LAURA MACHADO DE FARIA
INTRODUÇÃO
Metabolismo da energia mitocondrial:
- Cadeia transportadora de elétrons => bombeia prótons para o espaço intermembranar =>
produzindo um ΔμH+ => força dirigente para a síntese de ATP;
- ΔμH+ pode ser convertido em calor (bat) => termogênese por não-tremor;
- ΔμH+ => mecanismo de defesa em stress oxidativo.
INTRODUÇÃO
Mecanismo de Regulação das taxas de
Respiração e Síntese de ATP
Grau de acoplamento entre respiração e fosforilação
regulados por dois distintos processos:
- Oxidase Alternativa (AOx);
- Proteínas Desaclopadoras (UCP).
INTRODUÇÃO
Quais os mecanismos de regulação Termogênese em Plantas?
Oxidase Alternativa (AOx)
Proteína Desaclopadora
Mitocondrial de Plantas
(PUMP)
Regulação intrínseca –
sistema de dissipaçãopotencial redox
(não forma ΔμH+)
Regulação extrínseca –
sistema de dissipaçãopotencial próton
eletroquímico
(formação de ΔμH+)
Mitocôndrias de plantas possuem dois sistemas dissipadores de energia que
diminuem a eficiência da fosforilação oxidativa.
Oxidase Alternativa - AOx
- são enzimas mitocondriais encontradas no eucariontes, possivelmente em animais;
- AOx – tipo 1 – monocodiledôneas e dicotiledoneas – expressão relacionada ao estresse;
- AOx – tipo 2 – somente em dicotiledôneas – expressão constitutiva;
- AOx – tipo 3 – Arabdopsis – expressão diminui a baixas temperaturas (downregulated) –
indicando papel fisiológico no metabolismo de energia.
- funcionam como dímero;
- catalizam a oxidação/redução do oxigênio/ubiquinol;
- a única função confirmada para AOx é a termogênese respiratória em Arum spp e outras
espécies, onde a produção de calor durante a antese volatiza compostos aromáticos e
atrai polinizadores.
- produz uma rota alternativa para geração de elétrons na cadeia transportadora
(transloca elétrons somente no complexo 1).
- a ativação da oxidase reduz a geração de ATP.
Oxidase Alternativa - AOx
- torna-se ativa quando UQ pool é 40-50% reduzido, aumentando sua atividade com
o aumento da redução de UQ pool;
- qto maior a redução do UQ pool, menor a afinidade de AOx por O2;
- o estado reduzido de AOx depende da geração de NADPH e envolve sistema de
acoplamento de redução do NADPH por glutationa e tioredoxina;
- AOx não é sensitiva a inibidores da rota metabólica do citocromo, mas é inibida por
ácidos hidroxâmicos, como o benzohidroxamato (BHAM) e por fatty acids (FA);
- Não ocorre ΔμH+ durante a respiração.
OBJETIVOS
Mini-revisão focando nos possíveis papéis de Oxidase Alternativa,
e a Proteína Desaclopadora Mitocondrial Vegetal (PUMP) no
metabolismo de energia mitocondrial em plantas.
METODOLOGIA
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas (UCP)
Oxidase Alternativa AOx
Análises de Expressão
Estudos Funcionais
Em tecidos
termogênicos e não
termogênicos
Em condições
normais e de
estresse
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
EXPERIMENTOS
1. Superexpressão de AtPUMP1 em plantas de tabaco transgênico:
-
Levando a um significativo aumento na tolerância ao estresse oxidativo
(promovido por peróxido de hidrogênio) qdo comparado às plantas controles
não transgênicas;
-
Em plantas chilling-sensitive (cana-de-açucar), o estreses oxidativo é o
principal componente do chilling stress);
-
ROS (espécies de oxigênio reativas) pode reagir com DNA, lipídeos e proteínas
e causar sérios danos celulares;
-
a mitocôndria representa uma das maiores fontes de ROS durante cold stress
=> PUMP e AOx podem agir como reguladores da produção de ROS.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
EXPERIMENTOS
2. Indução de expressão de PUMP de milho por menadiona:
-
gera superóxido => sugere que a expressão de ZmPUMP in vivo pode ser
controlado por níveis de ROS;
considerar que o propósito da expressão da PUMP cold-stress-induced é
balancear a produção aumentada de ROS potencial.
3. Análises da região upstream promotora 1.0 kb de PUMP4, 5 e AOxla (PLACE e
PlantCARE) do sítio de transcrição em Arabidopsis, revela uma sequência
comum alvo de um FT envolvido no processo oxidativo, ativando proteinas
peroxissomal.
Oxidase Alternativa - AOx
- a energia para termogênese é fornecida pelo o aumento da respiração mitocondrial
por meio de AOx;
- e é controlada pelo Ácido Salicílico;
- entretanto, a expressão de AOx1 é induzida por ácido salicílico tanto em plantas
termogênicas como não-termogênicas.
Oxidase Alternativa - AOx
• O provável papel de AOx em plantas não-termogênicas é o de minimizar a produção
de ROS:
- experimentos com transgênicos de tabaco overexpressando ou faltando AOx sugerem
que AOx está envolvido na resposta hipersensitiva à infecção por vírus e pode prevenir
a morte programada da célula induzida pela downregulaion da rota metabólica do
citocromo;
- Aox é efetivamente induzida pela inibição química artificial da rota metabólica do
citocromo por poisons (tóxicos) tais como cianido e antimicina A;
- alguns autores sugerem que a indução de AOx por cianido/antimicina A, bem como
por ácido salicílico é indireta, via aumento da produção de ROS que é conhecido por
upregulate a expressão de AOx1.
Oxidase Alternativa - AOx
- É conhecido que estresse ao frio
ativa a AOx em plantas nãotermogênicas.
- Taxas de CO2 em tubérculos em
batata diferentes temperaturas.
Fig. 1. Ratio between CO2 evolution rates of intact potato tubers stored at 5±1 °C and tubers stored
at 25±1 °C. Each point represents the mean value ±SD of four determinations, each one using a
group of four intact potato tubers. Significant differences (p < 0.01) between CO2 evolution rates of
cold- and warm-treated potato tubers are indicated by asterisks.
Oxidase Alternativa - AOx
Akdkdkdkd
-A taxa de CO2 output aumentou a
5 °C;
-Alto consumo de O2.
- Atividade AOx a 5 °C foi ~ 10x
maior que em 25°C.
Fig. 2. Determination of AOx capacity in mitochondria isolated from potato tubers stored for 4 days at
5±1 °C or 25±2 °C. Mitochondria (0.5 mg/ml) were incubated in a standard reaction medium
(28 °C) in the presence of 2.5 μg/ml oligomycin, 300 μM propranolol, 2 μM atractyloside, 0.1 mM ATP,
0.5% BSA, 1 mM DTT, and 0.15 mM pyruvate. Additions of 2 mM KCN and 2 mM BHAM were done
where indicated. Slope 1 refers to the total respiration rate, a difference between slope 1 and slope 2
refers to CN-sensitive respiration and between slope 2 and slope 3 to AOx capacity.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Características:
• sistemas de gradiente eletroquímico de próton por dissipação de potencial;
• principal forma de regulação extrínseca de eficiência de fosforilação oxidativa;
• mediado por ΔμH+, sem a produção de ATP;
• UCPs e PUMPs permitem o retorno dos prótons novamente à matrix mitocondrial sem
síntese de ATP, dissipando a energia de ΔμH+ como calor;
• o resultado é um desaclopamento de respiração da síntese de ATP.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Histórico:
• first uncoupling protein (UCP) in 1976 (bat);
• Vercesi et al. (1995) descobriram PUMP em tubérculos de batata;
•foi detectada em vários outros seres por produção de anticorpos contra batatas PUMP
ou contra PUMP recombinante isolada de sistema de expressão em E. coli;
•
outros genes codificando UCPs 1-5, AtPUMP1 e AtUCP2 foram descobertos;
•descoberta pelo grupo distintos padrões de expressão entre monocot. e dicot. durante
estresse ao frio – sistema de dissipação de energia sujeitos a diferentes regulação
transcricional em diferentes células e tecido;
•a existência de UCPs em vários seres vivos e alta homologia (em todos os eucariotos,
exceto em Saccharomyces cerevisiae), sugerindo sua emergência no início da escala
evolutiva.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Mecanismos hipotéticos de transporte de prótons:
• modelo proton-buffering – o H+ é transportado diretamente pela UCP;
• modelo protonophore – em que o H+ é transportado por um free fatty acid (FA)
cycling (mecanismo flip-flop) mediado pela UCP (anions vão para o espaço
intermembranar e voltam para a membrana interna quando protonados e neutros).
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:
• Ativadores como ex.:
- FA - free fatty acid;
- UQ - ubiquinona e seu estado redox;
- ROS - espécies reativas de oxigênio: peróxido de hidrogênio, superóxidos e
radicais hidroxil.
• Inibidores como ex.:
- nucleotídeo purina, pH-dependente;
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:
• Ativadores:
UQ - ubiquinona e seu estado redox
FA - free fatty acid
- Em 2004, o grupo dos autores relataram UQ regulando a atividade UCP de uma forma
diferente – ao invés da ativação de UCP por UQ, encontraram que a inibição de FFA
induziu a atividade de UCP por GTP, sendo este sob o controle do estado redox de UQ;
- UCPs em músculos se tornou GTP-sensitiva quando o nível de redução de UQ foi
abaixo de 64% e completamente inibida qdo abaixo de 57%.
• Inibidores como:
Nucleotídeo purina, pH-dependente
 Sugerindo que o estado redox de UQ poderia ser um sensor metabólico que modula
a inibição do nucleotídeo purina de UCPs ativadas por FFA em mitocôndria de músculo.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
Regulagem da atividade de UCPs em animais, plantas e fungos:
• Ativadores:
ROS - espécies reativas de oxigênio: peróxido de hidrogênio, superóxidos e radicais
hidroxil:
Evidência de que UQ pode ativar UCP indiretamente via produção de superóxido
(Echtay et al., 2002). Da mesma forma para PUMP de batata (Considine et al., 2003) =>
sugerindo conservação dos mecanismos básicos de ativação de UCP e PUMP.
- após Echtay & Brand (2001) encontrarem uma ativação de GDP-sensitive proton
conductance de um mitocôndria de rim por UQ. Adicionando superóxido dismutase, a
ativação por UQ diminui fortemente.b
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
UCPs – Função Termogênica x Não-Termogênica
- originalmente consideradas apenas produtoras de calor em termogênese por nãotremor em mamíferos que hibernam – rewarming period (BAT de UCP1 e muscle-type
UCP);
Obs.: Ca2+ -ATPase (SERCA) hidrolisa ATP (dissipação da energia conservada em ATP)
sem o transporte de Ca2+ (uncoupled Ca2+ ATPase), resultando em produção de calor.
- a participação de outras isoformas de UCP na termogênese é incerta:
- UCP2 e UCP3 – regulação do peso do corpo ou produção de ROS;
- PUMP1, 4 e 5 são induzidas pelo frio (expressão de genes PUMP em Arabidopsis
codificando PUMP1, 4 e 5.
- PUMP2 e 3 – expressão lenta e insensível ao frio.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas - PUMP
UCPs – Função Termogênica x Não-Termogênica
UCPs em plantas não-termogênicas:
- Hipótese a favor de um papel mais geral: a regulação do metabolismo energético em
mitocôndria => para evitar um extremo aumento do ΔμH+, o qual pode levar a uma
excessiva produção de espécies de oxigênio reativas.
=> Levantando questões sobre o real papel fisiológico das UCPs.
Proteína Desaclopadora Mitocondrial de Plantas
Expressão de StPUMP aumenta na exposição ao frio => Entretanto, a alta capacidade funcional de
StPUMP não dispara a termogênese.
- Armazenamento no frio por 4
dias seguidos produz uma resposta
da mitocôndria ao re-acoplamento
(taxa de respiração diminui ao
mesmo nível do controle) quando
adicionado ATP e BSA.
- Ao contrário, ATP não produz
efeito no controle mitocondrial ao
re-acoplamento para tubérculos
warm-stored.
Fig. 3. Electrical transmembrane potential (ΔΨ) of mitochondria isolated from potato tubers stored for 4 days at 25±2 or 5±1 C.
Potato mitochondria (‘‘PM’’; 0.5 mg/ml) were incubated in a standard medium (28 C) containing 2 μg/ml oligomycin, 7 μM
atractyloside, 300 μM propranolol, 0.1 mM ATP, and 10 μM linoleic acid (LA). Additions of 5 mM ATP, 0.1% BSA, and 1 mM KCN
were done where indicated. ΔΨ was estimated as a function of changes in safranin O fluorescence (arbitrary units, here referred to
as a.u.).
CONCLUSÕES
• As Regulações intrínseca e extrínseca da fosforilação oxidativa em plantas são realizadas por
meio da dissipação de energia que leva ao aumento da produção de calor;
• Contudo, sistemas de dissipação de energia manifestam termogênese somente diante de uma
capacidade funcional muito alta;
• Níveis de expressão suficientemente altos para promover a termogênese: UCP1 em tecido
adiposo marrom de mamíferos e AOx1 em algumas espécies de espádices;
• A possível função termogênica de PUMP veio de observações de estresse ao frio, que
estimulou a transcrição de genes PUMP em raízes e flores de batata a Arabidopsis thaliana;
• Contudo, o estresse ao frio elevou a produção de ROS que também induziu a transcrição de
genes PUMP;
• A maioria das plantas, com exceção das termogênicas, não produzem suficiente aquecimento
metabólico para aumentar a temperatura de todo o tecido;
• Isto sugere que o papel biológico de ambos os sistemas pode ser mais no sentido de, por haver
nestes casos relevantes funções da PUMP e AOx concomitantes, melhorar a regulação do
metabolismo de energia mitocondrial e a prevenção da formação excessiva de ROS.