PREPARO DE AMOSTRAS PARA
ANALITOS ORGÂNICOS
Por quê é necessário o preparo da amostra??
Amostra coletada
x
HPLC, ou LC-MS/MS
Material desenvolvido por:
Amostra = não apropriada para a análise...POR QUÊ??
Prof. Dr. Fábio Augusto (Unicamp)
Profa. Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de
Siqueira (Unifal-MG)
Profa. Dra. Isarita Martins (Unifal-MG)
• Muito “suja” – contém outros componentes na matriz que
interferem com a análise
• Muito diluída – analitos não estão concentrados
suficientemente para perimitir a detecção
• Matriz não compatível ou perigosa para a coluna/sistema
cromatográfico
Métodos de preparo de amostras para análises
cromatográficas
Fontes de erro em cromatografia
O método analítico e suas principais etapas
Contaminação (4%)
Preparo de amostras: fundamentos
Colunas (11%)
Extração líquido-líquido - ELL
Introdução da amostra (6%)
Cromatografia (7%)
Integração (6%)
Instrumento (8%)
Extração em fase sólida - SPE
Operador (19%)
Calibração (9%)
Headspace estático e dinâmico
Processos miniaturizados: SPME, LPME, SBSE, etc
Outros: extração em fluido supercrítico (SFE), em SPE
com polímeros de impressão molecular (MISPE), em
membranas, extração acelerada por solventes (ASE), etc
Tempo gasto na análise
Tratamento dos
dados (27%)
Coleta (6%)
Processamento da amostra (30%)
O MÉTODO ANALÍTICO
E SUAS ETAPAS
PRINCIPAIS
Análise (6%)
Processamento da
amostra (61%)
1
Etapas do procedimento
analítico
amostragem
quantificação
preparo da amostra
análise estatística
separação
tomada de decisões
Amostragem
Coleta de amostras representativas do
material a ser analisado
Preparo das
amostras
Eliminação de interferentes e
isolamento dos analitos de interesse
Identificação e/ou
quantificação
Processamento dos
resultados
Avaliação dos
resultados
Separação, identificação e quantificação
dos analitos
Métodos algébricos/ estatísticos para
estimar quantidades e incertezas
Decisão sobre ações a serem tomadas
em face aos resultados
Método idealizado de preparo de amostra
analito
PREPARO DE
AMOSTRAS:
FUNDAMENTOS
Separar analitos
quantitativamente dos
interferentes da matriz
Volume Vam da
amostra contendo n
gramas de analito
Concentração = Cam
Preparo de amostras:
finalidades
Isolar os componentes de interesse (analitos)
de uma matriz.
O preparo de amostras envolve procedimentos de
extração e pode também incluir etapa de purificação
(cleanup) para amostras muito complexas.
Esta etapa também objetiva trazer os analitos num
nível de concentração adequado para a detecção e
assim, técnicas de preparo de amostras tipicamente
incluem o enriquecimento.
interferente
matriz
Cromatografar a
porção concentrada e
limpa de analito
CG/CLAE
n g de analito
concentrados em
um volume Vam
Vfinal << Vam
Cfinal >> Cam
Finalidades do preparo de
amostras
1. Purificação (clean up) da amostra
- eliminação de interferentes que possam danificar o
sistema cromatográfico ou que possam interferir na
identificação e/ou quantificação dos analitos.
2. Pré concentração dos analitos
2
Benefícios do preparo de
amostras
1. Tornar a matriz compatível com a fase móvel e o
detector.
2 Proteger o sistema e coluna cromatográfica de
2.
contaminação por partículas e material de elevado
peso molecular:
Benefícios do preparo de
amostras
3. Remover interferências:
- simplificando a extração;
- diminuindo o tempo de análise;
- aumentando o limite de carga/ sensibilidade.
- aumento da vida útil da coluna;
- menor gasto com manutenção;
- menos problemas operacionais.
4. Concentrar componentes de interesse:
- aumentando a sensibilidade (detectabilidade);
- aumentando a reprodutibilidade.
Preparo de amostras
biológicas
Materiais biológicos são complexos: contêm proteínas,
sais, bases, lipídeos, carboidratos e compostos
orgânicos às vezes similares quimicamente aos
orgânicos,
analitos.
Analitos: presentes em quantidades muito pequenas
na amostra e ainda ligados às proteínas.
COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E
INTERFERENTES?
3. Características da instrumentação disponível
-O detector é sensível? seletivo? específico? para o analito
- Algum componente do sistema é incompatível com constituintes
d amostra
da
t ou reagentes
t usados?
d ?
4. Requisitos técnico-gerenciais
- Existe metodologia oficial/ oficiosa a ser seguida?
- Quantas amostras serão analisadas por dia?
- Existe pessoal capacitado para cumprir estas demandas?
COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E
INTERFERENTES?
1. Propriedades físico-químicas dos constituintes da amostra
- analitos, interferentes e matriz são voláteis?
- polares? apolares?
- amostra:
t
sólida?
ólid ? líquida?
lí id ? gasosa??
- analitos são quimicamente e/ou termicamente estáveis?
2. Concentração de analitos e interferentes na amostra
- Quais as concentrações esperadas de analitos e de
interferentes na amostra?
Preparo de amostras
Os objetivos da análise indicam quanto de esforço
deve ser envidado no preparo da amostra.
Quesitos para um eficiente preparo da amostra:
a)) Perda mínima da amostra e boa recuperação
p ç do analito;;
b) Componentes existentes na amostra e sem interesse
devem ser removidos eficientemente;
c) Não devem ocorrer problemas no sistema
cromatográfico;
d) O procedimento deve ser feito de forma conveniente e
rápido;
e) O custo da análise deve ser baixo.
3
Preparo de amostras:
tipos de técnicas
1) Exaustivas
Preparo de amostras:
tipos de técnicas
2) Não-exaustivas
baseadas em princípios de equilíbrio
O objetivo é a remoção completa dos analitos da matriz e
sua transferência para a fase extratora.
2 1 Pequeno volume da fase
2.1
f
extratora: SPME,
S
LPME
- técnicas de equilíbrio batch (ELL), técnicas flow trough
2.2 Baixa constante de distribuição amostra/fase
extratora: headspace
(SPE), extração em fluido supercrítico (SFE), e dinâmica,
como em Soxhlet
Técnicas de preparo: "off-line" e "on-line“
... e “in-line”
Tratamento prévio de
amostras
Tratamento prévio de
amostras
REMOÇÃO DE PROTEÍNAS: precipitação,
ultrafiltração e diálise
REMOÇÃO DE PROTEÍNAS: VANTAGENS
Desproteinização requer:
(a) temperaturas elevadas
(b) alteração da força iônica ou osmótica ou do pH;
(a) Simplicidade (2 a 3 etapas)
(b) Baixo custo
(c) Facilidade de automação
(c) agentes orgânicos de precipitação;
(d) enzimas proteolíticas.
Tratamento prévio de
amostras
REMOÇÃO DE PROTEÍNAS - PROBLEMAS
Tratamento prévio de
amostras
REMOÇÃO DE PROTEÍNAS - Agentes mais usados:
-
precipitação incompleta das proteínas (e algumas
globulinas podem permanecer no sobrenadante e
passarem para o sistema de detecção);
-
diluição da amostra (mais usado para concentrações
mais elevadas de analitos);
b) Ácidos: tricloracético, perclórico, sulfosalicílico,
túngstico
-
geração de picos no CLAE ou interferência na leitura
espectrofotométrica devido ao agente precipitante
usado.
c) Hidróxido de zinco
a) Solventes orgânicos miscíveis em água (metanol,
(metanol
etanol, acetonitrila, acetona, entre outros)
4
Tratamento prévio de
amostras
Tratamento prévio de
amostras
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
(a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas
enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases
(a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas
enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases
Fontes: Helix pomatia (tbém sulfatases) e a Patella vulgata,
Helix aspersa e a Escherichia coli.
- mais lenta, porém, menos vigorosa e mais seletiva, e não
degrada os analitos;
- exige que a atividade da enzima seja avaliada periodicamente,
através do estudo de sua eficiência no processo de hidrólise; além
disto, a atividade da enzima pode ser inibida por componentes da
matriz.
Tratamento prévio de
amostras
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
b) Não-específicos, utilizando-se a hidrólise ácida ou
alcalina.
- utiliza condições extremas de pH e de temperatura;
- formação de produtos que interferem na extração e
derivatização, ou no perfil cromatográfico dos analitos.
PARTIÇÃO: Princípio básico de operação
analito apolar
matriz aquosa
Principais processos físico-químicos de separação usados
em metodologias de preparo de amostras
A
PARTIÇÃO
Os analitos são removidos da amostra por
dissolução em solvente apropriado
B
ADSORÇÃO
Os analitos são coletados na superfície
p
de
um sólido com elevado poder adsortivo
C
VOLATILIZAÇÃO
Os analitos são evaporados
seletivamente e separam-se da
matriz e dos interferentes
PARTIÇÃO: fundamentos teóricos
solvente apolar
1 volume Vam da amostra com concentração Cam do
analito
2 volume Vext do solvente extrator adicionado
3 analitos dissolvem-se no solvente extrator até
que ocorra o equilíbrio
Como a afinidade dos analitos pelo solvente apolar é maior
que sua afinidade pela matriz, eles tendem a se DISSOLVER
(serem absorvidos) nessa fase apolar, imiscível na matriz
Na separação por partição, os analitos são transferidos da matriz
para um solvente extrator, formando uma solução
No equilíbrio:
Cres – concentração residual na amostra
Cext – concentração na fase extratora
K = Cext / Cres
K = constante de distribuição
Parâmetro básico do equilíbrio de partição
5
PARTIÇÃO: fundamentos teóricos
Equilíbrio de partição:
1. Solventes orgânicos: hidrocarbonetos (hexano, éter
de petróleo); solventes organoalogenados
(clorofórmio, diclorometano), etc.
Cext = next/ Vext
K = Cext / Cres
PARTIÇÃO: materiais mais comuns
K = next/ nres . Vam/ Vext
2. Polímeros: acima da temperatura de transição vítrea
(Tg), os polímeros orgânicos têm comportamento
dissolvente semelhante aos dos líquidos convencionais
Cres = nres /Vam
A constante de distribuição K pode ser expressa em termos do
volume de amostra Vam e da fase extratora Vext usada, e das massas
extraídas next e residual (não-extraída) nres
ADSORÇÃO: fundamento da operação
Polidimetilsiloxano
PDMS, silicona (Tg = -120ºC)
Poliacrilatos
R = metila, etila, etc. (Tg = - 24ºC)
ADSORÇÃO: dessorção dos analitos extraídos
Solvente orgânico
Gás inerte + aquecimento
dessorção por dissolução
dessorção térmica
Adsorção é temporária!!!
Os analitos são transferidos seletivamente da matriz
para o adsorvente
ADSORÇÃO: fundamentos teóricos
Cada sítio
ativo: liga uma
molécula por
vez
Analitos dissolvidos
em gás inerte
Analitos dissolvidos
em pequeno volume
de solvente orgânico
CG
ADSORÇÃO: fundamentos teóricos
Kads = coeficiente de adsorção. DEPENDE da afinidade do
analito pelo sólido adsorvente e pela matriz (similar ao K
para a partição)
A superfície contém número grande, porém finito, de sítios ativos
fisisorção
ligação do analito no
sítio ativo
Atração entre dipolos (van der
Waals): FISISORÇÃO
Por ligação química covalente:
QUIMISORÇÃO
Quanto mais elevado o Kads, maior a quantidade de
analito adsorvida no equilíbrio.
6
ADSORÇÃO: classes de material adsorvente
ADSORÇÃO: classes de material adsorvente
1. CARVÕES: carvão ativo, carvão ativo grafitizado
(Carboxeno®), peneiras moleculares carbonáceas
(Carbosleves®).
3. POLÍMEROS ORGÂNICOS: grande variedade de
materiais
Grande afinidade por compostos orgânicos voláteis (e amostras
gasosas). Elevada estabilidade térmica (Tmax = 400 – 450 o. C)
2. ADSORVENTES INORGÂNICOS: quase sempre de
alumina (Al3O2) e sílica (SiO2) – às vezes recobertos por
filmes orgânicos quimicamente ligados.
Menor estabilidade térmica (Tmax= 180 - 350 o C); podem se
decompor e introduzir contaminantes (artefatos) nos extratos.
Tenax TA
Polioxi de 2,6- difenileno
Mais usados para compostos orgânicos de diferentes
volatilidades (amostras gasosas e líquidas). Alta estabilidade
térmica (Tmax = 400 – 450 o. C)
VOLATILIZAÇÃO: fundamentos teóricos
matriz aquosa ou sólida
fase gasosa (headspace)
analito volátil
interferente não-volátil
Técnicas de extração mais usadas
para analitos orgânicos de
matrizes biológicas
Extração líquido-líquido (LLE)
Extração em fase sólida (SPE)
Extração por headspace (HS)
Microextração em fase sólida (SPME)
O headspace (espaço confinante) pode ser introduzido
diretamente no CG ou passar por outras etapas para
isolamento do analito.
EXTRAÇÃO LÍQUIDOLÍQUIDO (ELL)
EXTRAÇÃO LÍQUIDOLÍQUIDO (ELL)
Baseia-se na afinidade da
f
forma
li fíli
lipofílica
d analito
do
lit por
um solvente orgânico
7
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
A quantidade extraída depende do volume de amostra e de
solvente extrator e da constante de distribuição K
β = Vam / Vext
Eficiência da extração η η = K / K + β
Aumento do volume do extrator incrementa a fração extraída de um
analito
li em um determinado
d
i d volume
l
da
d amostra, mas pode
d
comprometer o efeito de pré-concentração do analito extraído.
Ocorre partição dos analitos
entre a amostra aquosa e o
solvente extrator orgânico.
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Escolha do agente
extrator:
Solvente
Isooctano
0.0002
- maior compatibilidade
com a ELL: baixo ponto
de ebulição e baixa
viscosidade;
Heptano
0.0003
Pentano
0,040
- seletividade maior:
solventes menos polares
Clorofórmio
0,815
Diclorometano
1,6
Inalterado x Metabólitos
Solubilidade
%
Ci l h
Ciclo-hexano
0 006
0.006
Hexano
0,014
Éter etílico
6,89
Álcool Isobutílico
8,50
Acetato de Etila
8,70
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Tipos de solvente
Triagem → Mistura de solventes.
Análise direcionada → Solvente
com maior afinidade pelo analito.
Ácido hipúrico: acetato de etila
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Concentração do extrato:
Fluxo de N2 → Acelera a
vaporização sem aumento da
t
temperatura.
t
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
= molécula de água
EFEITO “SALTING OUT”
CH2 CH N
CH3
H
H
+
NaCl (cloreto de sódio)
O2 → Oxidar compostos mais
sensíveis
Na+
Cl-
CH2 CH N
CH3
H
H
8
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
procedimento convencional: efeito do pH
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Extração ácida:
pH ácido → substâncias de
caráter ácido prevalecem na
forma não ionizada, lipofílica
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO: procedimento
convencional
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
•substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nordelta -9-THC-COOH
O
C OH
O
C OH
CH3
CH3
OH
H+
CH3
OH
CH3
O
C5H11
O
C O
C5H11
O
Forma
nãoionizada
OH-
ácido 11-nor-delta 9-THC-COOH
OH
CH3
CH3
O
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Extração básica:
pH básico → substâncias
caráter básico prevalecem
forma não ionizada, lipofílica
Forma
ionizada
C5H11
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO: procedimento
convencional
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
Solvente
orgânico
•substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas
CH2 CH N
CH3
Anfetamina
H
H+
CH2
de
na
H H
+
CH N
H
CH
urina
Drogas/
metabólitos
3
urina
Forma ionizada
H
OH-
CH2 CH N
CH3
H
Agitação
H
Forma não-ionizada
Centrifugação
Separação da
fase orgânica
extrato
9
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO:
procedimento convencional
Vantagem:
☺extremamente simples e rápida
Desvantagens:
EXTRAÇÃO EM FASE
SÓLIDA
grande volume de solventes
descarte do material
formação de emulsão
seletividade sofrível
SOLID PHASE
EXTRACTION (SPE)
efeito de pré-concentração limitado
Extração em fase sólida
Permite a separação seletiva,
purificação e a concentração de
compostos
presentes
em
matrizes complexas
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Escolha do cartucho
DEPENDE:
volume da amostra, tipo de matriz, número e
tipo de analitos, entre outros...
CARTUCHO PARA SPE: seringa de polipropileno ou de
vidro, contendo uma pequena quantidade de material
sorvente ou adsorvente finamente granulado
Mais usados: volume pequeno 200mg (1,2
mL amostra); volume grande 500mg (4-5
mL amostra).
Massa de sorvente varia entre 25 mg e 10 g
10
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Pre-tratamento da amostra, dependendo de:
- tipo de analito;
- tipo de matriz;
- natureza da retenção química.
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 1 – Condicionamento do dispositivo de
extração
Passagem de pequeno volume de solvente apropriado
para umedecer o sorvente (grupos funcionais ligados) e
garantir interação consistente
ENVOLVE:
- ajuste de pH;
- centrifugação;
- filtração;
- diluição;
- adição de tampão, etc
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 1 – Condicionamento do dispositivo de extração
- depende da aplicação do material
de recheio;
Natureza do solvente: depende do sorvente [sílica e sorventes
apolares – metanol; sorventes polares – solventes orgânicos] e da
matriz
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 2 – Eluição da amostra (líquida ou aquosa)
Passagem da amostra no sorvente
- necessário p
para ativar a fase;;
- não permite que o material seque.
Equilibrio: Sorvente/ fase é tratada com solução similar
(em polaridade, pH, etc) à matriz para maximizar a
retenção dos analitos.
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 2 – Eluição da amostra (líquida ou aquosa)
- volume de μL a L;
- ajustes de pH, força iônica pode ser feito;
(analito permanece na forma não dissociada para
ficar mais retido no adsorvente))
Base fraca: pH 2 acima do pKa
Ácido fraco: pH 2 abaixo do pKa
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 3 – Lavagem do sorvente (clean up)
Natureza do solvente para
clean up: poder de dissolução
suficiente para dessorver
materiais fracamente sorvidos
(interferentes?) mas não
espécies fortemente sorvidas
(analitos?)
- passar a amostra com vácuo ou pressão;
- fluxo pode afetar a eficiência.
descarte
11
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 3 – Lavagem do sorvente (clean up)
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
Etapa 4 – Dessorção dos analitos
Solvente: deve possibilitar
dessorção completa
(quantitativa) dos analitos
Volume do solvente: o
menor possível (préconcentração)
- eluição do material não desejado ou não
retido é lavado com mesmo solvente da
amostra;
- passando um solvente mais forte que a
amostra pode remover algumas impurezas
indesejáveis
(pode
retirar
o
analito.
Perigoso para a análise).
Preferência a solventes
voláteis
Análise cromatográfica
Aplicação da SPE: analitos não-voláteis e semi voláteis em
amostras aquosas + separação cromatográfica
OPERAÇÃO BÁSICA DE SPE
REGRAS NO USO DA SPE
Etapa 4 – Dessorção dos analitos
√ Analito deve ser adsorvido no sorvente da SPE
- eluição com pequeno volume de solvente
adequado (forte); Concentra o analito
- duas alíquotas pequenas são mais
eficientes que uma grande;
- interação por vários segundos aumentam
a eficiência da extração.
SPE: Mecanismos de
separação
1. Adsorção: material sólido que não
apresenta filme líquido depositado na
partícula - sílica gel
√ Deve haver tempo suficiente de contato
analito/sorvente
√ Interferentes endógenos da amostra devem ser
seletivamente separados dos analitos
√ Analitos devem ser capazes de ser eficientemente
removidos do sorvente
SPE: Mecanismos de
separação
2. PARTIÇÃO: com fase quimicamente
ligada (comportamento similar a de um
filme de sorvente líquido na superfície =
partição)
p
ç )
- fase normal: polar + matriz
apolar
retém analitos polares
e os apolares são eluídos
Sílica: diâmetro da partícula: 30-50 μm
Superfície: 500-600 m2 /g
12
SPE: Mecanismos de
separação
FASE NORMAL : polares
-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)
Si
CN
Cianopropil
C N
-fase reversa: apolar + matriz
polar
retém analitos apolares
e os polares
l
são
ã eluídos
l íd
H O
NH2
Aminopropil
2OH
Diol
Si
O
OH
Si
O
H
H
NH
NH
H
H
O
SPE FASE REVERSA: REGRAS
90% de uso em análises de fármacos e
toxicantes
Deseja reter um analito apolar não
dissociado num meio aquoso. Matriz polar:
urina
FASE REVERSA: apolares
-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
• Retenção: mecanismos não-polares ou interações
hidrofóbicas
• Matriz (amostra): aquosa (fluidos biológicos,
águas)
• Características
C
t í ti
dos
d analitos:
lit exibirem
ibi
grupos
funcionais não polares (a maioria de analitos
orgânicos)
• Esquema de eluição: interações hidrofóbicas são
rompidas com soluções mais hidrofóbicas ou com
solventes (metanol, diclorometano, etc ou
combinação de água ou tampões/solventes)
Papel crítico do pH em SPE
C8
Octila
Si
PH
Fenila
CH
Ciclo
hexila
Si
Si
SPE: Mecanismos de
separação
-fases especiais e mecanismos
mistos: fase mista contém parte
da molécula apolar e parte com
radicais polares: usadas para
reter analitos polares e apolares
Pouco eficiente: retém muitos interferentes
13
SPE: Mecanismos de
separação
SPE: Mecanismos de
separação
3. Pareamento iônico
4. Troca iônica
Fase apolar + matriz polar
com analitos iônicos.
iônicos Adição de
contra-íon neutraliza o analito
que é retido na fase apolar
(=mecanismo da fase reversa)
Fase
modificada
com
funcionalidade iônica; analito de
carga oposta à fase será retido.
dentro da própria matriz passa um íon e depois
um contra íon
Trocadores
catiônicos
fortes
(ácido
sulfônico) e fracos (ácido carboxílicos)
Trocadores
aniônicos
fortes
alquilamôneo) e fracos (amina)
(tetra
SPE TROCA IÔNICA : regras
SPE: TROCA IÔNICA
Mecanismos de retenção
interações eletrostáticas
- o sorvente e os grupos funcionais do
analito devem ter cargas opostas
Amostra (matriz)
não polar ou polar com baixo teor de sais ( <
0,1 M)
Características do analito
troca catiônica p
para compostos
p
básicos (ex:
(
aminas)
troca aniônica para compostos acídicos (ex.
ácidos carboxílicos, ácidos sulfônicos, fosfatos)
Esquema de eluição
quebra de ligações eletrostáticas
- modificação do pH para neutralizar grupos
funcionais do analito ou sorvente;
- aumento da concentração de sal ( < 0,1 M)
- uso de um contra-íon de grande seletividade
para o sorvente com relação ao analito
-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)
O
CBA
Ácido
carboxílico
C
Si
O-
+
NH3
R
SCX
Si
Ácido
benzenosulfônico
SAX
Trimetil
aminopropil
Si
N+(CH3)3
-
SO3
SO3-
+
NH3
R
!
Natureza dos solventes x SPE
Concentração no
equilíbrio:
Se for usada a partição: K = Cext / Cres
K=f
{
afinidade sorvente
afinidade matriz/ solvente de eluição
Cext = na fase sorvente
extratora
Cres = na amostra ou
solvente de eluição
Eluição
ç da amostra
Clean up
Dessorção dos analittos
Sorção dos analitos
Dessorção de interferentes
Dessorção de analitos
K alto
K baixo
K baixo
Matriz com menor afinidade
pelos analitos de que o
solvente
Solvente com maior
afinidade pelos
interferentes de que o
sorvente
Solvente com maior
afinidade pelos analitos de
que o sorvente
INSTRUMENTAÇÃO PARA SPE
O SPE pode trabalhar on line
(analitos transferidos diretamente
para o CG ou HPLC)) ou off
do SPE p
line (analitos coletados em tubos e
transferidos para o cromatógrafo)
14
INSTRUMENAÇÃO PARA SPE
DISCOS DE SPE
DISCOS DE SPE
Operação similar à filtração à vácuo
Recomendados: para grandes volumes de
amostra contendo material particulado
Extração mais rápida de que em
cartuchos, permitindo uso de vazões
elevadas de amostra.
Volumes maiores de amostra podem ser
necessários para aumentar a
detectabilidade dos analitos.
DESVANTAGENS DA SPE
• Maior dificuldade para otimizar seu uso
(desenvolvimento do método)
• Grande variedade de substâncias químicas,
muitas escolhas para manipular solventes
• Várias etapas e maior tempo requerido
• Maior custo por amostra
VANTAGENS DA SPE
☺ uso de pequeno volume de solvente
☺ pouco manuseio da amostra
☺ ausência de emulsão
☺ facilidade na automação
☺ baixo consumo de vidrarias
☺ menor tempo de análise
☺ menor custo de mão de obra
15
EXTRAÇÃO POR HEADSPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina,
sangue ou saliva)
+ sulfato de sódio
+ PI
seringa
ESTUFA 70°C
30 min
i
GC
16