T73 - CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL
DE SOJA GENETICAMENTE MODIFICADA
N.G. Lemos1; R. Stolf2; S.R.R. Marin3; A.M. Polizel1; M.A. Beneventi4; N. Yamanaka5 ; A.L.
Nepomuceno3 1 UEL, 2 UNESP, 3 Embrapa Soja; 4 UFRGS, 5 JIRCAS (Japan International
Research Center for Agricultural Sciences)
Palavras chave: Soja transgênica, PCR em tempo real, Número de cópias.
INTRODUÇÃO
Recentes avanços em biotecnologia e engenharia genética têm tornado possível inserir
genes específicos no genoma de uma planta e obter um organismo geneticamente
modificado (OGM) (Kiihl, 2004). O uso de culturas transgênicas pode ajudar a aumentar a
produtividade de culturas, evitando, sobretudo, maiores desmatamentos e o aumento da
erosão dos solos provocados pelo uso da agricultura convencional (Souza, 2004).
Para obter uma planta geneticamente modificada viável, é necessária a identificação do
número de cópias e expressão do gene inserido, através de análises moleculares. Dentre
as técnicas para detecção do número de cópias de um transgene, o Southern blot é a
mais utilizada, apesar de ser mais trabalhosa e demorada, requerendo grandes
quantidades do material a ser utilizado. Além disso, em caso de perda do sítio de restrição
ou formação de concatâmeros, o número de bandas pode não corresponder com o
número de cópias (Mason et al., 2002). A técnica de PCR em Tempo Real se baseia na
detecção e quantificação de um repórter fluorescente, um sinal que aumenta na proporção
direta à quantidade do produto de PCR em uma reação (Ambion, 2004). O DNA molde
usado no PCR em Tempo Real pode ser tanto DNA genômico, quando se quer analisar
número de cópias em um genoma, quanto DNAc quando o objetivo é estudar os níveis de
expressão de um determinado gene. Na técnica de PCR em Tempo Real é possível
monitorar a reação durante todos os ciclos (Dorak, 2001).
O objetivo deste trabalho foi utilizar a técnica de PCR em Tempo Real para análise do
nível de expressão através de genótipos de soja gerados pela Embrapa Soja unicamente
para essa finalidade. O gene introduzido pela técnica de Biobalística foi o ahas, obtido de
Arabidopsis thaliana com uma mutação de ponto que confere resistência aos herbicidas
da classe das imidazolinonas.
MATERIAL E MÉTODOS
No processo de transformação, as construções gênicas foram introduzidas nos
embriões da cultivar MGBR 46 pela técnica de biobalística, de acordo com o método
patenteado pela Embrapa (Aragão et al., 2000). O fragmento introduzido conteve somente
o gene de interesse, sua região promotora e terminadora da construção pAG1. Para
análise de PCR das plantas transformadas, foram utilizados primers específicos que
amplificaram um fragmento 685 pares de base, localizado dentro do promotor e dentro da
seqüência codante do gene ahas.
As sementes positivas na geração R0 foram coletadas e ressemeadas até a geração R3.
Dezessete plantas positivas entre as duas últimas gerações (R2 e R3) foram escolhidas
para as análises moleculares. Foi conduzida nas plantas transformadas: Quantitativa
Relativa (QR) para avaliação dos níveis de expressão em cada evento.
A quantificação relativa foi realizada utilizando DNAc das 17 amostras de folhas das
plantas positivas para o gene ahas. As reações de PCR em Tempo Real foram realizadas
em triplicata, utilizado primers que geram fragmentos de aproximadamente 200 pares de
bases, sendo que o primer reverso está localizado sob a região de mutação do gene. Para
normalização das amostras, foi usado como controle endógeno o gene 18S RNAr (n0
acesso: X02623.1). Antes da avaliação dos níveis de expressão foi construída uma curva
de calibração para verificar a eficiência do sistema, que foi calculada pela fórmula E = [10(1/inclinação curva)
] –1 .Para as reações de PCR foi utilizado o kit Platinum� SYBR� Green qPCR
Supermix UDG (Invitrogen, Carlsbad, California, USA cat. 11730-017). Os primers foram
desenhados pelo programa PrimerExpress�, as reações conduzidas no Termociclador
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Mejoramiento Genético
para PCR em Tempo Real ABI 7300 e a análise dos dados foi feita pelo programa
Sequence Detection (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Foram montadas placas para a avaliação dos níveis de expressão, utilizando-se em
cada placa como controles positivos dois eventos gerados anteriormente na Embrapa,
sendo o evento controle com uma cópia confirmada por Southern blot e o evento 16 com
duas cópias estimadas por cálculos de segregação mendeliana, e um genótipo sem
inserção do transgene. Para essa quantificação, os eventos foram comparados em
relação ao nível de expressão somente em relação ao genótipo não transgênico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 170 plantas R0 regeneradas, 11 plantas foram positivamente confirmadas por PCR.
Na geração R1 apenas um indivíduo se apresentou positivo para o gene ahas. Nas
gerações seguintes (R2 e R3 ), foram utilizadas apenas sementes dessa planta positiva.
Na análise dos níveis de expressão, foi possível observar que eventos obtidos de um
mesmo evento de transformação apresentaram níveis de expressão diferentes entre eles,
e entre uma geração e outra. O evento controle, contendo uma cópia, foi o que
apresentou o menor nível de expressão (Figura 1). Segundo Andow et al. (2004), como a
inserção gênica é aleatória no genoma, o transgene pode integrar-se em regiões de alta
ou de baixa expressão gênica, ou até mesmo dentro de genes endógenos inativando-os,
ou adjacentes a eles alterando sua expressão. A recombinação genética que ocorre nas
gerações seguintes, dependendo dos loci de inserção na R0 , pode causar um desbalanço
nos níveis de expressão do gene de interesse e mesmo de genes nativos da planta
(Wilson et al., 2004). Os resultados mostraram também que os níveis de expressão
podem não estar diretamente relacionado com o número de cópias do evento.
1,8
1,6
Número de Cópias
1,4
1,2
1,0
0,8
1.
Controle
2.
306
3.
16
4.
102
5.
110
6.
122
7.
129
8.
131
9.
25
10. 29
11. 31
0,6
12. 36
13. 55
0,4
14. 96
15. 160
0,2
0,0
16. 165
17. 157
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
Eventos
Figura 1. Níveis de expressão relativo das amostras da geração R2,( 102, 110, 122, 129, 131) R3 (25,
29, 31,36, 55, 96, 160, 165, 157), evento controle e evento com duas cópias (16) em relação a
amostra controle (genótipo não transformado).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ambion. Disponível em <www.ambion.com>. Acesso em julho, 2004.
Andow Da, Somers Da, Amugune N, Aragão Fjl, Ghosh K, Gudu S, Magiri E, Moar Wj, Njihia S And Osir E
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Risk Assessment of Genetically Modified Organisms, v.1. CAB International, Wallingford, UK, p. 83-116, 2004.
Aragão, F.J.L., Sarokin, L., Vianna, G.R., Rech, E.L. Selection of transgenic meristematic cells utilizing a
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Dorak, M.T. Real Time PCR Special Issue. Methods Journal, v.25, 4, dez.2001.
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Mejoramiento Genético
Kiihl, T. A. M.; ARIAS, C. A. A. Behavior of soybean genotypes transformed with the AHAS gene wich confers
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Mason, M.; Provero, P.; Vaira, A.M.; Accotto, G.P. Estimating the number of integrations in transformed plants by
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Souza, L. Qualidade e segurança de alimentos transgênicos : percepção pública e científica. Disponível em
<www.anbio.org.br >. Acesso em agosto, 2004.
Wilson, A.; Latham, J. And Steinbrecher, R. Genome scrambling-induced mutations in transgenic crop plants.
Eco Nexus Technical Report
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Mejoramiento Genético