Avaliação dos genes acessórios de
HIV e polimorfismos humanos no
sucesso terapêutico contra AIDS
Renato S. Aguiar
Laboratório de Virologia Molecular
Universidade Federal do Rio de Janeiro
HIV
AIDS
HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS - HIV
 Family: Retroviridae (Reverse Transcriptase – RT)
 Genus: Lentivirus (enveloped virus with a conical capsid and slow progression)
gp120
gp 41
matrix
envelope
Capsid
Viral RNA
HIV-1 GENOMA
Genoma duas moléculas de vRNA (DIS)
Proteínas  sintetizadas como poliproteínas precursoras
Proteínas essenciais: Gag, Pol e Env
Proteínas regulatórias: Tat, Rev e Nef
Proteínas acessórias: Vpr, Vpu e Vif
5’ LTR
gag
MA CA
3’ LTR
~ 9 kb~ 9 kb
NC
vif
rev
nef
P6
pol
PRO
RT
nef
tat
INT
vpr
vpr vpu
SU
env
TM
REPLICATIVE CYCLE – early stages
Receptors
Reverse transcription
Fusion
Uncoating
Integration
HIV replication – Late steps
Assembly
Budding
Env proteins
Imature
Translation
Mature
Transcription
PATOLO
AIDS PATOLOGIA
Infeçção aguda ao HIV
Células T CD4+ (células/mL)
Infecção
Oportunística
Latência Clinica
Começo dos
Sintomas
AIDS
Semanas
Anos
Tempo de Infecção
Cópias de RNA do HIV (cópias/mL plasma)
Morte
Infecção
Primária
ANTIRETROVIRALS TARGETS
Fusion
Inhibitors
Integrase
Inhibitors
Protease
Inhibitors
NRT
Inhibitors
INIBIDORES
NNRT
NNRT
DE RT
Inhibitors
FATORES QUE INFLUENCIAM
A FALHA TERAPÊUTICA
• Fatores Virais
Mutações
(IAS,2011)
de
Resistência
Aderência
• Fatores do Hospedeiro
Variação
Genética
TRANSCRIPTASE REVERSA - RT
 Ausência de atividade revisora
 Taxa de mutação da RT: ~ 2,5 x 10-4
mut / nt / ciclo replicativo
 Geração de partículas: 109 a 1010 por
ciclo replicativo.
1o salto da RT
RNase H degrada
RNA, exceto PPT
RT utiliza PPT
como primer fita +
2o salto da RT
EVOLUÇÃO DE HIV
PACIENTES:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Vírus isolados de 9 pacientes coletados em diferentes datas e de diferentes
compartimentos. Árvore filogenética construída a partir do gene de envelope (1.122
sequências de 822 pares de bases)
Mutações Virais
(IAS, 2011)
Dinâmica viral na resistência
Resistência secundária
Coffin JM, 1995
Camacho, R (2000)
Além da atividade da RT para a geração de
diversidade de HIV, vamos adicionar a atividade
da APOBEC.
HIV-1 restriction of Apobec proteins
G→A
Hypermutations
CYTOSINE DEAMINATION DOMAIN - CTD
All proteins in this family have one or two CDA motifs harboring one histidine
and two cysteine residues, and the glutamic acid residue that are involved in the
hydrolytic deamination of cytosine. The zinc-binding motif is highlighted.
HYPERMUTATIONS IN HIV SAMPLES FROM PATIENTS
• high content of mutations
• stop codons creation
• viral proteins inactivation
• decrease of viral replication
APOBEC proteins family
• A1
apoB mRNA edition
(colesterol transport)
• AID
Somatic hypermutation
antibody gene
diversification
• A2
Unknow function
•A3 (A3A – A3H)
Inate Immunity
Antiviral restriction (HIV,
SIV, MLV, MMTV, HBV e
HTLV-1)
Retroelements inhibition
If APOBEC proteins are so
effecient in HIV restriction WHY
virus still replicates?
HIV-1 genes
non-productive infection
cytidine deamination
(G to A transitions)
A3G
A3F
RT
HIVVif
DNA degradation
mutant HIV
producer
cells
target
cells
RT
reverse transcription
A3G, A3F
Vif
HIV
26S
Ub
SCF
Integration
productive infection
The mechanism of Vif-dependent APOBEC3G degradation
Vif binds APOBEC3G and forms a complex that recruits the cellular proteins
elongin B and elongin C, which then mediate cullin-5 dependent ligation of ubiquitin (Ub)
to APOBEC3G and posterior degradation.
NO ENTANTO, se existirem mutações em vif que
diminuam sua atividade mas não com perda de
função o genoma viral pode ser hipermutado por
APOBEC gerando diversidade e resistência aos
antiretrovirais.
They show that naturally
occurring HIV-1 Vif point
mutants with suboptimal antiAPOBEC3G activity induce the
appearance of proviruses with
lamivudine (3TC) drug
resistance-associated mutations
before any drug exposure
640 samples of individuals with treatment failure, using RT
and protease inhibitor from clinical follow-up in the Brazilian
program National Network of HIV-1 genotyping (RT e PRO)
The levels of hypermutations of each sequence were
evaluated using the software:
www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.ht
ml.
Using a subtype B standard, 11 samples profile
hypermutation P <0.09, 7 samples showed hypermutation
profile of P <0.05. Mutation M36I, L63P, L89M, I93L at the
protease, K103N, M184V at the RT more frequently.
We found other vif polymorphism with high frequency
between amino acids 33-39, and 122-128
“Avaliação da atuação das proteínas
APOBEC na integrase de pacientes
controladores”
Dra. Mariza Morgado
Dra. Caroline Passaes
Long Term Non Progressors
Controladores de elite (EC)
Controladores virêmicos
(VC)
● Pacientes com carga viral
● Pacientes com carga viral
indetectável (<50 cópias/ml).
● Apresentam contagem alta de
células T CD4+.
detectável (<2000 cópias/ml).
● Apresentam contagem alta de
células T CD4+.
● Apresentam contagem baixa de
● Apresentam contagem baixa
de células T CD8+.
células T CD8+.
Tabela 1: Características clínicas dos pacientes controladores do HIV
NA – não analisados
Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador
● DNAg
amplificação dessa
região
● primers
externos
● primers
internos
Funcional Vif
Funcional IN
Transfectar em
293T
+ PCR da
integrase
NL43-Luc
ΔIN
Transfectar em 293T
+ A3G
+ NL43Luc ΔVif
IN de paciente EC13
hipermutados
Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador
● DNAg
amplificação dessa
região
● primers
externos
● primers
internos
Funcional Vif
Funcional IN
Transfectar em
293T
+ PCR da
integrase
NL43-Luc
ΔIN
Transfectar em 293T
+ A3G
+ NL43Luc ΔVif
FATORES QUE INFLUENCIAM
A FALHA TERAPÊUTICA
• Fatores Virais
Mutações
de
Resistência
(IAS,2011)
Aderência
• Fatores do Hospedeiro
Variação
Genética
VARIAÇÃO GENÉTICA
Recuperação dos níveis de CD4
» Respondedores x Não Respondedores
Imunológicos
Farmacodinâmica/Metabolismo
» Reações Adversas
Resistência Celular
» Influxo/Efluxo Celular
MECANISMOS DE ENTRADA
H
O
S
P
E
D
E
I
R
O
Drogas
MECANISMOS DE ENTRADA
Mutação
H
O
S
P
E
D
E
I
R
O
Drogas
MECANISMOS DE EFLUXO
Efluxo
de
Drogas
H
O
S
P
E
D
E
I
R
O
Droga
MECANISMOS DE EFLUXO
Efluxo
de
Drogas
H
O
S
P
E
D
E
I
R
O
Mutação
Droga
Variações Genéticas - Polimorfismos
Single-Nucleotide Polymorphism – SNP
Genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e
ABCB1
C
R
O
M
O
S
S
O
M
O
6
SLC22A3
6q25.3
SLC22A2
SLC22A1
SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3
Transportadores de Cátions Orgânicos
OCT-1, OCT-2, OCT-3
C
R
O
M
O
S
S
O
M
O
7
7q21.12
ABCB1
ABCB1
Proteína Associada à Resistência a Múltiplas Drogas
Glicoproteína P
OBJETIVO GERAL
Caracterizar a associação entre os
polimorfismos de base única (SNPs) dos genes
relacionados ao transporte de antirretrovirais
com a falha terapêutica na população de
pacientes HIV+ da região sul do Brasil
Objetivos Específicos
• Caracterizar a frequência dos SNPs e dos
haplótipos dos genes SLC22A1, SLC22A2,
SLC22A3 e ABCB1 na população de
pacientes HIV+ da região sul do Brasil;
• Caracterizar a associação dos SNPs dos
genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e
ABCB1 com a falha terapêutica;
• Caracterizar o impacto dos SNPs associados
com a falha terapêutica em ensaios funcionais.
Amostras – Projeto sul (2008)
PACIENTES EM TRATAMENTO
Curitiba, Porto Alegre – 350
CONTROLE
CASO
Sucesso
Falha
terapêutico desde a
1ª linha de
tratamento, com
acompanhamento
de pelo menos 6
meses
120
terapêutica na 1ª
linha de
tratamento
117
Variáveis Demográficas
♂
Controle
Caso
Valor p
76 (63,33%)
68 (58,12%)
>0,05*
♀
43 (35,83%)
47 (40,17%)
PR
70 (58,33%)
74 (63,25%)
>0,05*
RS
Idade
Me Idade
50 (41,67%)
43 (36,75%)
38,84 ±10,12
34,50 ±10,04
38 (21-68)
33
(9-61)
<0,05**
-
*Teste Chi2; **Teste Mann-Whitney
Preparação das Amostras
Qiaamp DNA Mini and
Blood Mini Handbook
NanoPhotometer™
Pearl
Spectrophotometer
Diluição das amostras para 50ng/mL
SNaPshot®
SLC22A1
10 SNPs tipados – informação de 21 SNPs
Amplificação de 7 fragmentos que contêm os 10 SNPs por
MULTIPLEX®
100
bp
Padronização
Multiplex®
C-
177 251
273 433 492
534 583
1kb
plus
500
400
500
400
300
300
200
200
100
100
TESTE PRIMERS
Reação de SNaPshot®
SNAPSHOT
MULTIPLEX
H
A
T
H
TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA G
C
H
G
H
H
H
H
H
CTCCAACACGACATCGCCGCA
TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA
TGCCCTTTTCTTCTTTGCTGTTTGC
Polimorfismo
Ancestral
Purificação
Purificação
com SAP
SAP e ExoI
24bp
®
OpenArray
SLC22A2
12 SNPs tipados – informação de 38 SNPs
SLC22A3
4 SNPs tipados – informação de 11 SNPs
ABCB1
Total de Marcadores
156
16 SNPs tipados – informação de 86 SNPs
Ensaio TaqMan®
Média/Larga Escala
Total de genótipos/amostras por lâmina – 3072/96
96
AA
amostras
AG
GG
RESULTADOS
OPEN ARRAY
rs1045642
384
AA
AG
amostra
GG
Equilíbrio
de HW
GeneMapper
(SNaPshot)
TaqMan
Genotyper
(OpenArray)
Desequilíbrio
de Ligação
R
Regressão Logística
(com ou sem ajuste)
Correção para
comparações múltiplas
(Bonferroni, FDR)
Resultados
Estudo de Desequilíbrio de Ligação
Medida de associação – r2
RESULTADOS
TABELA DE P VALOR
rs9282564
0.65301
rs3842
0.04544
rs17588242 0.64928
rs17327624 0.95093
rs1867351
0.23927
rs10945657 0.30444
rs1202172
0.72461
rs683369
0.40158
rs315978
0.91938
rs10280623 0.76100
rs628031
0.33814
rs316003
0.37963
rs1202170
0.03931
rs35167514 0.00050
rs316002
0.62532
rs1128503
0.04411
rs1382785
0.89969
rs3103352
0.58021
rs2235035
0.09278
rs622591
0.03768
rs2292334
0.27222
rs6961419
0.03394
rs316019
0.94504
rs2048327
0.19087
rs11760837 0.43903
rs2279463
0.60016
rs1810126
0.08060
rs1045642
rs315996
0.66321
rs3088442
0.28258
0.63961
Resultados
Estudo de Associação
rs35167514 – 420del (A)
SLC22A1 (éxon)
Genótipo
N frequência
Casos
Controles
Modelo de Regressão Logística
com Correção (Idade, Sexo,
Modelo de Regressão Logística
Região)
FRAMESHIFT
OR (p value)
IC 95%
OR (p value)
IC 95%
AA
47 (46,5) 76 (73,1)
Referência
Referência
Referência
Referência
A_
51 (50,5) 27 (26,0)
3,05
1,69-5,52
3,17
1,71-5,86
0,49-48,01
5,27
0,50-55,92
__
3 (3,0)
1 (1,0)
4,85
101
104
0,0005
0,0004965
0.0001261
>1 = Risco de
Falha
OR
PERSPECTIVAS
• Análise multivariada das 237 amostras tipadas
considerando ancestralidade e tratamento;
• Analisar o desfecho mutação de resistência para
os SNPs que se mostraram associados;
• Confirmar a associação encontrada por
sequenciamento;
• Validar os SNPs significativos em testes
funcionais.
contact: [email protected]
UFRJ-Brazil
Agradecimentos
• Amilcar Tanuri - UFRJ
• Rodrigo Brindeiro – UFRJ
• Cynthia Chester - UFRJ
• Mariza Morgado – Fiocruz
• Carolina Passaes - Fiocruz
• Juliana Dias - UFRJ
• Veronica Bichara
Secretaria de
Vigilância em
Saúde