ELEN SILVIA CARVALHO SIQUEIRA PYLES
CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS
Botucatu – SP
2003
ELEN SILVIA CARVALHO SIQUEIRA PYLES
CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS
Monografia
apresentada
à
disciplina
“Seminários II” do programa de pós-graduação
em Medicina Veterinária, nível doutorado, área
de concentração em Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da UNESP, Campus de Botucatu.
DOUTORANDA: Elen Silvia Carvalho Siqueira Pyles
ORIENTADORA: Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga
PROFESSORES RESPONSÁVEIS: Profa. Dra. Maria Denise Lopes
Prof. Sony Dimas Bicudo
Botucatu – SP
2003
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................................3
INTRODUÇÃO......................................................................................................................4
REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................................5
1. PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO........................................................................5
2. AGENTES CRIOPROTETORES......................................................................................7
3. PROCEDIMENTOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS.....9
3.1 Congelação de embriões.................................................................................................10
3.1.1 Método tradicional de congelação...............................................................................10
3.1.2 Aquecimento...............................................................................................................11
3.2 Vitrificação de embriões................................................................................................13
3.2.1 Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25mL.................................14
3.2.2 Método OPS – Open Pulled Straw..............................................................................15
3.2.3 Método de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de transmissão............16
4. CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES
MICROMANIPULDADOS.................................................................................................17
CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................................18
REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS....................................................................................19
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA = albumina sérica bovina
DMSO = dimetilsulfóxido
EG = etilenoglicol
mL = mililitro
M = molar
OPS = open pulled straw
PVP = polivinilpirrolidona
SFB = soro fetal bovino
TE = transferência de embriões
INTRODUÇÃO
Na década de 70, quando a transferência comercial de embriões teve seu início, a
sincronização dos estros já era utilizada, porém nem sempre havia receptoras em número
suficiente para efetuar as transferências. Conseqüentemente, descartavam-se os embriões
excedentes ou os cultivavam à temperatura ambiente ou a 0°C, até no máximo por 24 horas
(HASLER et al., 1997).
Uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de
embriões produzidos in vivo ou in vitro não transferidos é a utilização de técnicas de
criopreservação de embriões. O domínio dessas técnicas torna viável a formação de bancos
de embriões, promovendo a oportunidade de se preservar material genético fundamental no
melhoramento genético dos plantéis, podendo ser efetuado com maior rapidez e eficiência,
mesmo em pequenas populações de animais, com a possibilidade de disseminação do
material genético de animais zootecnicamente superior.
Assim, a criopreservação de embriões tem se tornado uma parte integrante da
reprodução assistida em animais, especialmente de espécies domésticas (LEIBO et al.,
1996; PALASZ & MAPLETOFT, 1996; KULESHOVA & LOPATA, 2002).
A evolução da criopreservação de embriões bovinos propiciou uma série de
benefícios, tais como: utilização de receptoras em cio natural; aproveitamento de
receptoras excedentes ao número de embriões obtidos no dia da colheita; realização de
grandes programas de descongelação e transferência de embriões (TE) em novilhas
provenientes de rebanhos homogêneos quanto à genética e ao manejo (rebanhos de
cruzamento industrial); planejamento do período de nascimento dos bezerros de acordo
com os interesses de manejo da propriedade; formação de bancos de germoplasma, com
preservação de espécies ou raças em extinção; facilidade de importação e exportação, pois
os custos são menores e sem os longos períodos de quarentena, riscos de transporte e de
premunição; e, segurança quanto ao aspecto higiênico sanitário.
Com o advento da produção in vitro de embriões, e por estes serem mais sensíveis à
criopreservação, muitos esforços têm sido empregados no sentido de se aprimorar a
criopreservação dos mesmos.
As pesquisas na área de criopreservação incluem estudos sobre o tempo de préequilíbrio, o tipo e a concentração do crioprotetor, a velocidade de resfriamento, a
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temperatura de imersão em nitrogênio líquido, a velocidade de aquecimento e o método de
remoção do crioprotetor.
Apesar de muitos embriões parecerem viáveis após a criopreservação e remoção do
crioprotetor, com a maioria de suas células intactas, os índices de gestação obtidos após as
transferências são consideravelmente menores que aqueles obtidos com a transferência de
embriões não submetidos aos processos de criopreservação (transferidos a fresco). Dessa
forma, é clara a necessidade do desenvolvimento de um maior número de pesquisas
envolvendo diferentes metodologias de criopreservação e de crioprotetores aplicáveis à
espécie bovina.
REVISÃO DA LITERATURA
1. PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO
A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de quiescência,
tornando possível a conservação de células e tecidos por tempo indeterminado. O primeiro
sucesso desta técnica foi mencionado por Whittingham (1971), utilizando embriões de
camundongos.
Um dos mais importantes princípios da criopreservação reside na necessidade de se
remover o máximo possível de água das células antes de se proceder a sua congelação. Se
esta desidratação não ocorrer, grandes cristais de gelo se formarão lesando severamente a
estrutura intracelular. No entanto, a remoção demasiada de água das células também pode
ser deletéria (SEIDEL Jr., 1986).
Os danos causados aos tecidos durante os processos de criopreservação e
aquecimento são devido principalmente a: formação de cristais de gelo intracelulares, que
afetam a estrutura da célula; concentração de soluto resultante do processo de desidratação
que ocorre durante a congelação tanto no meio extra como intracelular; interação entre
esses dois fatores (PICKETT, 1986).
A congelação provoca um aumento da pressão osmótica na célula, uma vez que a
concentração total de solutos dentro e fora deve estar sempre em equilíbrio. Em resposta a
esse estresse, a água sai da célula e o soluto entra. O processo cessa quando a concentração
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de soluto se torna grande o bastante para prevenir futuras transformações de água em gelo
(STOREY & STOREY, 1990).
Como resultado dos danos causados pelos efeitos da solução, as células de
mamíferos, independente do grau de desidratação, não sobrevivem a resfriamentos abaixo
de -20°C, a não ser que se utilize um crioprotetor (SZELL & SHELTON, 1986).
De acordo com Mazur (1970), ao submeter-se uma suspensão celular contendo
crioprotetores à temperaturas ao redor de -5°C, tanto as células como o meio circundante
permanecem descongelados. Isto é causado pelo super resfriamento decorrente do
abaixamento do ponto de solidificação da solução provocado pela adição de substâncias
crioprotetoras à suspensão celular. Entre -5 e -15°C normalmente ocorre a formação de
gelo no meio extracelular, mas as células continuam descongeladas e super resfriadas,
provavelmente porque a membrana plasmática impede o crescimento dos cristais de gelo
em direção ao meio intracelular. A água super resfriada do interior da célula tem um
potencial químico maior do que a água do meio extracelular parcialmente congelada e
dessa forma a água sai da célula para se congelar externamente. Se a congelação for lenta,
a célula perde água com rapidez adequada para manter em equilíbrio seu potencial químico
com o da água do meio extracelular. Como resultado, a célula se desidrata e não sofre a
congelação intracelular. Por outro lado, se a célula for resfriada rapidamente, ela não perde
água com rapidez suficiente para manter o equilíbrio, provocando um super resfriamento e
congelação intracelular, que leva à lise das membranas.
O gelo intracelular resulta não da cristalização espontânea da água celular, mas sim
do contato com o gelo extracelular, que cresce através dos canais aquosos na membrana. A
membrana é uma barreira a passagem dos cristais de gelo à temperaturas ao redor de
-10°C, mas deixa de ser uma barreira em temperaturas menores (LANDIMALVARENGA, 1995).
Segundo Seidel Jr. (1986) os crioprotetores promovem o abaixamento do ponto de
congelação do meio, conferindo um período maior para remoção da água intracelular
durante o resfriamento prévio à congelação da água. Esses possuem ainda a capacidade de
interagir com as membranas celulares, auxiliando-as a sobreviverem ao estresse provocado
pelas mudanças físicas. Em adição, estas substâncias têm a aptidão de proteger os embriões
contra as lesões causadas pela elevação das concentrações dessas soluções, no processo de
formação do gelo, durante o resfriamento.
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Efeitos adversos causados pela criopreservação são injúrias pelo resfriamento
(MARTINO et al., 1996a) e citotoxicidade tempo-dependente do agente crioprotetor
durante a exposição (VICENT & JOHNSON, 1992).
Após a descongelação, a remoção do crioprotetor do interior da célula deve ser
realizada de forma lenta, através da diluição desse, uma vez que a re-entrada brusca de
água no meio intracelular também leva à lise das membranas (LANDIM-ALVARENGA,
1995).
2. AGENTES CRIOPROTETORES
Independentemente da técnica, todos os métodos de criopreservação necessitam de
crioprotetores que possuem a função de proteger as células e tecidos durante a congelação
e a descongelação. Os crioprotetores são divididos em duas categorias: intracelulares
(como dimetilsulfóxido - DMSO, metanol, etanol, glicerol, etilenoglicol - EG, 1,2
propanodiol, etc) e extracelulares (como lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona PVP, rafinose, manitol, sorbitol, trealose, etc) (NIEMANN, 1991). Essas duas classes de
crioprotetores são usadas separadamente ou associadas para diferentes tipos de protocolos
de criopreservação (IM et al., 1997; YOUNG et al., 1998).
Hanada & Nagase (1980) afirmam que as propriedades requeridas para um eficiente
agente crioprotetor devem ser: baixo peso molecular, habilidade para atravessar a
membrana das células vivas, alta solubilidade em soluções aquosas eletrolíticas e não ser
tóxico.
Em geral, quando o embrião é exposto a um crioprotetor que penetra na célula,
como o glicerol, ele inicialmente se retrai devido à perda de água causada pela
hiperosmolaridade inicial do meio extracelular e também porque o embrião é muito mais
permeável à saída da água do que à entrada do crioprotetor. A retração do embrião irá
continuar até que o afluxo de água seja balanceado com o influxo de crioprotetor. O índice
de entrada do crioprotetor irá depender do coeficiente de permeabilidade deste e da
temperatura da solução. Ao mesmo tempo, a água entra novamente na célula e causa um
aumento gradual de volume. O equilíbrio é atingido quando o embrião retorna ao seu
volume anterior quando em meio isotônico (SCHNEIDER & MAZUR, 1984).
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Segundo Leibo (1984), o intervalo de tempo em que ocorre o retorno ao volume
inicial atingindo-se o equilíbrio osmótico está relacionado com: espécie do embrião em
questão, estágio de desenvolvimento, relação superfície/volume do embrião, características
intrínsecas do crioprotetor e temperatura em que o embrião é exposto. Para o autor, estes
aspectos atinentes à permeabilidade de membrana explicam, em parte, as diferenças
observadas entre os vários crioprotetores quanto à eficiência.
Apesar dos efeitos benéficos do crioprotetor, não existe uma técnica de
criopreservação celular que permita 100% de sobrevivência após a criopreservação e
aquecimento, mesmo utilizando-se curvas de resfriamento e aquecimento consideradas
ótimas. Existem duas razões para justificar as falhas na ação dos crioprotetores: primeira, a
toxicidade do crioprotetor limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do
resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (FAHY, 1986). Segunda,
os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por
exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas (ARNOLD et
al., 1983).
Os crioprotetores são usualmente diluídos em solução salina tamponada (Phosphate
Buffered Saline - PBS ) acrescida de 0,4% de albumina sérica bovina (BSA) ou 10% de
soro fetal bovino (SFB). No entanto, para a criopreservação de embriões tem sido relatada
também a diluição em meios como TCM-199 (HAMANO et al., 1992; OTOI et al., 1993;
PALASZ & MAPLETOFT, 1996; PAPIS et al., 1999), H-CZB (MARTINO et al., 1996b),
TCM-199/Hepes (VAJTA et al., 1998a), acrescidos de diferentes concentrações de SFB e
antibióticos (OTOI et al., 1995; OTOI et al., 1998). Vajta et al. (1998a) e Papis et al.
(1999) relatam o uso do meio TCM-199 acrescido de 20% de SFB para diluição de
diferentes crioprotetores.
O EG tem sido utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de embriões
em várias espécies, devido principalmente ao seu baixo peso molecular quando comparado
a outros crioprotetores, o que proporciona rápida entrada e saída na célula durante o
período de equilíbrio e rehidratação, respectivamente, o que permite a rehidratação direta
após o aquecimento (VOELKEL & HU, 1992). O EG possui ainda a vantagem de ser
menos tóxico do que outros crioprotetores (KASAI et al., 1990).
A sacarose, embora isoladamente não seja um bom crioprotetor, foi utilizada em
combinação com outros agentes. A exemplo de outros carboidratos, não atravessa a
membrana celular, exercendo assim um efeito osmótico significativo. Seu efeito
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crioprotetor ocorre durante a fase de rehidratação, após a congelação, na medida em que as
células são submetidas à diluições sucessivas de sacarose (FRIEDLER et al., 1988). A
adição de açúcares como a sacarose, dextrose e trealose aumenta a sobrevivência in vitro
de blastocistos após a vitrificação (SAITO et al., 1994).
Na prática, a criopreservação de embriões pelas técnicas de congelação
convencional normalmente utilizam um único crioprotetor como o glicerol, EG ou
propanodiol, enquanto que a vitrificação envolve o uso de misturas de crioprotetores como
glicerol e EG, glicerol e propanodiol ou propanodiol e EG em combinação com sacarose,
trealose ou galactose (DOBRINSKY, 2002).
Os crioprotetores e a criopreservação podem provocar ruptura no citoesqueleto do
embrião e para se evitar este fato, uma alternativa seria provocar a despolimerização
reversível dos filamentos de actina antes da criopreservação. As citocalasinas têm sido
empregadas como estabilizadores de microfilamentos para prevenir danos e estabilizar a
membrana plasmática. A repolimerização dos microfilamentos ocorre naturalmente após a
rehidratação (DOBRINSKY, 2002). A ação das citocalasinas é reversível se o período de
incubação for curto. O tratamento das células com essas substâncias faz com que a
membrana plasmática se torne mais elástica e que os microfilamentos não se rompam
devido à micromanipulação (Mc GRATH & SOLTER, 1983).
3. PROCEDIMENTOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES
Durante os últimos anos diversas técnicas de criopreservação de embriões foram
desenvolvidas. As substâncias crioprotetoras vêm sendo utilizadas em diversas
concentrações e combinações. Tais substâncias são adicionadas às soluções em um único
passo ou paulatinamente e os embriões criopreservados com diferentes curvas de
abaixamento da temperatura, sendo em alguns casos mergulhados diretamente no
nitrogênio líquido a partir da temperatura ambiente. Da mesma maneira, a temperatura de
aquecimento tem variado de 20 a 37°C em banho-Maria ou ao ar e a retirada do
crioprotetor realizada em um ou mais passos (LANDIM-ALVARENGA, 1995).
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3.1 Congelação de embriões
Com relação aos avanços obtidos na criobiologia nos últimos anos, muito poucos
protocolos de congelação de embriões têm sido colocados na prática. A maioria dos
embriões é congelada pelo método tradicional (PALASZ & MAPLETOFT, 1996).
Para a realização da congelação de embriões existe a necessidade da utilização de
uma máquina eletronicamente programável para monitorar a temperatura da curva de
resfriamento antes que as palhetas contendo os embriões sejam imergidas no nitrogênio
líquido. Vários tipos de máquinas são completamente automatizados e capazes de obter
padrões controlados de criopreservação com ou sem nitrogênio líquido (HAFEZ, 1980).
Leibo & Mazur (1978) e Palasz & Mapletoft (1996) mostraram a importância da
indução da cristalização do meio extracelular (“seeding”) antecedendo a congelação do
meio contendo os embriões, proporcionando as condições necessárias para uma retirada
lenta de água do meio intracelular através da formação de gelo no espaço extracelular. Os
autores fazem algumas observações sobre o procedimento de “seeding” que devem ser
consideradas: o instrumento a ser usado para efetuar a indução da cristalização deve ter
temperatura abaixo da temperatura da amostra. Não é desejável empregar instrumentos
muito grandes para proceder indução da cristalização de amostras desproporcionalmente
menores, pois a massa relativa de um instrumento muito maior resfria as amostras por
temperaturas muito baixas. Os embriões são lesados caso haja neste momento congelação
intracelular. Instrumentos muito pequenos também não são desejáveis, por se aquecerem
rapidamente após serem retirados do nitrogênio líquido. A indução da cristalização deve
ser feita em locais onde preferencialmente não estejam os embriões, como no menisco
superior da coluna central da palheta.
3.1.1 Método tradicional de congelação
Denominou-se curva clássica de congelação os procedimentos descritos por
Whittinghan (1980) para conservação de embriões mamíferos em baixas temperaturas: 1)
equilíbrio no crioprotetor; 2) envase; 3) colocação das palhetas no aparelho congelador; 4)
“seeding”; 5) resfriamento de -0,3 a -0,5°C por minuto até -32°C; 6) imersão e
conservação no nitrogênio líquido; 7) descongelação; 8) remoção do crioprotetor.
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Os procedimentos adotados por Niemann (1991) para congelação de embriões
bovinos foram: 1) adição de 1,4M glicerol feita em única etapa à temperatura ambiente,
com período de equilíbrio de 20 minutos; 2) envase dos embriões em palhetas de 0,25mL,
com três colunas de meio, separadas por duas colunas de ar, estando o embrião na coluna
central; 3) transferência das amostras para o banho de álcool, à temperatura de -7ºC,
realizando-se o “seeding”; 4) após 5 minutos da indução da cristalização, a temperatura foi
decrescida à 0,3°C por minuto, até atingir -28°C; 5) de -28°C à -35°C, a taxa de
resfriamento foi de -0,1°C por minuto, sendo as palhetas mergulhadas em nitrogênio
líquido.
Porém, Schneider & Mazur (1984) demonstraram uma adequada curva de
resfriamento no processo de congelação de embriões bovinos que propicia uma eficiente
remoção da água intracelular, assim descrita: 1) após a adição do crioprotetor e envase, as
amostras devem ser transferidas para o recipiente do congelador previamente resfriado à
temperatura próxima de -5°C para soluções a 1M glicerol e -7°C, para soluções a 1,5M; 2)
as amostras devem ser equilibradas à temperatura do “seeding” por 5 a 10 minutos; 3) deve
ser realizado o “seeding”; 4) a temperatura do “seeding” deve ser mantida por mais 10
minutos, para permitir equilíbrio da solução, inicialmente cristalizada; 5) as taxas de
resfriamento devem estar entre -0,3 a -0,5°C por minuto até atingir temperaturas entre -30
a -40°C. É aconselhado manter as amostras no equipamento de congelação por 15 a 30
minutos antes de imergi-las em nitrogênio líquido (-196ºC), quando adotadas elevadas
taxas de resfriamento.
3.1.2 Descongelação
A sobrevivência dos embriões à descongelação depende da específica combinação
do regime de resfriamento e taxas de descongelação. Embriões congelados sob taxas de
resfriamento lentas (exemplo: -0,1°C/min) e imersão em nitrogênio às baixas temperaturas
(exemplo: -60 a -110°C), requerem procedimentos de descongelação lentos (exemplo:
10°C/min). Entretanto, a maioria dos processos de congelação é realizada às taxas de
resfriamento entre -0,1 a -0,5°C/min e imersão das amostras em nitrogênio líquido às
temperaturas entre -25 e -40°C (TAKEDA et al., 1984).
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A diluição do crioprotetor tem como função evitar a entrada muito rápida da água
na célula, pois uma redução muito drástica na osmolaridade levaria à lise celular, de acordo
com Schneider & Mazur (1984).
Com a introdução da sacarose nos procedimentos de diluição de substâncias
crioprotetoras intracelulares, as técnicas tornaram-se mais rápidas e seguras, pois a
sacarose atua como um tampão osmótico, mantendo constante a concentração do meio
extracelular, regulando a velocidade de entrada da água e saída do crioprotetor do embrião,
evitando o choque osmótico. Somente após o emprego da sacarose e das palhetas francesas
foi possível realizar o método “one-step” de descongelação (NIEMANN, 1991).
Este método permite a transferência direta dos embriões para as receptoras na
mesma palheta no qual foram congelados. Isto simplificou significativamente a tecnologia
de TE, reduzindo o tempo requerido para preparar os embriões para serem transferidos e
eliminando a necessidade de equipamentos especiais (PALASZ & MAPLETOFT, 1996).
Estes pesquisadores relataram que 5000 embriões bovinos foram congelados e transferidos
por este método e as taxas de gestação foram superiores a 55%, não diferindo de valores
observados para embriões nos quais foi realizada a remoção dos crioprotetores antes da
transferência.
Segundo Niemann (1991), a metodologia “one-step” oferece vantagens
significativas quando embriões são enviados para regiões desprovidas de estrutura
laboratorial para realizar manipulação dos mesmos. As taxas de gestação alcançadas por
este método, foram de 30 a 50%, podendo ser a principal causa dessas diferenças as
variações individuais ocorridas sobre as soluções que são homogeneizadas no interior da
própria palheta. Para evitar essas variações, Massip et al. (1987) desenvolveram nova
técnica, com adaptações dos métodos “one-step” de diluição do crioprotetor, adicionandose 0,25M de sacarose à solução de 1,36M de glicerol em PBS. A adição da mistura
crioprotetora foi efetuada em única etapa, adotando-se período de equilíbrio de 10 minutos,
sendo realizado o “seeding” à temperatura de -7 °C. A taxa de resfriamento foi de
-0,3°C/min até a temperatura de -25 ou -35°C, quando as palhetas foram imersas em
nitrogênio líquido. A descongelação das mesmas ocorreu em banho-Maria à 20°C,
obtendo-se taxa de gestação de 50% (5/10). A grande vantagem dessa metodologia foi de
possibilitar a inovulação imediatamente após a descongelação, sem a necessidade de
homogeneizar as colunas da palheta e nem aguardar o período de equilíbrio da solução ao
12
embrião, uma vez que na composição da própria solução para congelação (glicerol a
1,36M) dos embriões havia 0,25M de sacarose.
As taxas de sobrevivência após a descongelação apresentaram variações segundo a
qualidade pré-congelação de embriões bovinos, em experimento delineado por Kennedy
(1986). As taxas de sobrevivência pós-descongelação para embriões classificados como
grau 1, 2 e 3 foram, respectivamente, 100% (11/11), 86% (24/28) e 83% (20/24) e os
índices de desenvolvimento in vitro 91% (10/11), 50% (14/28) e 29% (7/24). Os autores
concluíram que elevados índices de sobrevivência somente seriam possíveis selecionandose rigorosamente, através da morfologia, os zigotos para congelação.
3.2 Vitrificação de embriões
A vitrificação pode ser definida segundo Fahy (1986) como sendo a solidificação
de um líquido, não pela cristalização, mas pela extrema elevação da viscosidade durante o
processo de resfriamento. Dobrinsky (2002) e Kuleshova & Lopata (2002) afirmam que
este processo provoca solidificação das células evitando completamente a formação de
cristais de gelo tanto durante o resfriamento como no aquecimento e que, se realizada
corretamente, evita a formação de cristais de gelo intra e extracelular.
Este é um protocolo de criopreservação baseado na desidratação do embrião através
da sua breve exposição à soluções com altas concentrações de crioprotetores seguida da
imersão direta em nitrogênio líquido. Devido a estas altas concentrações de crioprotetores
e à rápida curva de congelamento o sistema se solidifica sem que ocorra cristalização
(MARTINO et al., 1996b).
A vitrificação é uma técnica promissora na reprodução assistida, sendo um
procedimento simples, menos oneroso e que requer menos tempo do que os métodos de
congelação (DOBRINSKY, 2002; KULESHOVA & LOPATA, 2002).
Comparando as duas técnicas, a congelação tradicional é uma tentativa de
manutenção do equilíbrio entre danos osmóticos e tóxicos utilizando baixas concentrações
de crioprotetores e controlando a formação de gelo através da congelação do meio
extracelular e desidratação do embrião. Em contraste, a estratégia de vitrificação é mais
radical, pois é baseada na eliminação total da formação de gelo. Porém, as altas
concentrações de crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos. Por outro lado, a
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alta velocidade de resfriamento e aquecimento resulta em uma rápida passagem através da
temperatura perigosa ao redor de 0ºC, o que minimiza os danos causados pelo resfriamento
que prejudica predominantemente estruturas ricas em lipídeos (VAJTA, 1997).
As soluções de vitrificação, assim como as soluções usadas para a congelação,
contêm um crioprotetor, vários sais e usualmente uma ou mais macromoléculas. As
macromoléculas agem para modificar os crioprotetores durante o processo de vitrificação.
A adição de polietilenoglicol como uma macromolécula aumenta a viscosidade da solução
de vitrificação contendo EG. Outras macromoléculas comumente usadas incluem o Ficoll,
a PVP e o dextran. Um crioprotetor não permeável comum é a sacarose, a qual exerce um
significativo efeito osmótico e assim, muitas vezes, é empregada na diluição ou
rehidratação de embriões após o aquecimento (O’NEIL et al., 1997). Para protocolos de
vitrificação, o EG em associação com outros crioprotetores não permeáveis tem se tornado
a solução mais comumente utilizada (HOCHI et al., 1996; MARTINO et al., 1996a e b).
Utilizando mistura de 20% de 1,2 propanodiol e 25% de glicerol, Massip et al.
(1987) vitrificaram mórulas e blastocistos de bovinos em fase bastante precoce. O
resultado de gestação atingido foi de 39,1%.
Mahmoudzadeh et al. (1993) comunicaram o método de adição de soluções de
vitrificação em única etapa em mórulas e blastocistos iniciais, observando que a melhor
solução de vitrificação era composta de EG a 7,15M e sacarose a 0,3M, enquanto que
Ishimori et al. (1993) relataram o uso da mistura das soluções de DMSO e EG para a
vitrificação de embriões bovinos. A taxa de gestação de mórulas e blastocistos iniciais foi
de 38% e para blastocistos de 40%.
3.2.1 Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25ml
Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de inseminação de 0,25mL
para abrigar os embriões. Contudo, essas palhetas limitam o padrão máximo de congelação
e aquecimento a 2000ºC/min (VAJTA et al., 1998a).
De acordo com Martino et al. (1996b), as palhetas francesas de 0,25mL são
parcialmente preenchidas com uma coluna de 200µL solução de vitrificação seguida de
20µL de meio contendo os embriões e 25µL de solução de vitrificação. As colunas de meio
são separadas por colunas de ar com aproximadamente 8mm de comprimento. Após serem
seladas, as palhetas são imersas em nitrogênio líquido. Para prevenir rachaduras, pode-se
14
primeiro colocar a extremidade da palheta no nitrogênio líquido e após poucos segundos a
sua totalidade. O tempo transcorrido desde o início da exposição aos agentes crioprotetores
até a imersão da palheta em nitrogênio líquido é de 30 segundos.
No aquecimento as palhetas são colocadas em banho-Maria a 37ºC por 15 segundos
e imediatamente agitadas vigorosamente para misturar as colunas de fluido entre si. O
conteúdo é expelido e os embriões transferidos para a solução de vitrificação em dois
passos: o primeiro, em meio mais concentrado por 1 minuto e, o segundo, em meio mais
diluído durante 5 minutos. Para remoção completa dos agentes crioprotetores os embriões
são lavados duas vezes em H-TCM-199 + 10%SFB (MARTINO et al., 1996b).
3.2.2 Método OPS – Open Pulled Straw
A técnica chamada Open Pulled Straw (OPS) foi desenvolvida por Vajta et al.
(1997a), originalmente desenvolvida para embriões de bovinos e de porcos.
Nesta técnica, os tampões de algodão das palhetas francesas de inseminação de
0,25mL são removidos e estas são amolecidas por aquecimento em sua região central e
esticadas manualmente até que o diâmetro interno e a espessura da parede diminuam para
aproximadamente metade do tamanho original. As palhetas são subseqüentemente
resfriadas em ar e cortadas em duas na extremidade estreita. O envasamento dos embriões
é realizado utilizando o efeito capilar simples. Cerca de 1 a 2µL do meio de vitrificação
contendo o embrião é introduzido na extremidade estreita da palheta, a qual é
imediatamente submersa no nitrogênio líquido. A coluna líquida solidifica-se
imediatamente, sem que haja a dispersão da solução, o que é comum quando são utilizadas
palhetas de tamanho original (VAJTA et al., 1998a).
O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa
contendo o meio aquecido. O meio vitrificado volta ao estado líquido dentro de 1 a 2
segundos. Imediatamente após, o embrião flutua no meio de aquecimento (VAJTA et al.,
1998a).
Neste método a taxa de resfriamento é de 20000ºC/min (KULESHOVA &
LOPATA, 2002). As razões para a diferença nas taxas de resfriamento entre este método e
o convencional (palhetas de 0,25mL) são a redução do volume das soluções, o contato
direto entre a solução e o material resfriado ou aquecido e a diminuição da espessura da
parede (aproximadamente 0,07mm e 0,15mm para a palheta estendida e original,
15
respectivamente). As conseqüências dessas diferenças foram altamente benéficas para a
criopreservação de embriões. Os altos padrões de resfriamento e aquecimento resultaram
em diminuição de danos causados pelo resfriamento. Adicionalmente, o alto padrão de
mudanças de temperatura permite o uso de uma concentração menor de crioprotetores o
que, junto com o rápido envase e liberação das estruturas, minimiza as injúrias tóxicas e
osmóticas. Além disso, o manejo e armazenamento das palhetas são simples, fáceis e não
requerem equipamentos especiais (VAJTA et al., 1998a).
A única desvantagem do método OPS é o risco de contaminação, pois o meio
possuindo os embriões fica diretamente em contato com o nitrogênio líquido. Porém, esse
risco também está presente usando-se palhetas originais, pois a superfície externa a qual é
ocasionalmente submersa no meio de diluição é considerado contaminado, podendo carrear
patógenos para o interior da palheta. O risco pode ser diminuído filtrando-se o nitrogênio
líquido comercialmente produzido através de um filtro de 0,2µL e acondicionado-se a OPS
dentro de palhetas de 0,5mL pré-resfriadas, fechando-se ambas as pontas (VAJTA et al.,
1998b; KULESHOVA & LOPATA, 2002).
3.2.3 Método de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de transmissão
Martino et al. (1996b) desenvolveram um método de criopreservação utilizando
grades de microscopia eletrônica de transmissão como suporte físico para os embriões, as
quais são imediatamente submersas em nitrogênio líquido, na tentativa de obter uma curva
de resfriamento super rápida. Com o procedimento da congelação ultra-rápida a velocidade
de congelação é maior do que 20000ºC/min.
O método consiste em manter os embriões em pequeno volume de crioprotetor e
colocá-los quase que em contato direto com o nitrogênio líquido, criopreservando-os em
grades de microscopia eletrônica, sendo os embriões e os crioprotetores mergulhados
diretamente no nitrogênio líquido (MARTINO et al., 1996b; VAJTA et al., 1998a; PAPIS
et al., 1999).
São utilizadas grades (de cobre) de microscopia eletrônica (3,05mm de diâmetro)
para obter padrões de congelação muito altos. Os embriões são expostos à solução
crioprotetora e com o auxílio de uma delicada pipeta eles são então transferidos sobre o
topo da grade em um volume muito pequeno (1µL). Para favorecer a redução do volume, o
lado inferior da grade é colocado sobre um papel filtro para retirar o excesso de meio,
16
restando apenas os embriões expostos na parte superior. A grade é manuseada com uma
pinça de dissecação e imediatamente imergida no nitrogênio líquido. O tempo transcorrido
desde o início da exposição aos crioprotetores até a colocação das grades no nitrogênio
líquido é de 30 segundos (MARTINO et al., 1996b).
4. CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES
MICROMANIPULADOS
Muitas pesquisas têm sido realizadas para a criopreservação de embriões bovinos
produzidos in vitro, pois estes são mais sensíveis à criopreservação e tem as taxas de
gestação significativamente menores após a transferência quando comparado com os
embriões produzidos in vivo também criopreservados (DOBRISNKY, 2002).
Nos últimos anos, várias tentativas têm sido feitas para aumentar as taxas de
sobrevivência desses embriões após a criopreservação. Duas linhas de pesquisa têm sido
seguidas: a) modificações nos sistemas de cultivo in vitro para melhorar o meio
embrionário para que os embriões possam resistir melhor às condições do processo de
criopreservação; b) desenvolvimento de uma técnica de criopreservação específica
adaptada para embriões produzidos in vitro (MARTÍNEZ et al., 2002).
Khurana & Niemann (2000) relatam gestações e nascimentos de bezerros
provenientes de transferência de embriões produzidos in vitro congelados e aquecidos.
Porém, as taxas de gestação são inconsistentes e invariavelmente menores do que aquelas
reportadas para embriões produzidos in vivo. Isto pode estar relacionado com algumas
diferenças na morfologia, ultra-estrutura e metabolismo entre os embriões provenientes das
duas técnicas. Existe um consenso geral de que a qualidade dos embriões produzidos in
vitro é inferior àquela dos embriões produzidos in vivo e que isto, juntamente com outros
fatores, poderia ser responsável pela pobre sobrevivência destes embriões após a
criopreservação. Os autores afirmam que os embriões produzidos in vitro são mais
sensíveis às crioinjúrias e que esta sensibilidade é afetada pela qualidade do embrião.
Segundo Hasler et al. (1997) e Dobrinsky (2002), as taxas de sobrevivência dos
embriões produzidos in vitro após criopreservação são afetadas também pela idade do
embrião, estágio de desenvolvimento embrionário, qualidade do embrião, crioprotetor, pH
do meio de criopreservação, método de criopreservação e sistema de cultivo no qual os
17
embriões são produzidos. Siqueira-Pyles et al. (2002) produziram embriões in vitro em
diferentes meios de cultivo e Fernandes et al. (2002) os vitrificaram e avaliaram a sua
viabilidade podendo observar que o meio composto por aminoácidos e BSA desde o início,
associado a SFB no terceiro dia de cultivo produz altas taxas de produção de blastocistos
(159/312, 51%), porém não promove diferença estatística nas taxas de viabilidade,
concluindo que o meio de cultivo pode aumentar a quantidade de blastocistos produzidos
sem contudo, melhorar a qualidade embrionária.
O método OPS tem sido aplicado para criopreservação de embriões bovinos
produzidos in vitro a diferentes estágios de desenvolvimento (VAJTA, 1997; VAJTA et
al., 1997a e b; VAJTA et al., 1998a). Os resultados nas taxas de re-expansão de embriões
vitrificados no dia 6 (blastocistos iniciais e blastocistos) e no dia 7 (blastocistos eclodidos)
foram 90, 97 e 81%, respectivamente (VAJTA et al., 1998b). Esses resultados podem ser
considerados como um avanço significativo na criopreservação de embriões bovinos,
porém nem a curva lenta de congelação e nem os métodos de vitrificação se mostraram
adequados até o momento para obtenção de padrões desejáveis de sobrevivência de
embriões bovinos em estágio de pré-compactação produzidos tanto in vivo como in vitro
(LEIBO et al., 1996).
Martínez et al. (2002) afirmam que a vitrificação pode ser utilizada com sucesso na
criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro e que essa técnica pode ser
considerada inclusive para utilização em programas comerciais.
Segundo Palasz & Mapletoft (1996), os embriões micromanipulados são mais
sensíveis à criopreservação devido aos danos que ocorrem em suas células e à zona
pelúcida decorrentes da micromanipulação. Por exemplo, embriões bipartidos resultam em
perda de 10% de suas células e uma proporção similar de células geralmente são
danificadas durante a criopreservação.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O grau de aproveitamento dos embriões criopreservados e aquecidos depende de
técnicas de tratamento que não produzam danos que os inviabilizem. Verifica-se, no
entanto, que quando o manejo requer que os embriões bovinos sejam criopreservados antes
18
da transferência para as receptoras, as técnicas correntes de criopreservação sempre
causam perdas de viabilidade.
É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa
preservação de embriões, os quais possam minimizar os danos causados aos embriões em
decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua
viabilidade pós-aquecimento.
A produção in vitro de embriões bovinos a partir de ovócitos imaturos tem se
tornado um procedimento de rotina para pesquisas em transgênese, clonagem e outras
áreas da biologia reprodutiva. Esta técnica tem crescido consideravelmente em aplicações
comerciais em programas de criação de bovinos. Para que possa haver maior flexibilidade
para uma utilização eficiente e mais difundida desta tecnologia é essencial que os embriões
possam ser estocados de forma eficaz em nitrogênio líquido.
O desenvolvimento de tecnologias de criopreservação de embriões revolucionou a
criação de bovinos. Embora a criopreservação possa aumentar a utilização de tecnologias
de produção in vitro de embriões ou de micromanipulação de embriões, a sobrevivência
dos embriões produzidos in vitro à criopreservação ainda é menor que dos embriões
produzidos in vivo.
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