UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA
PCR em Tempo Real
PCR Quantitativa (qPCR)
DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA
PPG MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
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Histórico
• Descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus
colaboradores
• Acoplaram uma câmara de vídeo monitorando a PCR durante todos
os ciclos para detectar a fluorescência
• Ligação do EtBr às moléculas de dsDNA recém-sintetizadas
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Princípios da PCR em Tempo Real
• Metodologia de PCR + Sistema de detecção de sinais
fluorescentes
• Detecção, quantificação e amplificação de DNA em uma
única etapa
o Agilidade na obtenção de resultados
• Técnica quantitativa
o Quantificação do número de moléculas produzidas a cada ciclo
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Princípios da PCR em Tempo Real
• Etapas de amplificação de uma PCR convencional
o Temperaturas e tempos diferentes
o Curva de dissociação
• Coleta de dados
o Fase exponencial da reação
• Reagentes de uma PCR convencional + Corante
o Intercalantes de DNA de dupla fita (dsDNA)
o Oligonucleotídeos marcados
• Plataforma de instrumentação
o Termociclador + Sistema Óptico
o Computador com software para aquisição de dados e análise final
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Vantagens
PCR em Tempo Real
PCR convencional
• Coleta de dados na fase
exponencial
• SEM manipulação pósPCR
• Resultados quantitativos
• Requer concentrações de
DNA/cDNA 1000 x <
• Tempo
de
reação
reduzido
• Maior reprodutibilidade,
sensibilidade e precisão
• Coleta de dados na fase final
da reação (plateau)
• Manipulação pós-PCR
• Preparação de gel de agarose
- visualização
• Resultados qualitativos
• Requer
concentrações
maiores de DNA/cDNA
• Muito tempo para obter
resultados
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Aplicações
• Todas as aplicações da PCR tradicional
• Quantificação de carga viral
• Quantificação de expressão gênica
• Testes de eficiência terapêutica
• Detecção de agentes infecciosos
• Caracterização de agentes (Genotipagem)
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Princípios da PCR em Tempo Real
Curva de Amplificação
Amplificação
Exponencial
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
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Princípios da PCR em Tempo Real
Curva de Amplificação
Gráfico de Amplificação
A2
Fluorescência (Rn) Linear
A1
Baseline
background
Exponencial
Plateau
NTC
(no template
control)
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Princípios da PCR em Tempo Real
Curva de Amplificação
Gráfico de Amplificação
Fluorescência (delta Rn) Linear
A1
A2
Exponencial
Threshold
Baseline
NTC
Ct 14,5 Ct 20,8
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Princípios da PCR em Tempo Real
Curva de Amplificação
Fluorescência (delta Rn) Log
Gráfico de Amplificação
Exponencial
Threshold
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Princípios da PCR em Tempo Real
Reagentes - Mix
• Master Mix Comerciais
o Primers e DNA/cDNA
• Mix convencional
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Princípios da PCR em Tempo Real
Ciclagem
Tempo estimado: 00:57:34
12
Princípios da PCR em Tempo Real
Ciclagem
Tempo estimado: 00:47:37
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Princípios da PCR em Tempo Real
Otimização – Primers
• Desenho de primers (Produto de 100 – 150 pb)
• Determinar a concentração ideal de uso
• Utilizar uma concentração fixa de DNA/cDNA
• Gradiente da concentração dos primers
o 0,25 μM; 0,4 μM; 0,5 μM e 0,7 μM
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Princípios da PCR em Tempo Real
Otimização – Primers
• Analisar a “Curva de dissociação”
• Melhor concentração dos primers
• Menor
concentração
de
primers
–
Máxima
amplificação
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Princípios da PCR em Tempo Real
Validação – Primers
• Determinar a concentração ideal de uso
• Utilizar uma concentração fixa de primers
• Gradiente da concentração de DNA/cDNA
o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng
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Princípios da PCR em Tempo Real
Validação – Primers
• Analisar a “Curva de dissociação”
• Valores de “slope” e de “R2” – Eficiência
Concentração ideal dos primers (Otimização) determinada e validada
(Validação) → Reações Padronizadas
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
Detecção não-específica
• Fluoróforos ligando-se ao dsDNA e emitindo fluorescência
o SYBR-Green®
Detecção específica
• Oligonucleotídeos
marcados com fluoróforos altamente
específico a sequência alvo, emitindo fluorescência apenas na
presença do produto de PCR de interesse
o TaqMan®
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
• Fluoróforos ou Fluorocromos
• Cada molécula apresenta um espectro de absorbância e
emissão característicos
SYBR-green
Absorção máxima : 494 nm
Emissão máxima : 521 nm
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
TAMRA
Absorção máxima : 555 nm
Emissão máxima : 580 nm
FAM
Absorção máxima: 495 nm
Emissão máxima : 521 nm
TET
Absorção máxima : 519 nm
Emissão máxima : 539 nm
HEX
Absorção máxima : 537 nm
Emissão máxima : 556 nm
20
Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de
Detecção
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
Intercalantes de dsDNA – “green”
• Detecta produtos inespecíficos – dímeros de primers
• Fluoróforo disponível em suspensão
• Curva de dissociação
• Não permite multiplex
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
O
corante
liga-se
imediatamente a todos os
Amplificação dos genes
O corante liga-se a cada
alvos
nova cópia de dsDNA alvo
dsDNA
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
O corante liga-se a todos as moléculas
de dsDNA
Quando o DNA é desnaturado, o corante
dissocia-se
Início da fase de anelamento de primers
Polimerização é completada. O corante
liga-se ao produto de dsDNA e a
fluorescência aumenta
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
Oligonucleotídeos Marcados
• Detecta produtos específicos
• Permite Multiplex
• Não necessita curva de dissociação
• Sondas
o Corante reporter 5’ (fluorescente) e Corante quencher 3’ (silenciador)
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Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
26
Princípios da PCR em Tempo Real
Sistemas de Detecção
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Máquinas
Eppendorf
Mastercycler ep realplex
Corbett
Stratagene
Rotor Gene 6000
Mx series
28
Máquinas
Bio-Rad
Qiagen
Roche
Rotor Gene Q
LigthCycler
29
Máquinas
Applied Biosystems
7300/7500/7500 Fast/Step One/ Step One Plus
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Máquinas
Illumina
EcoTM Real-Time PCR System
31
Eco Real-Time PCR System
32
Eco Real-Time PCR System
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Ensaios
Quantificação Absoluta
• Correlacionar o número de cópias virais vs. estado de
uma doença – DNA/RNA
Quantificação Relativa
• Analisar alterações na expressão gênica em determinada
amostra relativa à outra amostra de referência (controle
não tratado) → Transcrição - RNAm
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Quantificação Absoluta
Curva Padrão
• Método para determinar o número exato de moléculas
(cópias de DNA ou ng de DNA)
• Determinar a concentração inicial de uma amostra de
concentração desconhecida a partir de uma curva padrão
de concentração conhecida
o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng
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Quantificação Absoluta
Curva Padrão
• Otimização e Validação dos primers
• “Standard” x Amostras Testes
• Amplificação
• Determinar a quantidade de “alvo”
• Parâmetros para conversão de concentração
o ng/µl → moléculas/µl
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Quantificação Relativa
• Método da Curva Padrão
o Exige menor quantidade de otimização e validação
• Método CT Comparativo
o Semelhante ao método da CP, porém utiliza-se fórmulas
aritméticas
o Experimento de validação – eficiência da amplificação do alvo e
do controle deverão ser ≈ iguais
o Aumenta rendimento (número de poços na placa)
o Elimina erro de diluição das amostras
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Quantificação Relativa
• Genes Alvo
o Genes de interesse
• Genes Endógeno – Referência
o Gene de expressão estável sob diferentes situações testadas
o Normalização de dados – Correção das variações entre amostras
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Quantificação Relativa
Método CT Comparativo – Método 2-ΔΔCt
• Eficiência das amplificações 90 – 110%
• Software já calcula
• Comparação dos valores CT amostras/controle
normalizados por genes endógenos
ΔΔCT= ΔCTamostra - ΔCTreferência
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Quantificação Relativa
Gene expression fold-change values derived from qPCR data. The changes in expression of four
genes: glucose-6-phosphate isomerase (GPI); granulysin (GNLY); granzyme B (GZMB); and granzyme H
(GZMH) in MCF-affected tissues were normalised to ribosomal protein S9 (RPS9) and plotted with
respect to equivalent tissues from control animals. Results of kidney transcript assays are in the light
columns while results of lymph node assays are in the dark columns
Russell et al 2012. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus
40
Research v169, p.246 – 254.
Bibliografia
•
Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in
Quantitative PCR
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf
•
EcoTM Real-Time PCR System User Guide http://www.illumina.com/ecoqpcr
•
Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time
Quantitative PCR. Disponível em: http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI__Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf Acesso em 08 de abril de
2013.
•
Higuchi R et al (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification
reactions. Biotechnology Nature Publishing Company 11, 1026-1030.
•
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using
realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) ) method. Methods 25, 402-408.
•
Oliveira TMS (2010). PCR em tempo real: métodos e aplicações. Dissertação de
Mestrado. Universidade de Aveiro
•
Russell et al (2012) Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine
herpesvirus 1. Virus Research v169, p.246 – 254.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
ANÁLISE TRANSCRICIONAL DO
PATÓGENO Enterococcus faecalis
VANCOMICINA RESISTENTE
DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA (BOLSISTA CAPES)
ORIENTADORA: PROFA. DRA. ANA PAULA GUEDES FRAZZON
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Justificativa e Objetivos
A espécie E. faecalis
• Comensal potencialmente patogênica
• Desenvolve estratégias para detectar, responder e se adaptar a
ambientes hostis – oportunista
• Relevância clínica – infecções x tratamento
o Verificar o comportamento de uma cepa EVR em ambiente simulado
frente à vancomicina
o Analisar a regulação in vitro de alguns genes relacionados a virulência
o Avaliar o conjunto de transcritos gerados
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In Vitro Evaluation of Biofilm Formation and Expression of Virulence-Related
Genes in Vancomycin Resistant Enterococcus Faecalis Isolated from Urinary
Tract Infection
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Objetivo
• Avaliar a resposta apresentada por uma cepa de E.
faecalis Vancomicina Resistente em um ambiente
simulado acrescido de urina (simulação de ITU) frente à
Vancomicina
• Expressão de genes relacionados a virulência
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Resultados e Discussão
qPCR
Fold Changes
100
80
60
tuf
40
20
0
bopA*
bopC*
vanA*
Expressão de genes de relacionados à virulência de VRE em caldo 2xYT/Urina tratados com vancomicina em
comparação ao controle (sem vancomicina) (* p ≤ 0,05).
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Conclusão
• A presença de vancomicina é capaz de estimular a regulação
de genes importantes na formação de biofilme
• A vancomicina induz a auto-expressão do vanA
• Administração de vancomicina pode estar contribuindo para o
aumento da virulência em isolados clínicos portanto, é
extremamente necessário ter cautela na prescrição deste
antimicrobiano
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Obrigada!
[email protected]