fmvz-unesp

TERAPIA CELULAR: PERSPECTIVAS NA
CLÍNICA DE PEQUENOS ANIMAIS
Profa Titular Fernanda da Cruz Landim
LABORATÓRIO DE REPRODUÇÃO AVANÇADA E TERAPIA CELULAR
Dep. Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ – UNESP – Botucatu
[email protected]
INTRODUÇÃO
O interesse em pesquisa com a utilização de
células-tronco na medicina veterinária está
relacionado ao seu uso em medicina
regenerativa e na utilização de animais como
modelo experimental para medicina humana
Meisner, 2009
CTS NA MEDICINA VETERINÁRIA
O uso mais comum das células tronco em
medicina veterinária de pequenos animais é para
o tratamento de osteoartrite em cães,
juntamente com a terapia para injurias ósseas,
articulações, tendões, ligamentos e lesões da
medula espinhal.
Características das células
tronco:
a) Células indiferenciadas e não especializadas,
b) Capazes de se multiplicar por longos períodos
mantendo-se indiferenciadas  capazes de originar
uma grande população,
c) Capazes de se diferenciar em células de um tecido
específico  fazem divisões assimétricas
Células Tronco Embrionárias
Totipotentes
Pluripotentes
Células Tronco Adultas
Unipotentes
Multipotentes
Pluripotentes – Embrionárias
e iPS
obtidas da massa celular
interna de embriões no
início de seu
desenvolvimento
Células germinativas
embrionárias
Células somáticas
transformadas
DESAFIO

É
conciliar
o
conhecimento
da
manipulação
de
células
tronco
embrionárias com protocolos para
diferenciação celular, visando à terapia
celular, na substituição de tecidos
lesados.
•Formação de Teratomas: Indução da formação
de tumores após transferência para receptores
A transferência de CTE para um indivíduo pode
resultar na formação de teratomas ou na
diferenciação de um tipo celular não desejado.
PROBLEMAS ÉTICOS PARA UTILIZAÇÃO DO EMBRIÃO
Celulas Tronco Adultas
encontradas em tecidos já
diferenciados de fetos, recém
nascidos ou adultos
presentes em quase todos
os tecidos do organismo
fazem a reposição celular e
originam novas células tronco
Células tronco Adultas
Multipotentes
Linhagem
hematopoiética
Conhecidas desde 1940
Presentes no:
Sangue da Medula óssea
Sangue periférico
Sangue da placenta e cordão
umbilical
Células tronco Adultas
Multipotentes
Linhagem
mesenquimal
(Friedenstein et al. 1966)
Células estromais
Aparecem na proporção de
0,001 a 0,01% no sangue da
medula óssea
No sangue periférico sua
concentração é de 0,00001%
Se diferenciam nos tecidos de
origem mesodermal
Alto potencial terapeutico
Cordão Umbilical
Fonte: Pesquisa Google
Tecido Adiposo
Membranas extraembrinárias
Fonte: Pesquisa Google
Fonte: Arquivo Pessoal
Terapia com CTM é um procedimento
promissor no tratamento de diversas
doenças degenerativas:
Fácil isolamento e expansão, multipotencialidade, efeitos parácrinos,
comportamento migratório e considerações éticas (BROOKE et al.,
2007).
Adicionalmente, tem sido revelado que essas células tem atividade
imunossupressora (DONALD et al., 2007)
Inicialmente acreditava-se no potencial de
transdiferenciação, o qual não foi comprovado
Fonte: CHEN et al. (2008)
É importante que o uso das células-tronconão
seja banalizado.
Que a terapia celular não seja utilizada para
qualquer doença e ou qualquer situação.
Necessidade de um grupo de especialistas
atuando conjuntamente no diagnóstico, parte
clínica e manipulação celular.
investimento alto
Coleta
Principais sítios de coleta para
obtenção de CTMs
MEDULA ÓSSEA

Agulha = Komiyashiki /Cateter intravenoso
Seringa = 5ml de heparina + 5ml de PBS
Punção = ~20ml
Coleta
Umero
MEDULA ÓSSEA
Tuberosidade Coxal
Coleta
TECIDO ADIPOSO
Cirurgias de conveniência
Coleta
TECIDOS FETAIS
Número e capacidade de diferenciação diminuem com a
idade: potencial terapêutico declina com o tempo
Cesareana
Isolamento
Separação da fração mononuclear

• Celulas
mononucleares
(Celulas
precurssoras,
linfocitos e
monócitos
(ZAGO e COVAS, 2006)
Isolamento
Processamento da Gordura/Tecido fetal

Fragmentação
Digestão com colagenase
Lavagem
Cultivo
Expansão
Características do cultivo
• Crescer aderida ao plástico
• Aspecto fibroblastóide
• Unidade formadora de colônias
• Formação de monocamada
• Não podem ser imortalizadas
Expansão
Cultivo celular


Meio de cultivo = DMEM/F12 + 20% de
SFB
Expansão
2 dias
Cultivo celular

Fonte: LANÇA - UNESP
BOTUCATU
Expansão
5 dias
Cultivo celular

Fonte: LANÇA - UNESP
BOTUCATU
Expansão
15 dias
Cultivo celular

Fonte: LANÇA - UNESP
BOTUCATU
Caracterização das CTM
Marcadores de superfície em conjunto: características
biológicas e funcionais das células

Diferenciação
O tratamento com baixa
O tratamento com
concentração de soro fetal
betaglicerolfosfato, ácido
bovino e TGF-β fazem com que
ascórbico, dexametazona e soro
as CTMs passem a secretar
fetal induz a modificação da
glicosaminoglicanos, matriz
morfologia das celulas que
cartilaginosa e colágeno do tipo
O tratamento com
passam a expressar fosfatase
II
alcalina e depositar matriz isobutilmetilxantina faz com as
CTMs passem a acumular
extracelular rica em cálcio
gotículas lipídicas no citoplasma
e se diferenciem em adipócitos
Diferenciação osteogenica
Diferenciação adipogenica
Oil red
Alizarin red
Diferenciação condrogenica
Fonte: LANÇA - UNESP
BOTUCATU
Azul de toluidina
Alcian blue
O que acontece com as CTM após o transplante ?
Inflamação:
Redução da ativação
de linfócitos T
Redução da infiltração
de macrofagos e
ativação da microglia
Produção de citocinas
pro- e anti-inflamatórias
Angiogenese
Redução da
apoptose
Produção de
Fatores tróficos
Qual tipo de célula utilizar?
Medula óssea
Tecidos Fetais
Gordura
Qual tipo de célula utilizar?
Homologa
Coletada do mesmo animal
Vantagens
Desvantagens
Antigenicidade nula
Demora entre a
colheita e a aplicação
Qual tipo de célula utilizar?
Heteróloga ou
Alogenica
Vantagens
Formação de bancos
Desvantagens
Possibilidade de
rejeição ????
Laboratório de Reprodução Avançada e
Cultivo Celular + Ambulatório de acupuntura e
fisioterapia
FMVZ – UNESP, Botucatu
Casos tratados:
• Não união óssea
• Osteoartrite
• Ruptura de ligamento
• Incontinencia urinária e de esfincter
• Trauma raquimedular
• Protusão de disco intervertebral
•Sequelas de cinomose
% sucesso
90%
80%
50%
40%
20%
30%
70%
Terapia Celular:
Obtenção de resultados
Avaliação clínica
e escolha da
casuística
• Quando iniciar o tratamento?
• Quantas aplicações?
• Qual a concentração de células?
• Qual a via de administração?
Terapia com CTMs para não união óssea
10 animais
fraturas de ossos longos
2 anos  cirurgias prévias
Destinados a amputação
Terapia com CTMs para não união óssea
CT no foco
de fratura
15 dias
30 dias
60 dias
Baby - Incontinencia
Madona - Discopatia
Maradona - Osteoartrose
Lupita - Cinomose
AGRADECIMENTOS:
Rogério Amorin
Jean Joaquim
fmvz - unesp
• Danielle Barberine
• Celina Okamoto
• Marianne Camargos dias
• Leandro Maia
• Isadora Arruda
• Marina Landim Alvarenga
OBRIGADA PELA
ATENÇÃO
[email protected]