821 E’lat/A’lat -0,1021 0,7937 0,0714 0,8790 Emitral/E’lat 0,5858 0,0974 -0,1786 0,7016 E’sep 0,3952 0,3325 -0,2500 0,5887 A’sep 0,2036 0,6287 0,1071 0,8191 Ssep 0,5629 0,1463 -0,3964 0,3786 E’sep/A’sep 0,4397 0,2756 -0,1091 0,8159 Emitral/E’sep -0,0359 0,9327 0,0286 0,9571 5.4. Atividade miocárdica das MMPs 2 e 9 A forma ativa da MMP-2 e as formas inativa e ativa da MMP-9 não foram identificadas nas amostras de tecido analisadas. Os resultados da atividade miocárdica da pro-MMP-2 foram então submetidos ao teste de normalidade de Shapiro-Wilk, demonstrando distribuição normal. A comparação entre GC e GD foi realizada pelo teste T não pareado, cujo resultado não evidenciou diferença significativa (Tabela 9). A figura 7 exibe as medianas, interquartis, valores mínimos e máximos, além das médias da pro-MMP-2 miocárdica obtida nos grupos GC e GD. Na sequência, o teste de Pearson foi utilizado para averiguar a existência de correlação entre as atividades plasmática e miocárdica da pro-MMP-2, não sendo 27 identificadas correlações significativas (Figura 8) em tais parâmetros obtidos nos grupos GC (r=0,1541, P=0,6922) e GD (r=0,0860, P=0,8258). Tabela 9 – Valores médios, desvios-padrão, medianas (entre parênteses) da proMMP-2 miocárdica e resultado do teste T não pareado para comparação dos grupos controle (GC) e doxorrubicina (GD). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Variável Grupos GC (n=9) GD (n=9) Pro-MMP-2 0,2880,082 0,2010,091 Miocárdica (0,280) (0,170) P 0,0706 Figura 7 – Medianas, interquartis (25/75), valores mínimos e máximos e médias (+) da atividade miocárdica (Unidades Arbitrárias) da pro-MMP-2 nos grupos controle e doxorrubicina. UNESP, Jaboticabal, SP (2014). Figura 8 – Correlação de Pearson entre as atividades plasmática e miocárdica da pro-MMP-2 nos grupos controle (esquerda) e doxorrubicina (direita). UNESP, Jaboticabal, SP (2014). 28 6. DISCUSSÃO A indução da cardiomiopatia tóxica ocorreu ao longo de 45 dias, aplicando-se a doxorrubicina duas vezes por semana. Os índices ecocardiográficos retratam a dilatação cardíaca, com alteração progressiva da função miocárdica. Sousa (2007), estudando cães com cardiomiopatia induzida por doxorrubicina, observou modificações significativas nas variáveis ecocardiográficas indicativas de função sistólica e diastólica. Gava (2011), por sua vez, ao estudar a cardiomiopatia com doxorrubicina em coelhos, encontrou dilatação do ventrículo esquerdo em sístole e diminuição da fração de encurtamento e ejeção já em T45 e T60 nos animais tratados, concluindo que tais achados refletem prejuízo à função sistólica ocorrida após exposição cumulativa à doxorrubicina. Durante o estudo houve mortalidade de 33% nos animais tratados com doxorrubicina, corroborando Jaenke et al. (1980), Arnolda et al. (1985), Chen et al. (2010) e Gava (2011), as causas dos óbitos foram compactação intestinal (1), pneumonia (1) e em decorrência de complicações de ICC (3). Ademais, os achados macroscópicos de necropsia indicaram que os animais perdidos nesta pesquisa apresentaram ao menos um sinal clínico atribuído à ICC, sendo o edema pulmonar o mais freqüente, embora alguns animais também tenham desenvolvido ascite e efusão pericárdica, sinais estes descritos por Sisson et al. (2004), O´Grady & O´Sullivan (2004) e Ware (2006). Souza (2009), em um modelo de cardiomiotoxicidade aguda em ratos, também identificou efusão pericárdica. Semelhante ao relatado por Ivanova et al. (2012) em um estudo focado na atividade das MMPs em ratos com cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina, as formas ativas das MMP 2 e 9 não foram evidenciadas nesta pesquisa. Em contraste, a pro-MMP 2 plasmática esteve presente na maioria dos momentos estudados, corroborando os resultados do referido autor. A análise estatística da concentração plasmática de pro-MMP 2 ratificou a variação significativa entre o momento basal e T30, havendo queda nos valores de unidade arbitrária, assim como entre T30 e T45, onde há um abrupto aumento desse valor. Ao se comparar os grupos GC e GD, é tácita a diferença significativa em T15 e T30, embora no estudo de Ivanova et al. (2012) não tenha sido constatada diferença significativa nos valores da atividade da 29 pro-MMP 2 entre animais induzidos e controles. Contudo, Squire et al. (2004) encontrou aumento significativo da atividade plasmática de MMP 2 em seres humanos apresentando infarto agudo do miocárdio. A pro-MMP 9, por sua vez, apresentou-se fracamente marcada nas amostras em que esteve presente, embora tenha resultado em diferença significativa entre os momentos T15 e T45, comparativamente ao momento basal no GC. Em GD, por outro lado, foi perceptível diferença apenas entre T0 e T30, momento este em que o valor atinge seu pico de atividade. Não houve diferença significativa entre os grupos, corroborando Ivanova et al (2012), ao pesquisar a MMP 9 no plasma de ratos com cardiomiopatia induzida por doxorrubicina. Em tal estudo, os autores detectaram a atividade da pro-MMP 9 pelo método de zimografia após 4 e 8 semanas de administração de doxorrubicina, mas também não encontraram diferença entre os animais induzidos e controles. Em contraste, Uzuelli (2008), ao induzir embolia pulmonar aguda em cães, demonstrou aumento na atividade plasmática da pro-MMP 9 diante de embolia grave, com diferença significativa em relação ao grupo controle, mas não encontrou diferença significativa quando a embolia pulmonar mostrava-se mais leve. Ao se avaliar a correlação entre a pro-MMP 2 plasmática e os resultados dos parâmetros ecocardiográficos, observa-se correlações positivas significativas com as variáveis DIVEs e DIVEd, bem como correlação negativa significativa com o parâmetro SIVs, sugerindo que a pro-MMP 2 supostamente participa do processo de remodelamento miocárdico proveniente da cardiotoxicidade exercida pela doxorrubicina. Nesse sentido, Silva & Camacho (2005), ao estudarem cães com cardiomiopatia induzida por doxorrubicina, encontraram aumento significativo do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs) e em diástole (DIVEd), além de diminuição significativa na espessura do septo interventricular na sístole (SIVs). Ademais, Kittleson (1998) cita que o aumento gradual do diâmetro do ventrículo esquerdo ao final da sístole é indicativo de comprometimento da contratilidade cardíaca, fato este identificado neste estudo. No tocante às variáveis ecocardiográficas obtidas por Doppler convencional, houve correlação negativa significativa entre pro-MMP 2 e os parâmetros PPE e TEI em T15. Boon (2013) refere que o PPE é sensível às mudanças na pré e pós-carga, 30 podendo estar alterado antes mesmo do remodelamento cardíaco. O índice de TEI foi relatado em alguns trabalhos como método de detecção precoce de cardiotoxidade induzida por antraciclinas em crianças (ISHII et al, 2000; EIDEM et al, 2000). Para o Doppler tecidual, já se demonstrou sua aplicabilidade como método aparentemente mais sensível para detecção de lesão miocárdica subclínica em crianças tratadas com antraciclinas (KAPUSTA et al, 2000). Neste estudo houve correlação positiva significativa entre Emitral/E´sep e pro-MMP 2 em T45, sugerindo que a Pro-MMP 2 se eleva à medida que progride o quadro congestivo do paciente. Os achados de correlação entre a pro-MMP 2 e as variáveis ecocardiográficas remetem à participação dessa substância no processo de remodelamento miocárdico, aventando seu emprego como marcador de lesão e/ou remodelamento do tecido cardíaco. De forma semelhante, Cogni, (2012), ao avaliar pessoas com infarto agudo do miocárdio, demonstrou que a forma ativa da MMP-2 foi indicadora do remodelamento, sendo que cada elevação de uma unidade no nível da MMP-2 foi associado a um aumento de 39% na probabilidade de remodelamento ventricular. Condições semelhantes também são encontradas no remodelamento que ocorre em outros tecidos em condições diversas. Ao avaliar a expressão da MMP-2 em colesteatomas valendo-se de imunoistoquímica, Morales (2007) evidenciou expressão mais intensa de MMP-2 em colesteatomas invasivos comparativamente aos latentes. Finalmente, estudo de Navarro et al. (2006) evidenciou a participação MMPs nos processos fisiológicos da cavidade bucal, incluindo mineralização dentinária, erupção dental e remodelação do colágeno nos tecidos periodontais, assim como nas condições patológicas, como destruição tedidual periodontal, lesões de cárie radicular, desordens da articulação temporomandibular e metástases tumorais. A pro-MMP 9, por sua vez, mostrou correlação negativa significativa com PLVE% em T30, onde foi identicado seu maior valor plasmático. Para Henik (2002), o encurtamento fracional da parede livre pode estar diminuído na cardiomiopatia dilatada e em outras doenças que causem dilatação da câmara. Nesse sentido, à medida que progrediu a disfunção miocárdica, houve redução do referido parâmetro, ao passo que a concentração plasmática da pro-MMP 9 se elevou, ilustrando sua participação no remodelamento do músculo cardíaco. De maneira semelhante, 31 também foi identificada correlação negativa entre pro-MMP 9 e TEVE em T45, refletindo a redução do tempo de ejeção ventricular esquerda conforme progride o remodelamento e, consequentemente, a disfunção miocárdica (BOON, 2013). No tecido cardíaco foi evidenciada apenas a pro-MMP 2, cujo resultado não diferiu entre grupos. Resultados semelhantes foram encontrados por Adamcova et al. (2010), ao estudarem o mesmo modelo experimental em coelhos. Naquela ocasião, foi identificada a presença de MMP 2, com valores maiores no grupo de animais induzidos, embora não tenha havido diferença significativa comparativamente ao grupo controle em face da grande variabilidade encontrada nos resultados, assim como observado nesta pesquisa. Ao estudarem ratos com cardiomiopatia por doxorrubicina, Ivanova et al. (2012) encontraram aumento na atividade miocárdica da pro-MMP 2 apenas após 8 semanas de indução, quando havia sido alcançada a dose cumulativa de 15 mg/kg. Embora não tenha sido identificada neste estudo, Adamcova et al. (2010) constatou, valendo-se de técnicas imunoistoquímicas, expressão leve e esporádica da MMP 2 em cardiomiócitos e fibroblastos em focos de dano tóxico significativo em ratos com cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina, ao passo que nos indivíduos incluídos no grupo controle, a referida enzima não foi identificada. Assim como no estudo em tela, o grupo de Adamcova et al. (2010) não idenfificou formas inativas e/ou ativas de MMP 9 no tecido miocárdico. Concluíram que, embora a atividade da MMP 9 esteja envolvida em muitas outras enfermidades cardíacas, os dados encontrados sugeriam fortemente que a MMP 9 não participa na cardiotoxicidade crônica exercida pela antraciclina, que pode estar associada com ausência de infiltrado inflamatório típico. De modo similar, Ivanova et al. (2012), em seu estudo em ratos, também não encontrou as formas inativas e/ou ativas da MMP 9 no tecido cardíaco. Em contraste com os dados desta investigação científica, Aupperle et al. (2007), por meio de imunoistoquimia, encontrou aumento na expressão de MMP 1, MMP 2 e MMP 9 em cardiomiócitos de coelhos com cardiomiopatia induzida por doxorrubicina, comparativamente aos animais do grupo controle. Não houve correlação significativa entre as atividades plasmática e miocárdica das metaloproteinases nesta pesquisa. Alguns autores argumentam 32 acerca da validade das mensurações dos níveis de metaloproteinases obtidas em amostras de soro ou plasma. Em estudos sobre arteriosclerose aórtica em humanos, Tanus-Santos e Gerlach (2005) afirmaram que não há correlação entre os níveis séricos e plasmáticos de MMP-9 e, mesmo valendo-se de plasma tratado com diferentes anticoagulantes e de soro, as concentrações mostraram-se artificialmente alteradas. De fato, Meisser, et al. (2005) verificaram que as condições pré-analíticas afetam a mensuração das concentrações (plasmáticas e séricas) das MMPs 2 e 9 circulantes, sendo que normalmente os anticoagulantes (EDTA, heparina e citrato) aumentariam os níveis plasmáticos de MMP 9, enquanto os níveis de MMP 2 são reduzidos. Ainda assim, concluíram que o melhor anticoagulante a ser usado na coleta de plasma seria o citrato, o qual evita a liberação de colagenages pelas células sanguíneas, reduzindo o efeito do tempo, sendo esta a mesma conclusão de Mannello (2008). Em estudos sobre câncer, Ferretti et al. (2006) reforçaram o paradigma de que não há correlação entre os níveis séricos e plasmáticos de MMP 9. Por ser instável, sua concentração reflete a liberação de proteinases pelos leucócitos durante a coleta do sangue. Ao mesmo tempo, os autores citam que uma eventual correlação entre valores séricos e plasmáticos de MMP 9 não implica necessariamente em correlação com a atividade tecidual dessa colagenase. No sentido oposto, Nikkola et al. (2005) e Vihinen (2005) afirmaram que há correlação segura e significativa entre os níveis séricos e plasmáticos das MMP. No tocante à aplicabilidade das MMP-2 e MMP-9 como biomarcador, Nikkola et al. (2005) comentaram que o uso clínico dos valores séricos da MMP-9 seria útil para o acompanhamento clínico e individual do desenvolvimento do câncer, obviamente apoiando-se em outros exames. Cogni (2012) demonstrou que a atividade sérica da forma ativa da MMP-2 funcionou como marcador prognóstico do remodelamento ventricular. Gusmão (2013), ao estudar pessoas com cardiomiopatia dilatada crônica atribuída ao Trypanossoma cruzi, constatou que os níveis séricos da MMP-9 estiveram aumentados, estando associados com a gravidade do acometimento cardíaco. Contudo, para Gerlach et al. (2007), o nível sérico de MMP 9 é artificialmente maior nas amostras plasmáticas, independentemente do tipo de anticoagulante empregado, comparativamente à sua concentração tissular. Mesmo 33 assim, recomendaram que a mensuração dos níveis de MMP-9 seja feita com uso de plasma com heparina ou citrato, desabonando o uso de soro, visto que os níveis dessa metaloproteinase poderia se apresentar artificialmente maior. As MMPs estão distribuídas ao longo de todo o organismo, sendo responsáveis pelo controle de diversos eventos biológicos (ARAÚJO, et al. 2011). Como descrito por De-Nardi (2008) a doxorrubicina desencadeia toxicidade como efeito colateral, envolvendo não apenas alterações cardiocirculatórias, mas também hematológicas, gastrointestinais, dermatológicas e renais. A suposta modificação da atividade fisiológica das MMPs nessa miríade de tecidos lesados e a aparente inexistência de correlação entre a atividade plasmática e miocárdica das metaloproteinases neste estudo desabona a utilização da quantificação plasmática das MMPs como biomarcador que retrate, especificamente, a lesão/remodelamento miocárdico neste modelo experimental. As limitações encontradas ao longo do experimeto foram a restrição financeira, que não nos permitiu ir além nas técnicas de pesquisa, na detecção das TIMPs e em outras formas de detecção das MMPs. E o fato de executar uma técnica pouco conhecida (zimografia), que foi padronizada pelo laboratório a partir de artigos científicos, mas que nos faltava conhecimento para, quando algo na técnica não dava certo, entendermos o por que não estava dando certo. Foram necessários meses, até que tudo estivesse pronto, pois cada etapa que dava errada, era necessário muitas repetições, até se descobrir qual era o ponto exato a ser corrigido. 34 7. CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos neste estudo, foi possível estabelecer as seguintes conclusões: A atividade plasmática das metaloproteinases da matriz, em especial a proMMP 2, pôde ser relacionada às alterações morfofuncionais que se estabelecem ao longo da indução da cardiomiopatia em questão; Não houve correlação entre a atividade plasmática e miocárdica das MMPs 2 e 9, limitando a aplicabilidade de sua quantificação sanguínea como biomarcador das alterações miocárdicas atribuídas à cardiotoxicidade exercida pela doxorrubicina; São necessários estudos mais profundos para esclarecimento da aplicação prática das MMPs como biomarcador de lesão e/ou remodelamento miocárdico. 35 8. REFERÊNCIAS1 ADAMCOVÁ, M.; POTÁČOVÁ, A.; POPELOVÁ, O.; ŠTĚRBA, M.; MAZUROVÁ, Y.; AUPPERLE, H.; GERŠL, V. Cardiac remodeling and MMPs on the model of chronic daunorubicin-induced cardiomyopathy in rabbits. Physiological Research, Praga, v. 59, p. 831-836 2010. ARAÚJO, R. V. S.; SILVA, F. 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