Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus
Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1
(HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do
Hospedeiro Envolvidos no Desenvolvimento de
TSP/HAM em Salvador.
Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara
Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro
Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos
1. Caracterização molecular do genoma proviral (U3LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos
polimorfismos destas regiões relacionando os
mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM;
2. Caracterização molecular de genes do hospedeiro
envolvidos no mecanismo de transativação por Tax
(promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos
infectados assintomáticos e com TSP/HAM;
3. Determinar a carga proviral nos indivíduos
infectados, assintomáticos e com TSP/HAM,
correlacionando estes resultados com as alterações
genotípicas do hospedeiro.
QUAL A IMPORTÂNCIA DO
ESTUDO DO POLIMORFISMO NA
REGIÃO LTR VIRAL?
•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos
indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos
desenvolvem doença.
•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as
manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes
provirais envolvidos na patogenicidade de Tax.
•Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de
TSP/HAM no Japão.
5’
3’
LTR
3’
GAG
POL
ENV
X
LTR
5’
ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I
U3
R
TATA
box
21-pb
Sinal de
enhancer poliadenilação
U5
ATT
9032 pb
5’
LTR
GAG
POL
ENV
X
3’
LTR
5’
3’
TAX
TRE - Elemento de resposta a TAX
CREB/ATF
TAX/CREB
Transcrição
5’
3’
LTR
3’
U3
R
U5
5’
Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da
Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ - 2005 )
POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 )
CHTLV n= 6
TSP/HAM
total= 36
FNN n= 30
ASSINTOMÁTICOS
CHTLV
POPULAÇÃO GERAL
FNN
ACRE
n= 34
n=3
total= 52
n=12
n= 3
CHTLV
Menor 45 anos
ASSINTOMÁTICOS
BAHIA AZUL n=3 total n=32
FNN
ACRE
Maior 45 anos
n= 18
CHTLV n=16
FNN n=3
ACRE n=1
n= 9
n= 2
total=20
RESULTADOS
Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb)
*A significance level p<0.05 value was calculated by x2 test
Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group.
Comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).
RESULTADOS PRELIMINARES
Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb)
* A significance level p <0.05 value was calculated by x2 test
Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR
ATK1 Japanese prototype: the -631-632C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017).
•
•
A mutação -632C>T
p=0.024).
está presente no grupo assintomático (19,2%;
Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior
que 45), uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com
maior idade (25%, p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações
entre variações gênicas específicas e as diversas manifestações clínicas como
ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000).
•
Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do
HTLV-1 poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de
transcrição viral e desenvolvimento da TSP/HAM.
•
Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo
Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições
–632 e –452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas
fora deste grupamento.
QUAL A IMPORTÂNCIA DO
ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS
PROMOTORES DAS CITOCINAS?
•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos
indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos
desenvolvem doença.
•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as
manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das
várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax.
• Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas
nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a
patogenicidade do vírus;
•Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o
desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.
 IL-6
IL-6
Células T
citotóxicas
Células B
Células T
Diferenciação e
secreção de
anticorpos
Células tronco
hematopoiéticas
Co-estimulante
Produção de IL-2 e
de receptor de IL-2
Potencializa a
diferenciação na
presença de IL-2 e
IFN-
Atividade estimuladora
de colônia
http://www.nature.com/emboj/journal/v16/n5/thumbs/7590092f1.jpg
http://adams.mgh.harvard.edu/Reeves/Research%20Images/Cytokinealign.jpg6
Ativação de macrófagos e células T
IL-1
+
TNF-
fator de crescimento
derivado de plaquetas
Crescimento e diferenciação de
células B
IL-6
+
Resposta de fase aguda
+
endotoxinas
infecção viral
+
+
-
Hematopoiese
glicocorticóides
esteróides
 Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos.
Infeçção, estresse, trauma:  níveis
Menopausa e andropausa:  níveis
Ershler WB & Keller ET, 2000
Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em
genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/
resistência a algumas doenças  lupus, artrite reumatóide,
diabetes, artrite juvenil
Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP  podem afetar
a transcrição e a produção de citocinas
fenótipos alto, intermediário e baixo produtor.
Fishman et al, 1998
A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em
genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com
diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002;
Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002).
 ORIGEM GENÉTICA  Susceptibilidade a várias doença
 ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS
Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois
polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição
NFIL6
-158
G
A
MRE
-174
-634
G
-145
-597 -572
C
G
-145
NF-B
TATA
-73
-26
+1
-174
C
G
C
Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6
induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como
IL-1 e TNF-
Adaptado de Terry et al, 2000
A freqüência
de –174G/C IL-6 é altamente
heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al.
1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a
variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras
asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002;
Yamada et al. 2003).
http://www.icviacilea.it/pagine/giornalino/giornale
 SNP –174 (GC): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998),
mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas
et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000),
desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002).
SNP -634 (GC): progressão da nefropatia diabética (Kitamura
et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al,
2001).
 Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados
com HTLV-I
 População do Japão
diferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6
na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos
e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).
Pergunta:
Existe associação desses Polimorfismos
com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos
infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia,
Brazil?
G A GG
GC CC T
?
Resultado 1:
3 populacões brasileiras
293 amostras coletadas entre 1997 e 2001:
100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003);
94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de
Joinville (Grimaldi et al. 2002);
http://www.firststudy.ch/schools/images_gross/Baiana.jpg
99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al.
2002)
ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC
GROUPS.
Gadelha, S.R. 1; Alcântara, L.C.J. 1,2; Costa, G.C.S. 1; Rios, D.L. 1; GalvãoCastro, B. 1,2
1
http://www.nippobrasil.com.br/3.turismo.br/
http://www.giemmegi.org/images/indios-1.jpg
Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz,
Salvador, Ba;
2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências.
Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations
Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de
polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições –
634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras.
GG
N (%)
GC
N (%)
GC
N (%)
G
N (%)
C
N (%)
Salvador
68 (68.0)
30 (30.0)
02 (2.0)
166 (83.0)
34 (17.0)
Tiriyó
18 (18.2)
52 (52.5)
29 (29.3)
88 (44.4)
110 (55.6)
Joinville
87 (92.6)
7 (7.4)
-
181 (96.3)
07 (3.7)
Salvador
71 (71.0)
25 (25.0)
04 (4.0)
167 (85.2)
29 (14.8)
Tiriyó
94 (94.9)
5 (5.1)
-
193 (97.5)
5 (2.5)
-634
-174
Joinville 43 (45.75)
33 (35.1)
18 (19.15) 119 (63.3)
*2:
69 (36.7)
147.648, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica)
2: 76.100, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).
Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no
promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil
Salvador
(n*=200)
%
Tiriyó
(n*=198)
%
Joinville
(n*=188)
%
-634G/-174G
66.5
42.8
59.1
-634G/-174C
16.5
1.6
37.2
-634C/-174G
17.0
54.8
3.7
-634C/-174C
-
0.8
-
*n= número de cromossomos
Salvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001
Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001
Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001
Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C
nos principais grupos étnicos
Africanos/
Afro-descendentes
%
Asiaticos/
Ameríndios
%
Europeus/
Europeusdescendentes
%
G
89.7 - 90.7*,#
(83.5)
95.5 – 100#,**,##,&
(97.5)
61.7#
(63.3)
C
9.3 - 10.3*,#
(16.5)
0.2 - 4.5#,**,##,&
(2.5)
38.3#
(36.7)
IL-6-174
•Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002;
## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998
Resultados e Discussão
Polimorfismos X Grupos étnicos
As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C
p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três
populações.
As frequências dos haplótipos variaram significativamente
(p<0.0001) (Tabela 2).
A maior frequência do alelo C na posição –174 em
descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles
demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela
3).
A frequência do alelo C na posição –174 em amostras de
Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente
observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo
daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com
dados históricos que mostram a importância da contribuição
africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS
2003; Alcantara et al., AIDS 2006).
A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi
encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa
observada para populações de origem asiática (Tabela 3).
Estes dados são consistentes com a teoria da origem
asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em
outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga
et al. 2001).
 Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G  C
no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em
populações asiáticas.
Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo
nestes grupos étnicos.
 Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634
GC e -174GC).
Resultados 2
Polimorfismos nos promotores dos genes da
interleucina-6 em indivíduos infectados de
SALVADOR. Existe associação com o
desenvolvimento de doença neurológica?
Manuscrito em fase final
de preparação
 Tipo de estudo: Corte-transversal
População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda
espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação
Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC),
confirmadamente positivos.
Número de amostras analisadas:
 Indivíduos assintomáticos: 84
Pacientes com HAM/TSP: 26
Sintomáticos: 23
Soronegativos: 100
Idade (Mediana)
HAM/TSP
Oligosintomáticos
52.5 anos
51 anos
Assintomáticos
38 anos
Gênero
HAM/TSP: 26
Masculino
Feminino
09 (34.6%)
17 (65.4%)
Assintomáticos: 84
Masculino
Feminino
31 (36.9%)
53 (63.1%)
Oligosintomáticos: 24
Masculino
Feminino
09 (39.1%)
14 (60.9%)
Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –
634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo
HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos
soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia.
HTLV-1 positivo
N (%)
HTLV-1 negativo
N (%)
Alelo G
246 (89.1)
166 (83)
Alelo C
30 (10.9)
34 (17)
Alelo G
240 (87.0)
167 (85.2)
Alelo C
36 (13.0)
29 (14.8)
Posição –634
Posição –174
p>0.05
Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em
indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em
indivíduos soronegativos
Assintomático
N (%)
HAM/TSP
N (%)
Oligosintomático
N%
Posição –634
Alelo G
152 (90.5)
41 (78.8)
43 (93.5)
Alelo C
16 (9.5)
11 (21.2)
06 (6.5)
Alelo G
145 (86.3)
49 (94.2)
36 (78.3)
Alelo C
23 (13.7)
03 (5.8)
10 (21.7)
Posição –174
-174GC -  do alelo G e  do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando
comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X
assintomáticos: p=0.14
-634GC -  Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e
oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5
Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no
promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1.
HAM/TSP
n(%)
OLIGOSSINTOMÁTICOS
n(%)
ASSINTOMÁTICOS
n(%)
-634GG/-174GG*
13 (50)
13 (56.5)
52 (61.9)
-634GG/-174GC
01 (3.8)
05 (21.7)
13 (15.5)
-634GG/-174CC
-
02 (8.7)
03 (3.6)
-634GC*/-174GG*
10 (38.5)
02 (8.7)
13 (15.5)
-634GC*-174GC
02 (7.7)
01 (4.4)
02 (2.4)
-634GC*/-174CC
-
-
01 (1.1)
*genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP
-597 G/A
Monomórfico: todas as amostras foram GG
-572 G/C
A três genótipos G/A (3.8%).
Todos os demais G/G (96.2%)
Promotor de IL-2:
20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região
onde NF-B se liga
10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o
HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado
http://www.monografias.com
Carga proviral
http://www.tthhivclinic.com/
 14 pacientes HAM/TSP
 53 assintomáticos
Carga proviral (número de cópias/106cels)
número de cópias/106cels
HAM/TSP X Assintomáticos
Mann-Whithney: p=0.0001
Carga proviral X Genótipo na
posição -174 do promotor de IL-6
número de cópias/106cels
número de cópias/106cels
Carga proviral X Genótipo na
posição -634 do promotor de IL-6
Mann-Whithney: p=0.97
Mann-Whithney: p=0.66
-634 G/C
Mediana
-174 G/C
GG: 28665 cópias/106 céls
GC: 20624 cópias/106 céls
Mediana
GG: 22189 cópias/106 céls
GC: 20945 cópias/106 céls
Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador)
Sandra Rocha Gadelha (Doutorado)
Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado)
Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado)
Cinara Carvalho(Apoio técnico);
Simone Kashima (Colaborador)
Anne-Mieke Vandamme (Colaborador)
Ceuci Nunes (Clínica)
Rodrigo Gaspar (Administração do projeto)
Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP)
FAPESB