TLC - Cromatografia de camada fina
Química Analítica / JCM
Cromatografia de camada fina
TLC - Thin Layer Chromatography
planar / adsorção / zonal / analítica
possibilidade de desenvolvimento bidimensional e
de quantificação
Fases estacionárias
Adsorventes / diferentes de absorventes
actividade de um adsorvente é determinada pela sua área superficial, a sua natureza química
e o arranjo geométrico dos átomos superficiais
propriedades de um adsorvente:
☺
☺
☺
☺
☺
☺
não deve dissolver na fase eluente
não deve reagir com a fase móvel
não deve reagir com os solutos
deve dar resultados reproductíveis
o processo de adsorção deve ser reversível
o adsorvente não deve ser muito caro
distância percorrida pelo soluto
Rf = ----------------------------------------------------------distância percorrida pela frente do solvente
Camada
Camadade
defase
faseestacionária
estacionária: :250
250µµmm
TLC - adsorventes
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Polares
vários óxidos inorgânicos ( sílica, alumina, magnésia)
☺ ordem de eluição dos solutos segue a polaridade destes - solutos polares são fortemente
retidos
hidrocarbonetos saturados < hidrocarbonetos aromáticos < éteres < ésteres
≈ aldeídos ≈ cetonas < álcoois ≈ aminas < amidas < ácidos carboxílicos
Não-polares
carvão activado
☺ ordem de eluição segue a polarizabilidade das moléculas
MAIS RETIDOS - compostos aromáticos, homólogos de maior peso molecular, moléculas com
átomos de halogénio ou enxofre
F o rte s
M é d io s
F ra c o s
s ilic a g e l
a lu m in a
c a rv ã o a c tiv a d o
h id ró x id o d e c á lc io
c a rb o n a to d e c a lc io
m a g n é s ia
ta lc o
a m id o
s u c ro s e
Ácidos
Ácidos: : sílica
sílica(separa
(separaácidos)
ácidos)
Básicos:
Básicos:Alumina
Alumina/ /magnésia
magnésia(separa
(separabases
bases
TLC - adsorventes
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Sílica gel
suporte mais popular (5-10 µm)
O
preparada por hidrólise do silicato de sódio
seguida de condensação e polimerização
actividade resulta da presença dos grupos Si -- OH (silanol) à superfície
controlo da actividade por aquecimento durante a preparação
OH
Si
OH
Si
O
O
O
O
☺ activação recomendada (110º / 30 - 60 min)
Sílica gel é ligeiramente ácida
☺ esteróides, amino-ácidos, álcoois, hidrocarbonetos, lípidos e vitaminas
Preparação
50g / 60 ml água destilada - espalhar rapidamente / secar / activar
☺ H - sem impregnante
☺ G - com 13% de sulfato de cálcio
☺ F254 - com indicador fluorescente
impregnação com nitrato de prata (20%) - separação de compostos com duplas ligações
(menos duplas > Rf)
TLC - adsorventes
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Alumina
O
O
O
Ainda muito comum
Al
Preparada por condensação do hidróxido de
O
alumínio hidratado
A actividade depende quer dos átomos de oxigénio quer dos de alumínio
☺ mais difícil de preparar dado que geralmente contem mais impurezas
o conteúdo de água é muito importante para obter resultados reproductíveis
☺ activação a 75 - 110 º / 30 - 60 min
Pode ser obtida com superfície ácida, neutra ou básica (a mais comum)
☺ separação de corantes, vitaminas e alcalóides
Preparação
30g / 40 ml de água destilada - espalhar rapidamente / secar e activar
☺ pode conter impregnantes e indicadores de fluorescência
O
O
Al
O
Al
O
TLC - adsorventes
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Celulose
material orgânico
diferente da cromatografia de papel
☺ papel - apresenta espaços vazios onde se acumula o solvente - a difusão leva ao alargamento
das manchas
☺ celulose - são usadas partículas pequenas / distribuição mais regular - menor difusão
Celulose é usada para separar compostos hidrofílicos tal como açúcares, aminoácidos, iões
inorgânicos solúveis e ácidos nucléicos - soluções aquosas
☺ geralmente aderem muito fortemente à sílica e alumina
Tal como em papel o mecanismo é predominantemente de partilha
Preparação
400 mg amido / 10 ml água destilada + 90 ml de água a ferver + 20 g de celulose
☺ o grau de hidratação depende do tempo de agitação
☺ agitação durante muito tempo leva à formação de gel
espalhar rapidamente / secar a 110º
pode conter indicadores de UV
Placas comerciais
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Adsorventes
Sílica; alumina
Suportes
Vidro, alumínio ou plástico (tereftalato de polietileno)
Espessura
0,25 mm / 0,5 mm / 1,0 mm / 2,0 mm
Maior amostra exige maior espessura (TLC preparativa)
Activação
15 minutos ao ar + 30 minutos a 110 ºC
Nalguns casos pode elevar-se a temperatura a 200 ºC (4 horas) para maior activação
Conservação
Após secagem / activação as placas devem ser guardadas num excicador
As placas de sílica desactivam-se muito rapidamente
☺ 50% de actividade perde-se em 3 minutos numa atmosfera com 50% de humidade
TLC – outros adsorventes
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Kieselguhr
Diatomite - terra de diatomáceas
☺ sílica com plâncton marinho (diatoms)
elevada porosidade e área superficial - muito usada como ajudante de filtração
muito usada como suporte de fase estacionária líquida - partilha
Sephadex
gel dextran - hidrofílico e neutro
habitualmente usado na filtração em gel - de acordo com os pesos moleculares
Fase reversa / inversa
a separação de soluto de polaridade semelhante é difícil com sílica gel mesmo para
moléculas de pesos moleculares diferentes
é possível alterar a superfície da sílica (OH reagem com silanos orgânicos)
RP-2, RP-8 , RP-18
☺ a fase estacionária orgânica apresenta uma retenção preferencial dos compostos nãopolares (fase reversa) e a separação depende dos pesos moleculares
a fase móvel é polar (acetonitrilo)
cromatografia de partilha
TLC - fase eluente
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Características - a fase móvel é o componente de mais fácil substituição
boa qualidade - a composição não deve variar de lote para lote
não reactiva - de outro modo os resultados seriam difíceis de interpretar
baixo ponto de ebulição - preferível para a secagem da placa
Alta pureza (Analar) e preço razoável !!
Escolha
a fase eluente deve ser activa ( retirar o soluto da fase estacionária) e selectiva (separar dois
solutos diferentes)
actividade (capacidade de eluição) em relacção a sílica-gel
☺ água > metanol > etanol > propanol > propanona > triclorometano >
☺ diclorometano > benzeno > metilbenzeno > tricloroetileno > tetraclorometano >
☺ ciclohexano > hexano
Misturas de solventes
☺ o mais usual - capacidade de eluição não é proporcional à composição
amostra desconhecida
☺ usar sílica gel e um solvente pouco polar (pentano)
☺ acrescentar solvente polar (2, 4, 8, 16, 32%)
Separação de pigmentos
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Série eluotrópica para adsorventes polares
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Tabela definida para placa de
alumina
A escala vai até cerca de
0,75 para uma placa de sílica
Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
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J.C. Touchstone (Practice of TLC)
Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
Química Analítica / JCM
J.C. Touchstone (Practice of TLC)
Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)
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J.C. Touchstone (Practice of TLC)
Exemplo de fases móveis
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TLC - aspectos experimentais
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Preparação
preparar a mistura eluente nas proporções adequadas ao ensaio
saturar a câmara - manter fechada e à temperatura do ensaio
evitar evaporação da mistura eluente - alteração da composição
controlar o grau de humidade da placa
Aplicação da amostra
usar micropipeta (1 -2 µl) - não danificar o suporte
colocar a amostra a cerca de 1,5 cm da base - todas a amostras na
mesma linha
a mancha deve ser de reduzidas dimensões (1,5 mm)
☺ no caso de amostras diluídas colocar por diversas vezas, secando após
cada aplicação
evitar que a mancha toque a superfície do solvente (5 - 8 mm)
Desenvolvimento
manter a temperatura
deixar desenvolver o cromatograma até cerca de 3 cm do topo da placa
Revelação
usar luz UV (254 / 366 nm) ou revelador adequado (H2SO4)
determinar Rf, definir tamanho das manchas - quantificar se desejável
Placa de TLC
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Saturar a câmara / equilibrar a placa
Efeito da insaturação da placa
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TLC - maus exemplos
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Polaridade
soluto muito polar é retido na origem
Amostra em demasia / amostra mal seca
demasiada amostra cria tailing / amostra mal seca cria anéis
Câmara mal saturada
saturação insuficiente leva a demasiada evaporação da fase eluente
Colocação muito baixa / demasiada humidade
amostra baixa difunde-se na fase eluente / muita humidade leva a maior difusão das manchas
e também a uma separação deficiente
TLC - reveladores
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Métodos químicos / métodos físicos
Métodos não-destructivos
radiação visível e UV (254 nm e 366 nm)
Vapor de iodo
☺ evaporação / placa sem alteração
água
indicadores de pH (bromocresol / bromofenol)
Métodos destructivos
50% H2SO4 / 110 C
5% dicromato de potássio ou 5% ácido nítrico em
40% H2SO4 seguido de aquecimento a 110 C
UV (vitaminas) / água (hidrólise - ésteres) / iodo (ácidos gordos poliinsaturados)
Reagentes específicos são conhecidos para quase todas as classes de compostos
NOTA: o uso de métodos destructivos é desaconselhado sempre que a quantificação seja o objectivo da separação cromatográfica
TLC - amostras
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Classificação (energias de adsorção)
Grupo 1: moléculas neutras - hidrocarbonetos
☺ forças de Van der Waal - físicas (não há formação de
ligações químicas
☺ grupos metileno - não há separação por peso molecular
☺ separações boas e manchas redondas
Energias de adsorção
(sílica gel)
Grupo 2: ligações polares (C - Cl / C - NO2)
☺ dipolo induzido - físicas / manchas redondas
Grupo 3: moléculas polares ( ácidos, álcoois)
☺ Grupos de superfície polar - nucleofílica
☺ interação com adsorvente via lig. H-H
☺ forte - possibilidade de “caudas” nas manchas
Grupo 4: ligações químicas (covalentes)
☺ ligações fortes - má separação
A forma das manchas depende do equilíbrio
de concentrações estabelecido entre as fases
móvel e estacionária
Cs
Cs
Cm
Grupo
Qi
interação
R-CH3
+0.07
VdW
R-CH2-
-0.05
VdW
R-Cl
+1.32
dip. ind.
R-O-R
+3.61
receptor H
R-CHO
+4.97
receptor H
R-NO2
+5.71
dip.ind
R-CO2R
+5.27
rec.H /dip.ind.
R-COR
+5.27
rec.H/dip.ind.
R-OH
+5.60
H-H
R-NH2
+8.00
H-H
R-CO2H
+7.60
H-H
Cs
Cm
Cm
Casos especiais
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TLC preparativo
Colocar bandas largas de amostra e desenvolver a placa
Retirar a sílica de cada mancha e dissolver usando um solvente adequado
Analisar noutro equipamento (HPLC, LCMS, FTIR)
TLC bidimensional
Colocar a amostra no lado esquerdo da placa e desenvolver
Secar a placa e desenvolver de novo noutro eluente (colocar o lado esquerdo da placa para
baixo)
Revelar
Separação de aminoácidos
F. estacionária: sílica gel
F. Móvel 1: tolueno:2-cloroetanol:piridina
F. Móvel 2: clorofôrmio:álcool benzílico:ac. Acértico
1: ac. Aspártico, 2: ac. Glutámico, 3: serina
4: alanina, 5: glicina, 6: alanina, 7: metionina,
8: valina, 9: isoleucina, 10: cisteina
TLC - vantagens e desvantagens
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Vantagens
Técnica simples e versátil - aplica-se a quase todas as classes de compostos
Pequenas quantidades de amostra – sem grande preparação
A separação pode ser obtida com custos razoáveis - bom adsorvente e solventes puros
As separações podem ser obtidas em tempos relativamente curtos
☺ começa a não ser vantagem em relação às pequenas colunas de HPLC
O processo de separação é “visível” e pode ser melhorado alterando suportes ou a fase
eluente
☺ ao contrário do GC ou HPLC e que os solutos muito retidos podem passar despercebidos
Desvantagens
A preparação das placas é complicada
☺ está a cair em desuso (aquisição de placas preparadas)
A quantificação é possível mas implica um enorme custo financeiro
☺ por isso o TLC é a técnica de separação cromatográfica tipicamente qualitativa /
semiquantitativa
Colocação de amostras em quantidades conhecidas e quantificação por comparação
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Linha de frente do solvente
Distância percorrida pelo solvente
Distância percorrida pelo soluto B
Distância percorrida pelo soluto A
Linha de colocação das amostras
Resolução = X / 0,5 (d1 + d2); x - distância entre
as manchas; d1 e d2 – diâmetros das manchas
R mínimo = 1
Rf = distância percorrida pelo soluto / distância
percorrida pela frente do solvente