Universidade Federal do Triângulo Mineiro
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO EM OSSOS DE RATAS JOVENS
SUBMETIDAS À ATIVIDADE FÍSICA DE ALTO IMPACTO E
ADMINISTRAÇÃO DE PROPRANOLOL
Daniel Silva Gontijo Penha
Uberaba, MG
2006
Daniel Silva Gontijo Penha
Estudo histomorfométrico em ossos de ratas jovens
submetidas à atividade física de alto impacto e administração de propranolol
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Patologia – Área de Concentração Patologia Geral, da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro – UFTM, como
requisito parcial para a obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos dos Reis
Co-orientador: Prof. Dr. Vicente de Paula Antunes Teixeira
Uberaba – MG
Dezembro, 2006
Este trabalho foi desenvolvido nos laboratórios das disciplinas de Fisiologia,
Patologia Geral e Histologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)
e realizado graças ao apoio financeiro da Fundação de Ensino e Pesquisa de
Uberaba (FUNEPU), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais (FAPEMIG), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).
Sumário
1. Introdução..............................................................................02
2. Hipótese.................................................................................15
3. Objetivo..................................................................................17
4. Material e Métodos.................................................................19
5. Resultados.............................................................................25
6. Discussão...............................................................................31
7. Resumo..................................................................................36
8. Abstract..................................................................................39
9. Referências Bibliográficas......................................................42
10. Anexo.....................................................................................53
P457e
Penha, Daniel Silva Gontijo.
Estudo histomorfométrico em ossos de ratas jovens
submetidas à atividade física de alto impacto e
administração de propranolol / Daniel Silva Gontijo Penha.
- - 2006.
65 f.: tab.; fig. + anexos.
Tese - Doutorado em Patologia - Universidade Federal
do Triângulo Mineiro, Uberaba.. MG, 2006.
Orientador: Luiz Carlos dos Reis
1. atividade física. 2. histomorfometria óssea. 3. ossos. 4.
propranolol I. Título. II. Reis, Luiz Carlos dos.
NLM - WE200
Introdução
Ossos
Apesar de sua aparência simples e estática, os ossos são estruturas
complexas que estão em constante remodelação, desempenhando uma
variedade de funções importantes: 1) proteção mecânica de tecidos e órgãos
nobres; 2) suporte estrutural para o corpo; 3) atuação como sistema de
alavancas, transformando as contrações musculares em movimentos úteis; 4)
armazenamento de minerais, como cálcio e fósforo, liberando-os para a
corrente sangüínea quando necessário; 5) alojamento da medula óssea, que
possui função hematopoiética (DOBLARÉ; GARCIA; GÓMEZ, 2004).
Classificação
Um indivíduo adulto possui em seu esqueleto cerca de 206 ossos que
podem ser classificados quanto à forma em seis categorias: 1) ossos longos,
que apresentam comprimento consideravelmente maior que a largura e
espessura; 2) ossos curtos, que possuem comprimento, largura e espessura
relativamente
equivalentes;
3)
ossos
laminares
ou
planos,
que
têm
comprimento e largura equivalentes, predominando sobre a espessura; 4)
ossos irregulares, cuja morfologia é complexa e não guarda relações com
formas conhecidas; 5) ossos pneumáticos, que possuem cavidades revestidas
de mucosa e que contém ar (sinus); 6) ossos sesamóides, geralmente
pequenos e chatos, encontrados dentro de tendões (DÂNGELO; FATTINI,
2000).
Estrutura Óssea
Externamente, os ossos são recobertos por uma membrana de tecido
conjuntivo denominada periósteo, que possui importante função na proteção,
nutrição, crescimento diametral do osso, na recuperação após fratura e que
funciona ainda como ponto de inserção de tendões e ligamentos. Internamente,
os ossos também são recobertos por uma membrana, chamada de endósteo,
que possui função importante na nutrição e remodelação óssea (DOBLARÉ;
GARCIA; GÓMEZ, 2004).
Um osso longo típico possui uma diáfise, duas metáfises e duas epífises.
A diáfise corresponde ao corpo do osso e possui forma cilíndrica com uma
cavidade que abriga a medula óssea em seu interior, chamada de canal
medular. As epífises correspondem às extremidades ósseas e são recobertas
de uma fina camada de cartilagem hialina, onde se articulam com outros ossos.
As metáfises representam a zona de transição entre a diáfise e as epífises. Nos
animais em crescimento, as metáfises possuem uma zona de aumento
longitudinal do osso, chamada de epífise de crescimento ou disco epifisário
(WEINER; WAGNER, 1998).
Cartilagem Hialina
A cartilagem hialina é o tipo mais abundante de cartilagem do corpo
humano. No adulto, além de recobrir as superfícies articulares dos ossos
longos, também pode ser encontrada em locais como traquéia, brônquios e
parede das fossas nasais. Nos indivíduos em fase de crescimento, a cartilagem
hialina forma os discos epifisários, responsáveis pelo crescimento longitudinal
do osso longo. Além disso, também forma o esqueleto do embrião, que
posteriormente é substituído por um esqueleto ósseo. A fresco, esse tipo de
cartilagem possui um aspecto branco-azulado e translúcido. (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004).
Tecido Ósseo
Na verdade, o tecido ósseo, assim como também o tecido cartilaginoso,
é uma subcategoria de tecido conjuntivo, com consistência rígida. Trata-se de
um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células e material
extracelular calcificado, a matriz óssea. Esta matriz, possui uma parte orgânica
formada por fibras colágenas (95%) constituídas de colágeno tipo I e por
pequena quantidade de proteoglicanas e glicoproteínas adesivas. Na parte
inorgânica são encontrados principalmente os íons cálcio e fosfato, mas
também há bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato em pequenas
quantidades. O cálcio e o fósforo formam cristais que possuem a estrutura da
hidroxiapatita, com a seguinte composição: Ca10(PO4)6(OH)2 (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004). A associação de colágeno com minerais é responsável
pelas características mecânicas do osso, que permitem sua função.
Tipos de Tecido Ósseo
Os ossos possuem pequenos espaços entre seus componentes, não
sendo, portanto, completamente maciços. Alguns desses espaços servem
como canais para vasos sangüíneos enquanto outros são preenchidos por
medula óssea. Dependendo do tamanho e da distribuição dos espaços, as
regiões de um osso podem ser classificadas como osso compacto, também
conhecido como cortical, ou osso esponjoso, também conhecido como
trabecular (WEINER; WAGNER, 1998).
Ao se observar a olho nu um osso seco serrado (Fig. 1), verifica-se a
presença de regiões praticamente sem cavidades visíveis, compostas de osso
compacto, e regiões com muitas cavidades intercomunicantes, compostas de
osso esponjoso (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
As epífises dos ossos longos são formadas por osso esponjoso
recoberto por uma fina camada de osso compacto. A diáfise é quase
totalmente compacta, possuindo uma pequena quantidade de osso esponjoso
em sua região mais profunda (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Osso
compacto
Osso
esponjoso
Fig. 1. Corte de osso seco, evidenciando o osso
compacto e esponjoso. Adaptado de Junqueira e
Carneiro, 2004.
Constituintes Celulares
No tecido ósseo, podem ser encontrados quatro tipos celulares
principais: 1) Células osteoprogenitoras ou pré-osteoblastos, que são derivadas
do mesênquima e são as únicas células ósseas capazes de divisão, podendo
posteriormente se diferenciar em osteoblastos. São encontradas na porção
interna do periósteo, no endósteo e nos canais ósseos que contém vasos
sanguíneos (SOMMERFELDT; RUBIN, 2001). 2) Osteoblastos, células
responsáveis pela produção da parte orgânica da matriz, geralmente
encontrados nas superfícies ósseas, formando um revestimento celular
cuboidal em um arranjo que lembra um epitélio simples. Possuem aparelho de
Golgi proeminente e citoplasma basófilo, rico em retículo endoplasmático,
indicando alta capacidade de síntese protéica (HARADA; RODAN, 2003). 3)
Osteócitos, que são células ósseas maduras originadas dos osteoblastos que
ficaram aprisionados na matriz. Possuem forma achatada e ficam situados no
interior de lacunas das quais partem canalículos. Dentro dos canalículos os
prolongamentos dos osteócitos estabelecem contatos através de junções
comunicantes, por onde podem passar pequenas moléculas de um osteócito
para outro. Possuem pequena quantidade de retículo endoplasmático e
aparelho de Golgi pequeno. Embora possuam pequena capacidade sintética,
são essenciais para a manutenção da matriz. Através de seus canalículos os
osteócitos permanecem conectados à superfície via prolongamentos celulares,
permitindo transferência de cálcio (TATE et al., 2004). 4) Osteoclastos, células
móveis, gigantes, multinucleadas, originadas da fusão de monócitos do
sangue, que, possuem grande número de mitocôndrias e lisossomos. São
capazes de produzir ácidos que solubilizam o cálcio e enzimas proteolíticas
que digerem a matriz óssea, sendo portanto importantes no processo de
reabsorção durante a remodelação óssea (ROODMAN, 1999).
Osteogênese
Existem dois tipos de processo de ossificação responsáveis pela
formação de todos os ossos do corpo: 1) ossificação intramembranosa e, 2)
ossificação endocondral. A ossificação intramembranosa é aquela que ocorre
no interior de uma membrana conjuntiva formada por células mesenquimais
condensadas e se caracteriza pela ausência de um molde cartilaginoso. É
responsável pela formação de ossos como escápula, esterno e ossos planos
do crânio. É importante também para o crescimento em espessura dos ossos
longos. A ossificação endocondral se caracteriza pela presença de um molde
cartilaginoso para o osso em desenvolvimento. É o tipo principal de ossificação
responsável pela formação dos ossos curtos e longos (SOMMERFELDT;
RUBIN, 2001).
Remodelação Óssea
O processo de remodelação do tecido ósseo envolve uma constante
transformação influenciada por fatores diferentes como hormônios ou
solicitação mecânica. O processo de adaptação microestrutural é conhecido
como remodelação óssea e pode ser dividido em remodelação interna, quando
ocorre uma mudança na distribuição dos componentes da matriz, ou
remodelação externa, quando ocorrem mudanças na geometria externa
(DOBLARÉ; GARCIA, 2002).
Wolff, em 1892, foi quem primeiro propôs o conceito “a forma segue a
função”, no que se refere ao tecido ósseo (apud TURNER, 1998). Segundo a
lei descrita por Wolff, as características geométricas dos ossos e a distribuição
de seus componentes são influenciadas pela magnitude e direção dos
estresses funcionais. Mais de um século depois, os parâmetros e influências
endógenas e exógenas aos quais o processo de remodelamento responde,
ainda não estão detalhadamente descritos. De qualquer forma, a lei de Wolff se
exterioriza
pelas
ações
dos
osteoclastos
e
osteoblastos,
que
estão
continuamente remodelando a matriz óssea (TURNER, 1998).
O fenômeno de remodelação é um processo contínuo que compreende
dois mecanismos sucessivos: primeiramente ocorre a reabsorção, feita pelos
osteoclastos, e em seguida a formação óssea, realizada pelos osteoblastos.
Durante o período de crescimento, enquanto o esqueleto aumenta de tamanho,
predomina a formação óssea. No indivíduo adulto jovem, o organismo atinge
um equilíbrio entre a quantidade de osso reabsorvido pelos osteoclastos e a
quantidade de osso formado pelos osteoblastos. Em torno da terceira década
de vida, é comum ter início o predomínio da reabsorção, que reduz
progressivamente a massa óssea (SEEMAN, 2003). O ciclo reabsorçãoformação ocorre de forma difusa e simultânea em diferentes focos do
esqueleto, através de pequenos conjuntos de células denominados basic
multicellular units ou unidades multicelulares básicas (FROST, 1991). A cada
momento cerca de 20% da superfície óssea total está sofrendo remodelação
(HILL; ORTH, 1998).
O processo de reabsorção depende da diferenciação e ativação dos
osteoclastos. Neste processo estão envolvidos mediadores como a citocina
RANKL (receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand) e o polipeptídio
CFS-1 (colony stimulating factor-1) (YASUDA et al., 1998; LACEY et al., 1998).
Juntos, o CFS-1 e a RANKL são suficientes para induzir a expressão de genes
característicos da linhagem osteoclástica, como os que codificam a TRAP
(tartrate-resistant acid phosphatase) e a CATK (catepsin K). Os préosteoclastos que são recrutados pela ação do CFS-1 e da RANKL se aderem
ao osso e passam por citodiferenciação para se tornarem osteoclastos
maduros. A RANKL estimula a ativação dos osteoclastos, induzindo a secreção
de prótons e enzimas líticas na zona de reabsorção, entre a superfície basal do
osteoclasto e o osso. Esta região é chamada de lacuna de Howship e consiste
de um vacúolo de reabsorção hermeticamente selado onde os osteoclastos
ativados depositam sua secreção ácida. A acidificação deste compartimento
leva à ativação da TRAP e CATK, que são as principais enzimas responsáveis
pela degradação da matriz mineral e orgânica (LI et al.,1999).
O processo de reabsorção óssea é bem mais rápido que o de formação.
A quantidade de osso reabsorvida em um período de três semanas leva
aproximadamente três meses para ser novamente formada. Após o período de
reabsorção, os osteoblastos depositam o material orgânico chamado de
osteóide, que será posteriormente mineralizado (HILL; ORTH, 1998).
Muitos fatores contribuem para o acoplamento entre a reabsorção e a
formação (FROST, 2001). Entre estes podem ser incluídos os fatores
estimuladores de formação óssea liberados durante a reabsorção, como os
fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF-I e II) e o fator de
crescimento transformante beta (TGF- beta). Outros fatores como o
paratormônio (PTH), prostaglandina classe E (PGE), fator de crescimento
fibroblástico (FGF) e também TGF-beta e RANKL, têm sido associados com a
estimulação tanto da reabsorção como da formação óssea (HARADA; RODAN,
2003).
Mecanotransdução
Fatores mecânicos também estão envolvidos com a modulação da
atividade dos osteoclastos e osteoblastos, estimulando ou inibindo sua
atividade de acordo com a demanda (PAVALKO et al., 2003).
O mecanismo de remodelação depende da percepção da demanda
funcional. A principal célula responsável pela detecção da tensão mecânica é
possivelmente o osteócito. O princípio da mecanotransdução, ou da tradução
do estímulo mecânico pelas células ósseas, envolve principalmente o fluxo do
fluido extracelular através do sistema lacuno-canalicular (TATE, 2004).
Quando um osso é submetido à sobrecarga mecânica, a deformação do
tecido provoca movimento do líquido intersticial pelo sistema lacunocanalicular, que é monitorado pelos osteócitos.
Ao contrário dos osteoblastos que são móveis, os osteócitos estão
aprisionados na matriz e mantém contato com células adjacentes através de
seus prolongamentos. Por meio destes prolongamentos, os osteócitos se
comunicam com osteoblastos e outros osteócitos, formando uma complexa
rede de informação que se assemelha com uma rede neuronal (KAMIOKA et
al., 2001).
Dessa forma, a informação referente à deformação mecânica detectada
pelo osteócito é repassada aos osteoblastos, que por sua vez aumentam sua
proliferação e síntese dos constituintes orgânicos da matriz (RAUCH;
SCHOENAU, 2001).
Atividade física de alto impacto
A eficácia de determinado exercício em estimular a formação óssea
parece depender de 3 fatores: 1) dinamismo da atividade; 2) estímulos de curta
duração e alta intensidade; 3) estímulos intervalados. (TURNER, 1998)
Dentre as atividades que promovem a formação óssea, a atividade de
alto impacto parece ser a mais eficaz, sendo a modalidade que mais se adapta
aos 3 fatores supracitados (TURNER, 1998; NOTOMI et al., 2000).
As atividades de alto impacto, como os saltos, possuem características
importantes. Essas atividades possuem um componente inicial de aceleração
provocado pela contração muscular vigorosa, que cria uma forte tensão sobre
os ossos, e um outro componente final, onde participam a desaceleração e
absorção de impacto, criando um segundo mecanismo gerador de forte tensão
(NAGASAWA; UEMURA, 2002).
Leptina
Estudos recentes indicam uma influência catabólica sistema nervoso
simpático sobre a massa óssea, através de receptores beta2-adrenérgicos
presentes nos osteoblastos (TAKEDA et. al., 2002, FLIER, 2002; ELMQUIST;
STREWLER, 2005). A via envolve a liberação de leptina, pelos adipócitos, que
através do hipotálamo ativa o simpático e provoca a liberação de
noradrenalina, que ao se ligar aos receptores beta2 provoca diminuição da
massa óssea, ao diminuir a atividade dos osteoblastos (FLIER, 2002).
Propranolol
Os antagonistas dos receptores beta-adrenérgicos foram inicialmente
descritos em 1958, uma década após Ahlquist ter postulado a existência dos
receptores beta-adrenérgicos. O primeiro composto descoberto foi um agonista
parcial chamado de dicloroisoprenalina, que um derivado da isoprenalina.
Novos desenvolvimentos conduziram à descoberta do propranolol, um
antagonista poderoso, com efeito bloqueador equivalente sobre receptores
beta1 e beta2, primeiramente identificado por James Black, em 1962
(AHLQUIST, 1948; POWEL; SLATER, 1958; BLACK, 1962; STAPLETON,
1997).
Ao bloquear os receptores beta2, o propranolol parece exercer atividade
osteogênica (TAKEDA, 2002). Os dados relativos aos efeitos do propranolol
sobre os ossos ainda são escassos, havendo a necessidade de novos estudos
sobre seus efeitos em ossos.
Apesar de existirem dados na literatura que comprovem a eficácia da
atividade física para aumentar a massa óssea e também surgirem novas
informações sobre a ação do propranolol sobre os ossos, não existem na
literatura dados que comparem as duas formas de estímulo potencialmente
osteogênico, ou que indiquem uma possibilidade de prevenção da osteoporose
através destes recursos, ao proporcionar maior pico de massa óssea em
fêmeas jovens.
Hipótese
Visto que a osteoporose é um processo patológico com grande
prevalência em indivíduos do sexo feminino, que maiores picos de massa
óssea durante a juventude podem ser importantes na prevenção da doença e
que existem condições onde a prática de exercícios não é possível,
formulamos o nosso trabalho partindo da suposição de que a administração de
propranolol pode minimizar a falta de atividade física em ratas jovens.
Objetivo
Considerando o efeito da atividade física e da administração de propranolol
na indução da formação óssea, e ainda que a obtenção de um maior pico de
massa óssea durante a juventude pode impedir a perda funcional com o
passar dos anos, realizamos o seguinte estudo com o objetivo de avaliar as
características histomorfométricas de ossos de ratas jovens submetidas à
atividade física de alto impacto e administração de propranolol.
Material e métodos
Animais
Foram utilizadas vinte e uma ratas jovens da linhagem Wistar (Fig.
2), provenientes do biotério da disciplina de Fisiologia da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro (UFTM). Os animais possuíam idade inicial de 40 dias e
foram separados por sorteio em três grupos experimentais (E, P e C), com 7
animais cada.
O grupo E foi submetido ao protocolo de exercícios de alto impacto,
5 dias por semana, durante 8 semanas. Cada sessão de exercícios consistia
em 20 saltos de uma altura pré-determinada (40 cm) e já descrita na literatura
(NAGASAWA; UMEMURA, 2002; HONDA et al., 2003).
O grupo P foi submetido ao tratamento com propranolol diluído na
água de beber em uma concentração de 0,5 g/l (LEVASSEUR et al., 2003), por
um período de 8 semanas, sendo que todos os animais deste grupo tinham
livre acesso à água.
Os animais do grupo C, ou grupo controle, não foram tratados com
propranolol nem submetidos aos exercícios.
Todos os animais foram mantidos no biotério de origem, com
temperatura mantida entre 20 e 23º C, umidade entre 40 e 70% e sob ciclo
claro-escuro 12h/12h
Fig. 2. Rata Wistar.
Coleta do material
A coleta dos ossos (fêmures e tíbias) foi realizada 8 semanas após o
início do protocolo. Para a coleta do material ósseo os animais foram
sacrificados
pela
exposição
a
ambiente
contendo
éter
anestésico,
permanecendo neste ambiente até que não fossem mais verificados
movimentos respiratórios. Após a retirada do frasco com vapor anestésico,
realizava-se a confirmação da ausência de batimentos cardíacos, sendo os
animais então pesados. Com auxílio do bisturi e tesouras era realizada incisão
na pata traseira dos animais, seguida de cuidadosa exposição da tíbia e do
fêmur pela desinserção e afastamento da musculatura e demais tecidos, até o
completo isolamento dos ossos (Fig. 3). Os ossos foram então desarticulados e
retirados, sendo colocados em frasco com solução de formol a 10%,
tamponado. Cada frasco recebeu um código numérico para identificação.
Fig. 3. Coleta dos ossos. A: incisão na pata traseira dos animais; Fig. B:
exposição da tíbia; Fig. C: exposição do fêmur; Fig. D: ossos
desarticulados e limpos.
Posteriormente, os fêmures foram seccionados transversalmente no
terço proximal e os fragmentos proximais foram mergulhados em líquido Bouin
por sete dias para fixação e descalcificação.
Depois de fixados, os fragmentos proximais retirados foram
desidratados em álcool com concentração crescente de 70% a 100%,
permanecendo no mínimo 2 horas em cada concentração. Após a
desidratação, os materiais foram diafanizados por pelo menos 2 horas em xilol,
incluídos em parafina quente (60ºC por 60 minutos), e em seguida foram
confeccionados os blocos. A microtomia foi realizada para a obtenção de cortes
de 5 μm de espessura. Os fragmentos foram capturados em lâminas de vidro
com polilisina e então processados para a análise. Foram utilizadas as
seguintes colorações: Hematoxilina-Eosina, Tricrômico de Masson Azul e
Picro-sírius.
Equipamento para histomorfometria
As medidas foram realizadas utilizando-se uma câmara de vídeo
acoplada a microscópio de luz comum que envia as imagens do microscópio a
um sistema analisador de imagens interativo (KS 300 Zeiss® , Kontron,
Germany).
Esse sistema é constituído basicamente por: um microscópio de luz
acoplado a uma câmara de vídeo colorida, um monitor de vídeo de alta
definição e uma unidade de processamento, com uma placa capturadora de
vídeo (Figura 4). A câmara de vídeo acoplada a microscópio de luz comum
envia as imagens do microscópio a um sistema analisador de imagens
interativo.
Fig. 4 Equipamento utilizado no estudo histomorfométrico.
Estudo histomorfométrico
De cada um dos 3 grupos (E,P e C) foram selecionadas 3 regiões para
análise dos fêmures esquerdos dos animais. A primeira região analisada foi a
cabeça do fêmur (CF), onde foi medida a espessura da cartilagem articular em
10 pontos eqüidistantes (Fig. 5A). A segunda região estudada foi a tábua óssea
externa ou lateral (TE), onde foram coletadas as medidas de espessura em 10
pontos eqüidistantes (Fig.5B). A terceira região estudada foi a tábua óssea
interna ou medial (TI), onde também foram coletadas medidas de espessura
em 10 pontos eqüidistantes (Fig.5C). Para todas as medidas as imagens foram
capturadas com o menor aumento (objetiva 4x).
A
B
C
Fig. 5. Exemplo de imagens utilizadas no estudo histomorfométrico (objetiva 4x).
Em A – Cabeça do fêmur; B – tábua externa; C – tábua interna.
Análise estatística:
Para a análise estatística foi elaborada uma planilha eletrônica. As
informações foram analisadas através do programa eletrônico Sigma Stat ®,
versão 2.0. Em seguida, as variáveis normais, homocedásticas, foram
analisadas utilizando-se testes paramétricos, na comparação entre dois grupos,
o teste "t" de Student; e na comparação entre três ou mais grupos a análise de
variância (ANOVA).
Quando
a
distribuição
não
foi
normal,
utilizamos
testes
não
paramétricos: na comparação entre dois grupos, o teste de Mann-Whitney, e na
comparação entre três ou mais grupos o teste de Kruskal-Wallis, geralmente
empregado para testar diferentes amostras provenientes da mesma população
ou de populações idênticas. Para verificar se um grupo apresentava diferenças
de outros grupos utilizamos o pós-teste de Tukey para comparação múltipla.
Foram consideradas estatisticamente significantes as diferenças em que p foi
menor que 5% (p<0,05).
Resultados
Os
valores
correspondentes
aos
resultados
das
análises
histomorfométricas dos fêmures estão apresentados nas tabelas adiante e
correspondem à mediana e valores máximo e mínimo de cada grupo. Já os
valores dos pesos corporais dos animais estão representados como média e
desvio padrão, pois apresentaram distribuição normal. As unidades utilizadas
para expressar os valores foram unidades do sistema internacional de
medidas.
Peso Corporal
Os animais foram pesados antes do início do protocolo e logo após
serem sacrificados para coleta dos ossos. Antes do início do protocolo, os
pesos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Após o
término do protocolo, o grupo propranolol apresentou peso corporal
significativamente menor em relação aos outros grupos. As médias ± desvios
padrões das médias dos pesos dos animais dos grupos controle e
experimentais estão apresentadas nas tabelas abaixo.
Grupo
Média
DP
EX
122
7,69
PROP
126
8,14
CTR
126
8,48
Tabela 1. Peso corporal (em gramas) dos animais antes do início do protocolo experimental.
Valores correspondentes à média e desvio padrão.
Grupo
Média
DP
EX
246
12,1
PROP
226,3 *
13,4
CTR
245
8,9
Tabela 2. Peso
dos animais ao término do protocolo.
*: diferente em relação ao controle (p<0,05).
Valores correspondentes à média e desvio padrão.
corporal (em gramas)
Morfometria
Cartilagem da cabeça femoral
Os valores obtidos na morfometria se encontram representados por
mediana, valor máximo e mínimo. Em cada amostra, foram coletados valores
em 10 pontos eqüidistantes. Os valores máximo e mínimo nas amostras são
geralmente bem diferentes em função da espessura variável da cartilagem, que
anatomicamente é mais espessa no ponto superior da cabeça femoral e mais
delgada nas regiões inferiores. Foram observadas diferenças significativas
entre a espessura da cartilagem do grupo exercício em relação ao controle,
mas não houve diferença estatística entre o grupo propranolol e controle ou
entre o grupo exercício e propranolol, pois o grupo propranolol obteve valores
intermediários, em média maiores que o controle e menores que o exercício,
mas não suficientemente altos para permitir diferença em relação ao controle,
ou suficientemente baixos para apresentar diferença em relação ao exercício.
Grupo
Mediana
Vmin
Vmax
EX*
0,633
0,232
1,12
PROP
0,645
0,203
0,830
CTR
0,481
0,194
0,938
Tabela 3. Espessura (em milímetros) da cartilagem articular da cabeça do fêmur. *: diferente
em relação ao controle (p<0,05).
Tábua óssea externa
Os valores obtidos na morfometria se encontram representados por
mediana, valor máximo e mínimo. Em cada amostra, foram coletados valores
em 10 pontos eqüidistantes. Os valores encontrados no grupo exercício são
significativamente maiores em relação ao grupo propranolol e controle. Ao se
comparar o grupo propranolol e controle, também foi observada espessura
significativamente maior no grupo propranolol.
GRUPO
Mediana
Vmin
Vmax
EX # *
0,652
0,492
0,804
PROP*
0,544
0,416
0,724
CTR
0,455
0,278
0,686
Tabela 4. Espessura (em milímetros) da tábua óssea externa do fêmur.
*: diferente em relação ao controle (p<0,05).
#: diferente em relação ao propranolol (p<0,05).
Tábua óssea interna
Os valores obtidos na morfometria se encontram representados por
mediana, valor máximo e mínimo. Em cada amostra, foram coletados valores
em 10 pontos eqüidistantes. Os valores encontrados no grupo exercício são
significativamente maiores em relação ao grupo controle. Os valores do grupo
propranolol também são significativamente maiores em relação ao controle.
Não houve diferença entre os valores encontrados no grupo exercício em
relação ao grupo propranolol.
GRUPO
Mediana
Vmin
Vmax
EX*
0,810
0,578
1,014
PROP*
0,737
0,512
0,955
CTR
0,515
0,371
0,726
Tabela 5. Espessura (em milímetros) da tábua óssea interna do fêmur.
*: diferente em relação ao controle (p<0,05).
Discussão
Para que os ossos cumpram sua função estrutural de forma eficaz, a
arquitetura óssea é continuamente remodelada. O processo de remodelação
óssea envolve a participação das células ósseas que provocam alterações na
distribuição dos constituintes da matriz e causam modificações na sua
geometria. Esse processo que provoca alterações da microestrutura e da
macroestrutura é contínuo e sofre influência de fatores como a sobrecarga
mecânica, ação de substâncias endógenas ou de fármacos, como o
propranolol.
O incrível efeito da sobrecarga mecânica sobre a arquitetura óssea se
tornou muito conhecido, sendo inicialmente postulado por Wolf em 1892 (apud
TURNER, 1998), com o conceito “forma segue função” que afirmava que as
características geométricas dos ossos e a distribuição de seus componentes
são influenciadas pela intensidade e direção dos estresses funcionais.
Entretanto, os mecanismos envolvidos na mecanotransdução, ou seja, na
tradução do sinal mecânico para que seja efetivada a adaptação, ainda estão
sob investigação, assim como a influência de outras vias para a adaptação
funcional ou patológica dos ossos.
Como o processo de remodelação óssea depende da ação das células
ósseas, é possível afirmar que a detecção do estímulo dependa de uma das
células ósseas, ou de células adjacentes que forneçam sinais químicos para a
reabsorção e formação ósseas.
No caso da mecanotransdução, existem vários pesquisadores que
afirmam que o osteócito é a principal célula responsável pela detecção dos
estímulos
mecânicos
e
que
podem
ser
consideradas
células
“mecanossensitivas” (MIKUNI-TAKAGAKI, 1999; SIKAVITSAS et al., 2001;
KLEIN-NULEND et al., 2005). Mas este fato não explica a resposta da
cartilagem articular. Dados mais recentes indicam que os condrócitos também
são capazes de perceber os estímulos mecânicos e responder com
proliferação e aumento da matriz extracelular (DESCHNER et al., 2003).
Em nosso estudo, pudemos verificar tanto a resposta do osso quanto da
cartilagem ao estímulo mecânico. Na cartilagem, os condrócitos provavelmente
percebem os sinais gerados durante a sobrecarga mecânica e provocam a
adaptação necessária, desde que a intensidade não seja exagerada e cause
lesão, ou desde que não haja uma lesão prévia (DESCHNER et al., 2003).
O aumento da espessura da tábua óssea no grupo submetido à
atividade física de alto impacto está de acordo com dados da literatura
(BASSEI; RAMSDALE, 1994; HEINONEN et al., 1999; FUCHS; SNOW, 2002).
A formação óssea possivelmente está relacionada com a maior tensão criada
durante o exercício (JUDEX; ZERNICKE, 2000). Durante o impacto, o fêmur
fica submetido a uma força de flexão, que cria na tábua interna uma tensão de
compressão com tendência à aproximação das duas extremidades, enquanto
na tábua externa, uma tensão de tração é criada, com tendência ao
distanciamento das duas extremidades ósseas (SRINIVASAN ; GROSS, 1999).
Ambas as tensões geram uma deformação temporária na matriz óssea,
que desencadeia a mecanotransdução, principalmente pela sensibilidade dos
osteócitos à movimentação do fluido intersticial através da rede lacunocanalicular e pela abertura de canais iônicos mecano-dependentes, permitindo
um influxo de cálcio (IQBAL; ZAIDI, 2005; KLEIN-NULEND et al., 2005). Os
osteócitos estão posicionados na matriz de forma a manter gap junctions com
os osteoblastos vizinhos e outros osteócitos, através de seus prolongamentos.
Através dessa rede de comunicação, os osteoblastos são estimulados a
aumentar a proliferação e síntese de osteóide (EHRLICH; LANYON, 2002).
Assim como o estímulo mecânico é capaz de aumentar a massa óssea,
a ausência de tais estímulos pode reduzir a massa. Um importante exemplo é o
dos indivíduos submetidos à imobilização prolongada de um membro ou
segmento corporal. A massa óssea diminui drasticamente com o passar do
tempo, fato que pode ser agravado pela idade avançada.
No caso de viagens espaciais, microgravidade também se torna um
problema para o esqueleto. A falta da sobrecarga mecânica no esqueleto dos
astronautas leva a um predomínio da reabsorção óssea, causando osteopenia
e osteoporose (VICO et al., 2000)
Nos últimos anos, o propranolol tem sido muito estudado por seus
efeitos sobre os ossos, principalmente pela possibilidade de ser usado para
minimizar os efeitos da imobilidade ou da microgravidade. Existem estudos que
afirmam não terem sido encontradas evidências de que o propranolol estimule
a formação óssea (REID et al. 2005), mas tais estudos geralmente foram
realizados em indivíduos em condições patológicas como deficiência hormonal
pós-menopausa. Outros pesquisadores indicam que os agonistas-beta
aumentam a reabsorção e os beta-bloqueadores promovem formação óssea
(TAKEDA, 2005). Os osteoblastos possuem receptores beta2, que quando
ativados reduzem a massa óssea através da diminuição do número e da
atividade destas células (TAKEDA, 2002).
Em nosso estudo, procuramos efeitos benéficos do propranolol sobre a
cartilagem e sobre a massa óssea e comparamos com a ação já bem
conhecida da atividade de alto impacto. Segundo nossos resultados, ação do
propranolol na dose administrada tem efeito osteogênico menor que a ação
mecânica, mas demonstra ótimas perspectivas como um mecanismo para
aumentar preventivamente a massa óssea ou minimizar a perda, evitando
doenças como a osteoporose ou reduzindo o risco de fraturas.
Além disso, o propranolol foi capaz de aumentar a massa óssea sem
aumentar o peso corporal. Na verdade, o peso corporal médio dos animais
submetidos à administração de propranolol foi significativamente menor que o
peso médio dos animais dos outros grupos.
A decisão de utilizarmos ratas jovens em nosso estudo, envolve, por um
lado, o fato de que quanto maior o pico de massa óssea, menor o risco de
osteoporose. Para isso é importante o estímulo durante a juventude. Por outro
lado, envolve o fato da osteoporose ser mais prevalente em indivíduos do sexo
feminino, tanto pela menor massa óssea quanto pelas alterações hormonais
pós-menopausa.
Ao demonstrar que o propranolol é capaz de aumentar a massa óssea
em animais jovens do sexo feminino, contribuímos para a investigação de
novas perspectivas para prevenção da osteoporose em uma população
mundial com expectativa de vida cada vez maior.
Resumo
Introdução: o aumento da expectativa de vida resultou no aumento da
incidência das doenças relacionadas ao envelhecimento. A osteoporose é uma
dessas doenças, sendo necessária a busca de novas estratégias para sua
prevenção e tratamento. Estudos recentes sugerem que o propranolol seria um
fármaco capaz de induzir aumento da massa óssea.
Objetivo: o presente estudo tem como o objetivo avaliar as
características histomorfométricas de ossos de ratas jovens submetidas à
atividade física de alto impacto, já reconhecida por sua propriedade
osteogênica, com a administração de propranolol.
Material e métodos: foram utilizadas vinte e uma ratas jovens da
linhagem Wistar, com idade inicial de 40 dias, separadas por sorteio em três
grupos experimentais (E, P e C) com sete animais cada. O grupo E foi
submetido ao protocolo de exercícios de alto impacto, cinco dias por semana,
durante oito semanas. O grupo P foi submetido ao tratamento com propranolol
diluído na água de beber, por um período de oito semanas. Os animais do
grupo C, ou controle, não foram submetidos aos exercícios nem tratados com
propranolol. Após o protocolo, os fêmures foram coletados e preparados para
análise histomorfométrica.
Resultados e discussão: os animais do grupo E apresentaram maior
espessura da tábua óssea, quando comparados aos outros dois grupos. No
entanto, os animais submetidos à administração de propranolol também
apresentaram maior espessura da tábua óssea, em relação ao controle,
indicando efeito osteogênico do fármaco (p<0,05).
Os dados encontrados sugerem que o propranolol é capaz de aumentar
a massa óssea em animais jovens do sexo feminino, criando perspectivas
favoráveis para a prevenção da osteoporose em uma população com
expectativa de vida cada vez maior.
Palavras-chave: atividade física, histomorfometria óssea, fisiologia
óssea, propranolol.
Abstract
Introduction: the higher life expectancy in population naturally brings the
augmentation of ageing-related diseases, such as osteoporosis, which justifies
a more intense search for prevention and treatment strategies. Recent studies
suggest that propranolol would be a beta-blocker capable of stimulating the
increase of bone mass.
Aim: this study aims to evaluate the histomorphometrical characteristics
of bones in young female rats that have been submitted to high-impact physical
activity, already known by its osteogenic property, under the administration of
propranolol.
Material and methods: twenty-one female rats from the Wistar lineage,
initially ageing forty days, have been used. They have been randomly separated
in three experimental groups (E, P and C) of seven animals each. Group E was
submitted to the protocol of high-impact exercise, five days a week, during eight
weeks. Group P was submitted to propranolol diluted in drink water, also during
eight weeks. Group C, the control group, has not been treated with propranolol
or exercises. The femurs were afterwards collected for histomorphometrical
analysis.
Results and discussion: the animals of group E presented higher bone
plates thickness than the other two groups. However, propranolol-treated rats
also presented thicker bone plates than the control group, which indicates
osteogenic effect of the drug (p<0.05).
Collected data suggest that propranolol is capable of expanding the
osseous mass in young female animals, creating favorable perspectives on the
prevention of osteoporosis for the ageing mankind.
Key-words: physical activity, bone histomorphometry, bone physiology,
propranolol.
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