AVANÇOS DA CITOGENÉTICA
MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE
DOENÇAS
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
Departamento de Biologia
IBILCE-UNESP
Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de
cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes
alterações
•Perda:
deleção
monossomia
•Ganho:
duplicação, amplificação
trissomia, poliploidia
•Relocação:
translocação
inversão
inserção
CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas
Resolução:
~6milhões pb
~50genes/banda
>4 Mb
CITOGENÉTICA MOLECULAR
Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de
biologia molecular em preparações
citogenéticas: sondas marcadas com
fluorocromos
Identificação de rearranjos cromossômicos de
novo e cromossomos marcadores
Detecção de alterações cromossômicas em
núcleos interfásicos
Estudo da estrutura e função de regiões
cromossômicas específicas
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA
MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente
(aneuploidias, rearranjos, amplificação)
SKY: Cariotipagem espectral (alterações
estruturais - translocações)
M-BAND: Bandamento colorido (inversão,
deleção/duplicação)
CGH: Hibridação Genômica Comparativa
(perdas ou ganhos cromossômicos)
Array-CGH: maior resolução (desbalanços
genômicos)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de
DNA em que uma sonda de DNA
marcada com fluorocromo é hibridizada
ao cromossomo ou núcleo interfásico e
visualizado em microscópio de
fluorescência
Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)
FISH - Fluorescent “in situ” hybridization
Blue
Acqua
Green
Yellow
Orange
Red
DNAFISH
Alvo:
cromossomo
ousitu”
região cromossômica
Cláudio C. Silva
- Hibridização
Fluorescente “in
UCG/LaGene
Sonda: segmento de DNA específico
http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO
ETAPAS
Preparação da lâmina (DNA
alvo)
Denaturação: DNA alvo e sonda
Pré-tratamento:
Ácido acético
RNase e pepsina
Desidratação Etanol
formamida a 70oC ou estufa temperatura de
~80oC
Fluorocromos: Sondas
FITC-fluoresceína (verde)
Espectrum green ( verde)
Rodamina (vermelho)
Texas red (vermelho)
Hibridização sonda/DNA
(estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)
Lavagem pós-hibridização:
tampão 2xSSC (citrato de sódio)
Detecção da sonda e contracoloração:
iodeto de propídeo (PI) ou DAPI
ETAPAS
• Método para obtenção de núcleos
interfásicos a partir de tecido fresco
Material:
-núcleos interfásicos:
tecido fresco, congelado,
cortes histológicos,
esfregaços
-cromossomos
metafásicos: cultura
celular
Desagregação dos
núcleos
Fixação dos núcleos
ETAPAS
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento
(Ácido acético, RNase, pepsina)
Aplicação da sonda
ETAPAS
Hibridização
(câmera úmida
à 37oc)
Co-denaturação
Lavagem pós-hibridação
Tempo de vida
limitado das
lâminas:perda da
fluorescência
Contra-coloração
Análise ao microscópio
TIPOS DE SONDAS
Sondas que hibridizam estruturas
cromossômicas específicas:
-sonda alfa-satélite (centromérica)
-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D
e G)
-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16
e Y)
-sonda telomérica (telômeros)
Sondas de cópia única ou locus específica
Sondas de cromossomo inteiro – Wholechromosome painting
TIPOS DE SONDAS
TIPOS DE SONDAS
SONDAS CENTROMÉRICAS
Enumeração dos cromossomos e aneuploidias
SONDAS CENTROMÉRICAS
gastrite: -7
gastrite:+7
APLICAÇÃO:
aneuploidias em núcleos
interfásicos
úlcera: +8
Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
del (21q11.2)
Diagnóstico de doenças com microdeleção
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Mucosa normal:
Adenocarcinoma
gástrico:
TP53 (vermelho)
Deleção TP53
17 (verde)
1 sinal vermelho
Deleção do gene TP53 em câncer gástrico
SONDAS WCP – Cromossomo Total
SONDAS WCP – Cromossomo Total
Detecção de Translocação recíproca balanceada
SONDAS WCP – Cromossomo Total
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material
extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta),
B- Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois
cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como
tendo origem no cromossomo 9 (seta).
SONDAS TELOMÉRICAS
SONDAS TELOMÉRICAS
Aplicação:
-Deleções
terminais
-perdas
teloméricas
SONDAS TELOMÉRICAS
(cromossomo 5)
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes
e sequências gênicas
Estrutura e organização
dos cromossomos
Identificação de rearranjos
cromossômicos/ pequenas
deleções
Monitoramento de
indivíduos/populações
expostas à mutagênicos
Identificação de
alterações cromossômicas
em esperma
Diagnóstico Pré-Natal e
Pré-Implantação
Diagnóstico de neoplasias
Monitoramento de pacientes
leucêmicos/transplante de
medula óssea (doador de sexo
oposto)
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X:
aneuploidias mais comuns relacionadas
com idade materna avançada e
malformações fetais
Citogenética convencional: diagnóstico em
8-15 dias
FISH: resultado rápido (2-3 dias) em
células do líquido amniótico não cultivadas
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Normal
Trissomia do 21
Triplo X
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO
3 sinais vermelho: blastômero
com trissomia do 21
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
CCND1, c-MYC, HER2/Neu
TRANSLOCAÇÕES
t(9,22); t(8;14)
DELEÇÕES
TP53 (17p13), RB (13q13)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica
(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
TRANSLOCAÇÃO
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
TRANSLOCAÇÃO
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Schrock et al., Science 273:494-497, 1996
Identificação precisa e simultânea
de todos os cromossomos
humanos: diferentes cores
Princípio: medição simultânea de
todos os pontos do espectro
emitidos pela amostra na faixa
espectral visível e próxima a infravermelha: uso de múltiplas sondas
sobrepondo-se espectralmente
Sondas: com 5 diferentes
fluorocromos : Cy2, Spectrum
green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas
combinações
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Sondas dos 24
cromossomos
humanos marcadas
com 5 fluorocromos
em combinação
resultando em uma
cor diferente para
cada cromossomo.
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cor capturada
Classificação das cores pseudocoloridas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cromossomos marcadores
Cariótipo normal
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
A
t(1;16)
t(5;9;13)
-6
-8
t(6;8;15)
t(6;7)
t(6;15)
B
t(11;19)
-6
-8
Limitação:
-Cultivo celular – metáfases
-Não detecta
deleções/duplicações e inversão
Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas
humanas  várias homologias cromossômicas
BANDAMENTO COLORIDO
CROSS-SPECIES COLOR BANDING
BANDAMENTO COLORIDO
Permite a coloração sub-regional dos
cromossomos para análise do cariótipo
humano
Sondas: derivadas de primatas (gibões) do
genêro Hylobates concolor e Hylobates
syndactilus: cariótipos com extensa
reorganização cromossômica quando
comparado ao homem
Identificação de rearranjos cromossômicos:
inversões, deleções, duplicações, inserções,
translocações
BANDAMENTO COLORIDO
mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a
uma resolução de 550 bandas
(complemento haplóide)
BANDAMENTO COLORIDO
Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem reprocessada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser
detectada por este sistema.
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA
COMPARATIVA - CGH
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA
COMPARATIVA - CGH
Método para detectar simultaneamente ganhos e
perdas de regiões genômicas sem precisar de células em
divisão
Extração do DNA: células teste (tumor) e referência
(normal)
DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com
fluorocromos diferentes (vermelho e verde)
Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e
referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos
normais
Comparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao
longo do comprimento de cada cromossomo
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA
COMPARATIVA - CGH
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho:
excesso do DNA teste
(verde)
Deleção/perda:
excesso do DNA
normal (vermelho)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em
câncer gástrico (Guan et al., 2000)
array - CGH
-cromossomos
metafásicos
substituídos por
sondas de DNA ou
oligonucleotídeos 
chips DNA
Resolução:
0,5 Mb
array - CGH
Análise dos
sinais
fluorescentes:
analisador de
imagem, scanner
confocal ou
câmera CCD
http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html
array - CGH
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
1o. Microscópio -Leeuwenhoek
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
Array-CGH continua transformando a Citogenética:
-fornecendo alta-resolução
-tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações
cromossômicas.
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php