APLICAÇÃO E TESTES DO MÉTODO APHA-4500-NO3-C PARA DETERMINAÇÃO DE NITRATOS EM
ÁGUAS POR LEITURA EM UV COM SEGUNDA-DERIVADA
Fernando Mota de Oliveira
Correspondência
Rua das Codornas, 202, ap-606, Imbuí, Salvador-BA, CEP-41.720-020
e-mail: [email protected]
Resumo
a
2
Até a 20 . edição do manual de “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” o único
método de Nitrato por UV (4500-NO3-B) era por leitura em um único comprimento de onda (220nm) e
considerado de “Screening” (teste de verificação da presença) por sofrer interferências facilmente,
a.
1
especialmente de matéria orgânica. Na 21 edição o método por UV com segunda-derivada foi incluído
como método “proposto” uma vez que diversas interferências do método por leitura direta já não ocorriam.
Neste trabalho adaptamos o método para que possa ser usado em qualquer espectrofotômetro com
capacidade de leitura na região UV, testamos as principais possíveis interferências e detalhamos a
execução do método.
Summary
th
2
Until the 20 edition of the “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” , the single
Nitrate analytical method by UV (4500-NO3-B) was in single reading at 220nm an called “Screening method”
st
1
with known interferences, specially from organic matter. In the 21 edition , a Nitrate analytical method by
UV readings with second-derivative was found as a “Proposed” Method once many interferences of the
direct reading at UV no more occurred. In this work we adapted this method in a way it may be used in any
spectrophotometer that can read in the UV region, we tested the main possible interferences and the
execution of the method was detailed.
Introdução
Os nitratos absorvem fortemente na região ultravioleta (UV), mas a leitura em único comprimento de onda
não é viável porque a matéria orgânica natural e outros compostos solúveis também absorvem radiação
nesta região do espectro. No entanto o espectro (Figura-1) dos nitratos mostra uma curva com inflexão na
região de 220nm, o que não ocorre com outros compostos. Desta forma, trabalhar com a segunda-derivada
ao invés de absorbância é o que permite que se obtenha um método adequado.
Figura 1. Curva de Absorbância de uma solução com 2mg/L de N-NO3
Os Nitritos também absorvem na região ultra-violeta, mas geralmente apresentam-se em teores bem mais
baixos. Os bicarbonatos absorvem abaixo de 210nm, mas não afetam a segunda-derivada dos Nitratos. Os
brometos interferem em teores típicos de água do mar (68mg/L, salinidade 35%o) de modo que o método
não se aplica a águas do mar. Os testes que fizemos neste trabalho comprovam a amplitude desta
interferência. O método original descreve que Ferro e Cobre interferem seriamente na faixa de 20mg/L o
que é algo extremamente raro de ocorrer. O método foi testado em águas potáveis e a viabilidade para o
uso em efluentes e esgotos não foi testada. Os testes que fizemos em água de uma lagoa relativamente
poluída mostraram viabilidade do método nesta matriz. A forma como fizemos o teste de interferência
4
(Seletividade/Especificidade ) pode ser aplicado em outras matrizes.
O método original requer que o espectrofotômetro possa calcular segunda-derivada através do software
original ou através de uma interface computadorizada, o que não é viável para muitos laboratórios. Fizemos
uma adequação do método realizando a leitura em 03 comprimentos de onda e um cálculo simples de
segunda derivada, da mesma forma que se encontra o ponto de inflexão em curva de titulação eletrométrica
ao se utilizar aparelho não computadorizado.
Os seguintes testes foram feitos:
a) Calibração: Preparo de curva analítica em água ultra-pura.
4
b) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água do mar diluída 10 vezes.
4
c) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água de lagoa.
4
d) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada.
4
e) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada com adição de Matéria
orgânica.
4
f) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada com adição de Bicarbonato
4
g) Validação : Repetitividade e %Recuperação do método a 2mg/L.
3
h) Validação : Limites de Detecção e Quantificação do método.
Os testes preliminares foram feitos em um espectrofotômetro “FEMTO 700 Plus” sem interface
computadorizada, com bons resultados, e concluídos em um espectrofotômetro “VARIAN Cary 5E”, que
embora seja computadorizado, com capacidade de cálculos de segunda-derivada e com feixe duplo foi
utilizado com leituras simples em feixe simples. O uso de 02 equipamentos diferentes ocorreu apenas em
função de disponibilidade dos equipamentos e também serviu para mostrar a viabilidade do método em 02
instrumentos bem diferentes.
Descrição do Método Analítico
Reagentes
a) Solução estoque de Nitrato a 100mg/L de N-NO3 (a)
b) Água destilada, ultra-pura ou isenta de nitratos.
(a) Atenção: O comum é que o padrão e as amostras sejam calculados como N-NO3 (Nitrogênio) ao invés de NO3 (Nitrato).
Aparelhagem
a) Espectrofotômetro capaz de fazer leituras em 210nm, 220nm e 230nm.
b) 02 cubetas “casadas”, ou de mesma origem, de quartzo com 10mm de caminho ótico. Opcionalmente
usar somente uma (b)
c) Aparelhagem para filtração de amostras.
(b) Cubetas de vidro causam interferência na região UV, sendo inviável o uso. Normalmente as cubetas de Quartzo são marcadas
como “QS” e as de vidro como “GS”. O uso de apenas uma cubeta aumenta o trabalho das leituras.
Procedimento
a) As amostras podem ser preservadas por adição de ácido sulfúrico ou de ácido clorídrico caso não
venham a ser lidas dentro de 48 horas. Para mais detalhes de preservação para diversos parâmetros
1
ver o capítulo do manual Standard Methods a este respeito.
b) Amostras que apresentem turbidez devem ser previamente filtradas.
c) Encha uma cubeta com água destilada e uma com Amostra ou Padrão (c).
d) Ajuste o espectrofotômetro a 210nm, zere com água e anote a absorbância da amostra ou padrão.
d) Repita o item anterior a 220nm e 230nm sempre zerando com a cubeta com água antes de cada leitura.
e) Tabele os resultados e calcule a segunda-derivada como “(Abs210 - Abs220) - (Abs220 - Abs230)”
f) Para as amostras, calcule os teores com base na equação da curva analítica.
(c) Tendo-se uma única cubeta
a) Encha a cubeta de água, ajuste a 210nm e zere o instrumento.
b) Leia (sem zerar) as absorbâncias da água a 220nm e 230nm anotando.
c) Ainda sem zerar leia as absorbâncias das amostras ou padrões a 210nm, 220nm e 230nm
subtraindo das leituras da prova em branco as leituras a 220nm e 230nm.
Curva Analítica
A curva analítica deve ser feita por leitura de padrões de N-NO3 a 0,5mg/L; 1,0mg/L; 2,0mg/L e 4,0 mg/L
obtidos por diluição da solução estoque a 100mg/L de N-NO3. Os pontos de calibração podem ser
modificados se o aparelho em uso apresentar linearidade apenas até 2,0 mg/L, que é o recomendado no
método original.
a
Considerando concentração no eixo Y e 2 . derivada no eixo X (d) obtenha a curva:
a
mg/L N-NO3 = “2 . derivada” X Inclinação + Intercepto
(d) Embora a estatística recomende a concentração no eixo X, o químico analista perceberá facilmente várias vantagens de se plotar a
concentração no eixo Y, especialmente ao tratar coisas como limite de detecção e incerteza da curva analítica.
Exemplo de Curva Analítica
A Tabela 1 mostra um exemplo de preparo de curva analítica.
Abs210
0,2894
0,5778
1,1632
2,4968
Abs220
0,1346
0,2672
0,5261
1,1433
Abs230
0,0294
0,0597
0,1153
0,2551
2a. Derivada
0,0496
0,1031
0,2263
0,4653
Concentração
0,50
1,00
2,00
4,00
Inclinação
8,37
Intercepto
0,11
correlação
0,9999
Tabela 1. Exemplo de Dados para curva analítica
a
mg/L N-NO3 = “2 . derivada” X 8,37 + 0,11
Os valores foram tratados em Excel, considerando a concentração como Y e a segunda derivada como X.
Foram usadas as funções do Excel “Inclinação”, “Intercepção” e “Correl”, respectivamente.
Validação do Método
4
Repetitividade e % Recuperação
Uma água tratada contendo 0,24mg/L de Nitratos teve adição de mais 2mg/L, totalizando 2,24mg/L de NNO3. A mesma foi analisada por um mesmo analista no mesmo instrumento. A Tabela 2 mostra os
resultados.
Resultado 1
Resultado 2
Resultado 3
Resultado 4
Resultado 5
Resultado 6
Resultado 7
Resultado 8
Resultado 9
Resultado 10
Média
Desvio Padrão
Repetitividade (D. Padrão x 2,772)
2,18
2,11
2,13
2,17
2,14
2,14
2,16
2,16
2,13
2,15
2,15
0,02
0,06
Coeficiente de Variância (%CV)
1,0
%Recuperação
96
Tabela 2. Resultados dos testes de Repetitividade
3
Limites de Detecção e Quantificação
Observando que a curva analítica tem grande influência neste método analítico escolhemos o método
4
“Houbax & Vox” para determinação do Limite de Detecção. A leitura de provas em branco poderia ser uma
boa alternativa também.
Foram preparados 03 padrões de 0,1mg/L, 03 padrões de 0,2mg/L e 03 padrões de 0,3mg/L com os quais
se preparou uma curva analítica com dados próximos do limite de detecção esperado (0,1mg/L). A curva foi
obtida com ajuda do Excel (plotando concentração como Y) como mostra a Figura 2. Os valores de
intercepto, inclinação e correlação também foram obtidos diretamente com funções do Excel. O cálculo de
RSD (Residues Standard Deviation ou Desvio Padrão dos Resíduos) foi obtido comparando os valores de
concentrações calculadas contra concentrações reais. A Tabela 3 mostra os dados usados para o cálculo
de RSD e LD. Observar que o RSD representa a incerteza da curva analítica.
a
Abs210 Abs220 Abs230 2 . Deriv.
0,0711 0,0319
0,007
0,0143
0,0708 0,0328 0,0079
0,0131
0,0662 0,0307 0,0064
0,0112
0,1347 0,0611 0,0134
0,0259
0,1342 0,0625 0,0153
0,0245
0,1311 0,0607 0,0129
0,0226
0,2659 0,1246 0,0269
0,0436
0,2647 0,1231 0,0288
0,0473
0,2614 0,1214 0,0263
0,0449
D
2
Soma =Soma de (yCalc-yRreal)
a
Conc. = “2 . Deriv.” * 5,94 + 0,037
D
RSD =Raiz (Soma / (n-1))
LD = 3 * 0,017 + 0,037
LQ = 10 * 0,017 + 0,037
Conc. (yCalc-yRreal)
0,1
0,000470
0,1
0,000212
0,1
0,000011
0,2
0,000089
0,2
0,000315
0,2
0,000843
0,3
0,000019
0,3
0,000311
0,3
0,000011
D
Soma =>
0,002281
RSD
LD
LQ
2
0,017
0,09
0,21
Tabela 3. Dados para cálculo de RSD e LD
N-NO3: Determ inação LD via Houbax/Vox - m g/L N-NO3 e 2a Derivada
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
Figura 2. Curva analítica dos dados para cálculo de LD e LQ
Seletividade/Especificidade
3
0,04
0,045
0,05
Uma das formas mais utilizadas para caracterizar interferências é pela comparação da curva analítica obtida
na padronização, normalmente por adição de padrão em água ultra-pura ou destilada, com curvas obtidas
1
por adição de padrão em matrizes possivelmente interferentes. O manual de Standard Methods define que
se houver uma variação superior a 10% no valor de inclinação da curva preparada com a matriz em teste
deve-se considerar que a matriz causa interferência. Não acreditamos que estes testes possam garantir
absolutamente ocorrência ou não de interferência em todos os casos, uma vez que interferência costuma
ser algo imprevisível algumas vezes. Mas é um teste bastante válido para a maioria dos casos. Uma rotina
de Controle da Qualidade Analítica com uma certa freqüência com adição de padrão em matrizes
“suspeitas” complementa a garantia dos resultados.
Fizemos os testes para validação do método em algumas matrizes suspeitas por comparativo das
respectivas curvas analíticas com a curva analítica da padronização do instrumento, preparada com água
ultra-purificada. As Figuras 3 a 8, que seguem são auto-instrutivas.
Observar que todos os testes, inclusive a calibração, foram feitos por adição 0,5mg/L; 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L
e 4mg/L. Os teores originais obtidos pelas análises das respectivas matrizes foram somados a estes valores
para lançamento nos gráficos.
Curva Analítica: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5
y = 8,451x + 0,108
R2 = 0,999
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Figura 3. Curva analítica preparada em água ultra-pura
Adição de Padrão em água do mar: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5
y = 7,503x - 1,154
4
R2 = 0,992
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
Figura 4. Curva obtida por adição de padrão em água do mar diluída 10 vezes.
0,800
Adição de Padrão em água de lagoa: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5
y = 8,055x - 0,086
R2 = 0,995
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
Figura 5. Curva obtida por adição de padrão em água de lagoa
Adição de Padrão em Água Tratada: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5
y = 7,978x + 0,112
R2 = 0,995
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
Figura 6. Curva obtida por adição de padrão em água tratada
0,500
0,600
Adição de 10m g/L M.O. em água tratada: N-NO3 m g/L e 2a. derivada
5
y = 8,510x + 0,239
R2 = 0,999
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
Figura 7. Curva obtida por adição de padrão em água tratada que sofreu adição de 10mg/L de Matéria
Orgânica proveniente de Leite de vaca (gordura, proteínas, carbohidratos, etc.)
Adição de 200m g/L Bicarbonato em água tratada: N-NO3 m g/L e 2a. derivada
5
y = 9,262x + 0,077
4,5
R2 = 0,999
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
Figura 8. Curva obtida por adição de padrão em água tratada que sofreu adição de mais 200mg/L de
Bicarbonato de Sódio
Resultados da validação
Desvio Padrão da Repetitividade a 2mg/l em água
tratada
Coeficiente de Variância a 2mg/L
Repetitividade a 2mg/l (k=2,772)
%Recuperação a 2mg/L
Linearidade e faixa de trabalho
0,02 mg/L
1,0 % (*)
0,06 mg/L
96 %
Testado até 4mg/L com um bom valor de r (0,999).
O manual de Standard Methods1 recomenda
valores de pelo menos 0,995, se não for definido
um valor no método.
Limite de Detecção
0,09 mg/L
Limite de Quantificação
0,21 mg/L
Sensibilidade
Inclinação da curva analítica 8,45
Interferências em água do mar diluída 10 vezes
Inclinação da curva 7,5. Variação de –11%, que
indica interferência, apesar da diluição. O
intercepto muito negativo (-1,15) também indica
problemas.
Interferências em água de lagoa
Inclinação da curva 8,06. Variação de –4,6% que
indica ausência de interferência.
Interferências em água tratada
Inclinação da curva 7,98. Variação de –5,6% que
indica ausência de interferência.
Interferências em água tratada com 10mg/L de Matéria Inclinação da curva 8,51. Variação de 0,7% que
Orgânica (de leite de vaca)
indica ausência de interferência.
Interferências em água tratada com adição de mais
Inclinação da curva 9,26. Variação de 9,6% que
200mg/L de Bicarbonato de Sódio
indica ausência de interferência, apesar do elevado
teor adicionado de Bicarbonato.
(*) O método cita em “precision and bias” que a diferença entre o método por Cromatografia a líquido e este método foi de 0,5mg/L na
faixa de concentração de 40mg/L, ou seja 1,25%. Consideramos os valores obtidos compatíveis com o citado no método original.
Infelizmente o método não cita valores de repetitividade nem de %Recuperação, LD, LQ, etc.
Conclusões
O método de Nitrato por UV com Segunda derivada mostrou-se um método de fácil aplicação, de execução
fácil, sem qualquer gasto de reagentes e aplicável às matrizes mais comuns (água tratada e água bruta)
para análises em laboratórios prestadores de serviços.
2
Comparando-o com o método da coluna de Cádmio percebe-se uma grande vantagem de custos de
materiais e de tempo de ocupação dos Analistas. Comparando-o com métodos de kits as principais
vantagens são o fato de ser um método oficial e não ter gastos de reagentes.
O principal requisito para a sua aplicação é ter um espectrofotômetro com capacidade de leitura na região
UV. Com as adaptações que aqui fizemos fica dispensado que o instrumento tenha uma interface
computadorizada.
st
1) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21 .
Ed., USA, APHA, 2006.
th
2) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20 .
Ed., USA, APHA, 1998.
3) Hubaux, A. and Vox, G.: Decision and detection limits for linear calibration curves, Analytical
Chemistry 42, 849 - 855 (1970).
4) EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods; A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. EURACHEM, First Internet version, December 1998, First English
Edition 1.0 – 1998; www.eurachem.ul.pt/guides
5) Miller, J. C. and Miller, J. N.: Statistics for Analytical Chemistry, second edition, Ellis Horwood
Ltd, London, 1992, pp-60-62.
6) Oliveira, Fernando M.: Guia do Usuário do Software LABWIN-CQA. Labwin Ltda, Revisão 00 de
14/06/2004.
Agradecimentos
a) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia, FAPESB
b) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química
c) Nossa estagiária Ivanice Ferreira dos Santos