Expressão Recombinante em Células
Eucarióticas
1-Introdução
2-Sistemas de expressão em leveduras
Edmar Vaz de Andrade
1-introduçao
Dificuldades em sistemas de expressão em
Escherichia coli
1-Processamento pós-traducional da
proteína (glicosilação)
2-Enovelamento da proteína na conformação
nativa (corpos de inclusão)
3-Degradação da proteína recombinante
pela E. coli.
2-Sistemas de expressão leveduras
Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae
Fácil manipulação
Cultivo relativamente rápido
preservam as características favoráveis das
bactérias
Maior proximidade filogenética de animais do que
as bactérias
processamento pós-traducional
comparável ao dos eucariotos pluricelulares
2-Sistemas de expressão leveduras
Padrão de Glicosilação
2-Sistemas de expressão leveduras
Pichia pastoris
Alto rendimento de proteína recombinante
Glicosilação comparável à realizada em células
animais
Maior eficiência de secreção
2-Sistemas de expressão leveduras
Vetor de Expressão em Pichia pastoris
Terminador de
transcrição
Promotor álcooloxidase
Gene AmpR
Peptídeo
sinal
Gene selvagem
para biossíntese
de histidina
Origem de
replicação em
E. coli
INVITROGEN
2-Sistemas de expressão leveduras
Transformação de leveduras P. pastoris HIS4Recombinação Homóloga
INVITROGEN
2-Sistemas de expressão leveduras
Vetor de Expressão em Pichia pastoris
Marca auxotrófica (nutricional) para biossíntese
de histidina
Cultivo em meio de cultura sem histidina
Clones não transformados são inviáveis
2-Sistemas de expressão leveduras
Vetor de Expressão em Pichia pastoris
Indução da síntese de proteína recombinante
com adição de metanol como fonte de carbono
Para inibir o promotor: cultivo na presença de
glicerol como fonte de carbono
Obtenção da proteína solúvel no sobrenadante