UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS GTPASES RHO
EM CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL
MARCO AURÉLIO DE OLIVEIRA MARINHO
Uberaba
2012
1
MARCO AURÉLIO DE OLIVEIRA MARINHO
PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS GTPASES RHO
EM CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Patologia, área de
concentração “Patologia Geral”, da
Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para a
obtenção do título de doutor.
Orientadora: Profa. Dra. Virgínia Oliveira Crema
Coorientador: Prof. Dr. Eurípedes de Oliveira Marinho
Uberaba
2012
2
MARCO AURÉLIO DE OLIVEIRA MARINHO
PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS GTPASES RHO
EM CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Patologia, área de
concentração “Patologia Geral”, da
Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para a
obtenção do título de doutor.
______ de ___________ de _________.
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Virgínia Oliveira Crema – Orientadora
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Prof. Dr. Filipe Modolo Siqueira
Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Dr. Marcos Brasilino de Carvalho
Complexo Hospitalar Heliópolis – São Paulo
Profa. Dra. Beatriz Martins Tavares Murta
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Profa. Dra. Adilha Rua Micheletti
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
3
DEDICATÓRIA
4
Dedico
este
trabalho
aos
pacientes oncológicos de cabeça e
pescoço.
5
AGRADECIMENTOS
6
Ao meu pai, José de Oliveira Marinho Júnior e minha mãe, Maria do
Carmo Pereira Marinho, pela bênção de ter me acolhido em seu lar e me
conduzido até aqui.
Aos meus irmãos Rogério Marinho, Cybele Marinho e Andréa Marinho
pela amizade eterna.
Ao meu filho Nicholas M. S. Marinho, pelo amor incondicional.
À Profa. Dra. Virgínia Oliveira Crema, pela brilhante orientação e pelo
apoio durante todo o percurso da pós-graduação. Agradeço também pela
paciência a mim dedicada neste período. Acolheu-me como amiga, levantou-me
das quedas, estimulou-me nos momentos de dificuldade, iniciou meus passos no
interior de um laboratório e jamais deixou de prestar-me socorro, quando
solicitado. Meu profundo agradecimento.
Ao Prof. Dr. Eurípedes de Oliveira Marinho, meu estimado tio e
coorientador, pela gentileza de me ensinar tudo o que sou capaz de aprender
dentro da nossa especialidade: a cirurgia de cabeça e pescoço. Agradeço
também pelo apoio frente às atividades da disciplina na UFTM, durante a reta final
do meu trabalho. É o meu pai científico!
Aos meus queridos colegas de pós-graduação e de laboratório: Sergio,
Nanci, Simone, Fabrizio, Rodolfo, Leonor, Nayara, Leopoldo, André, Lair e
Nathália pelo amparo na resposta para as minhas dúvidas e pela amizade
sincera que se formou.
À Profa. Dra. Ana Cristina de Araújo Lemos pela importante colaboração
na revisão dos diagnósticos anatomopatológicos e às técnicas disciplina de
Patologia Especial pela confecção das lâminas.
Ao Prof. Dr. Marcos Brasilino de Carvalho, meu orientador na
dissertação de mestrado, pelo apoio e estímulos iniciais na minha vida de
pesquisador.
7
Às técnicas do laboratório Maria Aparecida Oliveira Tito, Luzia Maria
Eugênia e Ellen Silva de Sousa pelo sorriso constante ao nos prestar auxílio e
pela dedicação apresentada aos pós-graduandos.
Às secretárias da pós-graduação, Nelma e Denise, pela presteza e
atenção a mim dispensadas.
Aos professores que ministraram disciplinas, pelo grande ensinamento
que obtive, pela ampliação de meu conhecimento científico e pelas críticas
construtivas que recebi.
Aos meus pacientes, pela confiança.
À minha secretária Germana, pela enorme quantidade e qualidade de
trabalho a mim dedicado.
A todos os meus amigos fora do ambiente acadêmico, principalmente
aqueles da banda Outubro, pelas minhas ausências durante a realização deste
trabalho.
Finalmente, porém jamais menos importante, agradeço, do fundo do meu
coração, à Natalee Gonçalves Freitas. Graças a Deus eu a conheci e hoje posso
desfrutar de seu amor e convívio diários.
8
APOIO FINANCEIRO
•
Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG)
•
Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU)
9
RESUMO
10
O carcinoma epidermoide oral (CEO) é uma doença que ocupa a oitava
posição na incidência geral de câncer na população mundial, com altas taxas de
mortalidade e morbidade. Seu tratamento ainda está baseado na cirurgia, na
radioterapia e na quimioterapia. As GTPases Rho já foram descritas como
proteínas
importantes
para
vários
processos
biológicos
envolvidos
na
carcinogênese, como a proliferação e a migração celular em vários tecidos. Este
estudo visou avaliar o padrão de expressão das GTPases Rho (RhoA, RhoB,
Cdc42 e Rac1) em CEO. Foi realizada imunohistoquímica pela técnica da avidinabiotina-peroxidase para RhoA, RhoB, Cdc42 e Rac1 e a intensidade de
imunomarcação quantificada em 83 casos de CEO diagnosticados na UFTM no
período de 1984 a 2007. Os casos foram classificados de acordo com
Organização Mundial de Saúde em: bem diferenciado, moderadamente
diferenciado e pouco diferenciado. A expressão de RhoA variou de forma
diretamente proporcional à diferenciação tumoral (p<0,0001), sugerindo seu
envolvimento na regulação de diferenciação em CEO. Embora tenha havido
diferença entre os graus de diferenciação (p<0,0001), RhoB não parece participar
da
regulação
da
diferenciação
celular
em
CEO.
Cdc42
apresentou
imunomarcação inversamente proporcional ao grau de diferenciação celular,
quanto menos diferenciada a lesão e maior o potencial de proliferação, maior a
expressão de Cdc42 (p<0,0001), sugerindo seu envolvimento na regulação da
proliferação celular. Não houve diferença na expressão de Rac1 entre os graus de
diferenciação, no entanto, as células no fronte migratório expressaram Rac1,
indicando sua participação na regulação da migração celular. O padrão de
expressão das proteínas RhoA, RhoB, Cdc42 e Rac1 sugere que essas GTPases
Rho podem participar de vias de transdução de sinal reguladoras de processos
biológicos envolvidos na patogênese de CEO.
Palavras-chave: GTPases Rho, carcinoma epidermoide oral, diferenciação
celular.
11
ABSTRACT
12
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is ranked eighth in the overall
incidence of cancer in the world with high mortality and morbidity rates. Treatment
is still based on surgery, radiotherapy and chemotherapy. The small Rho GTPases
have been described as proteins related to various phenomena such as
tumorigenesis, cell proliferation and migration in many tissues. This study aimed to
evaluate the expression pattern of Rho GTPases (RhoA, RhoB, Rac1 and Cdc42)
in OSCC. Immunohistochemistry by avidin-biotin-peroxidase was performed for
RhoA, RhoB, Rac1 and Cdc42 and intensity of stain quantified in 83 cases of
OSCC from the Federal University of Triângulo Mineiro at the period from 1984 to
2007. The cases were classified according to World Health Organization: well
differentiated, moderately differentiated and poorly differentiated groups. The
expression of RhoA varied in direct proportion to tumor differentiation (p <0.0001),
suggesting their involvement in the regulation of CEO differentiation. Although
there was difference between the degrees of differentiation (p <0.0001), RhoB
does not seem to participate in the regulation of cellular differentiation in CEO.
Cdc42 showed stain inversely proportional to the degree of cell differentiation, the
less differentiated the lesion and the greater the potential for proliferation,
increased expression of Cdc42 (p <0.0001), suggesting their involvement in
regulation of cell proliferation. No differences in expression between Rac1 degree
of differentiation, however, at the front migratory cells expressed Rac1, indicating
its involvement in the regulation of cell migration. The expression of RhoA, RhoB,
Rac1 and Cdc42 suggests that Rho GTPases may participate in signal
transduction
pathways
regulating
biological
processes
involved
in
the
pathogenesis of oral squamous cell carcinoma.
Keywords: Rho GTPases, oral squamous cell carcinoma, cell differentiation
13
LISTA DE FIGURAS
14
Figura 1. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo o gênero. ................................................................................................ 52
Figura 2. Média de idade dos pacientes portadores de carcinoma
epidermoide oral, total e por gênero, no Hospital de Clínicas da UFTM no período
de 1984 a 2007. .................................................................................................... 53
Figura 3. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo a cor. ...................................................................................................... 53
Figura 4. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo a localização do tumor............................................................................ 54
Figura 5. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo o grau de diferenciação histológica do tumor. ........................................ 54
Figura 6. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo a utilização regular de tabaco. ................................................................ 55
Figura 7. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo a utilização regular de bebidas alcoólicas. ............................................. 55
Figura 8. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo o tipo morfológico da lesão. .................................................................... 56
15
Figura 9. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo o estádio clínico. ..................................................................................... 56
Figura 10. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007,
segundo o tratamento empregado. ....................................................................... 57
Figura 11. Padrão de Expressão da GTPase RhoA em Carcinoma
epidermoide oral. .................................................................................................. 59
Figura 12 Comparação de expressão da GTPase RhoA em carcinoma
epidermoide oral em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral
no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007. ............................. 59
Figura 13. Padrão de Expressão da GTPase RhoB em Carcinoma
epidermoide oral. .................................................................................................. 61
Figura 14. Comparação do padrão de Expressão da GTPase RhoB em
carcinoma epidermoide oral em pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007. . 61
Figura 15. Padrão de Expressão da GTPase Cdc42 em carcinoma
epidermoide oral. .................................................................................................. 63
Figura 16. Comparação do padrão de Expressão da GTPase Cdc42 em
carcinoma epidermoide oral em pacientes diagnosticados com carcinoma
epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007. . 63
Figura 17. Padrão de Expressão da GTPase Rac1 em carcinoma
epidermoide oral. .................................................................................................. 64
16
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
17
AH – Ácido hialurônico
BD – Bem Diferenciado
CEO – Carcinoma epidermoide oral
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
COX-2 – Ciclo-oxigenase 2
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
EGF – Fator de Crescimento Epidérmico
EGFR – Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico
FAK – Kinase de Adesão Focal
FGF – Fator de Crescimento de Fibroblasto
GAPs - GTPase-activating Proteins
GDIs - Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitors
GDP – Guanosina Difosfato
GEFs - Guanine Nucleotide Exchange Factors
GGT1 – Geranilgeraniltransferase 1
GPCR - Receptor Acoplado à Proteína-G
GTP – Guanosina Trifosfato
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
HSG – Human Salivary Glands
18
INCA – Instituo nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
LPA – Ácido Lisofosfatídico
MD – Moderadamente Diferenciado
MEC – Matriz Extracelular
MMP – Metaloproteinase
OMS – Organização Mundial de Saúde
PAKs - P21-activated kinases
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase
PD – Pouco Diferenciado
PI3 Kinase - Fosfatidilinositol 3-Kinase
Rho – Ras Homology
RNA – Ácido Ribonucleico
ROCK – Rho Kinase
S-1P – 1 Fosfato Esfingosina
Shh - Sonichedgehog
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
TNM – Classificação Tumor Nódulo Metástase
UFTM – Universidade Federal do Triângulo Mineiro
VEGF – Fator de Crescimento Endotelial Vascular
19
SUMÁRIO
20
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 23
1.1
INCIDÊNCIA ............................................................................................ 24
1.2
CARCINOGÊNESE.................................................................................. 26
1.3
ETIOPATOGENIA .................................................................................... 28
1.4
ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICOS ............................................ 31
1.5
TRATAMENTO ........................................................................................ 34
1.6
PREVENÇÃO .......................................................................................... 36
1.7
GTPASES RHO ....................................................................................... 37
1.8
GTPASES RHO NO CEO ........................................................................ 41
2. HIPÓTESE ........................................................................................................ 43
3. OBJETIVOS...................................................................................................... 45
3.1
OBJETIVO GERAL .................................................................................. 46
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 46
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 47
4.1
CASUÍSTICA ........................................................................................... 48
4.2
ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ............................................................... 48
4.3
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA........................................................ 49
4.4
REAGENTES ........................................................................................... 49
4.5
REAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA ........................................................... 49
21
4.6
AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA .............................................................. 50
4.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 50
4.8
OBSERVAÇÃO E OBTENÇÃO DE IMAGENS ........................................ 50
5. RESULTADOS ................................................................................................ 51
5.1
CARACTERIZAÇÃO DA CASUÍSTICA.................................................... 52
5.2
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RHOA EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL 58
5.3
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RHOB EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL 60
5.4
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE CDC42 EM CARCINOMA
EPIDERMOIDE ORAL .......................................................................................... 62
5.5 PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RAC1 EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL .................................................................................................................... 64
6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 65
7. CONCLUSÕES ................................................................................................. 81
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 83
ANEXOS ............................................................................................................. 112
ANEXO 1. PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFTM. ....... 113
ANEXO 02. CARACTERIZAÇÃO DOS CASOS ESTUDADOS
DIAGNOSTICADOS COM CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL NO HOSPITAL
DE CLÍNICAS DA UFTM NO PERÍODO DE 1984 A 2007. ................................. 120
22
1. INTRODUÇÃO
23
1.1
INCIDÊNCIA
O carcinoma epidermoide oral (CEO) ocupa, em média, a oitava posição na
incidência geral de câncer na população mundial, sendo o terceiro mais comum
na região centro-sul da Ásia. Compreende de 2% a 6% de todas as doenças
malignas nos países ocidentais e de 30% a 40% no subcontinente indiano. É mais
frequente nos afroamericanos e hispânicos do que nos caucasianos. Esta
incidência elevada na Índia provavelmente ocorre devido ao hábito de se utilizar
produtos não fumados à base de tabaco (LLEWELLYN et al., 2001).
Cerca de 500.000 pessoas são afetadas por esta doença em todo o mundo
(GLAZER et al., 2009). Somente nos Estados Unidos da América, o CEO é
responsável por cerca de 8000 mortes anuais. No diagnóstico inicial, 36% dos
pacientes tem doença localizada, 43% tem doença com disseminação regional
(comprometimento de linfonodos cervicais) e 9% apresentam metástase à
distância (MASSANO et al., 2006). Os indivíduos afroamericanos do gênero
masculino possuem mortalidade significativamente mais elevada, quando
comparados com os correspondentes o feminino, com índice de sobrevida em
cinco anos substancialmente menor (KALMAR, 2006). Em outros países como a
Bélgica, a Dinamarca, a Grécia, Portugal e Escócia, há uma tendência ao
aumento do número de novos casos de CEO (LA VECCHIA et al., 2004).
Na América do Sul, o CEO ocupa o quinto lugar entre os homens e sexto
lugar entre as mulheres. Os homens brasileiros só perdem em incidência para os
homens da França e da Índia (WUNSCH-FILHO e DE CAMARGO, 2001).
Segundo o Instituto Nacional do Câncer, a estimativa para novos casos de
tumores de cavidade oral para o ano de 2012 é de cerca 10 para cada 100.000
homens (9.990 novos casos) e de cerca de 04 para cada 100.000 mulheres
(4.180 novos casos), (INCA, 2011). O CEO ocorre predominantemente na
população masculina, aparecendo em idades mais precoces do que na população
feminina, talvez pelo fato de os homens consumirem mais álcool e utilizarem mais
produtos com tabaco (DE CARVALHO et al., 2001).
24
Das doenças malignas da cavidade oral, o CEO corresponde a mais de
90% (CHEN, 2001). Outras incluem as neoplasias de glândulas salivares,
sarcomas, linfomas, melanoma e doenças metastáticas (KALMAR, 2006). Cerca
de 90% dos casos de CEO possuem como sítios primários o assoalho da boca, a
região ventral-lateral da língua e o palato mole (BROUMAND et al., 2006). O CEO
de língua é o mais comum da cavidade oral, correspondendo a cerca de 20-40%,
devido à sua rica rede linfática e sua estrutura altamente vascularizada, as
invasões e metástases tumorais são mais frequentes (LIM, 2006).
Os pacientes com CEO de língua e assoalho de boca possuem risco
aumentado para o aparecimento de segundo tumor primário, cancerização em
campo ou múltiplos tumores primários (THOMSON, 2002). O risco para o
desenvolvimento de um segundo CEO primário varia de 4,3% a 30% (JONES et
al., 1994). Isto demonstra um comportamento local agressivo, relacionado à falta
de barreiras anatômicas para a sua disseminação e a propensão às metástases
cervicais (AROSARENA et al., 2006). O local mais frequente de aparecimento de
metástases à distância é o pulmão (BETTENDORF et al., 2004).
Apesar de toda a pesquisa e dos avanços nos campos da oncologia e da
cirurgia nas cinco últimas décadas terem melhorado a qualidade de vida dos
pacientes, os índices gerais de mortalidade por CEO não foram alterados
(BETTENDORF et al., 2004; MASSANO et al., 2006; HOOPER et al., 2009). Os
índices de sobrevida global e sobrevida livre de doença permanecem em torno de
56% e 58%, respectivamente (BELL et al., 2007).
A maioria dos pacientes portadores de CEO se encontra na sexta ou
sétima décadas de vida. Apenas 0,4% a 6% desses tumores aparecem em
indivíduos abaixo de 45 anos de idade (IYPE, 2004; BROUMAND et al., 2006). A
maioria dos casos de CEO em indivíduos abaixo de 45 anos pode ser também
atribuída aos efeitos conjuntos de tabaco e álcool (GILLISON, 2007). Entretanto,
gênero e idade não parecem apresentar diferenças significativas quanto ao
prognóstico (LO, 2003).
25
As condições socioeconômicas estão intimamente relacionadas com a
incidência de CEO (LEITE e KOIFMAN, 1998). Em 2010, alguns autores
obtiveram dados sobre renda, educação, características demográficas, frequência
de visitas ao cirurgião dentista por ano e hábito de fumar de pacientes portadores
de câncer de cabeça e pescoço nos Estados Unidos e no Canadá. Concluíram
que tais tumores são mais incidentes em indivíduos de baixa renda, que visitam o
cirurgião dentista menos que uma vez ao ano, com menor tempo de educação
escolar e tabagistas (JOHNSON et al., 2010).
Dados semelhantes foram obtidos no Brasil, com o sangramento gengival,
a falta de cuidados odontológicos e o uso de colutórios orais à base de álcool
mostrando-se como fatores associados ao CEO, a despeito do consumo de
tabaco ou álccol (MARQUES et al., 2008). O baixo nível educacional e a profissão
de trabalhos manuais também estão relacionado ao maior risco de desenvolver
CEO no Brasil (BOING et al., 2011).
1.2
CARCINOGÊNESE
Está claro que a biologia molecular do carcinoma epidermoide de cabeça e
pescoço é muito complexa e se desenvolve a partir da disfunção de várias vias
inter-relacionadas. Não há um mecanismo ou uma molécula que seja
isoladamente responsável pela carcinogênese (GLAZER et al., 2009).
A progressão do tumor ocorre de forma multifatorial e em vários graus,
demonstrando que uma avaliação de múltiplos marcadores deve ser logicamente
requerida para as estimativas de resultados finais (MASSANO et al., 2006). O
crescimento tumoral resulta de um desequilíbrio entre a proliferação e a apoptose,
sendo influenciado pela angiogênese, enquanto que o potencial metastático é
influenciado pelas alterações nas interações célula-célula e célula-matriz
extracelular (BETTENDORF et al., 2004).
26
Aberrações cromossômicas 3, 9, 11, 13 e 17 são as mais comumente
encontradas em CEOs (MASSANO et al., 2006). A instabilidade genômica
(aneuploidia) é fator importante para a carcinogênese oral; indivíduos com
tumores advindos de lesões aneuploides possuem prognóstico acentuadamente
pior (SUDBO, 2004). Os CEOs apresentam até 90% de lesões com aneuploidia,
comparados a 17% nas lesões pré-malignas (ABOU-ELHAMD e HABIB, 2007).
O gene supressor de tumor p53 apresenta expressão elevada em CEOs
com menor diferenciação; mutações nesse gene estão intimamente relacionadas
com fatores ambientais, como o tabagismo (FERLITO et al., 2006). Espécimes de
CEOs ressecados com margens histológicas negativas e com p53 mutado
positivo em uma das margens resultou em cerca de 38% de recidiva local
(BRENNAN et al., 1995).
Deleções dos genes 16p e 9p21 estão associadas à progressão da
doença; a perda de heterozigose aumenta o índice de recorrência e piora o
prognóstico (MASSANO et al., 2006). Tumores bem diferenciados de cabeça e
pescoço apresentam deleções dos cromossomos 3p, 5q e 9p e ganho em 3p;
tumores pouco diferenciados apresentam deleções de 4q, 8p, 11q, 13q, 18q e 21q
e ganhos em 1p, 11q, 13q, 19q e 22q (BOCKMUHL et al., 1998).
A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)
está presente em uma frequência de 30% dos CEOs e associada a quadros de
evolução desfavorável devido à sua associação com estádio clínico do tumor
primário e estádio patológico avançado, modo de invasão difuso e alta incidência
de metástases linfonodais (BETTENDORF et al., 2004). O bloqueio de EGFR por
uso de drogas leva à potencialização da apoptose, inibição de angiogênese, da
invasão celular tumoral e da formação de metástases (MAO et al., 2004).
Os proto-oncogenes da família Ras estão envolvidos na sinalização celular
via ligação de GTP e uma proteína ligante (p21), que traduzem sinais mitogênicos
da superfície celular para componentes citoplasmáticos. Alguns membros da
família
Ras
de
oncogenes
demonstraram
super-expressão
no
CEO
27
(YARBROUGH et al., 1994). Em 15% de todos os tumores humanos são
encontrados oncogenes H-ras ou K-ras mutados, enquanto que 55% dos
cânceres de lábio apresentam mutação de H-ras (BETTENDORF et al., 2004).
Várias outras proteínas foram estudadas quanto ao seu valor prognóstico
para o CEO; dentre elas, Ki-67, FAS, c-MYC, ciclina D1, PIK3CA, TRAILR1, ATM,
RUNX3, MGMT, GLUT-1, TAOS1, a família de proteínas SIBLING, o fator de
crescimento do hepatócito, CD44, NFkβ, STAT, Wnt, TGF-β, AKT, PTEN, mTOR
e a proteína ligante do ácido graxo epidérmico, além de outras, indicando uma
preocupação mundial com a descoberta de marcadores para a doença (BAGAN e
SCULLY, 2008; LORCH et al., 2009; MOLINOLO et al., 2009).
A superexpressão de ciclo-oxigenase 2 (COX-2) pode estar associada a
tumores com maiores índices de disseminação regional e à distância, menor
tempo de sobrevida livre de doença e até resistência ao tratamento radioterápico
(MADAULE et al., 1998; KIM e ORD, 2003; TERAKADO et al., 2004). Um inibidor
de COX-2, o celecoxib, é altamente eficaz e seguro para a inibição das células
cancerosas orais em camundongos, quando administrado precocemente,
sugerindo uma atividade preventiva no CEO (WANG et al., 2002).
1.3
ETIOPATOGENIA
A ingestão de álcool e o uso de tabaco são fatores de risco independentes
para o CEO, sendo esse risco de 3 a 9 vezes maior para o indivíduo que fuma ou
bebe e até 100 vezes maior para aqueles que possuem os dois vícios (NEVILLE,
2002). O maior fator de risco para o CEO entre não alcoólatras é o tabagismo e
entre os não fumantes é o alcoolismo (ZNAOR, 2003). O risco elevado de CEO
proveniente do hábito de fumar parece advir de alterações no balanço entre
ativação e reparo do dano ao DNA promovido pelos carcinógenos relacionados ao
tabaco (GILLISON, 2007).
28
O hábito de fumar e/ou ingerir bebidas alcoólicas ainda aumenta
significativamente a chance do aparecimento de um segundo tumor primário (DAY
et al., 1994; HALL, 2000). O tabagismo aumenta também o risco de periodontites
em quatro vezes, elevando os níveis de bactérias patogênicas na microflora oral
(JOHNSON, 2001). O hábito de mascar betel, planta preparada com tabaco para
mascar comum na Índia, está relacionado à maior incidência e pior prognóstico
(LO, 2003). O betel pode acelerar da migração tumoral através do estímulo de
expressão de metaloproteinase de matriz 8 (MMP-8), (LIU et al., 2007).
O histórico familiar positivo de CEO pode representar uma sensibilidade
herdada aos efeitos tóxicos aos genes de agentes mutagênicos presentes no
tabaco e dos metabólitos do álcool (GILLISON, 2007). O CEO de lábio é a única
apresentação da doença que não está relacionada diretamente ao tabagismo;
está relacionada à exposição à luz solar (KALMAR, 2006).
Vários outros fatores de risco já foram relacionados ao carcinoma
epidermoide de cabeça e pescoço, tais como a falta de higienização da boca, o
refluxo gastroesofágico, fatores dietéticos, inalação de gases provenientes de
material de pintura e gasolina, além do hábito de consumir maconha (MAO et al.,
2004; GILLISON, 2007).
O comportamento sexual parece exercer influência na incidência do CEO.
Para o gênero masculino, os fatores relacionados ao maior risco são: idade
precoce na primeira relação sexual, número de parceiros sexuais durante a vida,
histórico de úlceras genitais e hábito da prática de sexo oral. Para o gênero
feminino, o fator importante é o número de parceiros (GILLISON, 2007).
Indivíduos com menos de 55 anos de idade e com histórico de comportamento
sexual de alto risco tem maior probabilidade de apresentar carcinomas HPVpositivos (SMITH, 2004).
A falta de higiene oral parece ser um fator de risco independente para o
CEO, já que os pacientes portadores dessa doença geralmente se apresentam
com dentes cariados e periodontite (HOOPER et al., 2009). A periodontite
29
aumenta estatisticamente o risco para o CEO pouco diferenciado de cavidade oral
(TEZAL et al., 2009). O número de dentes perdidos é um importante indicativo de
risco elevado para CEO (LISSOWSKA et al., 2003).
A maneira pela qual as infecções bacterianas podem causar câncer ainda
não está elucidada. Sabe-se que as bactérias podem interferir nos mecanismos
de sinalização, induzir a proliferação celular e inibir a apoptose (LAX e THOMAS,
2002). Bactérias podem ativar substâncias químicas carcinogênicas. Alguns
microrganismos, como espécies de Streptococcus e Neisseria, podem converter
etanol em acetaldeído, substância altamente carcinogênica (HOOPER et al.,
2009). Certas cepas resistentes de Staphylococcus aureus podem induzir a
formação de mediadores da inflamação, como o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α); este fator está intimamente implicado na carcinogênese oral. É
necessário, entretanto, chegar a uma conclusão se o controle dessas bactérias
pode afetar a incidência do CEO (MEURMAN, 2010).
Alguns vírus estão associados ao CEO. O papiloma vírus (HPV),
especialmente os subtipos 16 e 18 (MILLER e JOHNSTONE, 2001) e o herpes
vírus, subtipos 1 e 2 (SHILLITOE, 2009), já foram descritos como participantes na
carcinogênese oral, possivelmente devido à sua relação com a regulação
genética. Os tumores de cavidade oral e faringe com detecção de fração de DNA
do HPV parecem apresentar melhor prognóstico do que aqueles HPV-negativos
(SCHWARTZ et al., 2001).
A associação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) com o CEO ainda
carece de maiores estudos. Estados de imunodeficiência associados ao consumo
de álcool e tabaco representam fatores de risco para o CEO em pacientes
infectados pelo HIV (EPSTEIN et al., 2005). Um estudo realizado com 539
pacientes com CEO entre 1985 e 1994 identificou 4,5% dos pacientes como HIV
positivos. Os pacientes HIV positivos eram significativamente mais jovens, tiveram
tumores primários maiores, estádios mais avançados da doença e pior sobrevida,
quando comparados com os HIV negativos (SINGH et al., 1996).
30
Algumas infecções fúngicas podem estar associadas ao CEO. A Candida
albicans já foi encontrada em maiores quantidades em biofilmes da superfície de
CEO em relação a sítios controle saudáveis (HOOPER et al., 2009). Leucoplasias
infectadas por Candida parecem ter maior probabilidade de transformação
maligna do que outros tipos (REIBEL, 2003). Compostos de nitrosamina
produzidos por espécies de Candida podem ativar oncogenes específicos e iniciar
o desenvolvimento de uma lesão maligna (HOOPER et al., 2009).
1.4
ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICOS
A suspeita de CEO deverá ser levantada em qualquer paciente com lesão
única da cavidade oral que persista por mais de três semanas. A apresentação
clínica dessas lesões precoces é comumente na forma de eritroplasia e/ou
leucoplasia. A lesão é bem demarcada e apresenta áreas de endurecimento à
palpação. As características clínicas das lesões avançadas incluem ulcerações,
nodulações e fixação aos tecidos subjacentes (BAGAN et al., 2010).
A dor é um sintoma presente em cerca de 30% a 40% dos pacientes
portadores de CEO (BAGAN et al., 2010). Outros sintomas relacionados ao CEO
são a otalgia, sangramentos, mobilidade dentária, problemas respiratórios,
dificuldades na fala, disfagia, trismo, parestesias e problemas com uso de
próteses (HAYA-FERNANDEZ et al., 2004).
Ocasionalmente, os pacientes podem se apresentar ao exame inicial
apenas com linfadenomegalia cervical, sem quaisquer outros sintomas. Há
relação direta entre o tamanho da lesão e o aparecimento de ulceração,
sangramento e linfadenopatia. Nos estádios terminais podem aparecer fístulas
cutâneas, hemorragias maiores, anemia severa e caquexia (BAGAN et al., 2010).
O CEO pode apresentar-se com sinais e sintomas menos comuns, como
dormência na região mentoniana, dificuldade de cicatrização após extração
dentária ou grande perda de peso (SCULLY e BAGAN, 2009).
31
O sítio anatômico do tumor também está ligado ao prognóstico, com os
tumores mais posteriores da cavidade oral evoluindo menos satisfatoriamente
(LEITE e KOIFMAN, 1998). Isto pode ser explicado pela diferença das redes
vasculares e linfáticas nos vários sítios da cavidade oral (MASSANO et al., 2006).
O estadiamento TNM, apesar de muito criticado, exerce enorme influência
no prognóstico do CEO, sendo que os estádios mais avançados correspondem a
pior evolução clínica e a um pior prognóstico (GONZALES-MOLES, 2002). A
presença de um linfonodo metastático reduz a sobrevida em 50% (GENDEN et
al., 2003). Quanto maior o número de linfonodos metastáticos, pior o prognóstico
(MASSANO et al., 2006).
O extravasamento capsular do linfonodo está associado a maiores índices
de recorrência, de metástases à distância e menor sobrevida (FERLITO et al.,
2002; GREENBERG, 2003). Quando há extravasamento capsular, ocorre um
decréscimo na sobrevida de 29% a 60%, assim como aumento nos índices de
metástases regionais (SHINGAKI et al., 2003).
Evidências sugerem que o grau de diferenciação do tumor esteja
correlacionado com o prognóstico; tumores mal diferenciados tendem a
apresentar pior evolução (LO, 2003). A presença de invasão perineural pode estar
correlacionada com maior probabilidade de metástases regionais e distantes,
maior profundidade de invasão tumoral, pior grau de diferenciação e menor índice
de sobrevida em cinco anos (RAHIMA et al., 2004).
A angiogênese no CEO está relacionada com os parâmetros de
estadiamento T e N e é um fator preditivo independente de recorrência tumoral,
além de ser um fator prognóstico confiável (BETTENDORF et al., 2004). O fator
de crescimento endotelial vascular (VEGF), importante para a formação de novos
vasos sanguíneos, é um componente chave na angiogênese tumoral. Encontra-se
super estimulado no fronte de invasão tumoral, indicando ter um papel importante
no desenvolvimento de metástases (SHINTANI et al., 2004).
32
A exploração convencional da cavidade oral (incluindo inspeção e
palpação) constitui o padrão ouro para o diagnóstico de CEO. A biopsia e o
exame histopatológico representam o estudo indispensável para a identificação
de novos casos da doença (SEOANE LESTON e DIZ DIOS, 2010). A investigação
do fronte de invasão tumoral nos CEOs está baseada no acesso aos parâmetros
histológicos qualitativos, como o grau de queratinização, o polimorfismo nuclear, o
padrão de invasão e a infiltração linfocitária local (BANKFALVI e PIFFKO, 2000).
Os exames de imagem devem ser realizados como complemento da
avaliação clínica e para o estadiamento do tumor primário e dos linfonodos
regionais (SEOANE LESTON e DIZ DIOS, 2010).
Algumas críticas foram levantadas quanto ao exame histopatológico padrão
para o diagnóstico dos carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço:
incapacidade de revelar células com mutação nas margens cirúrgicas
aparentemente livres de doença; falha no reconhecimento de tumores
genotipicamente diferentes com fenótipos idênticos, o que poderia afetar o
prognóstico, já que certas mutações genéticas podem ser preditivas de
comportamento ou prognóstico. A partir desse raciocínio, as técnicas de
diagnóstico moleculares como a reação em cadeia de polimerase (PCR),
hibridização in situ, hibridização in situ fluorescente, análise da instabilidade
microssatélite e da perda de heterozigose, a hibridização genômica comparativa,
a PCR transcriptase reversa, os microensaios de DNA e de RNA, a análise
microfluídica e a imunohistoquímica tem absorvido atenção maior nas últimas
décadas (BILODEAU et al., 2010).
Os biomarcadores moleculares, os painéis de detecção genética e os
tratamentos específicos tem se tornado uma realidade no cuidado de pacientes
com carcinomas de cabeça e pescoço (GLAZER et al., 2009). Também foram
desenvolvidos estudos sobre a participação da angiogênese (LIU, S. Y. et al.,
2008) e do fator de crescimento de fibroblasto (FGF) também foram
desenvolvidos (TANAKA et al., 2006).
33
Um estudo recente avaliou a presença de alguns genes relacionados a
tumores nas margens de peças cirúrgicas de CEO e houve positividade para pelo
menos um desses genes em 38% dos casos estudados. A identificação desses
genes nas margens cirúrgicas de pacientes portadores de CEO poderia ser útil no
reconhecimento de pacientes com um maior risco de desenvolver um segundo
tumor primário ou recorrência local e ainda auxiliaria o cirurgião na delineação da
extensão da ressecção do tumor e no planejamento da terapia adjuvante (DE
CARVALHO et al., 2012).
Os avanços no diagnóstico molecular sugerem que marcadores proteicos
de alterações pré-cancerosas podem ser detectados antes que as lesões
mucosas clinicamente aparentes sejam identificáveis. Se essa promessa de um
pré-diagnóstico puder ser realizada, a detecção precoce de pacientes com risco
para CEO inicial ou recorrente será possível e aumentará as esperanças de
redução na morbidade e na mortalidade (KALMAR, 2006).
Em termos práticos, os fatores com maior influência na evolução da doença
são o estadiamento, o extravasamento capsular, a espessura tumoral e margens
cirúrgicas livres de doença. O futuro recairá sobre a melhor compreensão da
biologia molecular tumoral (MASSANO et al., 2006).
Em resumo, a avaliação ideal para um indivíduo com CEO deve incluir uma
história com exame físico geral, exame detalhado da cabeça e do pescoço,
diagnóstico histopatológico, avaliação radiográfica e a coleta de dados do estado
psicossocial (PATEL e SHAH, 2005).
1.5
TRATAMENTO
A melhor opção de tratamento para os tumores iniciais e avançados ainda
é a cirurgia, podendo ser substituída pela radioterapia nos estádios I e II e
complementada pela radioterapia e/ou quimioterapia nos estádios III e IV
(BETTENDORF et al., 2004). Para o CEO de estádio inicial, a cirurgia constitui o
34
melhor e talvez o único tratamento a ser instituído. Mas alguns autores relatam
taxa de recorrência de 11,5%, mesmo para CEOs iniciais com margens cirúrgicas
livres ao exame anatomopatológico e sem complementação com radioterapia ou
quimioterapia (HUANG et al., 2010).
O tratamento cirúrgico local pode produzir comprometimentos funcionais
significativos para a fala, a deglutição, a mastigação, a saúde dentária e a
reintegração social. Deve ser considerado como um dos tratamentos mais
desfigurantes
e
debilitantes entre
todos
aqueles
envolvendo
o
câncer
(MIGNOGNA et al., 2001).
O esvaziamento cervical é o tratamento de escolha para os casos de CEO
com metástases regionais e pode estar indicado mesmo em pacientes sem a
presença de linfonodos cervicais palpáveis (CHENG e SCHMIDT, 2008). As
metástases ocultas para o CEO variam de 20% a 45% (ZBAREN et al., 2006). O
tratamento eletivo do estádio N0 pode prevenir recorrências e a necessidade de
uma cirurgia mais radical (FERLITO et al., 2006), mas os critérios para sua
indicação ainda merecem mais estudos (CHENG e SCHMIDT, 2008). Na
presença de linfonodos positivos, o tratamento do pescoço torna-se imperativo
(CARLSON e MILLER, 2006). Entretanto, esse procedimento é fonte de
complicações pós-operatórias significantes, como a disfunção da cintura
escapular (KERAWALA, 2010).
A identificação do linfonodo sentinela utilizando a linfocintilografia pode
diminuir a agressividade dessa cirurgia (MASSANO et al., 2006). A pesquisa do
linfonodo sentinela é um método potencial para o estadiamento das metástases
loco-regionais do CEO, principalmente quando o primário estiver localizado na
língua (KESKI-SANTTI et al., 2008).
O tratamento vigente para o CEO pode causar problemas. A cirurgia mutila
a anatomia dos tecidos; a radioterapia leva à diminuição da salivação por lesão
irreversível das glândulas salivares, mucosite e retração cicatricial tecidual; a
35
quimioterapia afeta fatores defensores locais e sistêmicos, podendo promover
infecções (MEURMAN e GRONROOS, 2010).
A associação de agentes quimioterápicos com radioterapia de forma
concomitante pode aumentar a sobrevida, porém às custas de elevada toxicidade
(MURPHY e CMELAK, 2006; BHIDE e NUTTING, 2010). Por este motivo, a
indústria farmacêutica tem focado no desenvolvimento de drogas que atuem em
componentes moleculares das células, codificados ou regulados por oncogenes
ou genes supressores de tumor. Sabe-se, entretanto, que os comportamentos das
células não são regulados por uma série linear de comandos, mas por redes de
interações moleculares (INGBER, 2008).
A terapia com inibidores da angiogênese tem se tornado uma estratégia
importante para o tratamento do câncer (HIDA e KLAGSBRUN, 2005). As células
endoteliais tumorais possuem características diferentes das células endoteliais
normais: aneuploidia, instabilidade cromossômica, ausência de pontos de
checagem no ciclo celular; as células endoteliais tumorais devem tornar-se o
principal alvo deste tipo de terapia (HIDA et al., 2008).
1.6
PREVENÇÃO
Várias estratégias de prevenção do aparecimento do CEO já foram
traçadas: a interrupção dos hábitos de alto risco (particularmente o uso de
tabaco), o tratamento adequado das lesões predisponentes e instalação de
programas de campanhas populacionais (KURIAKOSE e SHARAN, 2006).
Atualmente
emprega-se,
em
alguns
serviços
especializados,
a
quimioprevenção, que consiste na administração de agentes para bloquear ou
reverter a carcinogênese oral, obtendo redução ou eliminação de lesões précancerosas e diminuição na incidência de segundo tumor primário. Vários agentes
têm sido estudados para esse fim, a saber: os retinóides, o beta-caroteno, a
vitamina E e os inibidores de COX-2. Entretanto, outro grande estudo europeu
36
não demonstrou benefício da quimioprevenção em termos de sobrevida global,
sobrevida livre de doença ou índice de segundos tumores primários (VAN
ZANDWIJK et al., 2000).
Um estudo randomizado realizado na Índia com acompanhamento de mais
de 190.000 pessoas conseguiu detectar uma redução de 32% na mortalidade em
indivíduos de alto risco, no grupo de homens usuários de tabaco e álcool. Esses
dados sugerem que a avaliação visual da cavidade oral de pacientes de alto risco
poderia prevenir aproximadamente 40.000 mortes por ano decorrentes de CEO
em todo o mundo (SANKARANARAYANAN et al., 2005).
Dados alarmantes demonstraram que somente 34% de um grupo de 129
odontólogos brasileiros conseguiriam identificar as características clínicas comuns
do CEO e somente 11% poderiam identificar os agentes etiológicos responsáveis
pela doença (LEAO et al., 2005).
1.7
GTPASES RHO
Diversas proteínas sinalizadoras, como fatores de crescimento e proteínas
da matriz extracelular, ativam vias de sinalização que regulam a proliferação,
diferenciação, adesão e a formação de processos ricos em actina associados à
migração celular e apoptose. Estes processos biológicos são regulados por
GTPases Rho (Ras-Homology GTPases) em outros tipos celulares. Proteínas
pertencentes a essa família Rho regulam ainda vias de transdução de sinal em
células eucariontes normais envolvidas na morfogênese e citodiferenciação,
migração, polarização celular, adesão célula-célula e célula-matriz extracelular
(ETIENNE-MANNEVILLE e HALL, 2002).
Cerca de 20 proteínas Rho foram identificadas e classificadas em cinco
subgrupos, de acordo com sua sequência primária e suas funções conhecidas:
Rho-like, Rac-like, Cdc42-like, Rnd e RhoBTB. Membros menos conhecidos e não
37
incluídos nesta classificação são RhoD, Rif e RhoH/TTF (BURRIDGE e
WENNERBERG, 2004).
No subgrupo Rho-like (Ras homologous) estão as isoformas RhoA, RhoB e
RhoC. Embora existam muitas semelhanças em sua regulação e funções,
algumas diferenças funcionais entre essas isoformas têm sido descritas no
crescimento; enquanto RhoA e RhoC são promotoras, RhoB tem função inibitória
(CHEN et al., 2000). As proteínas do subgrupo Rac-like (Ras-related C3
botulinumtoxinsubstrate1)
estimulam
a
formação
de
lamelipódios,
como
inicialmente descrito para Rac1 (RIDLEY et al., 1992). Rac1 e RhoG são
amplamente expressas, enquanto Rac2 e Rac3 estão restritas aos tecidos
hematopoiético e nervoso, respectivamente (HAATAJA et al., 1997; BURRIDGE e
WENNERBERG, 2004).
Todas as isoformas do subgrupo Cdc42 (Cell division cycle 42) estimulam a
formação de filopódios (KOZMA et al., 1995; NOBES e HALL, 1995). TC10 e TCL
estão envolvidas em eventos metabólicos mediados pela insulina (CHIANG et al.,
2002). Wrch1 tem sido envolvida na via de sinalização de Wnt (TAO et al., 2001),
enquanto o papel de Chp/Wrch2 permanece desconhecido (BURRIDGE e
WENNERBERG, 2004). No subgrupo Rnd, Rnd1 e Rnd2 são expressas no
cérebro, enquanto Rnd3 e RhoE são amplamente expressas mas em baixas
quantidades, sendo reguladas pela sinalização de Ras/Raf (HANSEN et al.,
2000). A função de RhoBTB1 e RhoBTB2, do subgrupo RhoBTB, não é conhecida
(BURRIDGE e WENNERBERG, 2004).
RhoA, Rac1 e Cdc42 são as proteínas Rho mais bem caracterizadas e
amplamente expressas. Em fibroblastos, RhoA é responsável pela formação de
feixes contráteis de actina e miosina (fibras de estresse) e adesões focais, já
Rac1 e Cdc42 regulam a formação de lamelipódios e filopódios, respectivamente
(HALL, 1998). Entretanto, a participação dessas proteínas pode variar de acordo
com o tipo celular e composição da matriz extracelular (CHIOU et al., 2003).
38
Similarmente a outras GTPases, as proteínas Rho ciclam entre uma forma
ativa ligada ao GTP e uma forma inativa ligada ao GDP. Esse ciclo é regulado por
Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs), que estimulam a troca do GDP
pelo GTP e por GTPase-activating Proteins (GAPs), que catalizam a hidrólise do
GTP e, consequentemente, inativam as proteínas Rho. Vários GEFs que ativam
membros da família Rho, como Tiam-1, Dbl, Ost e Vav, são oncogenes
conhecidos (CERIONE e ZHENG, 1996). Proteínas inativas formam complexos
com GDP-dissociation Inhibitors (GDIs) no citosol, enquanto as proteínas ativadas
interagem com várias proteínas efetoras na fração de membrana (TAKAI et al.,
2001).
O principal estímulo ativador da família Rho é o receptor acoplado à
proteína-G (GPCR). GPCRs usam G-Alpha12 ou G-Alpha13 para transdução de
sinal dos receptores de ácido lisofosfatídico (LPA) e 1-fosfato esfingosina (S-1P) e
hormônios ativadores de Rho. Além do GPCR, as integrinas também ativam as
GTPases Rho (RIDLEY, 1997; VAN AELST e D'SOUZA-SCHOREY, 1997;
KJOLLER e HALL, 1999; BISHOP e HALL, 2000; HAKOSHIMA et al., 2003;
JAFFE e HALL, 2005).
As integrinas ativam as GTPase Rho, assim como aperfeiçoam a ativação
do fator de crescimento através da atuação sobre as membranas celulares. As
integrinas agem também na ativação de fosfatidilinositol 3-kinase (PI 3-kinase),
possivelmente através de kinase de adesão focal (FAK) para promover a
polimerização e reorganização dos filamentos de actina através tanto diretamente
quanto através de uma variedade de vias de sinalização (RIDLEY, 1997; VAN
AELST e D'SOUZA-SCHOREY, 1997; KJOLLER e HALL, 1999; BISHOP e HALL,
2000; RIDLEY, 2001; HAKOSHIMA et al., 2003; JAFFE e HALL, 2005;
BOURDON et al., 2006; BRAZIER et al., 2006; OLEKSY et al., 2006; TSAI e
JIANG, 2006)
Uma abordagem amplamente aceita para o estudo dessas proteínas é
utilização da Toxina A de Clostridium difficile, capaz de inibir todas as GTPases
pela glicosilação de um resíduo treonina (LERM et al., 2000). A ativação de
39
integrinas, receptores de fatores de crescimento ou de receptores acoplados a
proteínas G leva ao estímulo de um ou mais GEFs, que estimulam as GTPases
Rho. As respostas celulares resultam da interação das proteínas Rho com
diferentes proteínas efetoras (ETIENNE-MANNEVILLE e HALL, 2002; BURRIDGE
e WENNERBERG, 2004).
Vias de sinalização que são reguladas por membros da família Rho
desempenham um papel importante em várias doenças, incluindo câncer,
doenças autoimunes e infecções bacterianas (RIDLEY, 1999; BISHOP e HALL,
2000; RIDLEY, 2001; SAHAI e MARSHALL, 2002; ASPENSTROM et al., 2004;
JAFFE e HALL, 2005; MERAJVER e USMANI, 2005; KANDPAL, 2006;
HEASMAN e RIDLEY, 2008).
Previamente, em células tronco adultas, Human Salivary Gland (HSG)
provenientes de ducto intercalar, demonstrou-se que as proteínas Rho
desempenham um papel essencial na formação acinar estimulada pela matriz
extracelular (Matrigel®) e por fatores de crescimento como o EGF, bFGF e
também pelo LPA (CREMA et al., 2006).
Na reorganização do citoesqueleto, foram identificados diversos efetores
das proteínas Rho propriamente ditas, como Rho kinase (ROCK) (AMANO et al.,
1996; KIMURA et al., 1996), citronkinase (MADAULE et al., 1998) e PI P 5-kinase
(CHONG et al., 1994). Proteínas efetoras de Rac1 e Cdc42 como as P21activated kinases (PAKs) (TEO et al., 1995), PI 3-Kinase (WYMANN e PIROLA,
1998), WASP (SYMONS et al., 1996) e IQGAP (KURODA et al., 1998) também
atuam no citoesqueleto. As proteínas Rho regulam a formação das fibras de
estresse da actina e a geração de forças contráteis baseadas na actina e miosina
nas células. Rac e Cdc42 estão relacionadas à dinâmica da actina no bordo das
células migratórias e associadas com a formação de lamelipódios e filopódios
(KEELY, 2001).
Previamente, em células HSG, foi demonstrado, por meio da utilização de
inibidores: Toxina A de Clostridium difficile (GTPases Rho), Y-27632 (ROCK),
40
Wortmannin e LY294002 (PI 3-kinase), que durante a formação acinar, Rac1 e
Cdc42 são importantes na regulação da migração celular, enquanto RhoA
participaria principalmente da polimerização de actina no córtex celular (CREMA
et al., 2006).
1.8
GTPASES RHO NO CEO
O papel das GTPases Rho no desenvolvimento e progressão de
neoplasias
permanece
pouco
conhecido,
especialmente
no
carcinoma
epidermoide oral. Alguns trabalhos relatam o papel das GTPases Rho na
proliferação
e
diferenciação
celular,
função
como
fatores
prognósticos,
participação na invasão e migração celular. Contudo, ainda existem divergências
entre os papéis das proteínas Rho na promoção e regulação do câncer
(ABRAHAM et al., 2001; KITAJO et al., 2003; FARIED et al., 2006; KLEER et al.,
2006; FARIED et al., 2007; PATEL et al., 2007; ZHANG et al., 2007; LAI et al.,
2008; LIU, L. et al., 2008; ISLAM et al., 2009; KARLSSON et al., 2009; JIANG et
al., 2010).
Existem evidências contundentes do papel essencial da atividade da via de
sinalização das GTPases Rho em processos relacionados com o câncer, como
proliferação e migração celular, sobrevivência, crescimento e progressão das
células neoplásicas. A via de sinalização das GTPases Rho interage com
diferentes cascatas de sinalização oncogênica, como Ras e Wnt, contribuindo
com vários aspectos da tumorigênese (BOETTNER e VAN AELST, 2002;
MALLIRI e COLLARD, 2003). Alguns membros da família Rho e alguns de seus
efetores podem ser indicadores diagnósticos potenciais para a doença maligna
(ABRAHAM et al., 2001).
RhoA, Rac2 e Cdc42 estão superexpressos em carcinomas epidermoides
de cabeça e pescoço, assim como em linhagens de células deste tipo de tumor
(ABRAHAM et al., 2001). Recentemente, foi relatado um aumento na expressão
41
de Rac1 em apenas 15 casos de CEO; contudo, ainda não foi estabelecida uma
correlação entre o padrão de expressão e a graduação histopatológica ou
prognóstico (LIU et al., 2004). Mesmo carcinomas epidermoides moderadamente
diferenciados elevam as concentrações de Rho e Rac, o que sugere que estas
moléculas possam se tornar marcadores da progressão tumoral (KEELY, 2001).
Quanto à proteína ROCK, efetora de RhoA e RhoB, sua inibição atenuou a
proliferação celular induzida por Sonichedgehog (Shh) em linhagem de CEO
(NISHIMAKI et al., 2004). A sinalização intracelular de Shh é parcialmente
mediada pela família G12 de proteínas G heterotriméricas, seguida pela ativação
da GTPase RhoA e seu efetor downstream ROCK (KASAI et al., 2004).
A proteína PI 3-kinase, efetora de Rac1/Cdc42, parece estar envolvida em
processos biológicos da carcinogênese, uma vez que foi relatada uma
imunorreatividade em carcinomas orais invasivos; o tecido epitelial normal e
displásico não expressaram PI 3-kinase (STAHL et al., 2004). Além disso, a
ativação de uma proteína downstream da PI 3-kinase, a serina/treonina kinase Akt
(reguladora do crescimento de células normais e cancerosas), foi correlacionada
com a progressão de carcinomas de pele de camundongos e em linhagens
celulares
de
carcinoma
epidermoide
de
cabeça
e
pescoço
(AMORNPHIMOLTHAM et al., 2004).
.
42
2. HIPÓTESE
43
As GTPases Rho podem participar de vias de transdução de sinal reguladoras de
processos biológicos envolvidos na patogênese de carcinoma epidermoide oral.
44
3. OBJETIVOS
45
3.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar o padrão de expressão das GTPases Rho (RhoA, RhoB, Cdc42 e Rac1)
em carcinoma epidermoide oral.
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Verificar se a amostra estudada é adequada para a realização deste estudo,
por meio da revisão dos prontuários.
2. Comparar o padrão de expressão da GTPase RhoA com a diferenciação
celular (bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado)
em carcinoma epidermoide oral, por imunohistoquímica in situ.
3. Comparar o padrão de expressão da GTPase RhoB com a diferenciação
celular (bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado)
em carcinoma epidermoide oral, por imunohistoquímica in situ.
4. Comparar o padrão de expressão da GTPase Cdc42 com a diferenciação
celular (bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado)
em carcinoma epidermoide oral, por imunohistoquímica in situ.
5. Comparar o padrão de expressão da GTPase Rac1 com a diferenciação
celular (bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado)
em carcinoma epidermoide oral, por imunohistoquímica in situ.
46
4. MATERIAL E MÉTODOS
47
4.1
CASUÍSTICA
Foram estudados 83 casos de Carcinoma epidermoide oral. Os casos
arquivados em blocos de parafina no serviço de Patologia foram obtidos de
indivíduos submetidos a biopsia incisional ou excisional no Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), no período de 1984 a 2007.
Foi realizada a pesquisa do histórico da doença dos pacientes em seus
respectivos prontuários. Foram excluídos os casos com material insuficiente par
confecção de lâminas. Este Projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) da UFTM (Protocolo n° 804), (Anexo 1).
4.2
ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Os casos foram revistos e diagnosticados por uma mesma patologista, de
acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS). Os seguintes critérios foram
utilizados para a graduação histopatológica (BARNES, 2005):
 Carcinoma bem diferenciado: observação de diferenciação celular; células com
abundante citoplasma eosinófilo, queratinização proeminente, em células
isoladas ou a formação de pérolas córneas.
 Carcinoma moderadamente diferenciado: células semelhantes às epiteliais,
sem evidência de diferenciação escamosa; células com citoplasma escasso,
menos pontes intercelulares e menos queratinização; são vistas variações no
tamanho e na forma das células; os núcleos apresentam pleomorfismo e são
hipercromáticos; podem ser encontradas algumas figuras de mitoses.
 Carcinoma pouco diferenciado: as células apresentam pouca semelhança com
as epiteliais; pode ser observada grande quantidade de pleomorfismo celular e
atipias nucleares; ausência de queratinização e de pontes intercelulares, além
de altas taxas de mitoses típicas ou atípicas.
48
4.3
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA
Cortes histológicos de quatro µm de espessura do material de biopsia de
carcinoma epidermoide oral, previamente incluído em blocos de parafina, foram
obtidos em micrótomo (Leica®, Nussoloch, Alemanha) em lâminas pré-cobertas
com Poly-y-lisine® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
4.4
REAGENTES
Para as reações de imunohistoquímica foram utilizados os anticorpos
primários policlonais de coelho anti-RhoA (sc-179), coelho anti-RhoB (sc-180),
coelho anti Rac1 (sc-217) e coelho anti-Cdc42 (sc-87), que foram obtidos da
Santa Cruz BiotechnologyInc (Santa Cruz, CA, EUA). Os reagentes 3,3ʹdiaminobenzidine (DAB), os sais, Triton X-100 e o peróxido de hidrogênio foram
obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O soro não imune de cabra e o
anticorpo secundário de cabra anti-IgG de coelho biotinilado foram obtidos da
Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PENN, EUA).
4.5
REAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
Os experimentos foram realizados em duplicata. Após desparafinização e
hidratação dos cortes com tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 (PB), foi feito o bloqueio
da peroxidase endógena com solução H2O2 20 vol/metanol 1:1 por 10 minutos. O
bloqueio dos sítios específicos foi feito com soro não imune de cabra, na diluição
1:10 em PB/triton X-100 0,2%, durante uma hora em câmara úmida à temperatura
ambiente (TA). A incubação com os anticorpos primários de coelho contra Rho-A,
Rho-B, Rac1 e Cdc42 foi feita na diluição 1:50 em PB/triton X-100 0,2%, em
câmara úmida à TA, durante cerca de 16 horas. Após lavagem com PB, as
amostras foram incubadas com os anticorpos secundários de cabra anti-coelho na
diluição 1:200 em PB/triton X-100 0,2%, por uma hora e 30 minutos à TA. Após
49
lavagem com PB, os cortes foram incubados com o complexo avidina-biotinaperoxidase (Kit ABC-Elite®) por duas horas em câmara úmida. A reação foi
evidenciada com DAB. Para os controles negativos foi omitido o anticorpo
primário. A contra coloração foi feita com hematoxilina de Harris por 30 segundos.
As lâminas foram desidratadas e montadas com Entellan®.
4.6
AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA
As células de Carcinoma epidermoide oral marcadas foram analisadas em
toda extensão do corte histológico. A intensidade da marcação foi considerada
negativa (-), marcação: fraca (+), moderada (++) ou intensa (+++) de acordo com
a impregnação da substância cromógena.
4.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados da morfometria foram analisados com o programa Graphpad
InStat®. Através do teste de Kolmogorov-Smirnov, as variáveis foram testadas
para verificar a normalidade da distribuição. Foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis
e pós-teste Método de Dunn para a comparação múltipla entre os grupos
estudados. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
4.8
OBSERVAÇÃO E OBTENÇÃO DE IMAGENS
As avaliações das reações imunohistoquímicas foram realizadas em
microscópio Axiophot (Zeiss®). Com as imagens obtidas foram montadas figuras
com o programa Photoshop 7.0.1®.
50
5. RESULTADOS
51
5.1
CARACTERIZAÇÃO DA CASUÍSTICA
Foi realizado o levantamento do número de casos de Carcinoma
epidermoide de cavidade oral submetidos à biopsia no Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro no período de 1984 a 2007. Neste
período foram realizadas 97.609 biopsias, das quais foram identificados 83 casos
de carcinoma epidermoide de cavidade oral.
Os dados para a caracterização da casuística foram obtidos por meio de
revisão dos prontuários dos 83 pacientes com carcinoma epidermoide oral (Anexo
2).
Quanto ao gênero, 73% (n=61) eram homens e 27% (n=22) eram mulheres
(Figura 1).
27%
Feminino
73%
Masculino
Figura 1. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo o gênero.
52
A média de idade dos pacientes foi de 59,15 ± 14,55 anos, sendo de 57,38
± 14,73 anos para o gênero masculino e de 64,33 ± 12,97 anos para o gênero
feminino (Figura 2).
100
Idade (anos)
80
60
40
20
0
Total
Masculino
Feminino
Figura 2. Média de idade dos pacientes portadores de carcinoma epidermoide oral, total e
por gênero, no Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007.
Quanto à cor, 77% (n=64) dos pacientes eram brancos, 21% (n=17) eram
não brancos e 2% (n=2) não foram informados (Figura 3).
2%
21%
Branco
Não branco
77%
Não informado
Figura 3. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo a cor.
53
Quanto à localização do tumor, 46% (n=38) localizaram-se no lábio, 15%
(n=12) na gengiva, 15% (n=12) na língua, 11% (n=9) no assoalho, 7% (n=6) no
palato e 6% (n=5) na mucosa oral (Figura 4).
6%
7%
11%
15%
15%
Assoalho
Gengiva
Lábio
Língua
Mucosa oral
46%
Palato
Figura 4. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo a localização do tumor.
Quanto ao grau de diferenciação histológica do tumor, 53% (n=44) eram
moderadamente diferenciados, 29% (n=24) eram bem diferenciados, 16% (n=13)
eram pouco diferenciados e 2% (n=2) eram indefinidos (Figura 5).
16%
2%
29%
Bem diferenciado
Moderadamente
diferenciado
Pouco diferenciado
53%
Indefinido
Figura 5. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo o grau de diferenciação
histológica do tumor.
54
Quanto ao tabagismo, 60% (n=50) dos pacientes relataram uso regular de
tabaco, 11% (n=9) negaram uso regular de tabaco e em 29% (n=24) não havia
descrição no prontuário (Figura 6).
29%
Sim
60%
11%
Não
Não informado
Figura 6. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo a utilização regular de
tabaco.
Quanto ao etilismo, 40% (n=33) dos pacientes relataram consumo regular
de bebidas alcoólicas, 17% (n=14) negaram o uso e em 43% (n=36) dos casos
não havia registro nos prontuários (Figura 7).
40%
43%
Sim
Não
17%
Não informado
Figura 7. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo a utilização regular de
bebidas alcoólicas.
55
Quanto ao tipo morfológico da lesão encontrada, 63% (n=52) eram
ulceradas, 12% eram vegetantes (n=10), 10% (n=8) eram úlcero-vegetantes, 3%
(n=3) eram nodulares, 1% (n=1) era nodular ulcerada e em 11% (n=9) não havia
registro nos prontuários (Figura 8).
11%
3%
1%
Nodular
12%
Nodular ulcerada
10%
Ulcerada
Úlcero-vegetante
63%
Vegetante
Não informado
Figura 8. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo o tipo morfológico da
lesão.
Quanto ao estádio clínico, 33% (n=27) eram doenças em estádio I, 4%
(n=3) em estádio II, 6% (n=5) em estádio III, 8% (n=7) em estádio IV e em 49%
(n=41) não havia registro nos prontuários (Figura 9).
33%
I
49%
II
8%
6%
4%
III
IV
Não informado
Figura 9. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo o estádio clínico.
56
Quanto à profissão, 19 eram lavradores, 14 do lar, cinco domésticas, cinco
aposentados, quatro pedreiros, três prestadores de serviços gerais, dois
carpinteiros, dois ferroviários, um vendedor, um jardineiro, um servente, um
porteiro, um servidor público, um tratorista, um gráfico, um pintor, um técnico
têxtil, um militar, um mecânico, um agricultor, um motorista, um serralheiro, um
auxiliar de escritório, um vigilante, um sapateiro, um encanador, um autônomo e
em 10 casos não havia relato nos prontuários.
Quanto ao tratamento empregado, 46% (n=38) foram submetidos à
cirurgia, 4% (n=3) a radioterapia e/ou quimioterapia e em 50% (n=42) dos casos
não havia registro nos prontuários (Figura 10).
46%
Cirurgia
50%
Radioterapia e/ou
Quimioterapia
4%
Não informado
Figura 10. Distribuição dos pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no
Hospital de Clínicas da UFTM no período de 1984 a 2007, segundo o tratamento
empregado.
Em apenas 28 dos 83 casos estudados houve informação sobre a
sobrevida, dois quais oito eram CEO bem diferenciados, 15 eram CEO
moderadamente diferenciados e cinco eram CEO pouco diferenciados. Dentre os
28 casos, 16 pacientes tiveram sobrevida maior que cinco anos, sendo sete
diagnosticados como CEO bem diferenciado, sete como CEO moderadamente
diferenciado e dois como CEO pouco diferenciado.
57
5.2
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RHOA EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL
Nos casos de carcinoma epidermoide oral, a proteína RhoA foi vista
intensamente marcada nas células neoplásicas das lesões bem diferenciadas
(BD), moderadamente marcada nas lesões moderadamente diferenciadas (MD) e
fracamente marcadas nas lesões pouco diferenciadas (PD), (Figura 11).
A avaliação morfométrica da intensidade de imunoexpressão de RhoA
mostrou diferença estatisticamente significante (p<0,0001), quando comparados
os grupos BD (2,90 ± 0,30), MD (1,75 ± 0,43) e PD (0,36 ± 0,50). As células
neoplásicas das lesões BD apresentaram imunomarcação significantemente
maior, que a intensidade de marcação nas lesões MD (p<0,0001) e, que a
marcação das lesões PD (p<0,0001). E, a imunoexpressão observada nas lesões
MD foi significantemente maior das lesões PD (p<0,001), (Figura 12).
58
Figura 11. Padrão de Expressão da GTPase RhoA em carcinoma epidermoide oral.
Reação imunohistoquímica pela técnica avidina-biotina-peroxidase, sendo a positividade vista em
castanho. Carcinoma epidermoide oral: (A) bem diferenciado; (B) moderadamente diferenciado; (C)
pouco diferenciado; (D) controle negativo. Contra-coloração com hematoxilina. Barra = 25 µm.
Figura 12 Comparação de expressão da GTPase RhoA em carcinoma epidermoide oral em
pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no Hospital de Clínicas da UFTM no
período de 1984 a 2007.
Bem diferenciado (BD), moderadamente diferenciado (MD) e pouco diferenciado (PD). Teste de
Mann Whitney, ***p<0,0001: BD versus MD, BD versus PD, MD versus PD. Pós-teste de Dunn:
**p<0,001: MD versus PD; ***p<0,0001: BD versus MD; BD versus PD.
59
5.3
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RHOB EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL
Nos casos de carcinoma epidermoide oral, imunomarcação para proteína
RhoB foi observada fraca ou negativa nas células neoplásicas das lesões bem
BD, moderada nas lesões MD e fraca nas lesões PD (Figura 13).
A avaliação morfométrica da intensidade de imunoexpressão de RhoB
mostrou diferença estatisticamente significante (p<0,0001), quando comparados
os grupos BD (1,23 ± 0,43), MD (0,76 ± 0,42) e PD (0,53 ± 0,51). A
imunoexpressão observada para o grupo BD foi significante maior do que a
observada para o grupo MD (p<0,001), e, que a marcação das lesões PD
(p<0,0001). Não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre a
imunoexpressão dos grupos MD e PD (Figura 1).
60
Figura 13. Padrão de Expressão da GTPase RhoB em carcinoma epidermoide oral.
Reação imunohistoquímica pela técnica avidina-biotina-peroxidase, sendo a positividade vista em
castanho. Carcinoma epidermoide oral: (A) bem diferenciado; (B) moderadamente diferenciado; (C)
pouco diferenciado; (D) controle negativo. Contra-coloração com hematoxilina. Barra = 25 µm.
Figura 14. Comparação do padrão de Expressão da GTPase RhoB em carcinoma epidermoide
oral em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no Hospital de Clínicas da
UFTM no período de 1984 a 2007.
Bem diferenciado (BD), moderadamente diferenciado (MD) e pouco diferenciado (PD). Teste de
Mann Whitney, ***p<0,0001: BD versus MD, BD versus PD, MD versus PD. Pós-teste de Dunn:
**p<0,001: BD versus MD; ***p<0,0001: BD versus PD; p>0,05: MD versus PD.
61
5.4
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE CDC42 EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL
Nos casos de carcinoma epidermoide oral, imunomarcação para proteína
RhoB foi observada fraca nas células neoplásicas das lesões bem BD, moderada
nas lesões MD e intensa nas lesões PD (Figura 15).
A avaliação morfométrica para Cdc42 mostrou diferença estatisticamente
significante (p<0,0001), quando comparados os grupos BD (1,19 ± 0,40), MD
(1,91 ± 0,28) e PD (2,62 ± 0,61). As células neoplásicas das lesões BD
apresentaram imunomarcação significantemente menor, que a intensidade de
marcação nas lesões MD (p<0,0001) e, que a marcação das lesões PD
(p<0,0001). E, a imunoexpressão observada nas lesões MD foi significantemente
menor das lesões PD (p<0,001), (Figura 16).
62
Figura 15. Padrão de Expressão da GTPase Cdc42 em carcinoma epidermoide oral.
Reação imunohistoquímica pela técnica avidina-biotina-peroxidase, sendo a positividade vista em
castanho. Carcinoma epidermoide oral: (A) bem diferenciado; (B) moderadamente diferenciado;
(C) pouco diferenciado; (D) controle negativo. Contra-coloração com hematoxilina. Barra = 25 µm.
Figura 16. Comparação do padrão de Expressão da GTPase Cdc42 em carcinoma epidermoide
oral em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no Hospital de Clínicas da
UFTM no período de 1984 a 2007.
Bem diferenciado (BD), moderadamente diferenciado (MD) e pouco diferenciado (PD). Teste de
Mann Whitney, ***p<0,0001: BD versus MD, BD versus PD, MD versus PD. Pós-teste de Dunn:
**p<0,001: MD versus PD; ***p<0,0001: BD versus MD; BD versus PD.
63
5.5 PADRÃO DE EXPRESSÃO DE RAC1 EM CARCINOMA EPIDERMOIDE
ORAL
A proteína Rac1 não foi expressa pela grande maioria das células
neoplásicas casos BD, MD e PD. Apenas algumas células do fronte migratório
mostraram uma imunomarcação intensa (Figura 17).
Figura 17. Padrão de Expressão da GTPase Rac1 em carcinoma epidermoide oral.
Reação imunohistoquímica pela técnica avidina-biotina-peroxidase, sendo a positividade vista em
castanho. Carcinoma epidermoide oral: (A) bem diferenciado; (B) moderadamente diferenciado; (C)
pouco diferenciado; (D) controle negativo. Contra-coloração com hematoxilina. Barra = 25 µm.
64
6. DISCUSSÃO
65
A casuística obtida para a realização deste trabalho mostrou-se adequada,
pois os dados levantados assemelham-se àqueles encontrados na literatura.
Quanto ao gênero, 73% foram homens e 27% foram mulheres, mantendo uma
relação próxima de 3:1. A idade do diagnóstico do CEO foi mais precoce nos
homens (média de 57,38) do que nas mulheres (64,33). Esses dados coincidem
com a literatura (DE CARVALHO et al., 2001).
Com relação à cor, 77% dos pacientes eram brancos e 21% não brancos.
Quando relacionados ao sítio mais frequente, o lábio (46%), podemos fazer a
associação de cor e maior incidência de CEO de lábio, devido à exposição solar,
como observado por outros autores (BROUMAND et al., 2006; KALMAR, 2006;
LIM, 2006).
A avaliação do grau de diferenciação é muito dependente da amostra e, na
nossa casuística, predominaram os casos de CEO moderadamente diferenciados
(53%), seguidos pelos bem diferenciados (29%) e pouco diferenciados (16%).
O uso regular de tabaco, através de cigarros de papel, palha, cachimbo,
charuto e fumo de mascar foi observado em 60% dos casos, contra 11% que
negaram sua utilização. Não encontramos relato de uso de tabaco em 29% dos
prontuários. A literatura confirma amplamente a forte relação de tabagismo e CEO
(NEVILLE, 2002; ZNAOR, 2003; KALMAR, 2006; GILLISON, 2007).
O consumo regular de álcool foi relatado em 40% dos casos, contra 17%
sem consumo. Um dado preocupante foi a ausência de relato de consumo de
bebidas alcoólicas em 43% dos prontuários. O álcool tem sido descrito como um
dos fatores mais diretamente relacionados ao aparecimento do CEO (ZNAOR,
2003; GILLISON, 2007).
Os dados de higienização oral, hábitos sexuais, refluxo gastroesofágico,
fatores dietéticos, inalação de gases e consumo de maconha não foram relatados
nos prontuários, tornando impossível a análise da casuística com a literatura.
66
Quanto ao tratamento empregado, a cirurgia foi o mais utilizado (46%),
seguido por radioterapia e/ou quimioterapia (4%). Não encontramos qualquer
relato de tratamento em 50% dos casos, dado alarmante por nós observado. Em
relação à literatura, os dados foram semelhantes quanto ao predomínio do
tratamento cirúrgico (BETTENDORF et al., 2004; CARLSON e MILLER, 2006;
CHENG e SCHMIDT, 2008).
O tipo morfológico predominante das lesões foi o ulcerado, em 63% dos
casos, também condizente com a literatura (BAGAN et al., 2010). O estádio
clínico I foi o mais frequente (33%), seguido dos estádios IV (8%), III (6%) e II
(4%). Novamente, a escassez de informações nos prontuários limitou uma análise
mais detalhada de nossa casuística.
Finalmente, com relação às profissões, predominaram aquelas mais
relacionadas à exposição frequente e intensa ao sol (lavradores, pedreiros,
serviços gerais, carpinteiros, ferroviários, tratorista, jardineiro, servente de
pedreiro, entre outras). Muitos destes trabalhadores também estão expostos ao
consumo regular de álcool e tabaco, o que eleva a possibilidade do aparecimento
do CEO.
As GTPases Rho são pequenas proteínas pertencentes à super família
Ras, que traduzem sinais externos para dentro das células. São importantes para
a regulação de um grande número de funções celulares, incluindo a motilidade, a
mitose, a proliferação e a apoptose (PRICE e COLLARD, 2001; SPIERING e
HODGSON, 2011). O controle da polaridade, da protrusão e da adesão durante o
movimento da célula é também realizado por essas proteínas. As GTPases Rho
exercem um papel pivô na progressão da fase G1 do ciclo celular, primariamente
através da regulação da expressão da ciclina D1 (BURBELO et al., 2004). RhoA,
Rac1 e Cdc42 são os membros da família das GTPases Rho mais caracterizadas
e participam de complexas cascatas de sinalização que controlam a proliferação
celular (WELSH, 2004).
67
As proteínas Rho possuem mais de 60 efetores downstream conhecidos,
que determinam a evolução da ativação para uma dada proteína GTPase. Cada
efetor ativado por uma GTPase determina se a ativação será relacionada à
morfologia celular, à polaridade, ao tráfego vesicular ou ao controle do ciclo
celular (BUSTELO et al., 2007). Os efetores downstream mais conhecidos são
ROCK (maior efetor de RhoA), PKN, Rhotekin, Citron, PIP5-quinase e p140mDia,
que regula a polimerização de actina (LU et al., 2009).
Algumas GTPases da família Rho podem ser consideradas como atípicas.
São elas RhoH, Wrch-1, Chp e RhoBTB. Essas proteínas estão envolvidas em um
amplo espectro de processos biológicos (ASPENSTROM et al., 2007). Raramente
seguem o esquema de resposta cíclica aos GEFs e GAPs e são reguladas
positivamente pelo nível de expressão e negativamente por sua degradação.
Suas funções podem ser reguladas por interações entre proteínas, envolvendo
tipos de domínios não encontrados nas proteínas Rho clássicas (WENNERBERG
e DER, 2004). RhoH é uma GTPase específica do sistema hematopoiético
envolvida com a sinalização das células T, Wrch1 e Chp estão envolvidas com a
adesão celular e a dinâmica do citoesqueleto e RhoBTBs podem ser
consideradas como supressores de tumor (ASPENSTROM et al., 2007).
Há mais de uma década, estudos de vários laboratórios mostraram que os
membros Rho, Rac e Cdc42 da família Rho são essenciais para respostas
morfogênicas e de mitoses nas células. Desde então, outras vias oncogênicas
levando ao crescimento aberrante e envolvendo outras proteínas, como o Fator
de Crescimento Insulínico, o Fator de Crescimento Epidérmico ou os Receptores
para o Fator de Crescimento do Hepatócito mostraram-se dependentes da
sinalização das GTPases Rho (GRISE et al., 2009).
Para que as células tumorais adquiram comportamento invasivo é
necessário que haja a quebra das adesões celulares, modificações no padrão de
polarização celular, aumento da mobilidade e capacidade de remodelação da
matriz extracelular (MEC). Rho A e Rac1 regulam a função de proteínas que são
68
relacionadas à promoção da mobilidade celular, ligando o citoesqueleto de actina
à membrana plasmática (RIDLEY, 2006; TORKA et al., 2006).
Este papel é um evento importante na evolução das neoplasias, visto que
age em genes supressores de tumor dando origem a lesões altamente
metastáticas. RhoA e Rac1 pode modular a degradação e remodelação da matriz
extracelular através da regulação dos níveis de metaloproteinases (MMPs) de
matriz que degradam a matriz extracelular, ou regulando os níveis dos seus
antagonistas, inibidores teciduais de MMPs (KANG et al., 2007).
Considerando-se que nenhuma mutação com perda ou ganho de função foi
encontrada ainda nas GTPases Rho, os resultados dos estudos já realizados
sugerem que os distúrbios da sinalização dessas proteínas no câncer possam ser
causados por alterações de seus reguladores ou por regulação direta de seus
níveis de expressão, resultando em uma variação de sua atividade biológica. De
fato, a superexpressão e a repressão de GTPases ou de alguns efetores
upstream ou downstream da sinalização de Rho tem sido associados a muitos
tumores em humanos (GOMEZ DEL PULGAR et al., 2005)
As GTPases Rho podem contribuir com a iniciação e progressão do
câncer, incluindo a aquisição de potencial ilimitado de proliferação, sobrevivência
e evasão de apoptose, invasão de tecidos e o estabelecimento de metástases.
Elas estão frequentemente superexpressas em tumores e é provável que estejam
relacionadas ao fenótipo invasivo das células tumorais (VEGA e RIDLEY, 2008).
A aquisição de um fenótipo invasivo é um evento crucial na progressão de
uma lesão localizada para uma metastática (SCHMITZ et al., 2000). Para que
ocorra metástase, as células tumorais têm que cruzar limites do tecido, o que
requer motilidade celular aumentada remodelando o citoesqueleto e os contatos
celulares com a MEC. Vias intrínsecas e extrínsecas ativadas convergem para
estimular as GTPases Rho, incluindo RhoA e Rac1, reguladores fundamentais do
citoesqueleto de actina e, consequentemente, da migração celular (ETIENNEMANNEVILLE e HALL, 2002; SAHAI e MARSHALL, 2002; VEGA e RIDLEY,
69
2008). Porém, sua participação pode variar de acordo com o tipo celular e a
composição da MEC (CHIOU et al., 2003). A atividade de Rac é essencial para a
atividade protrusiva e movimento e a atividade de Cdc42 é requerida para o
estabelecimento de polaridade durante o movimento (NOBES e HALL, 1999).
Está evidente que as GTPases Rho e várias moléculas downstream
assumem um papel importante na contratilidade e adesão, em circunstâncias
normais. Há evidência crescente de que Rho e seu efetor ROCK estejam
relacionados com invasão e metástases (SCHMITZ et al., 2000). ROCK também
parece estar envolvida na proliferação celular, como mDia 1/2; porém essas
proteínas também estão envolvidas com a dinâmica do citoesqueleto de actina,
motilidade, adesão e morfogênese, dado ao equilíbrio de expressão de ambas
(NARUMIYA et al., 2009).
O ácido hialurônico (AH), um componente da matriz extracelular, é
encontrado em concentrações elevadas nos tumores malignos, quando
comparado com tumores benignos e tecidos normais. Em alguns tipos de tumor, o
nível de sua concentração é fator preditivo de malignidade (TOOLE et al., 2002).
Encontra-se frequentemente ligado a CD44, um importante receptor de superfície
celular, que pode se ligar às GTPases Rho, levando à instalação de múltiplas
funções. A ativação da sinalização das GTPases Rho pelo CD44 pode ser
responsável por comportamentos específicos de células tumorais, ativação da
transcrição, adesão da célula tumoral, crescimento, sobrevivência, migração e
invasão (BOURGUIGNON, 2008).
Os processos de migração e proliferação celular são regulados por
GTPases Rho em outros tipos celulares, estimulados pela MEC e fatores de
crescimento (NOBES e HALL, 1995; SANTOS et al., 1997; ETIENNEMANNEVILLE e HALL, 2002; AZNAR et al., 2004). Entre as GTPases Rho, Rac1
tem sido descrita como a chave reguladora para a migração celular (RIDLEY et
al., 1992); entretanto, em certos tipos celulares, RhoA (SANTOS et al., 1997) e
RhoC (WANG et al., 2003) também são essenciais para esse processo.
70
As GTPases Rho, principalmente RhoA, também estão envolvidas com a
perda de polaridade epitelial que aparece mesmo em neoplasias benignas (VEGA
e RIDLEY, 2008). A invasão de células tumorais requer uma coordenação entre
adesão celular/motilidade e degradação proteolítica da matriz extracelular
(NARUMIYA et al., 2009). A atividade de RhoA tem sido também associada com a
formação de adesões focais e fibras de estresse, que conferem contratilidade
para tracionamento do corpo celular e retração da porção traseira da célula
(RAFTOPOULOU e HALL, 2004). RhoA exerce um papel importante na
determinação dos níveis de p21 e p27, proteínas envolvidas com mecanismos
complexos da progressão do ciclo celular (WELSH, 2004).
Para pacientes com tumores sólidos, a maior ameaça à sobrevivência é a
metástase e a migração celular é a etapa crucial para a sua formação. Nas
células com motilidade, os lamelipódios e os filopódios podem ser observados na
área de avanço da célula, enquanto a retração é vista no lado oposto. Isto se
deve à reorganização do citoesqueleto (NOBES e HALL, 1999).
Embora haja intercomunicação entre os membros das GTPases da família
Rho, cada um deles é ativado em resposta a sinais ambientais específicos e cada
um induz uma resposta particular ao citoesqueleto de actina (MACKAY e HALL,
1998). Essas intercomunicações e as diferenças nos padrões de expressão entre
os membros da família Rho resultam em diferentes comportamentos nos variados
tipos de câncer (KAMAI et al., 2004). Há evidência de uma ativação sequencial de
Cdc42 → Rac1 → RhoA (NOBES e HALL, 1995). Entretanto, ainda faltam
respostas à questão de como as GTPases Rho são reguladas.
A inibição da via de sinalização das GTPases Rho está envolvida com a
inibição mediada por micro-RNA-138 da migração celular e da invasão no
carcinoma epidermoide de língua. Níveis reduzidos de micro-RNA-138 estão
associados a um maior potencial metastático nos CEOs (JIANG et al., 2010).
Em nosso laboratório, o papel das GTPases Rho tem sido avaliado por
alguns autores. RhoA, RhoB, Rac1 e Cdc42 foram estudadas em cultura primária
71
de células de CEO e parecem ser importantes para a regulação das vias de
transdução de sinal envolvidas na diferenciação dessas células, por meio do uso
do inibidor Toxina A de Clostridium difficile (PINHEIRO, 2010).
Também em cultura primária de células de CEO, demonstramos que o
processo de migração é promovido pelas GTPases Rho e pelas ROCKs, seus
efetores. A inibição das ROCKs reduziu significativamente a migração celular e PI
3-kinase mostrou sua participação em vias de transdução de sinal que restringem
a migração dessas células de CEO (SARGENTI NETO, 2011).
Demonstramos também que RhoA possivelmente participe da regulação da
diferenciação celular em astrocitomas, já que ocorre uma diminuição de sua
expressão com a progressão do grau de malignidade histopatológica (CARDOSO,
2011).
Mais recentemente, estudando as PAKs, proteínas que participam de vias
de transdução de sinal que regulam diversos processos biológicos, como
proliferação e morte celular, concluímos que as PAKs ½ não participam da
regulação da proliferação celular em queilite actínica e em CEO. Entretanto, as
PAKs 4/5/6 estão envolvidas na regulação da morte celular em CEO (DEL NERO,
2012).
Ainda em nosso laboratório, em estudo envolvendo o papel das GTPases
Rho nos adenomas pleomórficos de glândulas parótidas, RhoA parece regular a
diferenciação celular e RhoB, a diferenciação mesenquimal (CARBONI, 2011).
Ainda em ameloblastomas, RhoA e RhoB tiveram expressão elevada em um
grande número de células, principalmente as não polarizadas, podendo estar
associadas a mecanismos de invasão nesses tumores (MODOLO et al., 2011).
O papel de RhoA tem sido descrito tanto na promoção como na inibição da
invasão. Em adenocarcinoma mamário, RhoA foi observada com expressão
semelhante em relação ao tecido mamário normal (JIANG et al., 2003) e também
com expressão aumentada em casos de tumores mamários avançados (FRITZ et
72
al., 1999; BURBELO et al., 2004). Uma grande elevação na expressão de RhoA
também foi observada em tumores do cólon (FRITZ et al., 1999). RhoA teve
expressão menor em carcinomas de células claras de ovário nos estádios
precoces e maior expressão nos casos sem resposta à quimioterapia (CANET et
al., 2011).
Já foi caracterizada uma via de transdução de sinal envolvendo a ativação
de RhoA responsável pela inibição da migração celular em glioblastoma
(MALCHINKHUU et al., 2008). As proteínas oncogênicas Skp2 e Myc parecem
coordenar a indução da transcrição complexa de RhoA (CHAN et al., 2010). RhoA
foi envolvida na promoção da invasão e migração em linhagens TSGH de
carcinoma de bexiga (CHANG et al., 2010) e em células epiteliais mamárias
humanas (PILLE et al., 2005). RhoA também é requerida, tanto por células
endoteliais como por células em migração, para que as últimas cruzem o
endotélio vascular (WORTHYLAKE et al., 2001). RhoA já foi detectada com níveis
até duas vezes do normal em 80% dos carcinomas epidermoides de cabeça e
pescoço (ADNANE et al., 2002).
Para RhoA, foi observada diferença estatisticamente significante nas
comparações entre todos os grupos de nosso trabalho (BD versus MD, BD versus
PD e MD versus PD), demonstrando que a imunomarcação varia de forma
diretamente proporcional à diferenciação tumoral (quanto mais diferenciada a
neoplasia, maior a imunomarcação para RhoA). Portanto, RhoA, segundo nossos
resultados, coincidentes com aqueles da literatura, poderá ser utilizada como um
marcador de diferenciação celular no CEO. Um aspecto interessante observado
em nosso trabalho foi a intensa imunomarcação para RhoA na região da
membrana plasmática nas células sem lamelipódios nas margens das lesões,
sugerindo seu envolvimento nos processos iniciais da invasão.
RhoA e RhoB compartilham 86% da identidade de sequência de
aminoácidos e mesmo assim possuem papéis diferentes na oncogênese: RhoA
promove a formação, invasão e metástases (PRUITT e DER, 2001), enquanto
RhoB parece exibir um comportamento supressor de tumor (CHEN et al., 2000).
73
No entanto, a expressão de RhoA, RhoB e Rac1 encontram-se diminuídas à
medida que o grau de malignidade de tumores cerebrais aumenta (FORGET et
al., 2002). RhoA, Rac1, Cdc42 e ROCK encontram-se com expressão aumentada
e estão associadas à progressão do câncer de testículo (KAMAI et al., 2004).
RhoB localiza-se primariamente nos endossomos e está envolvida com o
tráfego de membrana e a sobrevivência celular (GRISE et al., 2009). RhoB é
dispensável para a morte celular fisiológica, mas é importante para a apoptose
induzida em células transformadas por vários tipos de terapia antineoplásica.
RhoB parece ser relevante para outros estados patológicos envolvendo o
estresse celular, como as respostas inflamatórias ou a lesão por reperfusão. A
inativação de RhoB ou de seus efetores poderia gerar resistência a drogas ou à
radioterapia em células cancerosas (PRENDERGAST, 2001).
Em células de cultura e em modelos animais, RhoB antagoniza a
transformação maligna, agindo como supressor de tumor. Na linhagem celular de
melanoma altamente metastático B16-F10, a expressão de RhoB inibiu as
metástases para o pulmão (JIANG et al., 2004). Sua superexpressão em células
cancerosas de humanos resulta em inibição de transdução de sinais envolvidos
na carcinogênese e na sobrevivência do tumor, assim como na indução de
apoptose (CHEN et al., 2000).
Baseado nesses dados foi estudada a imunoexpressão de RhoB em
carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço; sua expressão mostrou-se
prevalente em carcinomas in situ e em tumores bem diferenciados. A expressão
de RhoB tornou-se de fraca até indetectável à medida que o tumor mostrou-se
mais profundamente invasivo e menos diferenciado. Além disso, foi detectado que
RhoB, presente no ambiente intranuclear em tecidos não neoplásicos, apareceu
deslocado para o citoplasma no carcinoma invasivo, mostrando uma perda de sua
habilidade de deslocar-se para o núcleo celular. A função de RhoB parece,
portanto, estar implicada com a diferenciação celular (ADNANE et al., 2002). A
expressão de RhoB também sensibiliza as células cancerígenas ao 5-fluoruracil
(JIANG et al., 2004).
74
Ras regula a expressão de RhoB através de um mecanismo dependente
de PI3K e Akt. O bloqueio genético e farmacológico de PI3K e Akt resulta no
aumento da expressão de RhoB. Portanto, RhoB antagoniza as características
oncogênicas de PI3K e Akt, diminuindo a indução de transformação, migração e
invasão e induzindo à apoptose. Em modelo animal, RhoB inibe as metástases de
melanoma para o pulmão (JIANG et al., 2004).
Em nosso trabalho, não houve diferença estatisticamente significante para
RhoB, quando comparados os grupos MD versus PD. Apesar de haver sido
observada diferença estatisticamente significante entre os grupos BD versus MD
e BD versus PD, a maioria dos casos, em todos os grupos, apresentou
imunomarcação fraca (*). Portanto, RhoB não deve ser considerada como um
marcador de diferenciação celular em CEO. Observamos que RhoB, pelos
resultados obtidos, parece exercer função supressora de tumor, como descrito na
literatura.
Cdc42 tem um importante papel no estabelecimento da polarização inicial
de células epiteliais, resultando posteriormente na formação de adesões célula a
célula apropriadas (KROSCHEWSKI et al., 1999). Alguns de seus efetores agem
especificamente na mediação da motilidade, enquanto outros possuem um papel
importante na adesão celular. WASP e MRCK são exemplos de efetores de
Cdc42 cruciais para a organização da actina e formação de filopódios, conferindo
um fenótipo de motilidade (SCHMITZ et al., 2000). Os efetores de Rac e Cdc42
conhecidos como IQGAP1 e IQGAP2 parecem regular a adesão célula a célula
(ERICKSON et al., 1997). Pode-se especular, portanto, que a sinalização
aberrante hiperativa de Cdc42 possa facilitar o fenótipo de motilidade pela ruptura
dos contatos juncionais intercelulares (SCHMITZ et al., 2000).
Em
nosso
estudo,
observamos
um
aumento
significativo
da
imunomarcação de Cdc42 à medida que o tumor perde diferenciação. Como
Cdc42 está relacionada à proliferação celular e à migração, já discutidas
anteriormente, suspeitamos que a presença maior de Cdc42 no grupo PD indique
75
um maior fenótipo de proliferação e invasão, tornando essa proteína um potencial
marcador para esses fenômenos.
Algumas alterações na morfologia celular, como a reorganização do
citoesqueleto de actina por Rac e Cdc42, são iniciadas quando uma célula recebe
um sinal do seu ambiente, resultando em uma cascata de sinalização que leva a
mudanças na expressão genética. As alterações na expressão de algumas
proteínas, como as MMPs, levam a rearranjos arquiteturais essenciais para a
remodelagem da MEC (CURRAN e MURRAY, 1999).
Em células migratórias, Rac1 gera uma força protrusiva pela polimerização
de actina localizada na região anterior da célula (voltada para a direção de
migração), enquanto Cdc42 estimula a formação de filopódios (RIDLEY et al.,
1992).
Rac1 regula a polimerização de actina para a formação de lamelipódios
(protrusão da membrana), essencial para a migração celular. O início dessa
migração é caracterizado pela polimerização da actina no bordo de direção e
extensão de um lamelipódio na direção do movimento (ZHUGE e XU, 2001). Em
sua forma ativa, Rac1 acumula-se à frente das células em migração (JAFFE e
HALL, 2005), conforme observado nas células de CEO do fronte migratório com
lamelipódios evidentes em nosso estudo.
Além disso, Rac1 regula a formação de contato célula-célula dependente
de caderina em células epiteliais (BRAGA et al., 1997), o que entra em
concordância com a intensa marcação por nós observada na região de membrana
plasmática das células adjacentes de CEO. Os efeitos fisiológicos de Rac são
dependentes tanto das interações entre proteínas quanto da expressão dessas
proteínas e a invasão depende de uma reprogramação complexa da célula
(SCHMITZ et al., 2000).
Rac1 encontra-se superexpressa em vários tumores e algumas evidências
indicam que a sinalização celular dependente de Rac1 é importante para a
76
transformação maligna (GOMEZ DEL PULGAR et al., 2005). Mutações no
domínio efetor de Rac1 parecem aumentar a atividade da proteína e a
sobrevivência dos tumores (HWANG et al., 2004).
A depleção de Rac1 inibe fortemente a formação de lamelipódios, a
migração celular e a invasão em células de glioblastoma SNB19 e células de
carcinoma mamário (CHAN et al., 2005). Tiam1, um ativador de Rac1, induz
migração celular e formação de metástases em modelo animal (MICHIELS et al.,
1995). Rac1 apresenta níveis de expressão elevada em tumores de mama e
cólon (FRITZ et al., 1999).
Durante a metástase, as células invasoras devem atravessar barreiras
tissulares compostas principalmente de colágeno tipo I. Rac1 parece mediar a
ativação da metaloproteinase 2 (MMP-2), uma colagenase, em modelo in vitro,
aumentando a invasão de células de fibrossarcoma HT1080 através de uma
barreira de colágeno. Isto indica que a ativação de MMP-2 dependente de
colágeno por Rac1 contribui para a invasão de células tumorais através da
barreira de colágeno intersticial, levando a célula a assumir um fenótipo
colagenolítico (ZHUGE e XU, 2001).
A superexpressão de Rac1 foi identificada em 14 casos de CEO em
Taiwan, uma área com alta incidência de CEO devido ao consumo de fumo de
mascar de areca, rico em tabaco. A imunorreatividade para Rac1 foi
significativamente elevada no número de casos de CEO (74%), quando
comparados aos tecidos não neoplásicos utilizados como controle (48%). É
provável que a periferia do tecido normal adjacente ao CEO possa conter
alterações moleculares importantes nos estágios precoces da carcinogênese oral.
Nesse mesmo trabalho, foi observada uma redução significativa da expressão de
Rac1 nos tumores que recidivaram. Uma hipótese levantada seja a de que os
tumores recidivados possam modular outros mecanismos vantajosos para o
desenvolvimento neoplásico, que ultrapassem a importância da participação de
Rac1 (LIU et al., 2004).
77
Diferentemente
daquilo
observado
na
literatura,
não
obtivemos
imunomarcação para Rac1 nas células de CEO bem, moderadamente ou pouco
diferenciadas, a não ser nas células do fronte migratório, aonde a expressão foi
observada. Isto sugere que Rac1 deva participar realmente dos fenômenos de
migração e invasão celular tumoral, não estando diretamente relacionada à
diferenciação celular.
RhoC não foi objeto de nosso estudo, mas sua superexpressão parece
levar a um aumento da expressão de fatores angiogênicos, aumentando a
vascularização do tumor e a probabilidade de entrada de células tumorais na
corrente sanguínea (VAN GOLEN et al., 2000). Rho C é encontrada com níveis
elevados nos carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço e tem sido proposta
como marcador de mau prognóstico, por estar relacionada com maior incidência
de metástases linfonodais (KLEER et al., 2006). Resultados semelhantes foram
observados em linhagem celular de melanoma A375P, adenocarcinomas
pancreáticos e tumores renais, confirmando a hipótese de que RhoC é um gene
que afeta um processo essencial para a formação de metástases (HALL, 1991;
SUWA et al., 1998; CLARK et al., 2000).
A molécula GDI (Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitors), responsável
pela manutenção de RhoGDP em estado inativo no citoplasma, também
demonstrou expressão aberrante em adenocarcinomas mamários (JIANG et al.,
2003). Muitas GEFs participam também da ativação oncogênica das GTPases
Rho e induzem à malignidade frequentemente (BOURGUIGNON, 2008). As
proteínas Vav (Vav1, Vav2 e Vav3) são GEFs conhecidas e a superexpressão de
Vav2 foi recentemente relacionada a linhagens de células mais invasivas. A
ativação de Vav2 parece modular a invasão celular através da regulação
específica da atividade de Rac1 e Cdc42 no CEO (LAI et al., 2008). As Vavs
estão implicadas com várias neoplasias malignas como neuroblastoma,
melanoma, tumores pancreáticos e leucemias (KATZAV, 2007).
Parece que a regulação afinada das GTPases Rho e de suas moléculas de
interação é necessária para a manutenção de um estado saudável da célula e
78
seus efeitos são determinados por vários fatores como a sua concentração, tipo
celular, estímulo, substrato, localização e tempo (SCHMITZ et al., 2000).
Já foram publicados trabalhos considerando os inibidores de Ras como
potenciais drogas antineoplásicas (KLOOG e COX, 2004). Recentemente foram
realizadas pesquisas de mecanismos de interferência nas funções das GTPases
Rho, divididos em quatro fases: na prevenção do correto direcionamento da
proteína Rho ao nível da membrana celular; na inibição da atuação dos GEFs,
impedindo a aquisição de uma forma ativa; no impedimento da formação ou na
ruptura do complexo Rho-efetor e na inibição da atividade da proteína efetora
(CHARDIN e MCCORMICK, 1999; DU e PRENDERGAST, 1999; VASTRIK et al.,
1999; LIU et al., 2000).
Algumas estratégias foram propostas para a diminuição da atividade
específica das GTPases Rho em células tumorais, ou tendo as próprias proteínas
Rho como alvo, com resultados promissores. Para esse objetivo foram utilizados
anticorpos neutralizadores, proteínas dominantes negativas, toxinas bacterianas,
oligonucleotídeos ou a interferência de RNA (WANG et al., 2003; KLOOG e COX,
2004; WALKER e OLSON, 2005; FRITZ e KAINA, 2006; LU et al., 2009).
Um caminho mais promissor para a descoberta de drogas antineoplásicas
pode ser a geração de medicamentos com eficácia inibitória contra várias
proteínas Ras, particularmente K-Ras e N-Ras. Os bifosfonatos podem ter um
potencial terapêutico interessante em virtude de sua eficiência em modelos
animais contra o câncer ósseo, reduzindo o crescimento tumoral, a reabsorção
óssea e a dor oncológica (WALKER et al., 2002).
A utilização de estatinas como os inibidores de farnesiltransferase,
geranilgeraniltransferase (GGT1) e HMG-CoA-redutase tem sido estudada quanto
à sua aplicabilidade no tratamento do câncer (GIBBS et al., 1996; DU et al.,
1999). Com relação ao CEO, um estudo demonstrou que GGT1 suprimiu a
proliferação celular e induziu a suspensão do ciclo celular em G1. Houve um
aumento aparente na expressão e uma redução na localização na membrana de
79
RhoA, demonstrando que GGT1 pode ser útil como inibidor de invasão e de
metástases em casos de CEO (HAMADA et al., 2011).
As
GTPases
Rho
afetam
a
suscetibilidade
celular
às
drogas
antineoplásicas e à irradiação ionizante (FRITZ e KAINA, 2006). A correlação
entre a superexpressão de GTPases Rho e a evolução clínica levanta a
possibilidade de que seus níveis de expressão possam ser úteis como
indicadores prognósticos. O que importa agora é determinar os caminhos cruciais
que ligam as proteínas Rho ao câncer. Espera-se que novos trabalhos utilizando
modelos in vivo de progressão tumoral e análises mais detalhadas da expressão
das GTPases Rho em tumores humanos possa responder várias questões (VEGA
e RIDLEY, 2008).
A confirmação pela biologia molecular do diagnóstico histopatológico
elevaria a qualidade da abordagem terapêutica após o tratamento cirúrgico. A
determinação dos níveis de proteínas Rho nos espécimes de biopsia poderia
aumentar a acurácia do diagnóstico para pacientes em quadros limítrofes da
doença, assim como facilitaria o acompanhamento clínico (FORGET et al., 2002).
Então, quais são os mecanismos de desregulação das GTPases? Como a
expressão das GTPases Rho afeta a heterogeneidade do CEO? Ainda são
necessários aprimoramentos na monitorização da atividade das GTPases Rho em
pequenas amostras de tecido, como aquelas obtidas de biopsias.
Em síntese, os resultados deste estudo fornecem uma contribuição
importante para a compreensão das vias de transdução de sinal reguladoras de
processos biológicos envolvidos na patogênese do carcinoma epidermoide oral.
As proteínas RhoA, RhoB, Cdc42 e Rac1 parecem estar envolvidas na regulação
de processos biológicos que ocorrem em todos os graus histopatológicos do
CEO.
80
7. CONCLUSÕES
81
O padrão de expressão das proteínas RhoA, RhoB, Cdc42 e Rac1 sugere
que as GTPases Rho podem participar da regulação de processos biológicos que
ocorrem em todos os graus histopatológicos.
A casuística foi adequada para a realização de estudo de Carcinoma
epidermoide oral..
A GTPase RhoA pode estar envolvida na regulação da diferenciação
celular em CEO; quanto mais diferenciada a lesão, maior a expressão de RhoA.
A GTPase RhoB parece não estar envolvida na regulação da diferenciação
celular em CEO; quanto menos diferenciada a lesão, maior a expressão de RhoB.
A GTPase Cdc42 parece regular a proliferação celular em CEO; quanto
menos diferenciada a lesão e maior o potencial de proliferação, maior a
expressão de Cdc42.
A GTPase Rac1 parece não participar da regulação da diferenciação
celular. No entanto, as células com lamelipódios evidentes no fronte migratório
superexpressam Rac1, indicando sua participação na regulação da migração
celular.
82
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cancers in indian men. Int J Cancer, v. 105, p. 681-686, 2003.
111
ANEXOS
112
ANEXO 1. Parecer do comitê de ética em pesquisa da UFTM.
113
114
115
116
117
118
119
ANEXO 02. Caracterização dos casos estudados diagnosticados com carcinoma epidermoide oral no hospital de clínicas da UFTM
no período de 1984 a 2007.
Gênero
Idade
Cor
Profissão
1
2
3
4
5
M
F
M
M
M
79
55
30
57
70
B
B
B
B
B
lavrador
doméstica
servente
mecânico
aposentdo
6
7
M
M
88
81
B
B
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
M
M
M
M
M
M
M
M
F
F
F
M
M
35
62
65
51
35
64
54
46
74
NI
79
37
41
B
NI
B
B
B
B
NB
B
B
NI
B
B
NB
ferroviário
serviços
gerais
carpineiro
NI
lavrador
lavrador
lavrador
lavrador
encanador
lavrador
doméstica
NI
do lar
NI
vendedor
21
M
56
B
lavrador
22
23
24
F
M
M
82
59
29
B
B
B
do lar
lavrador
lavrador
Região
Topográfica
assoalho da boca
lábio
lábio
língua
gengiva e
assoalho da boca
lábio
lábio
lábio
lábio
lábio
lábio
lábio
lábio
gengiva
lábio
lábio
língua
lábio
lábio
lábio
assoalho da boca
e língua
língua
lábio
lábio
Tipo de lesão
Diagnóstico
Tabagismo
Etilismo
Tratamento
vegetante
ulcerada
ulcerada
ulcerada
vegetante
BD
BD
BD
BD
BD
sim
sim
NI
sim
sim
sim
não
NI
sim
sim
NI
cirurgia
cirurgia
NI
NI
Sobrevida
> 5 anos
NI
sim
NI
NI
não
ulcerada
nóduloulcerada
ulcerada
ulcerada
vegetante
ulcerada
ulcerada
vegetante
ulcerada
ulcerada
ulcerada
vegetante
vegetante
ulcerada
ulceradavegetante
ulcerada
BD
BD
sim
NI
não
NI
cirurgia
cirurgia
sim
NI
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
BD
sim
NI
não
sim
NI
sim
sim
sim
NI
NI
sim
NI
NI
sim
NI
não
sim
NI
sim
sim
NI
NI
NI
não
NI
NI
cirurgia
cirurgia
cirurgia
cirurgia
cirurgia
NI
NI
cirurgia
cirurgia
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
NI
sim
sim
NI
NI
NI
NI
NI
BD
sim
sim
radioterapia
NI
ulcerada
ulcerada
ulceradavegetante
BD
BD
BD
sim
sim
sim
sim
não
sim
NI
cirurgia
cirurgia
NI
sim
sim
sim
NI
NI
120
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
F
F
F
M
M
M
M
F
F
M
M
M
F
F
69
73
41
49
57
68
66
60
47
70
58
44
43
67
NB
B
NB
NB
B
NB
B
B
B
B
B
B
B
B
NI
do lar
doméstica
lavrador
sapateiro
aposentado
lavrador
do lar
do lar
lavrador
porteiro
carpineiro
do lar
do lar
gengiva
lábio
língua
assoalho da boca
lábio
língua
lábio
palato duro
lábio
palato mole
lábio
gengiva
gengiva
palato duro
39
40
41
42
M
M
M
M
51
71
53
43
B
B
B
B
militar
NI
lavrador
NI
assoalho da boca
lábio
lábio
assoalho da boca
43
44
M
M
48
52
NB
B
ser gerais
aux.escritório
gengiva
gengiva
45
46
47
48
49
50
51
M
M
M
M
M
M
F
57
92
54
53
85
49
82
B
NB
B
NB
NB
B
B
lavrador
aposentado
ferroviário
tratorista
lavrador
agricultor
do lar
língua
assoalho da boca
lábio
língua
mucosa oral
lábio
gengiva
52
53
M
M
49
32
B
B
lavrador
autônomo
lábio
lábio
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
NI
NI
ulcerada
nodular
ulcerada
ulcerada
NI
ulcerada
ulcerovegetante
NI
ulcerada
ulcerada
ulceradavegetante
vegetante
ulceradavegetante
vegetante
NI
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulceradavegetante
ulcerada
ulcerada
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
não
não
sim
sim
não
NI
não
NI
sim
sim
sim
sim
NI
sim
não
não
não
sim
não
NI
sim
NI
sim
sim
não
sim
NI
NI
cirurgia
cirurgia
cirurgia
cirurgia/quimioterapia
cirurgia
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
radio/quimio
NI
NI
NI
NI
NI
sim
não
sim
NI
sim
NI
NI
não
NI
NI
MD
MD
MD
MD
NI
sim
sim
sim
NI
sim
sim
sim
NI
cirurgia
cirurgia
NI
NI
NI
NI
NI
MD
MD
sim
NI
não
NI
cirurgia
NI
NI
não
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
NI
NI
sim
sim
sim
NI
sim
NI
NI
NI
sim
não
NI
NI
NI
NI
cirurgia
NI
NI
NI
cirurgia
NI
não
sim
NI
não
NI
não
MD
MD
NI
não
NI
NI
NI
cirurgia
NI
NI
121
54
55
56
57
58
59
60
61
M
M
F
F
M
F
F
M
42
39
55
73
45
58
60
51
NB
NB
NB
B
B
B
B
B
62
63
M
M
71
76
64
65
66
67
68
69
M
F
M
M
F
M
70
71
72
73
M
F
M
M
74
F
75
M
76
M
77
M
78
M
79
M
80
F
81
M
B - branco
língua
gengiva
gengiva
gengiva
mucosa oral
lábio
mucosa oral
palato mole
NI
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
NI
ulcerada
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
MD
sim
sim
sim
sim
NI
sim
NI
sim
sim
NI
NI
sim
NI
NI
NI
sim
NI
NI
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
não
não
NI
NI
sim
NI
NI
B
B
pedreiro
pedreiro
do lar
do lar
gráfico
técnico textil
do lar
servidor
público
lavrador
lavrador
lábio
lábio
MD
MD
NI
sim
NI
sim
cirurgia
NI
NI
sim
84
85
60
65
74
45
B
B
B
NB
B
B
NIRH
do lar
aposentado
jardineiro
doméstica
pedreiro
lábio
lábio
lábio
lábio
lábio
palato duro e mole
MD
MD
MD
MD
MD
PD
NI
sim
não
NI
sim
sim
NI
não
sim
NI
sim
sim
NI
NI
cirurgia
NI
cirurgia
NI
NI
NI
sim
NI
NI
NI
66
57
75
74
B
B
B
B
NI
do lar
lavrador
motorista
ulcerada
ulceradavegetante
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
nodular
ulceradavegetante
ulcerada
ulcerada
ulcerada
ulcerada
PD
PD
PD
PD
sim
NI
sim
sim
sim
NI
NI
sim
NI
NI
radioterapia
NI
não
NI
NI
NI
PD
PD
PD
PD
PD
PD
PD
PD
NI
sim
sim
sim
sim
sim
não
sim
NI
sim
NI
sim
NI
sim
NI
sim
NI
cirurgia
cirurgia
NI
NI
NI
cirurgia
NI
NI
NI
NI
NI
não
não
sim
sim
assoalho da boca
gengiva
língua e gengiva
assoalho, gengiva
e língua
64
B
do lar
língua
NI
74
NB
pedreiro
mucosa jugal
vegetante
64
B
aposentado
língua
NI
54
B
diversos
palato mole
vegetante
48
B
NI
língua (sublingual)
ulcerada
59
NB
serralheiro
mucosa jugal
ulcerada
53
B
doméstica
lábio
ulcerada
52
B
pintor
assoalho da boca
nodular
NB - não-branco
NI - não informado nos prontuários
122