Análise funcional de genes
diferentemente expressos em
macrófagos murinos infectados por
Leishmania amazonensis ou L. major
Mario Gandra
Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fiocruz/BA
Interação leishmania-macrófago via
proteoglicanos de superfície celular: um
novo alvo contra a infecção parasitária?
Mario Gandra
Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fiocruz/BA
Introdução
• Proteoglicanos são glicoproteínas que contém uma ou mais cadeias de
glicosaminoglicanos (GAGs);
• Os
proteoglicanos
são
moléculas
ubíquas,
podendo
ocorrer
na
matriz
extracelular, ancorados à superfície celular ou no interior de mastócitos;
• Participam de vários processos fisiológicos, tais como a coagulação, adesão
célula-matriz, reconhecimento de citocinas e fatores de crescimento, etc.
• Alguns microorganismos patogênicos ligam-se a proteoglicanos na membrana
celular de hospedeiros;
Introdução
• Muitos trabalhos já mostraram a importância dessa interação na infectividade
desses patógenos – Lysteria monocytogenes, Borrelia burgdorferi, Chlamidya
Trachomatis,
Plasmodium
falciparum,
Herpes
Simplex
Virus,
Human
Immunodeficiency Virus, etc.
• Na maioria dos casos, o proteoglicano envolvido é de Heparam Sulfato e a
ligação do parasito ocorre através das cadeias de GAG;
• Presença de Heparina exógena modula interação parasito-célula hospedeira.
• Amastigotas de L. amazonensis possuem uma proteína de superfície que se
liga a um proteoglicano de heparam sulfato na membrana de macrófagos.
Objetivos
• Investigar a participação dos proteoglicanos de superfície de macrófagos de
camundongos CBA na infectividade de L. amazonensis e L. major;
• Identificar os proteoglicanos envolvidos;
• Identificar o ligante dos proteoglicanos na superfície do parasito.
Metodologia
• Estímulo na cavidade peritoneal com tioglicolato, coleta de macrófagos
inflamatórios, plaqueamento;
• Infecção com L. amazonensis ou L. major, por 45`;
• Tratamento dos macrófagos com diferentes doses de GAGs exógenos (no
momento da infecção – competidores) ou de clorato (por 24 horas antes);
• Contagem das células infectadas em microscópio óptico.
Condroitim 4-sulfato
Infectividade
L. amazonensis
140
120
80
60
40
20
0
0,1
1
10
20
100
[C -4-S] ug/mL
L. amazonensis
Infectividade
140
120
100
% controle
% controle
100
80
60
40
L. major
20
0
0,1
1
10
[C -4-S] ug/mL
L. major
20
100
Condroitim 4-sulfato
Lsh/Mo
L. amazonensis
140
120
80
60
40
20
0
0,1
1
10
20
100
[C -4-S] ug/mL
L. amazonensis
Lsh/Mo
140
120
100
% controle
% controle
100
80
60
40
L. major
20
0
0,1
1
10
[C -4-S] ug/mL
L. major
20
100
Condroitim 6-sulfato
Infectividade
L. amazonensis
160
140
100
80
60
40
20
0
0.1
10
20
100
1000
[C -6-S] ug/mL
L.amazonensis
Infectividade
160
140
120
% controle
% controle
120
100
80
60
40
L. major
20
0
0.1
10
20
[C -6-S] ug/mL
L. major
100
1000
Condroitim 6-sulfato
Lsh/Mo
L. amazonensis
140
100
80
60
40
20
0
0.1
10
20
100
1000
[C -6-S] ug/mL
L. amazonensis
Lsh/Mo
140
120
% controle
% controle
120
L. major
100
80
60
40
20
0
0.1
10
20
[C -6-S] ug/mL
L. major
100
1000
Heparina
Infectividade
L. amazonensis
180
160
120
100
80
60
40
20
0
0,1
1
10
20
100
[Hep] ug/mL
L. amazonensis
Infectividade
180
160
140
120
Lsh/Mo
% controle
140
100
80
60
40
L. major
20
0
0,1
1
10
[Hep] ug/mL
L. major
20
100
Heparina
Lsh/Mo
140
L. amazonensis
120
80
60
40
20
0
0,1
1
10
20
100
[Hep] ug/mL
L. amazonensis
Lsh/Mo
140
120
100
% controle
% controle
100
80
60
40
L. major
20
0
0,1
1
10
[Hep] ug/mL
L. major
20
100
Clorato
L. amazonensis
120
100
80
60
40
20
0
1
50
200
[NaClO 4] ug/mL
L. amazonensis
Infectividade
% controle
% céls. infectadas
Infectividade
L. major
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
50
[NaC lO4] ug/mL
L. major
200
Clorato
L. amazonensis
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
50
200
[NaC lO4] ug/mL
L. amazonensis
Lsh/Mo
% controle
% controle
Lsh/Mo
L. major
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
50
[NaC lO4] ug/mL
L. major
200
Conclusões
• A carga negativa de GAG(s) do macrófago é importante para a infectividade de
L. amazonensis, mas não de L. major;
• Esse GAG parece ser um heparam sulfato;
Perspectivas
• Confirmar o heparam sulfato com enzimas que o degradam especificamente;
• Purificar, identificar e caracterizar o ligante na leishmania;