IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
Preparação, caracterização físico-química e estudo de estabilidade de gel de contendo complexo
de inclusão de diosmina em β-ciclodextrina
Dayanne V. S. Santanaa, Paula P. Menezesa, Grace Anne A. Dóriaa, Bruna M. H. Sousaa, Bruno S. Limaa, Mairim R.
Serafinia, Francilene A. Silvaa, Claudio M. Limaa, José Evaldo R. Menezes-Filhob, Evaleide D. Oliveirab, Gabriel F. Silvac,
Daniel P. Bezerrad, Adriano A. S. Araujoa*
a
Departamento de Farmácia, bDepartamento de Fisiologia, c Departamento de Engenharia Química Universidade Federal
de Sergipe, Sergipe, Brasil;, ,4Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Bahia, Brasil.
*Autor correspondente. Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe-UFS, Av. Marechal Rondon, s/n,
São Cristóvão, Sergipe-Brasil. Tel.: +55-79 9192-4545; E-mail: [email protected]
Resumo:
A diosmina (DSN), é um flavonóide natural abundante em frutas cítricas com atividades farmacológicas bem descritas na
literatura. Embora já seja utilizada há muitos anos, a DSN possui baixa solubilidade e como consequência, baixa absorção
por via oral. Para solucionar esse problema as ciclodextrinas (CDs) vem sendo amplamente utilizadas, já que estas são
capazes de formar complexos de inclusão com moléculas apolares. Os complexos de inclusão formados melhoram a
biodisponibilidade das moléculas hospedeiras. Dessa forma, no presente estudo foi realizada a caracterização físicoquímica da DSN, β-CD, bem como dos produtos obtidos por mistura física (MF) e co-evaporação (CE) pelas técnicas de
calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de
absorção na região do infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV). Além disso, foi avaliada a
estabilidade de géis nos quais os complexos foram incorporados. Os resultados demonstram que a CE, nesse caso, possui
uma melhor capacidade de complexação, pois na TG/DTG (114-312°C) exibiu perdas de massa de 0,6% enquanto a MF
apresentou um valor menor, na MEV foi possível visualizar mudanças morfológicas na amostra da CE. Além disso, foi
observado no FTIR a presença da banda característica da DSN, no ensaio de estabilidade não houve alteração na
estabilidade das amostras quando incorporadas em gel carbopol.
Palavras-chaves: Diosmina, β-ciclodextrinas, complexos de inclusão.
Abstract:
Diosmin, is a natural flavonoid abundant in citrus fruits with pharmacological activities already reportades in studies.
Although it has been used for many years, has low solubility and DSN as a consequence, low oral absorption. To solve this
problem cyclodextrins (CDs) has been widely used, since they are able to form inclusion complexes with nonpolar
molecules. Inclusion complexes formed improving the bioavailability of host molecules. Thus, in this study the
physicochemical characterization of the DSN, β-CD was performed and the products obtained by physical mixture (PM)
and slurry complexation (SC) by techniques differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry / derivative
thermogravimetry (TG / DTG) spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM).Furthermore, was evaluated the
stability of gels in which the complex was incorporated . The results showed that the SC in this case has a higher
complexing capacity, because the TG / DTG (114-312 ° C) exhibited mass losses of 0.6% while the MF showed a lower
value, in SEM was possible to visualize morphological changes in the sample of SC. Furthermore, it was observed in the
presence of the characteristic FTIR band DSN, the stability test there was no alteration in the stability of the samples when
incorporated in carbopol gel.
Keywords: Diosmin, β-cyclodextrins, inclusion complexes.
1. Introdução
A diosmina (DSN) é um flavonóide glicosídico, encontrado em abundância em várias frutas cítricas e que pode ser
facilmente obtido pela desidrogenação da hesperidina [1]. Há mais de 30 anos a DSN (7-[[6-O-(6-Deoxi-a-Lmanopiranosil)-b-D-glicanopiranosil]oxi]-hidroxi-2(3-hidroxi-4-metoxifenil)-4H-1-benzopirano-4-ona ) vem sendo
utilizada como protetor vascular no tratamento de hemorroídas e varises devido as suas propriedades anti-flebotônicas. A
DSN tem sido utilizada também no tratamento de alguns tipos de câncer e apresenta vantagens como baixo custo e menor
reação adversa quando comparada com outros quimioterápicos [2]. Além disso, o flavonóide apresenta atividade
antioxidante, anti-hiperglicêmica e anti-mutagênica [3]. Entretanto, possui baixa solubilidade em água e em outros
IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
solventes orgânicos [2], o que limita suas aplicações terapêuticas. Nesse contexto, a complexação em β-CD foi pensada
como estratégia para melhorar e ampliar a utilização farmacológica da DSN.
As CDs são oligossacarídeos cíclicos constituídos a partir de subunidades de α-D-glicopiranose ligadas entre si por
ligações α-1,4 glicosídicas, formando um anel que possui cavidade hidrofóbica e superfície hidrofílica. Essa organização
molecular confere as CDs uma característica interessante que é a capacidade de formar complexos de inclusão com uma
grande variedade de moléculas hóspedes. Esse fenômeno tem recebido importante atenção da indústria farmacêutica para
melhorar a solubilidade em meio aquoso, estabilidade química, dissolução e perfil de liberação de diversos fármacos. Além
disso, a complexação pode suprimir os odores e sabores desagradáveis, bem como a volatilização de determinadas
moléculas [4]. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi obter e caracterizar físico-químicamente complexos de
inclusão obtidos pelos métodos da mistura física (MF) e co-evaporação (CE) por meio das técnicas de calorimetria
exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de absorção na
região do infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV), e avaliar a estabilidade de géis obtidos com
os complexos.
2. Material e Métodos
2.1 Material
A DSN (lote: #070M1250V) e β-CD (lote: #041M1759V; pureza ≥ 97%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Saint
Louis- USA.
2.2. Preparo das amostras
Complexação por mistura física (MF): A mistura mecânica foi preparada pela adição da DSN (608,5 mg) em um
cadinho contendo CD pulverizada (1135 mg) sob agitação manual, na razão molar 1:1. A mistura mecânica foi armazenada
em recipientes de vidro hermeticamente fechados.
Complexação por co-evaporação (CE): A complexação por CE foi realizada por meio da adição de água (20 mL) a um
almofariz contendo CD (1135 mg) e DSN (608,5 mg) na proporção 1:1. A mistura foi submetida à agitação magnética em
400 rpm, por 36 horas. Posteriormente a amostra foi transferida para um recipiente e levada para um dessecador. Após a
secagem a massa passou por trituração manual e foi acondicionada em frasco de vidro âmbar hermeticamente fechado.
2.3. Preparo do gel
As amostras preparadas pelas técnicas de MF e CE, bem como a DSN padrão foram incorporados em gel de carbopol a
10%. A realização dos testes de estabilidade preliminar das formulações foi de acordo com o Guia de Estabilidade de
Produtos Cosméticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2004) [5].
2.4. Análise térmica
As curvas DSC e TG/DTG foram obtidas na faixa de temperatura entre 25 e 500°C e 25 e 650°C, respectivamente
utilizando equipamento da Shimadzu DSC-60 e TGA-60, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (100 mL/min), razão de
aquecimento de 10°C/min, utilizando cápsula de alumínio (DSC) e platina (TG/DTG) contendo aproximadamente 2 mg de
amostra. Os equipamentos foram previamente calibrados e/ou verificados antes dos ensaios no eixo de temperatura
utilizando padrão de oxalato de cálcio com pureza de 99,99%, no caso da TG, e índio metálico no caso do DSC.
2.5. FTIR
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos no comprimento de onda de 4000-500 cm-1, em
pastilhas de KBr, utilizando equipamento FTIR-SHIMADZU modelo IRTracer-100, em temperatura ambiente.
2.6. MEV
As amostras da β-CD, MF, MA e CE foram montadas em stubs de alumínio, posteriormente metalizados com feixes de
ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico (JEOL modelo JSM-6390-LV) em aceleração de voltagem de 8 kV.
2.8 . Estabilidade do Gel
Inicialmente, cerca de 5 g da preparação do gel de carbopol incorporado com complexo de inclusão β-CD/DSN e do gel
de carbopol puro foram pesados em balança analítica, acondicionadas em um tubo cônico graduado com capacidade para
10g e submetida a centrifugação sob 3.000 rpm durante 30 minutos. As amostras foram acondicionas em fracos de vidro
transparente com boa vedação. Foram observadas as características da formulação, tais quais, cor, separação de fase e
homogeneidade durante 30 dias, a fim de avaliar possíveis alterações podendo ser classificadas como: nenhuma alteração
visível – sem alteração de cor ou aspecto, leve perda de coloração, perda total de coloração, evidência de falta de
homogeneidade e alteração no aspecto.
IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
3. Resultados e Discussão
A curva DSC (Figura 1) da DSN apresentou dois eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de temperatura de 100160ºC provavelmente atribuído a eliminação de moléculas de água provenientes da sua estrutura química e o segundo na
faixa de 250-290ºC correspondente a fusão da DSN conforme relatado por Freag et al (2013) [2]. A curva TG exibiu uma
primeira etapa de perda de massa até 110ºC (Tabela 1) referente a desidratação da DSN e a partir de 260ºC teve início a
decomposição seguida de degradação. A curva DSC da β-CD apresentou três eventos endotérmicos seguidos de
degradação. O primeiro na faixa de temperatura de 32-110ºC referente a liberação de água, o segundo de 208-236ºC
característico de transição de fase da molécula e o último, na faixa de 283-343ºC é atribuído a fusão da β-CD. A curva TG
apresentou duas etapas de perda massa, uma vez que a transição de fase é um fenômeno físico não acompanhado de perda
de massa. Sendo assim, a primeira etapa de perda de massa foi de 11,4% relacionada a perda de água e a terceira 63,8% da
decomposição seguida de degradação da molécula hospedeira. As curvas DSC da MF e CE exibiram uma sobreposição das
curvas da DSN e da β-CD. Entretanto, na segunda etapa de perda de massa, onde β-CD e DSN não apresentaram perdas de
massa, a MF perdeu 0,2% enquanto o CE perdeu 0,6%, ou seja, o CE demonstrou ter uma quantidade maior de DSN
complexada, uma vez que na segunda etapa apresentou um valor de perda de massa mais elevado quando comparado com a
MF. Tal fenômeno indicou que o CE necessitou de uma temperatura mais elevada para ser liberado, sugerindo
complexação.
Figura 1: Curvas DSC da DSN, β-CD, MF e CE, obtidas
em atmosfera de N2
Figura 2: Curvas TD/DTG da DSN, β-CD, MF e CE,
obtidas em atmosfera de N2
IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
Tabela 1: Perdas de massa da DSN, β-CD, MF e CE.
Perda de massa/%
Amostra
DSN
-CD
MF
CE
a
1 etapa
25-110ºC
6,8
11,4
11,3
10,3
a
2 etapa
110-260ºC
0,2
0,6
3a etapa
260-390ºC
55,1
63,8
59,9
56,4
4a etapa
390-650ºC
38,1
24,2
28,6
32,7
Na Figura 3, estão apresentados os espectros de FTIR da DSN, β-CD, MF e CE. No espectro correspondente a DSN, foi
possível observar uma banda larga na região de 3570-3136 cm-1 relacionada às vibrações dos grupos OH. A banda
encontrada em 2931 cm-1 caracterizou à presença de C-H alifático. Outra banda em 1673 cm-1 indicou a presença do C=O
no oxano. Foi possível observar também, bandas nas regiões de 1661 e 1503 cm-1 características de alongamento C=C no
anel aromático. As bandas encontradas em 1448 e 1360 cm-1 foram relacionadas à deformação angular CH2/CH3, e as
bandas em 1262, 1182, 1136, 1099, 1069, 1033, 1012 cm -1 indicaram a presença de C-O na estrutura do composto. Já as
bandas encontradas em 852, 815 e 771 cm-1 confirmaram a presença do anel aromático [2]. O espectro de absorção na
região do infravermelho da β-CD mostrou uma banda larga com o máximo de absorção a cerca de 3341 cm -1, devido as
vibrações de alongamento dos diferentes grupos hidroxila (O-H) da molécula. A banda intensa em 1647 cm-1 foi
relacionada com as vibrações dos grupos -OH. O espectro apresentou outras bandas, principalmente em 2926 cm-1
(vibrações de alongamento dos grupos CH e CH 2), e em 1154, 1080 e 1027 cm-1 que foram atribuídas as vibrações do
alongamento C-O, das ligações entre os grupos éter e hidroxila. Já a banda encontrada na região de 1000-700 cm-1 foi
frelacionada as vibrações do esqueleto C-C presentes no anel de glicopiranose. Resultados semelhantes foram obtidos por
Sambasevam et al (2013) [6] e Menezes et al (2014) [7]. Os espectros da MF e CE forneceram informações que
evidenciaram a formação do complexo de inclusão pelo método da CE. Ao analisar as bandas da MF e CE foi observada a
presença do anel aromático da DSN na região espectral de 1661 e 1503 cm-1 e em 852, 815 e 771 cm-1 sendo estas mais
proeminentes no espectro da CE. Esses resultados sugerem que a complexação não alterou as características da DSN [2].
Figura 3: Espectros de infravermelho da DSN, β-CD, MF e CE.
Na Figura 4 estão apresentadas as fotomicrografias da DSN, β-CD, MF e CE, onde foi possível observar que a
morfologia da DSN não é bem definida. Os cristais de β-CD apresentaram-se grandes, retangulares e com partículas
aderidas a sua superfície. A fotomicrografia da MF demonstrou a não interação entre a DSN e β-CD, uma vez que os
cristais de ambas foram vistos separados e sem alterações morfológicas. Já na imagem correspondente a CE, foi observada
IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
a interação entre as partículas de DSN e β-CD, causando uma alteração na forma da β-CD, que neste caso não encontrou-se
mais tão definida.
Figura 4:Fotomicrografias de DSN, β-CD, MF e CE
nos aumentos de 250x e 500x respectivamente, sob
aceleraçãode voltagem de 8kV.
Os complexos de inclusão β-CD/DSN incorporados em gel de carbopol apresentaram-se estáveis frente as observações
dos aspectos das formulações no teste de estabilidade preliminar. Durante o período de exposição à radiação luminosa, não
houve alteração de cor, odor, aspecto, viscosidade e homogeneidade.
4. Conclusão
Os resultados obtidos demonstraram que dentre os métodos utilizados, o CE ofereceu melhor perfil de complexação, já
que os resultados de caracterização físico-química apresentaram melhores características para o CE em comparação a MF,
na qual não há indícios de formação de complexos de inclusão entre as moléculas em estudo. Os testes de estabilidade
preliminar das amostras β-CD/DSN, apontaram o potencial para estudos de desenvolvimento de um medicamento
fitoterápico com o complexo de inclusão da DSN.
5. Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES, CNPq, e FAPITEC/SE pelo suporte financeiro nesta pesquisa. Nós agradecemos
também a Dra. Maria Lúcia Vieira Moreno, Dr. Cláudio Pereira Figueira e a Profa. Adriana Lanfredi Rangel pelas imagens
da MEV obtidas no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz, Salvador.
IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
6. Referências
[1] Jain D, Bansal MK, Dalvi R, Upganlawar A, Somani R. Protective effect of diosmin against diabetic neuropathy in
experimental rats. J Integr Med. 2014; 12: 35-41
[2]Freag MS, Elnaggar YSR, Abdallah OY. Developmentof novel polymer-stabilized diosmin nanosuspensions: In vitro
appraisalandex vivo permeation. Int. J. Pharm. 2013; 454: 462– 471.
[3] Anwe MK., Jamil S., Ansari MJ, Al-Shafat R, Ali BE, Ganaie MA, Adobel- Kader MS, Shakeel F. Water soluble
binary and complexes of diosmin with β-cyclodextrin: Spectroscopic characterization, release sturdes and ant- oxidant
activity. J. Mol. Liq. 2014; 199: 35–41
[4] Waleczeka KJ, Cabral HMM, Hempelc B, Schmidta PC. Phase solubility studies of pure (2)-a-bisabolol and camomile
essential oil with b-cyclodextrin. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003; 55: 247–251
[5] Agência Nacional de Vigilância Santinária - ANVISA. Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos, Brasília. 2004.
Vol.1
[6]Sambasevam KP, Mohamad S, Sarih NM, Ismail NA. Synthesis and Characterization of the Inclusion Complex of βcyclodextrin and Azomethine. Int. J. Mol. Sci. 2013; 201 14: 3671-3682
[7] Menezes PP, Serafini MR, Quintans-Júnior LJ, Silva GF, Oliveira JF, Carvalho FMS, Souza JCC, Matos JR, Alves PB,
Matos IL, Hădărugă DI, Araújo AAS. Inclusion complex of (-)-linalool and β-cyclodextrin. J. Therm. Anal. Calorim. 2014;
115: 2429-2437.