ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MUTANTES DE
Gluconacetobacter diazotrophicus DEFECTIVOS PARA
OSMOTOLERÂNCIA
MARCOS VINICIUS VIANA DE OLIVEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO - 2008
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MUTANTES DE
Gluconacetobacter diazotrophicus DEFECTIVOS PARA
OSMOTOLERÂNCIA
MARCOS VINICIUS VIANA DE OLIVEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia
Orientador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
FEVEREIRO – 2008
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MUTANTES DE
Gluconacetobacter diazotrophicus DEFECTIVOS PARA
OSMOTOLERÂNCIA
MARCOS VINICIUS VIANA DE OLIVEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia
Aprovada em 22 de Fevereiro de 2008
_________________________________________________________________
Prof. Anna Lvovna Okorokova Façanha (D.Sc, Química Biológica) – UENF
_________________________________________________________________
Prof. Victor Martin Quintana Flores (D.Sc, Biociências e Biotecnologia) – UENF
_________________________________________________________________
Jean Luiz Simões de Araújo (D.Sc, Ciências Biológicas - Genética) – EMBRAPA
_________________________________________________________________
Prof. Gonçalo A. de Souza Filho (D.Sc, Biociências e Biotecnologia) – UENF
(Orientador)
AGRADECIMENTOS
Ao Deus Uno e Trino, que com seu infinito amor é o regente da orquestra
da minha vida.
A CAPES pela bolsa de mestrado concedida.
Ao CNPq, FINEP, FAPERJ e a UENF pelo apoio financeiro
Aos meus pais, Sebastião D. de Oliveira e Tânia Viana de Oliveira por
todo apoio dedicado a mim e por compreenderem a minha ausência em
momentos tão importantes.
A minha irmã Aline Viana de Oliveira por ser um instrumento de
santificação na minha vida.
A minha avó Mercedes Paula Dantas de Oliveira, pela constante
intercessão pelo meu sucesso.
Aos meus avós maternos Heraldo Vianna e Alfredina Vianna, pelo apoio e
carinho que sempre tiveram por mim.
Aos meus tios (as) e primos (as) por direta ou indiretamente colaborarem
no cumprimento desta trajetória.
Aos meus amigos e amigas da Escola de Evangelização Santo André por
ser a minha família na cidade de Campos. Obrigado por todo amor dispensado a
mim.
A amiga e companheira de trabalho Aline Chaves Intorne pela força,
incentivos, conversas, mas sobre tudo pelo companheirismo e profissionalismo
que foram essenciais para a elaboração desta dissertação.
As amigas Mariana e Juliana pela convivência agradável e troca de
experiências.
Aos amigos Leandro de Mattos Pereira e Bruno dos Santos Esteves pelas
conversas, momentos de distração, discussão científica. Sem vocês minhas
refeições teriam sido muito solitárias.
As amigas Beatriz Ferreira e Valéria Lopes Marques por todo apoio e
carinho com que sempre me trataram.
Aos meus companheiros e companheiras de grupo de pesquisa. A
agradável convivência com vocês foi essencial para tornar agradáveis os
trabalhos realizados.
Ao amigo Mateus do Nascimento pela agradável convivência em nossa
república.
ii
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
Aos membros da banca, Dra. Anna Okorokova, Dr. Victor Martin Flores e
Dr. Jean Luiz Simões, pelas contribuições ao trabalho;
A Dra. Adriane Nunes por toda dedicação na revisão da Dissertação.
Ao professor Gonçalo A. de Souza Filho pela orientação.
.
iii
ÍNDICE
ÍNDICE................................................................................................................... iv
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................ vi
ÍNDICE DE TABELAS........................................................................................... vii
RESUMO............................................................................................................... viii
ABSTRACT........................................................................................................... ix
1 – INTRODUÇÃO................................................................................................. 01
1.1 – Gluconacetobacter diazotrophicus......................................................... 01
1.1.1 – Os habitats de G. diazotrophicus.................................................... 01
1.1.2 – Características promotoras do crescimento vegetal....................... 03
1.1.2.1 – Fixação biológica de nitrogênio........................................... 03
1.1.2.2 – Síntese “in vitro” de hormônios vegetais............................. 04
1.1.2.3 – Solubilização de nutrientes minerais................................... 05
1.1.3 – Aspectos fisiológicos e bioquímicos de G. diazotrophicus.............. 05
1.2 – Resposta de bactérias a estresses ambientais...................................... 07
1.2.1 – Estresse osmótico........................................................................... 08
1.2.2 – Resposta de bactérias ao estresse osmótico..................................08
1.2.3 – Resposta de G. diazotrophicus ao estresse osmótico.................... 11
1.3 – Genômica funcional................................................................................ 11
1.3.1 – Projeto RioGene.............................................................................. 13
2 – OBJETIVO....................................................................................................... 14
2.1 – Objetivos específicos.............................................................................. 14
3 – MATERIAIS E METODOS............................................................................... 15
3.1 – Microrganismos...................................................................................... 15
3.2 – Meios de cultivo...................................................................................... 15
3.3 – Condições de cultivo.............................................................................. 16
3.4 – Análise do nível de tolerância de G. diazotrophicus a altas
concentrações de sorbitol................................................................... 17
3.5 – Escrutínio de mutantes sensíveis a estresse osmótico por sorbitol....... 17
3.6 – Curvas de crescimento em sorbitol dos mutantes selecionados............18
3.7 – Análise do efeito de diferentes agentes estressantes sobre o
crescimento dos mutantes selecionados............................................ 18
3.8 – Extração do DNA genômico bacteriano................................................. 19
3.9 – Confirmação da transposição por PCR.................................................. 19
iv
3.10 – Análise do número de inserções do transposon em cada mutante......19
3.11 – Identificação das seqüências interrompidas nos mutantes
selecionados para estresse osmótico................................................. 20
4 – RESULTADOS................................................................................................. 21
4.1 – Sensibilidade de G. diazotrophicus PAl5 a sorbitol................................ 21
4.2 – Escrutínio de uma biblioteca de mutantes de inserção de G.
diazotrophicus..................................................................................... 21
4.3 – Confirmação da presença e do número de inserções do
transposon no genoma de G. diazotrophicus..................................... 22
4.4 – Obtenção de curvas de crescimento dos mutantes selecionados
na ausência e na presença de 1,1 M de sorbitol................................ 25
4.5 – Identificação das seqüências gênicas interrompidas pelo transposon... 25
4.6 – Sensibilidade dos mutantes ao estresse osmótico.................................27
4.7 – Efeito do estresse salino sobre o crescimento da cepa selvagem
e dos mutantes................................................................................... 30
4.8 – Efeito combinado de NaCl e sacarose sobre o crescimento
dos mutantes...................................................................................... 32
4.9 – Análises dos genes identificados........................................................... 36
5 – DISCUSSÃO.................................................................................................... 40
6 – CONCLUSÕES................................................................................................ 48
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 49
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Gel de agarose 1%. Confirmação da presença do Transposon
Tn5 no DNA genômico de G. diazotrophicus via PCR....................... 23
Figura 2. Hibridação DNA/DNA para verificação do número de inserções
do Transposon no genoma de G. diazotrophicus............................... 24
Figura 3. Curvas de crescimento da bactéria G. diazotrophicus
na ausência e presença de 1,1 M de sorbitol..................................... 26
Figura 4. Efeito de diferentes agentes osmóticos sobre o crescimento
dos mutantes...................................................................................... 29
Figura 5. Crescimento dos mutantes na presença de diferentes
agentes osmóticos.............................................................................. 31
Figura 6. Efeito do estresse salino sobre o crescimento dos mutantes............... 33
Figura 7. Crescimento dos mutantes sobre estresse salino................................ 34
Figura 8. Efeito protetor da sacarose contra o estresse provocado por NaCl..... 35
Figura 9. Domínios conservados nos genes interrompidos pelo
transposon Tn5................................................................................... 37
Figura 10. Seqüências anotadas como nifU e suas respectivas posições
no genoma de G. diazotrophicus........................................................ 39
vi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Composição do Meio DYGS................................................................. 15
Tabela 2. Composição do Meio LB-Miller............................................................. 16
Tabela 3. Seqüências genômicas flanqueadoras do sítio de inserção do
transposon nos mutantes de G. diazotrophicus PAl5
sensíveis a estresse osmótico............................................................ 27
vii
RESUMO
O estresse osmótico é um dos fatores ambientais mais comuns encontrados pelos
organismos vivos, incluindo as bactérias. Os procariotos têm desenvolvido ao
longo da evolução diferentes mecanismos para superar os efeitos deletérios das
condições hipo e hiperosmóticas. Gluconacetobacter diazotrophicus é uma
bactéria Gram-negativa, considerada promotora do crescimento vegetal. Em sua
caracterização inicial, foi observado que G. diazotrophicus pode colonizar
diferentes tecidos da planta de cana-de-açúcar. Sua condição ótima de
crescimento foi determinada sendo em 10% de sacarose, podendo esta chegar
até 30%, sem que a bactéria tenha o seu crescimento interrompido. O principal
objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos na osmotolerância
de G. diazotrophicus, através da identificação e caracterização de mutantes
afetados para esta característica. Para tanto, uma biblioteca de mutantes de
inserção foi escrutinada na presença de altas concentrações de sorbitol a qual
permitiu a identificação de três genes de G. diazotrophicus envolvidos na
osmotolerância. O fenótipo sensível dos mutantes foi confirmado através de
curvas de crescimento em meio líquido e também através do crescimento de
colônias em meio sólido. As seqüências mutadas apresentaram identidade com
uma proteína de formação de grupamentos ferro-enxofre nifU , uma proteína de
estresse universal UspA e uma proteína hipotética de G. diazotrophicus. Para
determinar o comportamento da cepa selvagem e dos mutantes ao estresse
salino, as bactérias foram inoculadas em meio sólido suplementado com NaCl,
KCl e Na2SO4. Os resultados demonstraram que o NaCl e KCl foram mais tóxicos
para cepa selvagem e mutantes do que o Na2SO4 nas mesmas concentrações.
Demonstrando assim a toxicidade do íon cloreto para G. diazotrophicus durante o
estresse salino. Para verificar a capacidade da sacarose em proteger a bactéria
contra o estresse salino foi feito um ensaio utilizando a combinação de NaCl e
sacarose. Sacarose foi capaz de recuperar o crescimento da cepa selvagem e de
dois dos mutantes isolados, revelando assim que este açúcar pode ser usado
como um osmoprotetor por G. diazotrophicus.
Palavras-chave:
Gluconacetobacter
diazotrophicus;
mutantes
Osmotolerância; Sorbitol; Estresse salino; Cloreto; Sacarose.
viii
de
inserção;
ABSTRACT
The osmotic stress is one of the environmental factors most common faced by live
organisms, including bacteria. Prokaryotes have been developed along the
evolution time different mechanisms to overcome the defectives effects of the
hypo and hyperosmotic conditions. Gluconacetobacter diazotrophicus is a Gram
negative bacterium, considered a plant growth promoting bacterium. In an initial
characterization, it was observed that the G. diazotrophicus is able to colonizing
different plant tissues of the sugarcane. Its optimum growth condition was
determined to be in sucrose 10%, and it can reach until sucrose 30%, without the
growth of the bacterium being interrupted. The main aim of this work was to study
the mechanisms involved in the G. diazotrophicus osmotolerance, through the
identification and characterization of mutants affected for this characteristic. In this
way, one insertion mutant library was screened in the presence of high sorbitol
concentration
which
permitted
the
identification
of
three
genes
of
G.
diazotrophicus involved in the osmotolerance. The sensitive phenotypes of the
mutants were confirmed through growth curves in liquid medium and also by
colony growth in solid medium. The mutant sequence presented identity with a FeS cluster assembly protein NifU, a universal stress protein UspA and a
hypothetical protein from G. diazotrophicus. In order to determinate the behave of
the wild type and mutant strains to saline stress, the bacteria were inoculated in
solid medium amended with NaCl, KCl and Na2SO4. The results demonstrated that
NaCl and KCl were more toxic than Na2SO4 in the same concentration for both
strains. Thus demonstrating the toxicity of the chloride ion to G. diazotrophicus
during the saline stress. To verify the ability of the sucrose in protecting the
bacterium against the stress saline was done an assay utilizing a combination of
NaCl and sucrose. Sucrose was able to recover the growth of the wild type strain
and of the two of the isolated mutants, thus reveling that sucrose might be used as
an osmoprotector by G. diazotrophicus.
Keywords: Gluconacetobacter diazotrophicus; insertion mutants; Osmotolerance;
Sorbitol; Salt stress; Chloride; Sucrose.
ix
1
1 – INTRODUÇÃO.
1.1 – Gluconacetobacter diazotrophicus.
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria Gram-negativa, ácidotolerante, em forma de bacilo, com um diâmetro aproximado de 2 µm, que é
movida por 1 ou até 3 flagelos (Cavalcante e Döbereiner, 1988). Suas células
podem ser vistas sob o microscópio como bacilos simples, diplobacilos ou
formando estruturas semelhantes a cadeias, sem esporos (Muthukumarasamy et
al., 2002).
Em sua primeira classificação, esta bactéria foi denominada como
Saccharobacter nitrocaptans. Saccharobacter em referência a plantas de canade-açúcar, que pertencem ao gênero Saccharum, de onde a bactéria foi isolada.
E nitrocaptans devido a sua capacidade de captar e fixar o nitrogênio atmosférico
(Cavalcante e Döbereiner, 1988). Ainda neste mesmo estudo foi proposta a
inclusão desta bactéria no gênero Acetobacter, baseado em informações de
temperatura de hibridação entre DNA/DNA e DNA/RNA. Foi proposto então o
nome Acetobacter nitrocaptans. Em 1989, apenas um ano após o seu isolamento,
Gillis et al. publicaram os resultados de hibridação DNA/DNA e DNA/RNA
juntamente com análises fenotípicas e quimio-taxonômicas, propondo o nome
Acetobacter diazotrophicus. Posteriormente, com base em análises da seqüência
16S do RNA ribossômico (rRNA) e no tipo de ubiquinona produzida, o nome A.
diazotrophicus foi alterado para Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada et al.,
1997). Atualmente, a bactéria é classificada como pertencente ao filo
Proteobacteria na seção α-Proteobacteria, ordem Rhodospirillales e família
Acetobacteraceae.
1.1.1 – Os habitats de G. diazotrophicus.
G. diazotrophicus foi inicialmente isolada de raízes e colmos de
variedades de cana-de-açúcar cultivadas no nordeste e sudeste do Brasil
(Cavalcante e Döbereiner, 1988). Posteriormente sua presença foi confirmada em
plantas de cana-de-açúcar cultivadas em outras áreas do Brasil, e em quase
2
todas as regiões que cultivam cana-de-açúcar no mundo, incluindo Filipinas,
Japão, Argentina, Cuba, México, Austrália, Mauritânia e Índia (Saravanan, 2007a).
G. diazotrophicus é considerada uma bactéria endofítica. Este termo
abrange todos os microrganismos capazes de colonizar o interior dos tecidos
vegetais, durante uma parte do seu ciclo de vida, sem causar qualquer dano
aparente ao seu hospedeiro (Petrini, 1991). A natureza endofítica da bactéria foi
confirmada em estudos de microscopia, que mostraram um número relativamente
alto de células (106-107CFU g-1 de massa fresca) em colmos, folhas e raízes de
cana-de-açúcar (Bellone et al., 1997). Utilizando técnicas de microscopia
eletrônica, Dong et al. (1994) mostraram que G. diazotrophicus coloniza os
espaços intercelulares (apoplasto) do colmo de cana-de-açúcar, onde se
concentra a sacarose. Em trabalho posterior, os mesmos autores (Dong et al.,
1997), sugeriram que o xilema do colmo de cana-de-açúcar era um local
improvável para o estabelecimento da bactéria. Tal afirmação baseou-se na baixa
concentração de sacarose (0 a 9%) encontrada no xilema, na possibilidade da
bactéria estimular uma intensa resposta hostil por parte da planta quando
presente neste tecido e também que o movimento da bactéria estaria restrito a um
ou dois internós. Em contrapartida, James et al. (1994) e James et al. (2001)
demonstraram, através de técnicas de microscopia eletrônica utilizando
anticorpos específicos contra G. diazotrophicus, evidências anatômicas da
localização desta bactéria também nos vasos xilemáticos da cana, mais
especificamente no protoxilema, no parênquima xilemático e no metaxilema.
Inicialmente G. diazotrophicus foi considerada um endófito obrigatório,
uma vez que, embora esta bactéria possa ser cultivada e manipulada facilmente
em laboratório, estudos prévios não permitiram o seu isolamento, em quantidade
significativa, a partir do solo e da região da rizosfera de plantas de cana-deaçúcar. Entretanto, recentemente, sua ocorrência natural na rizosfera de plantas
de cana-de-açúcar foi verificada (Santos et al., 2006).
Embora G. diazotrophicus tenha sido descrita como uma bactéria
associada às plantas ricas em açúcar, esta tem sido encontrada naturalmente
associada com outros tipos de plantas. (Pedraza, 2007). Desde o seu primeiro
relato, G. diazotrophicus tem sido isolada de batata doce (Paula et al., 1991),
plantas de café (Jiménes-Salgado et al., 1997), do cereal Eleusine coracana
(Loganathan et al., 1999), abacaxi (Tapia-Hernández et al., 2000), plantas de chá
3
(raízes), manga (fruto), e rizosfera de plantas de banana (Muthukumarasamy et
al., 2002) e de plantas de arroz alagado (Muthukumarasamy et al., 2005).
1.1.2 – Características promotoras do crescimento vegetal.
G. diazotrophicus foi originalmente descrita como um endófito diazotrófico
e responsabilizada pelos altos níveis de fixação biológica de nitrogênio (FBN) em
cana de açúcar (Boddey et al., 1991). Além disso, a observação de sua
ocorrência na rizosfera, juntamente com outras características, tem levado a
classificação desta bactéria como uma bactéria promotora do crescimento vegetal
(PGPB, do inglês “Plant-growth-promoting-bacteria”) (Saravanan et al., 2007a).
Os efeitos benéficos como os de PGPB podem ser obtidos através de diferentes
vias, como a solubilização de nutrientes minerais, aumento da obtenção de
nutrientes, produção de hormônios vegetais, vitaminas e enzimas modulando o
crescimento vegetal, supressão de patógenos através de sideróforos ou através
de biocontrole (Dobbelaere et al., 2003). Tais características são especificamente
abordadas a seguir.
1.1.2.1 – Fixação Biológica de Nitrogênio.
O elemento nitrogênio é o mais abundante na atmosfera terrestre e é o
principal componente das proteínas e outras biomacromoléculas como o DNA.
Entretanto, a disponibilidade de nitrogênio fixado é o fator limitante de maior
importância para muitas culturas agrícolas economicamente importantes.
Compostos nitrogenados ocupam mais de 30% do total de fertilizantes nas
lavouras. Com o aumento dos custos dos fertilizantes químicos e da
conscientização acerca da poluição ambiental causada pelo excesso destes
adubos, a fixação biológica de nitrogênio tem ganhado destaque com uma
alternativa
para
tornar
a
agricultura
mais
sustentável
e
produtiva
(Muthukumarasamy, 2002).
Poucos estudos de inoculação têm sido realizados com o objetivo de
validar o potencial de cepas de G. diazotrophicus em fixar nitrogênio em
associação com cana-de-açúcar. Dentre as dificuldades encontradas para tais
análises, esta o fato da cana-de-açúcar ser propagada vegetativamente, através
4
do plantio das gemas laterais, levando assim a interferência de outros
microrganismos (Baldani e Baldani, 2005). Estudos com o objetivo de observar os
benefícios fornecidos por G. diazotrophicus para a produção de cana-de-açúcar
revelaram que a inoculação de plantas cultivadas “in vitro” com a cepa PAl5
aumentou o peso fresco da parte aérea em 28% (Baldani et al., 1999 apud
Baldani e Baldani, 2005). Resultados similares foram obtidos quando a inoculação
da cepa PAl5 foi realizada na presença de baixas quantidades de fertilizantes
nitrogenados (Moraes e Tauk-Tornisielo, 1997 apud Baldani e Baldani, 2005).
Estudos realizados por Sevilla et al. (2001) puderam comprovar a capacidade de
fixar nitrogênio de G. diazotrophicus. Neste trabalho, os autores inocularam
plantas de cana-de-açúcar com a cepa PAl5 selvagem e com um mutante para
fixação de nitrogênio (nif-). Através da utilização de um isótopo radioativo do
nitrogênio molecular (15N2) na forma gasosa, pôde-se observar o processo de
fixação biológica de nitrogênio nas plantas que foram inoculadas com a cepa
selvagem. Nestas, a presença do isótopo radioativo foi confirmada nas estruturas
do tecido vegetal.
1.1.2.2 – Síntese “in vitro” de hormônios vegetais.
Ácido indolacético (AIA) é uma importante auxina envolvida em vários
aspectos do desenvolvimento vegetal e sua produção por microrganismos é
considerada uma importante atividade promotora do crescimento de plantas
(PGP, do inglês Plant-growth promotion). A produção de AIA por G.
diazotrophicus em meio de cultura definido foi observada (Fuentes-Ramírez et al.,
1993). Estes autores sugerem que talvez esta característica poderia promover o
aumento das raízes e do crescimento de plantas de cana-de-açúcar.(FuentesRamírez et al., 1993). Posteriormente, a produção de AIA foi confirmada em
diversas cepas de G. diazotrophicus mantidas no “Indian Institute of Sugarcane
Research” (Suman et al., 2001).
Além disso, a produção de outros hormônios vegetais como giberilinas (A1
e A3) por G. diazotrophicus também foi detectada em meio de cultivo definido
(Bastian et al., 1998). Tais resultados demonstram que além da fixação biológica
de nitrogênio, outros fatores produzidos por esta bactéria podem ter um papel na
promoção do crescimento de plantas de cana-de-açúcar. Estudos realizados por
5
Sevilla et al. (2001), utilizando um mutante incapaz de fixar nitrogênio atmosférico,
demonstraram que mesmo na ausência de fixação biológica, G. diazotrophicus
promove o crescimento vegetal, quando quantidades adequadas de nitrogênio
são fornecidas as plantas. Sendo assim, talvez a produção de hormônios vegetais
por G. diazotrophicus seja de grande relevância para o desenvolvimento das
plantas hospedeiras (Saravanan et al., 2007a).
1.1.2.3 – Solubilização de nutrientes minerais.
A solubilização de fosfato mineral é considerada uma característica das
bactérias promotoras do crescimento vegetal presentes na rizosfera. Entretanto, a
solubilização de fósforo por uma bactéria endofítica poderia ajudar na
disponibilidade de fósforo para a planta hospedeira durante o início da
colonização e consequentemente promoverem o crescimento vegetal (KuklinskySobral et al., 2004). A solubilização de fosfato tem sido observada em várias
cepas de G. diazotrophicus isoladas de cana-de-açúcar (Saravanan et al., 2007a).
Similarmente, ensaios realizados por Saravanan et al. (2007b) mostraram
que G. diazotrophicus PAl5 é capaz de solubilizar a maioria dos compostos
insolúveis de Zinco. Tal metal é um micronutriente essencial na produção
agrícola, e sua deficiência causa o amarelamento precoce das pontas e bordas
das folhas de muitas espécies vegetais. Além destas observações, mutantes de
G. diazotrophicus deficientes na síntese de PQQ, cofator essencial para a síntese
do ácido glicônico, foram incapazes de solubilizar fósforo e zinco, em meio
contendo glicose como fonte de carbono (Intorne, 2008).
1.1.3
–
Aspectos
fisiológicos
e
bioquímicos
de
G.
diazotrophicus.
Os estudos fisiológicos e bioquímicos realizados com G. diazotrophicus
têm demonstrado que esta bactéria é capaz de crescer fixando nitrogênio
utilizando diferentes fontes de carbono (Cavalcante e Döbereiner, 1988).
Adicionalmente, G. diazotrophicus é capaz de crescer com pH chegando a 3,0 e
fixar nitrogênio em meio de cultura com pH até 2,5 (Stephan et al., 1991).
6
Entretanto, o pH ótimo para o seu crescimento é em torno de 5,5 (Cavalcante e
Döbereiner, 1988).
Uma característica interessante desta bactéria é sua habilidade em
excretar parte do nitrogênio fixado para o meio de cultura (Cojho et al., 1993).
Tais autores utilizaram uma levedura (Lipomyces kononenkoae), crescendo em
um meio deficiente de nitrogênio, para mimetizar as necessidades da planta. Eles
observaram que G. diazotrophicus poderia suprir mais de 40% do nitrogênio
requerido pela levedura. Essa observação sugere que, dentro dos tecidos
vegetais, G. diazotrophicus poderia disponibilizar grandes quantidades de
nitrogênio para a planta, fornecendo assim base para os altos níveis de fixação
biológica de nitrogênio reportado em certas variedades de cana-de-açúcar
cultivadas no Brasil (Urquiaga et al., 1992).
Foi observado que G. diazotrophicus não possui a enzima nitrato redutase
e que a atividade da nitrogenase não é inibida por altas concentrações de nitrato
(Cavalcante e Döbereiner, 1988; Stephan et al., 1991). Adicionalmente, foi
observado que ocorre somente uma inibição parcial da nitrogenase por NH4+
(Stephan et al., 1991). Tais características permitem a G. diazotrophicus fixar
nitrogênio mesmo na presença de nitrogênio do solo, tornando esta, uma bactéria
diazotrófica associada a plantas de grande interessante para a agricultura
(Pedraza et al., 2007).
A fonte de carbono que melhor suporta o crescimento de G.
diazotrophicus é sacarose. A concentração ótima para o crescimento é tida como
10%. Entretanto, esta bactéria pode crescer mesmo em concentrações maiores
deste mesmo açúcar (30%) (Cavalcante e Döbereiner, 1988). Uma vez que a
sacarose não pode ser transportada ou respirada por G. diazotrophicus, esta
cresce secretando uma enzima, levansucrase (Arrieta et al., 2004) para o espaço
periplasmático. A atividade desta enzima então hidrolisa a sacarose em frutose e
glicose que serão utilizadas como fonte de energia. A bactéria é também capaz
de utilizar outras fontes de carbono tais como gliconato, glicose, frutose, manitol,
arabinose, meso-inositol, i-inositol, sorbitol, glicerol, e galactose. Aminoácidos
como glutamato, serina, alanina e histidina podem ser usados efetivamente como
fonte de carbono e nitrogênio. Entretanto, celobiose, amido, meso-eritritol e
metanol (1%) não favorecem o crescimento bacteriano. Similarmente, nenhum
dos ácidos orgânicos mais comuns, como succinato e outros ácidos dicarboxilicos
7
suportam o crescimento de G. diazotrophicus, exceto o ácido 2-cetoglicônico que
está presente em plantas de cana-de-açúcar (Muthukumarasamy, 2002a).
G. diazotrophicus têm sido considerada uma bactéria diazotrófica aerotolerante, onde o oxigênio é um instrumento para a geração de grandes
quantidades de ATP requeridas para a fixação de nitrogênio. A oxidação
extracelular da glicose tem uma importante função no primeiro passo do
metabolismo da glicose por G. diazotrophicus. Uma glicose desidrogenase
associada
à
pirroloquinolina
quinona
(PQQ-GDH),
presente
no
espaço
periplasmático promove a conversão de glicose a gliconato (Stephan et al., 1991;
Attwood et al., 1991). A correlação entre o sistema respiratório e a atividade
diazotrófica de G. diazotrophicus PAl5 foi investigada por Flores-Encarnación et
al. (1999), usando aumento na aeração do meio de cultivo. Aeração mostrou um
forte efeito positivo sobre o crescimento e atividade diazotrófica desta bactéria.
Análises das membranas por cromatografia liquida de alta performance (HPLC)
revelaram a presença do citocromo ba como uma possível oxidase, concluindo
que a enzima glicose desidrogenase e o citocromo ba são componentes chaves
para o sistema respiratório de G. diazotrophicus quando esta bactéria esta fixando
nitrogênio na presença de oxigênio. Adicionalmente, uma glicose desidrogenase
associada à nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD-GDH) foi encontrada como
sendo ativamente sintetizada em culturas contendo excesso de glicose (Alvarez e
Martínez-Drets, 1995). Ensaios realizados por Luna et al. (2006), analisando as
enzimas PQQ-GDH e NAD-GDH, revelaram que G. diazotrophicus metaboliza
glicose principalmente pela via da PQQ-GDH. Entretanto, com excesso de
glicose, NAD-GDH é simultaneamente expressa, e esta enzima poderia então
também participar na oxidação da glicose. Neste mesmo estudo, Luna et al.
(2006) demonstraram que glutamato é a molécula central no metabolismo de
carbono desta bactéria e que o fluxo metabólico prossegue principalmente pela
via das pentoses fosfato como já foi reportado para outras bactérias do ácido
acético (Matsushita et al., 1994 apud Pedraza, 2007).
1.2 – Resposta de bactérias a estresses ambientais.
Estresse ambiental em bactérias pode ser definido como um fator externo
que promove um efeito adverso sobre o bem-estar fisiológico das células, levando
8
a redução do nível de crescimento ou, em circunstâncias extremas, à morte de
células individuais ou até mesmo da população. Exemplos desses estresses
bacteriostáticos ou bactericidas incluem extremos de temperatura, pH, pressão
osmótica, falta de nutrientes e a presença de compostos tóxicos ou inibitórios
(McMahon et al., 2007).
1.2.1 – Estresse osmótico.
A condição osmótica de um ambiente é um dos parâmetros físicos que
determinam à habilidade de proliferação dos organismos. O estresse osmótico
pode ser definido como um aumento ou decréscimo na pressão osmótica do
ambiente sobre um organismo (Csonka, 1989). Como habitante de meios
aquosos, naturais ou artificiais, as bactérias vivem com constantes mudanças na
osmolaridade extracelular. Por exemplo, bactérias do solo vivem em períodos de
pouca ou muita chuva; patógenos do sistema urinário sobrevivem em urina
concentrada ou diluída; e organismos industriais toleram soluções concentradas
de nutrientes e produtos metabólicos acumulados extracelularmente (Wood,
1999).
A membrana citoplasmática das bactérias é permeável à água, mas forma
uma barreira efetiva contra a maioria dos solutos presentes no meio extracelular e
metabólitos presentes no citoplasma. Uma diminuição na atividade da água no
meio extracelular (condições hiper-osmóticas) causa um rápido efluxo de água e
perda do turgor. Em situações extremas, as células podem plasmolisar, ou seja, a
membrana plasmática retrai e se separa da parede celular. Por outro lado, diante
de um choque hipo-osmótico a água entra na célula, promovendo aumento do
volume do citoplasma e da pressão de turgor, podendo levar a lise celular.
(Poolman e Glaasker, 1998).
1.2.2 – Resposta de bactérias ao estresse osmótico.
Estudos sobre as alterações moleculares decorrentes do estresse
osmótico nas bactérias têm revelado duas principais estratégias para o
crescimento e sobrevivência dos procariotos em ambientes de alta osmolaridade.
O acúmulo de sal no citoplasma, um mecanismo que foi descrito principalmente
9
entre os membros da família Halobacteriaceae, leva ao equilíbrio osmótico
através da manutenção da concentração de sal citoplasmática (KCl) similar a do
meio externo. Entretanto, em vista de grandes modificações estruturais serem
necessárias para a manutenção deste mecanismo, a maioria das outras espécies
tem evoluído convergentemente para lidar com ambientes de elevada
osmolaridade através do acúmulo de moléculas de baixo peso molecular,
denominadas solutos compatíveis. Esses solutos são assim chamados devido a
sua compatibilidade com os processos celulares, mesmo em altas concentrações
(Sleator e Hill, 2001).
O estresse osmótico deve ser percebido pelas bactérias e convertido em
mudanças de atividade de enzimas específicas e proteínas transportadoras de
modo que o balanço osmótico possa ser rapidamente restaurado (Poolman e
Glaasker, 1998). Enquanto a maioria das respostas biológicas depende do
reconhecimento de moléculas sinalizadoras, a osmoregulação difere pelo fato de
que a informação vinda do ambiente não é uma molécula específica, mas sim um
parâmetro fisiológico (Sleator e Hill, 2001). A ativação osmótica de proteínas de
membrana pode ser realizada por diferentes vias: (i) mudança no turgor celular;
(ii) deformação mecânica da membrana; (iii) estímulos mecânicos originados no
exo ou citoesqueleto celular; (iv) mudanças no estado de hidratação das
proteínas; (v) alterações físico-químicas da bicamada lípidica da membrana
celular, alterando as interações proteína-lípidio; (vi) mudanças na concentração
ou força iônica (Poolman et al., 2002).
Em Escherichia coli, um dos principais organismos modelos para a
resposta de bactérias ao estresse osmótico, diversos sistemas de osmoregulação
tem sido caracterizados. Nesta bactéria, uma aquaporina denominada AqpZ
medeia o fluxo de água através da membrana (Calamita et al., 1998). O acúmulo
de K+ em resposta a alta pressão osmótica é uma das primeiras respostas da
bactéria a perda de água e é intermediada pelos transportadores TrkA(G/H)SapD
e KdpFABC (Schlösser et al., 1995). KdpD é um sensor tipo cinase integral de
membrana que junto com KdpE, um regulador da resposta citoplasmática,
constitui um sistema que controla transcrição do operon KdpFABC em resposta
ao estresse osmótico. A supressão do catabolismo de glutamato, pelo estresse
osmótico, leva ao seu acúmulo como um par iônico para o potássio (Sleator e Hill,
2001). Os trasportadores de membrana ProP, ProU, BetT e BetU são
10
responsáveis pelo transporte e acúmulo de osmólitos no citoplasma das células.
Cada proteína representa uma família diferente de transportadores, com
diferentes fontes de energia. Quimicamente diversos, os osmólitos presentes no
meio extracelular contribuem tanto para o aumento da pressão osmótica como
para a ativação de cada um dos transportadores. Dessa forma, cada
transportador é capaz de atuar como osmosensor e osmoregulador. As enzimas
BetA e BetB catalizam a síntese de glicina betaína a partir de colina enquanto as
enzimas OtsA e OtsB medeiam a síntese de trealose a partir de glicose em
condições de alta osmolaridade (Wood, 2006). Os canais mecanosensíveis MscL
e MscS realizam a excreção de solutos em resposta a quedas na pressão
osmótica (Anishkin e Kung, 2005).
A adaptação de bactérias diazotróficas ao estresse osmótico é de grande
relevância, uma vez que a perda de água provocada pelos longos períodos de
estiagem e acumulo de solutos no ambiente inibe as atividades bacterianas
importantes para a promoção do crescimento vegetal, como a fixação de
nitrogênio e a produção de hormônios vegetais. Em geral, as bactérias Gramnegativas que convivem na rizosfera utilizam muitos dos mesmos solutos
compatíveis
e
osmoprotetores
que
as
bactérias
entéricas
durante
a
osmoadaptação (Miller e Wood, 1996)
Embora o transporte de íons, o transporte de água e o acúmulo de solutos
compatíveis sejam as principais respostas de bactérias ao estresse osmótico,
recentemente estudos para a identificação de proteínas envolvidas na resposta ao
estresse osmótico de Entrerobacter sakazakii, um patógeno alimentar oportunista,
revelaram que os principais efeitos observados foram a repressão de proteínas do
aparato de motilidade e a formação de células filamentosas (Riedel and Lehner,
2007). Além disso, estudos com o isolamento de mutantes de Sinorhizobium
meliloti sensíveis a estresse salino e com diferentes cepas de Azospirillum
brasiliense, duas bactérias rizosféricas diazotróficas, tem demonstrado que a
regulação das respostas das bactérias a mudanças na osmolaridade do ambiente
é complexa e em muitos níveis (Wei et al, 2004; Chowdhury et al., 2007). Para
Azospirillum brasiliense foi observado que a produção de exopolisacarídeos e a
agregação celular são as principais respostas desta bactéria ao estresse salino
quando comparado com a absorção e osmoproteção por glicina betaína
(Chowdhury et al., 2007).
11
1.2.3 – Resposta de G. diazotrophicus a estresse osmótico.
Como já mencionado, o principal sítio de localização de G. diazotrophicus
é o apoplasto, onde a concentração natural de sacarose se aproxima dos 10%.
Esta alta concentração de sacarose promove uma elevada pressão osmótica, que
é responsável pela inibição do crescimento de muitos microrganismos. Entretanto,
tal concentração é considerada como ótima para o crescimento de G.
diazotrophicus. Altas concentrações de sacarose influenciam na atividade da
nitrogenase desta bactéria, diminuindo a inibição causada por altas pressões de
O2 e pelo aumento na concentração de amônio (Reis e Döbereiner, 1998).
A capacidade de G. diazotrophicus tolerar estresse osmótico tem sido
estudo de alguns poucos trabalhos. O que se tem demonstrado é que G.
diazotrophicus é tolerante a altas concentrações de sacarose mas é sensível a
estresse salino. Adicionalmente, foi observado que a atividade da enzima
nitrogenase e das enzimas do metabolismo de carbono são afetadas por estresse
provocado por NaCl (Reis e Döbereiner, 1998; Tejera et al., 2003).
Recentemente, Delatorre (2007) relatou o efeito dos solutos compatíveis glicina
betaína, prolina e colina sobre cultivos descontínuos de G. diazotrophicus PAl5
sob estresse salino. Utilizando sacarose como fonte de carbono, prolina e colina
na concentração de 20mM foram capazes de recuperar o crescimento de G.
diazotrophicus em meio de cultura acrescido de 200 mM de NaCl. Entretanto,
glicina betaína não foi eficiente em nenhuma das concentrações utilizadas
(Delatorre, 2007). Em trabalho anterior, Boniolo (2006) relatou um efeito positivo
de glicina betaína, porém utilizando uma concentração menor (100 mM) de NaCl.
1.3 – Genômica funcional.
Com os recentes avanços obtidos nas tecnologias para seqüenciamento
de DNA em larga escala, cada vez mais tem crescido o número de organismos
com sua seqüência genômica completamente conhecida. Atualmente, este
número chega aos 650 organismos com seqüência completa e mais 678 projetos
em andamento. Dos 650 com seqüência completa 628 são organismos
procariotos, sendo a grande maioria Eubacteria (NCBI - Genome Project Statistic,
12
2008). Apesar da importância de se seqüenciar e caracterizar genomas, a
finalização desta etapa conduz à etapa posterior de análise funcional dos genes
encontrados. Tal fase, a “Genômica Funcional”, representa a possibilidade de
transformar em resultados aplicáveis, as informações geradas pelos projetos
genoma (Hieter e Boguski, 1997). Uma variedade de métodos tem sido utilizada
para monitorar os processos biológicos em escala genômica. Geralmente, os
pesquisadores definem uma resposta celular alvo, como por exemplo, resposta a
um determinado ambiente ou doença, selecionam um conjunto de condições e
realizam experimentos de análise em larga escala (Tanay et al., 2005).
Um rápido aumento no número de técnicas para análise funcional tem
permitido a análise da expressão de genes (Aspedon et al., 2006), da ligação a
fatores de transcrição (Iyer et al., 2001), seleção em coleções de mutantes (Wei et
al., 2004), análise de duplo - híbrido (Schiwikowski et al., 2000), entre outros. A
análise computacional típica agrupa os dados obtidos e então tenta caracterizar
cada grupamento gênico utilizando as funções gênicas conhecidas (Tanay et al.,
2005).
Um dos métodos que têm sido amplamente utilizados para a análise
genômica funcional é a estratégia baseada em bibliotecas de mutantes de
inserção. A maiorias das quais, é gerada com uso de transposons (Hayes, 2003).
Complexos, denominados transpossomas, formados pela interação de uma
transposase-Tn5 e o DNA tranposon propriamente dito tem sido introduzidos em
E. coli (Goryshin et al., 2000) e leveduras (Hoffman et al., 1999) através de
eletroporação para gerar inserções no DNA cromossômico.
O uso de transposon para a geração de mutantes de inserção tem sido
validada para diferentes organismos (Hoffman et al., 2000).. Recentemente,
Rouws et al. (2007) publicaram a construção de uma biblioteca total de mutantes
de inserção de G. diazotrophicus utilizando o tranposon Tn5. Além disso, Intorne
(2008) desenvolveu uma nova biblioteca parcial, armazenada no Núcleo de
Análises Genômicas da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro – UENF, desta mesma bactéria buscando realizar análises de genômica
funcional. Adicionalmente, esta metodologia tem sido utilizada para o estudo da
resposta de bactérias da rizosfera ao estresse osmótico (Jiang et al., 2004; Wei et
al., 2004). A inserção do transposon pode causar o silenciamento ou pertubar a
13
expressão de genes levando a mudanças fenotípicas no organismo hospedeiro
(Hoffman et al., 2000).
1.3.1 – Projeto Rio Gene
Devido à importância da lavoura canavieira para o Brasil e dos possíveis
benefícios que a bactéria G. diazotrophicus pode proporcionar para as plantas de
cana-de-açúcar, levando ao aumento da produção e redução de insumos, foi
lançado em novembro de 2000 o Programa Genoma do Estado do Rio de Janeiro
(RioGene). O consórcio, formado por nove laboratórios fluminenses, pertencente
a diferentes instituições de pesquisa, visou primeiramente o seqüenciamento
completo
do
genoma
da
bactéria
G.
diazotrophicus
(RioGene,
2006).
Recentemente, tal etapa foi concluída, com o depósito das informações no banco
de dados do NCBI (NCBI, 2007). Uma vez consolidado o seqüenciamento do
genoma desta bactéria, os trabalhos atualmente se dedicam à análise funcional
dos diversos genes encontrados.
Gluconacetobacter diazotrophicus tem sido considerada uma bactéria de
grande relevância para a agricultura. Devido a sua capacidade de fixar nitrogênio
atmosférico, produzir hormônios vegetais e solubilizar nutriente, esta bactéria foi
incluída no grupo das bactérias promotoras do crescimento vegetal. Para a
lavoura canavieira, a inoculação com G. diazotrophicus pode ser uma estratégia
para o aumento da produção e a diminuição da quantidade de adubos
nitrogenados. A capacidade de resistir a uma alta concentração de solutos no
meio extracelular, talvez seja um importante fator para a sobrevivência de G.
diazotrophicus no interior das plantas de cana-de-açúcar. Embora vários estudos
tenham sido conduzidos no intuito de caracterizar a osmotolerância de G.
diazotrophicus (Cavalcante e Döbereiner, 1988; Reis e Döbereiner, 1999; Tejera
et al., 2003; Boniolo, 2006; Delatorre, 2007), os mecanismos genéticos envolvidos
nesta tolerância ainda permanecem desconhecidos. A identificação de genes
associados a tais mecanismos pode contribuir para um melhor entendimento a
respeito da sobrevivência desta bactéria no interior das plantas de cana-deaçúcar.
14
2 - OBJETIVO
Elucidar
os
mecanismos
envolvidos
na
osmotolerância
em
Gluconacetobacter diazotrophicus, através da identificação e caracterização de
mutantes sensíveis para esta característica.
2.1 – Objetivos específicos:
Identificar mutantes sensíveis ao estresse osmótico, provocado por altas
concentrações de sorbitol, através do escrutínio de uma biblioteca de
mutantes de inserção de G. diazotrophicus.
Avaliar o efeito das mutações na velocidade de crescimento para os
mutantes selecionados, na ausência e na presença de sorbitol.
Comparar a resposta dos mutantes selecionados aos estresses
provocados por sorbitol e sacarose.
Avaliar o crescimento dos mutantes na presença de estresse provocado
por diferentes sais (NaCl, KCl e Na2SO4).
Avaliar o efeito da sacarose na resposta das diferentes cepas (selvagem
e mutantes) ao estresse provocado por NaCl.
Identificar os genes afetados nos mutantes defectivos para a
osmotolerância através do seqüenciamento das regiões flanqueadoras
aos sítios de inserção do Transposon.
15
3 – MATERIAL E MÉTODOS.
3.1 – Microrganismos.
A bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus PAl5, gentilmente cedida
pelo Professor Dr. Fábio Lopes Olivares do Laboratório de Biologia Celular e
Tecidual LBCT/CBB/UENF, foi utilizada em todos os ensaios deste trabalho.
Escherichia coli EC100D pir- foi adquirida comercialmente da Epicentre
Biotechnologies (Madison, WI).
3.2 – Meios de cultivo.
A bactéria G. diazotrophicus foi cultivada rotineiramente em meio DYGS
(Rodrigues Neto, 1986). A composição do meio DYGS é mostrada na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição do Meio DYGS
Componente
Concentração (g/L)
Glicose
2,0
Peptona Bacteriológica 1,5
Extrato de Levedura
2,0
K2HPO4
0,5
MgSO4
0,5
Ácido Glutâmico
0,75
Para a realização dos
ensaios
de estresse osmótico com G.
diazotrophicus, o meio de cultivo DYGS foi inicialmente preparado utilizando o
dobro da concentração estabelecida. Após a esterilização, o meio foi misturado na
proporção 1:1 com os agentes estressantes. Os estoques de sorbitol, NaCl, KCl e
Na2SO4 foram preparados com o dobro da concentração final desejada e foram
esterilizados em autoclave a 121 ºC. O estoque de sacarose foi preparado no
dobro da concentração final desejada e foi esterilizado utilizando filtros de
celulose com porosidade de 0,2 µm.
E. coli foi cultivada rotineiramente em meio LB-Miller (Miller, 1972). A
composição do meio LB-Miller é dada na Tabela 2.
16
Tabela 2 – Composição do Meio LB-Miller
Componente
Concentração (g/L)
Triptona
10,0
Extrato de Levedura
5,0
NaCl
10,0
Os componentes dos meios de cultivo foram dissolvidos em água
destilada e o meio foi esterilizado em autoclave a 121 ºC, 1,1 atm por 20 min.
Para o meio DYGS, o pH inicial do meio foi ajustado para 6,0 com a utilização de
KOH.
Para os cultivos realizados em meio sólido foram adicionados 15,0g/L de
agar, antes do processo de esterilização. Para os cultivos realizados em meio
DYGS sólido foi adicionado o indicador de pH azul de bromotimol, utilizando-se 5
mL/L de uma solução 0,5 % dissolvida em KOH 0,2 N e o pH foi ajustado para 6,0
antes da adição de agar.
Quando necessário, os meios de cultivo foram suplementados com 50
µg/mL de canamicina.
3.3 – Condições de cultivo.
As culturas de G. diazotrophicus foram incubadas a 30 ºC sob condições
controladas, em estufa e/ou “shaker” orbital com agitação de 150 min-1.
Para o processo de seleção de mutantes em larga escala, placas de
titulação de 96 poços com capacidade de 2 mL por poço foram utilizadas. O
volume máximo de meio de cultivo utilizado foi de 400 µL por poço, respeitando
assim a proporção de 1 volume de meio para 5 volumes de ar. As placas foram
seladas com adesivo plástico e incubadas sob agitação constante durante 5 dias.
Para a realização dos ensaios de curva de crescimento, foram utilizados
frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de cultivo. Os frascos foram
tampados com manta de algodão e gaze para permitir uma melhor troca gasosa.
Os inóculos das bactérias foram realizados utilizando-se 5% do volume
final de meio de cultivo, a partir de uma suspensão celular congelada,
previamente preparada e armazenada a -80 ºC.
17
3.4 – Análise do nível de tolerância de G. diazotrophicus a altas
concentrações de sorbitol.
Para estabelecer o nível de tolerância de G. diazotrophicus a altas
concentrações de sorbitol, primeiramente foi realizado um inóculo de ativação a
partir de culturas estoques armazenadas a -70 ºC até que a cultura atingisse
D.O600nm = 1,0. Esta cultura ativada foi então diluída em novo meio de cultivo
contendo uma concentração final de 700 (12%), 900 (16%), 1100 (20%), 1300
(24%) e 1500 (28%) mM de sorbitol. A turbidimetria inicial da cultura foi aferida
por espectrofotometria e ajustada para D.O600nm = 0,1. Cada uma das culturas foi
então distribuída em quatro réplicas de 400 µL nas placas de titulação de 96
poços. As placas foram seladas com adesivo plástico e mantidas sob agitação
durante 3 dias. Após este período as placas foram centrifugadas a 3000 xg por 5
minutos e a tolerância da bactéria a diferentes concentrações de sorbitol foi
avaliada qualitativamente através da observação da presença ou ausência de
biomassa bacteriana sedimentada.
3.5 – Escrutínio de mutantes sensíveis a estresse osmótico por
sorbitol.
Uma
biblioteca
contendo
diazotrophicus, obtida através
1630
mutantes
de
inserção
de transposição utilizando
o
kit
de
G.
EZ-Tn5
<R6Kori/KAN-2>Tnp Transposome da Epicentre Biotechnologies, estocada em
meio DYGS líquido a -80 ºC na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro (Intorne, 2008) foi utilizada para inoculação em placas de titulação de 96
poços contendo 400 µL de meio DYGS liquido suplementado ou não com 1,1
molar de sorbitol. Após período de crescimento, estas foram centrifugadas a 3000
xg por 5 minutos e comparadas visualmente para a observação da presença ou
ausência de biomassa bacteriana precipitada. Os mutantes que cresceram no
meio sem sorbitol e que não apresentaram crescimento no meio com sorbitol
foram selecionados.
18
3.6 – Curvas de crescimento em sorbitol dos mutantes selecionados.
O efeito do sorbitol sobre o crescimento dos mutantes selecionados foi
observado em meio DYGS líquido contendo 1,1 M de sorbitol em frascos
agitados. Culturas estoques dos mutantes e de G. diazotrophicus PAl5 selvagem
foram adicionadas na proporção de 5 % em meio fresco e os valores de
densidade ótica a 600nm (D.O600) foram aferidos em leitor espectrofotômetro para
microplacas (µquant, BIO-TEK) a cada 3 horas por um período de 3 dias. As
leituras foram feitas utilizando microplacas de 96 poços com fundo reto. Foi
utilizado 100 µL de cultura por poço. Foram feitas quatro réplicas de cada amostra
para cada um dos pontos de leitura. A média entre as réplicas foram usadas em
gráficos utilizando o programa Microsoft Excel 2003.
3.7 – Análise do efeito de diferentes agentes estressantes sobre o
crescimento dos mutantes selecionados
Para avaliar o crescimento dos mutantes selecionados com diferentes
solutos em concentrações distintas, as cepas mutantes e a cepa selvagem foram
inoculadas em meio DYGS sólido com o auxílio de um replicador manual de 96
pinos. As culturas foram crescidas em frascos agitados até atingirem a
concentração celular de 107 unidades formadoras de colônia (u.f.c)/mL. Após esse
período, as culturas foram aliquotadas em quatro réplicas de igual volume em
placas de 96 poços, de onde foram transferidas para o meio DYGS sólido com o
uso do replicador.
Para as análises de crescimento em meio sólido, o meio DYGS foi
suplementado com sorbitol, sacarose, NaCl, KCl e Na2SO4 nas seguintes
concentrações: 600, 800, 1000 e 1200 mM para sorbitol; 400, 600, 800 e 1000
mM para sacarose; 100, 150, 200 e 250 mM para NaCl, KCl e Na2SO4. As placas
foram incubadas a 30 ºC por cinco dias e o crescimento foi avaliado visualmente.
Para cada uma das colônias foi atribuído um valor numérico arbitrário numa
escala de 0-10, considerando como ótimo o padrão de crescimento das colônias
no meio sem a adição de solutos (controle). Para a compilação dos dados, foi
utilizada a média dos valores atribuídos a cada uma das quatro réplicas e gráficos
de barra foram traçados utilizando o programa Microsoft ® Excel 2003.
19
Para a validação dos resultados utilizando replicador de 96 pinos, uma
concentração de cada um dos agentes estressantes foi selecionada para uma
análise. Foram realizadas diluições de 10X, 100X e 1000X a partir de uma cultura
contendo 107 ufc/ml. O inoculo foi realizado utilizando alíquotas de 10 µL de cada
uma das culturas e das respectivas diluições. A cepa selvagem e os mutantes
foram dispostos juntos na mesma placa e foram feitas três réplica de cada uma
das placas. As placas foram incubadas por 5 dias a 30 ºC e o registro do ensaio
foi realizado através de fotografia utilizando câmera digital.
3.8 – Extração de DNA genômico bacteriano.
O DNA genômico de G. diazotrophicus foi extraído utilizando o kit de
extração Plant DNAzol da Invitrogen™ de acordo com as instruções do fabricante.
Foi utilizada a sugestão do fabricante de adicionar RNase no início do processo
de extração. No final do processo de extração o DNA foi hidratado em água
ultrapura autoclavada.
3.9 – Confirmação da transposição por PCR.
Além da resistência ao antibiótico canamicina, a presença do transposon
no genoma de cada um dos mutantes selecionados foi confirmada através da
reação em cadeia da polimerase (PCR do inglês Polymerase Chain Reaction). Foi
utilizado iniciador específico para as bordas do transposon, que flanqueiam o
fragmento de 2000 pb referente ao EZ-Tn5 <R6Kori/KAN-2>. Esse iniciador foi
denominado MEint e possui a seqüência 5’- CTGTCTCTTATACACATCT – 3’. Foi
utilizado 10 ng de DNA genômico como molde. A amplificação foi realizada em
termociclador, de acordo como seguinte programa: 5 minutos a 95 ºC + 40 ciclos
(60 segundos a 95 ºC + 60 segundos a 60ºC + 120 segundos a 72 ºC) + 30
minutos a 72 ºC). Os resultados foram observados através de eletroforese em gel
de agarose e coloração com brometo de etídio.
3.10 – Análise do número de inserções do transposon em cada
mutante.
20
O número de inserções do transposon em cada mutante foi verificado
através de ensaio de hibridação DNA/DNA. Um micrograma de DNA genômico de
cada um dos mutantes pré-selecionados e da bactéria selvagem foi submetido a
digestão completa utilizando a enzima EcoRI (New England Biolabs) de acordo
com as instruções do fabricante. O DNA digerido foi submetido à eletroforese em
gel de agarose e posterior transferência para membrana de nylon, onde foi então
submetido à técnica de hibridação DNA/DNA. O processo de transferência e
hibridação foi realizado de acordo com Sambrook e Russel (2001). A sonda
utilizada foi o fragmento de 2000 pb referente ao transposon, amplificado por PCR
e marcado com dCTP αP32 utilizando o kit Random primer T7.
3.11 – Identificação das seqüências interrompidas nos mutantes
selecionados para estresse osmótico.
Como as regiões contendo o transposon EZ-Tn5 <R6Kori/KAN-2 podem
ser auto-ligadas e replicar-se independentemente em E. coli DC100 pir
-
o DNA
genômico digerido com EcoRI foi auto-ligado através do uso da enzima T4 DNA
ligase (Invitrogen). O produto da ligação foi então eletroporado em E. coli e as
colônias foram selecionadas sobre LB sólido na presença de canamicina. Os
clones obtidos foram então inoculados em meio LB líquido e submetidos à
extração plasmidial pelo método de lise alcalina na presença de SDS de acordo
com Sambrook e Russel (2001). A seqüência de DNA genômico de G.
diazotrophicus flanqueando o transposon nestes plasmídeos foi determinada
utilizando seqüenciador automático ABI 3130 (Applied Biosystems) utilizando o kit
Big Dye Terminator (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do
fabricante. Para a reação de seqüenciamento foram utilizados os iniciadores KAN2-FP-1
e
KAN-2-RP-1
fornecidos
pelo
kit
EZ-Tn5
<R6Kori/KAN-2>Tnp
transpossome. Após a obtenção das seqüências, estas foram submetidas a
alinhamento com o genoma de G. diazotrophicus disponível no banco de dados
do NCBI (Centro Nacional para Informação Biotecnológica, do inglês National
Center
for
Biotechnology
Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
utilizando
a
ferramenta
BLAST
21
4 – RESULTADOS.
4.1 – Sensibilidade de G. diazotrophicus PAL 5 a sorbitol.
Para determinar a maior concentração de sorbitol que a bactéria G.
diazotrophicus PAL-5 é capaz de tolerar, um ensaio foi conduzido em meio DYGS
líquido com um gradiente de 0.7 a 1.5M de sorbitol. Os resultados foram
analisados visualmente e demonstraram que a bactéria foi capaz de crescer até a
concentração de 1.3 M o que equivale a uma proporção (peso/volume)
aproximada de 24%. Portanto, como o objetivo deste passo era determinar a
maior concentração de sorbitol que a bactéria ainda crescia bem e assim utilizar
esta concentração para o escrutínio da biblioteca de mutantes, foi selecionada a
concentração do ponto anterior à concentração inibitória, que equivale a 20% de
sorbitol (1,1 M).
4.2 – Escrutínio de uma biblioteca de mutantes de inserção de G.
diazotrophicus.
Com o objetivo de isolar mutantes de G. diazotrophicus sensíveis a
estresse osmótico, uma biblioteca de mutantes de inserção foi escrutinada
utilizando meio DYGS liquido com e sem 1,1 M de sorbitol. O crescimento dos
mutantes foi realizado em placas de cultura de 96 poços. Após 3 dias de cultivo,
as placas foram centrifugadas e cada um dos mutantes foi analisado quanto a
formação de precipitado bacteriano com relação ao controle. Os mutantes que
não cresceram em meio DYGS suplementado com sorbitol foram re-inoculados a
partir da cultura crescida no meio controle. Após o primeiro escrutínio, os
mutantes que não cresciam passavam a ser inoculados em triplicata. Este
processo de seleção foi repetido 3 vezes. Após este período foi possível isolar
quatro cepas mutantes que não apresentaram crescimento no meio DYGS líquido
contendo 1,1M de sorbitol. Os mutantes GDP6D5, GDP7C8, GDP25C4 e
GDP25C8 foram então denominados Gdosm1, Gdosm2, Gdosm3 e Gdosm4,
respectivamente. Estes mutantes foram selecionados para análises posteriores.
22
4.3 – Confirmação da presença e do número de inserções do
transposon no genoma de G. diazotrophicus.
Para averiguar a presença do transposon e o número de inserções do
mesmo no genoma de cada mutante, estes foram inoculados em meio DYGS
liquido e, após o crescimento da cultura, submetidos à extração de DNA
genômico. A presença do transposon foi confirmada através de reação em cadeia
da polimerase utilizando iniciadores específicos para o transposon. DNA
genômico da bactéria tipo selvagem foi utilizado como controle negativo.
Conforme
apresentado
na
Figura
1,
todos
os
mutantes
selecionados
apresentaram uma banda de aproximadamente 2000pb referente ao transposon
EZ-Tn5 <R6Kori/KAN-2> .
Para observar o número de inserções do transposon no genoma de cada
um dos mutantes, o DNA genômico dos mesmos foi submetido a ensaio de
hibridação DNA/DNA na presença de sonda correspondente ao Transposon. Para
tanto, primeiramente o DNA foi submetido à digestão completa utilizando a
endonuclease
EcoRI,
de
acordo
com
as
instruções
do
fabricante
e,
posteriormente os fragmentos foram separados utilizando eletroforese em gel de
agarose (Figura 2A). Finalmente, os fragmentos foram transferidos para
membrana de nylon e submetidos à hibridação utilizando o transposon EZ-Tn5
<R6Kori/KAN-2>, marcado radioativamente, como sonda. A membrana foi
exposta a filme de auto-radiografia e o resultado demonstrou que todos os
mutantes selecionados apresentam uma única inserção do transposon em seu
genoma (Figura 2B). Adicionalmente pode-se observar três tamanhos de banda
diferentes, pois os mutantes Gdosm3 e Gdosm4 apresentaram o mesmo tamanho
de fragmento. Portanto, isto indica que os mutantes Gdosm1 e Gdosm2 estão
inseridos em regiões diferentes do genoma. Os mutantes Gdosm3 e Gdosm4
podem estar inseridos numa mesma região do genoma. Por outro lado, pode
tratar-se apenas de coincidência que resultou na formação de dois fragmentos de
tamanho similar.
23
1
2
3
4
5
6
7
2 kb
Figura 1. Gel de agarose 1%. Confirmação da presença do Transposon Tn5 no DNA
genômico de G. diazotrophicus via PCR. Raia 1, padrão de peso molecular “1kb DNA
Ladder Plus” da Invitrogen. Raia 2, controle negativo. Raias 3 a 7, amplificação proveniente do
DNA
dos
mutantes
respectivamente.
Gdosm1,
Gdosm2,
Gdosm3,
Gdosm4
e
da
cepa
selvagem,
24
A)
1
2
3
4
5
B)
1
2
3
4
5
Figura 2. Hibridação DNA/DNA para verificação do número de inserções do Transposon
no genoma de G. diazotrophicus. A) Gel de agarose 0,8% contendo 5µg/raia de DNA
digerido com EcoRI. B) Filme de auto-radiografia revelando a hibridação do transposon,
marcado radioativamente, com regiões específicas do genoma. Raias 1 a 5, a numeração
crescente corresponde a cepa selvagem e aos mutantes Gdosm1, Gdosm2, Gdosm3 e
Gdosm4, respectivamente.
25
4.4 – Obtenção de curvas de crescimento dos mutantes selecionados
na ausência e na presença de 1,1 M de sorbitol.
Para caracterizar o efeito da inserção no crescimento dos mutantes
selecionados, estes foram cultivados em meio DYGS líquido. Após um período de
60 horas de cultivo, os resultados apresentados na Figura 3A demonstraram que,
quando cultivados em meio DYGS sem a adição de sorbitol, os mutantes Gdosm1
e Gdosm2 apresentam um padrão de crescimento semelhante à cepa selvagem.
Diferentemente, os mutantes Gdosm3 e Gdosm4, mesmo na situação controle,
apresentaram uma redução maior que 50 % do crescimento observado para a
cepa selvagem. Adicionalmente, pode-se observar que estes dois mutantes
apresentaram curvas de crescimento semelhantes (Figura 3A). Quando os
mutantes foram crescidos em meio DYGS suplementado com 1,1M de sorbitol o
resultado observado foi que após as 60 horas de cultivo nenhum dos mutantes
apresentou crescimento. Mesmo para a cepa selvagem o estresse provocado foi
relevante, reduzindo o seu crescimento para cerca de 50 % do crescimento
observado na condição controle (Figura 3B). Portanto, os experimentos serviram
para estabelecer curvas de crescimento para os mutantes selecionados e
confirmaram o fenótipo sensível a estresse osmótico.
4.5 – Identificação das seqüências gênicas interrompidas pelo
transposon.
Após a confirmação do número de inserções, as seqüências de DNA das
regiões flanqueadoras do transposon, dos 4 mutantes selecionados, foram
obtidas. Devido a presença de uma origem de replicação de E. coli no
transponson <R6Kyori/KAN-2>, os genes interrompidos puderam ser facilmente
retirados do DNA genômico, auto-ligados e eletroporados em E. coli EC100D pir-.
Todas as seqüências interrompidas foram isoladas e seqüenciadas. As
seqüências obtidas foram comparadas par a par com as seqüências do genoma
de G. diazotrophicus depositadas no banco de dados do NCBI utilizando a
ferramenta BLAST.
26
A)
B)
Figura 3. Curvas de crescimento da bactéria G. diazotrophicus selvagem e mutante na
ausência e presença de 1,1M de sorbitol. O sistema de cultivo utilizado foi o de frascos
agitados. Em A) curvas de crescimento em meio DYGS líquido. Em B) curvas de crescimento
em meio DYGS líquido suplementado com 1,1M de sorbitol. ( ) cepa selvagem; ( ) Gdosm1;
( ) Gdosm2; ( ) Gdosm3 e ( ) Gdosm4. Alíquotas foram retiradas a cada 3 horas de
crescimento e lidas em leitor de microplacas a 600nm. Os valores representam a média de 4
repetições de leitura.
27
Como apresentado na tabela 3, três diferentes genes puderam ser
identificados. O gene interrompido em Gdosm1 apresentou similaridade com uma
proteína possivelmente envolvida nos mecanismos de fixação de nitrogênio com
domínio nifU (descrita como responsável pela formação de “clusters” Fe-S). O
gene mutado em Gdosm2 apresentou similaridade com uma proteína com
domínio Usp (proteína de estresse universal). Os mutantes Gdosm3 e Gdosm4
apresentaram inserção no mesmo gene, entretanto em regiões diferentes. A
seqüência apresentou similaridade com uma proteína hipotética de função
desconhecida. Devido ao comportamento semelhante apresentado por esses dois
mutantes na curva de crescimento e a inserção ter ocorrido no mesmo gene
somente o mutante Gdosm3 foi selecionado para análises posteriores.
Tabela 3. Seqüências genômicas flanqueadoras do sítio de inserção do transposon nos
mutantes de G. diazotrophicus PAl5 sensíveis a estresse osmótico.
Cepa Mutante
Gene IDa
Sítio de Inserção (bp)
Possível função da ORFb
GDP6D5 (Gdosm1)
5788836
304-313
Possível
proteína
fixadora
de
nitrogênio nifU.
GDP7C8 (Gdosm2)
5790654
596-605
Proteína com domínio Usp.
GDP25C4 (Gdosm3)
5788812
739-748
Proteína hipotética GDI0714.
GDP25C8 (Gdosm4)
5788812
1337-1348
Proteína hipotética GDI0714.
a
– GeneID de acordo com o genoma de G. diazotrophicus disponível no NCBI.
b
– Possível função da seqüência aberta de leitura (ORF) de acordo com o genoma de G.
diazotrophicus disponível no NCBI.
4.6 – Sensibilidade dos mutantes ao estresse osmótico.
Devido ao ensaio em meio líquido ser extremamente laborioso, se fez
necessário uma metodologia que permitisse a avaliação do crescimento em
diferentes concentrações de agentes estressantes. O nível de sensibilidade dos
mutantes selecionados, foi então acessado em meio DYGS sólido utilizando o
replicador de 96 pinos. Foram utilizadas as concentrações de 600, 800, 1000 e
1200 mM de sorbitol e 400, 600, 800 e 1000 mM de sacarose. As culturas da
cepa selvagem e mutante, previamente crescidas e com a concentração celular
ajustada para 107 ufc/mL, foram transferidas para microplacas de 96 poços.
Foram feitas 4 réplicas de cada uma das culturas. A partir destas placas, o
replicador foi utilizado para inocular os mutantes nos meios de cultura. Após um
28
período de crescimento de 3 dias, o crescimento de cada uma das réplicas foi
avaliado em relação ao crescimento observado no meio controle. Valores
arbitrários foram dados para o crescimento de cada uma das réplicas. O
crescimento dos mutantes na situação controle foi considerado como nota 10 e
ausência de crescimento como nota 0. As médias entre as quatro réplicas de
cada tratamento foram plotadas em gráficos de barras e o resultado pode ser
observado na figura 4.
Os mutantes responderam de maneira semelhante ao estresse provocado
por sorbitol e ao estresse provocado por sacarose (Figura 4B). Entre eles, o
mutante Gdosm1 foi o que apresentou maior sensibilidade ao estresse osmótico.
Tal mutante teve o seu crescimento reduzido de forma gradual de acordo com o
aumento da concentração de açúcares no meio, chegando a ter mais de 50 % de
redução em sua capacidade de crescimento quando foi utilizado 800 mM de
sorbitol (Figura 4A).
Em contrapartida, os mutantes Gdosm2 e Gdosm3
apresentaram um crescimento semelhante à cepa selvagem nas concentrações
de 1 M de sorbitol e 800 mM de sacarose (Figura 4A e 4B). Acima destas
concentrações os mutantes apresentaram uma forte redução no crescimento. Em
geral, quando comparado com os resultados fornecidos pelas curvas de
crescimento em meio líquido, observa-se que a utilização do replicador de 96
pinos em meio sólido permitiu identificar as diferenças no nível de sensibilidade
dos mutantes a sorbitol.
Para a validação e confirmação dos resultados obtidos com a utilização
de replicador de 96 pinos foi realizado um novo ensaio em meio DYGS sólido.
Foram utilizadas as concentrações de agentes estressantes onde a bactéria
selvagem ainda apresenta um bom crescimento (1,2 M de sorbitol e 0,8 M de
sacarose). Diferentes diluições de cada uma das culturas, previamente
padronizadas por densidade ótica para uma concentração celular de 107 ufc/mL,
foram inoculadas em meio DYGS sólido. Foi utilizada uma micropipeta para
dispensar alíquotas de 10 µL de cada uma das diluições em cada um dos
tratamentos. Tal procedimento foi realizado para garantir que o volume aplicado
de células fosse o mais idêntico possível.
29
A)
B)
Figura 4. Efeito de diferentes agentes osmóticos sobre o crescimento dos mutantes.
Culturas de bactérias contendo 107 u.f.c/mL foram inoculadas em meio DYGS sólido com o
auxilio do replicador de 96 pinos. A) Gradiente de sorbitol. B) Gradiente de sacarose. Barras
em preto, cinza escuro, cinza claro e hachurada demonstram o crescimento das cepas
selvagem, Gdosm1, Gdosm2 e Gdosm3, respectivamente. O crescimento foi avaliado
visualmente dando-se valores arbitrários de 0-10 para cada uma das colônias. Os valores
representam a média de 4 repetições de cada cepa para cada uma das concentrações
testadas.
30
Como pode ser observado na figura 5A, o crescimento dos mutantes e da
cepa selvagem pode ser considerado semelhante. O crescimento observado para
as diferentes diluições demonstrou que a padronização por densidade ótica foi
eficiente para estabelecer um número similar de células, por volume de cultura,
entre as amostras. No crescimento com 1,2 M de sorbitol (Figura 5B) a bactéria
selvagem foi capaz de crescer mesmo nas maiores diluições. Os mutantes
Gdosm1 e Gdosm3 se mostraram altamente sensíveis a esta concentração de
sorbitol. O mutante Gdosm2, embora também fortemente afetado pelo estresse,
apresentou-se mais tolerante que os demais. Com relação ao crescimento em
800 mM de sacarose (Figura 5C), o crescimento da bactéria selvagem foi superior
ao crescimento observado na presença de sorbitol. Portanto, demonstrando a
capacidade desta bactéria em crescer na presença de sacarose, mesmo que esta
esteja em altas concentrações. Novamente, o mutante Gdosm1 se mostrou o
mais sensível entre os mutantes. O mutante Gdosm3 proporcionalmente melhor
que Gdosm1, embora também tenha se mostrado bastante sensível ao estresse.
O mutante Gdosm2 apresentou um crescimento semelhante a cepa selvagem na
presença de sacarose. Os dados obtidos em placas utilizando o método de gotas
apresentaram resultados semelhantes aos encontrados com o uso de replicador
de 96 pinos.
4.7 - Efeito do estresse salino sobre o crescimento da cepa selvagem
e dos mutantes.
Para verificar a resposta dos mutantes selecionados ao estresse salino, a
cepa selvagem e os mutantes foram inoculados com o uso de replicador de 96
pinos, em meio DYGS sólido suplementado com diferentes concentrações de
NaCl, KCl e Na2SO4. Embora tenha sido realizado um ensaio com concentrações
de sais de até 250mM, para concentrações de NaCl e KCl superiores a 100mM,
não foi observado crescimento da cepa selvagem e dos mutantes. A
concentração de 100 mM de NaCl e KCl afetou fortemente o crescimento dos
mutantes e da cepa selvagem (Figura 6A e 6B). Por outro lado, quando o sal
Na2SO4 foi utilizado, uma concentração de 250mM de Na2SO4 foi necessária para
se obter uma redução de crescimento semelhante ao ocorrido com 100mM de
NaCl (Figura 6C). Portanto, este resultado sugere que o íon cloreto (Cl-) é mais
31
A)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
Controle
Gdosm2
Gdosm3
B)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
1,2 M Sorbitol
Gdosm2
Gdosm3
C)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
Gdosm2
0,8 M Sacarose
Gdosm3
Figura 5. Crescimento dos mutantes na presença de diferentes agentes osmóticos..
Alíquotas de 10 µL de cada uma das culturas foram plaqueadas em meio DYGS sólido.
Diferentes diluições foram preparadas a partir de culturas de bactérias contendo 107 u.f.c/mL.
Em A) crescimento da cepas selvagem e mutantes em meio DYGS controle; em B) meio
DYGS suplementado com 1,2M de sorbitol e em C) meio DYGS suplementado com 0,8M de
sacarose. Foram realizadas três repetições de cada um dos ensaios.
32
prejudicial que o íon sódio (Na+) para o crescimento de G. diazotrophicus em
ambiente salino.
O mutante Gdosm1, se mostrou sensível aos sais NaCl e Na2SO4.
Entretanto, este mutante foi mais tolerante que a cepa selvagem à presença de
KCl. O mutante Gdosm2 apresentou nível de sensibilidade semelhante à cepa
selvagem, para todos os sais e concentrações testadas. O mutante Gdosm3 se
mostrou o mais sensível a estresse salino entre os mutantes analisados.
Os dados obtidos com a utilização do replicador de 96 pinos foram
confirmados em meio DYGS sólido contendo 100 mM de NaCl, 100 mM de KCl e
250 mM de Na2SO4. Para tanto, diferentes diluições de cada uma das culturas
foram inoculadas utilizando-se alíquotas de 10 µL. Como pode ser observado na
figura 7, o efeito do estresse salino foi severo para todos os tratamentos
analisados. O uso de diferentes diluições permitiu observar que o crescimento
superior do mutante Gdosm1 em relação a cepa selvagem foi confirmado apenas
quando a concentração celular foi a maior utilizada (Figura7C). Adicionalmente,
tanto para cepa selvagem como para os mutantes, quando uma concentração
menor de células foi utilizada, o efeito do estresse salino foi potencializado.
4.8 - Efeito combinado de NaCl e sacarose sobre o crescimento dos
mutantes.
Para avaliar a influência da sacarose na resposta dos mutantes ao
estresse salino um ensaio foi realizado utilizando meio DYGS sólido controle e
suplementado com 100mM de NaCl e 200mM de sacarose. Como pode ser
observado na figura 8C, a adição de sacarose ao meio foi capaz de reverter o
dano provocado NaCl sobre o crescimento da bactéria selvagem (Figura 8A). O
crescimento do mutante Gdosm1 na presença de NaCl foi parcialmente
recuperada pela adição de sacarose ao meio. Adicionalmente, o crescimento do
mutante Gdosm2 foi restabelecido para níveis semelhantes ao da bactéria tipo
selvagem. Diferente do observado para os mutantes Gdosm1 e Gdosm2, a
presença de sacarose no meio, não foi eficiente para recuperar o crescimento do
mutante Gdosm3.
33
A)
B)
C)
Figura 6. Efeito do estresse salino sobre o crescimento dos mutantes. Culturas de
7
bactérias contendo 10 u.f.c/mL foram inoculadas em meio DYGS sólido com o auxilio do
replicador de 96 pinos. Concentrações maiores que 100mM de NaCl e KCl não apresentaram
crescimento e portanto não foram plotadas no gráfico. Em A) meio DYGS suplementado com
100mM de NaCl; em B) meio DYGS suplementado com 100mM de KCl e em C) meio DYGS
suplementado com um gradiente de Na2SO4. Barras em preto, cinza escuro, cinza claro e
hachurada demonstram o crescimento das cepas selvagem, Gdosm1, Gdosm2 e Gdosm3
respectivamente. O crescimento foi avaliado visualmente dando-se valores arbitrários de 0-10
para cada uma das colônias. Os dados foram plotados utilizando a média entre as 4 repetições
de cada cepa para cada uma das concentrações testadas.
34
A)
B)
0
10
-1
10
-2
10
-3
100
10
PAl5
PAl5
Gdosm1
Gdosm1
Gdosm2
Gdosm2
Gdosm3
Gdosm3
Controle
C)
100
10-1
10-2
10-1
10-2
10-3
100 mM NaCl
D)
100
10-3
PAl5
PAl5
Gdosm1
Gdosm1
Gdosm2
Gdosm2
Gdosm3
Gdosm3
10-1
10-2
10-3
250 mM Na2SO4
100 mM KCl
Figura 7. Crescimento dos mutantes sobre estresse salino. Gotas de 10 µL de cada uma
das culturas foram plaqueadas em meio DYGS sólido. Diferentes diluições foram preparadas a
7
partir de culturas de bactérias contendo 10 u.f.c/mL. Em A) crescimento da cepa selvagem e
mutantes em meio DYGS controle; em B), C) e D) meio DYGS suplementado com NaCl (100
mM), KCl (100 mM) e Na2SO4 (250 mM). Foram realizadas três repetições de cada um dos
ensaios.
35
A)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
Controle
Gdosm2
Gdosm3
B)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
100 mM NaCl
Gdosm2
Gdosm3
C)
100
10-1
10-2
10-3
PAl5
Gdosm1
Gdosm2
100 mM NaCl +
200mM Sacarose
Gdosm3
Figura 8. Efeito protetor da sacarose contra o estresse provocado por NaCl.. Alíquotas de
10 µL de cada uma das culturas foram plaqueadas em meio DYGS sólido. Diferentes diluições
foram preparadas a partir de culturas de bactérias contendo 107 u.f.c/mL. Em A) crescimento
da cepas selvagem e mutantes em meio DYGS controle; em B) meio DYGS suplementado
com 100mM de NaCl e em C) meio DYGS suplementado com 100mM de NaCl mais 200mM
de sacarose. Foram realizadas três repetições de cada um dos ensaios.
36
4.9 – Análises dos genes identificados
No intuito de melhor correlacionar os genes identificados nos mutantes
com os fenótipos observados, análises de bioinformática foram realizadas
utilizando os dados do genoma de G. diazotrophicus disponíveis no NCBI e as
ferramentas disponíveis no mesmo site. Neste sentido a primeira análise realizada
foi uma busca por domínios conservados em cada um dos genes (Figura 9).
Como pode ser observado, para o mutante Gdosm1, além do domínio nifU, já
caracterizado no genoma de G. diazotrophicus, puderam também ser observados
os domínios NFU_N, COG0694 e PRK11190 (Figura 9A). O domínio NFU_N esta
relacionado a proteínas formadoras de grupamento ferro-enxofre, presentes em
organismos não fixadores de nitrogênio. O domínio COG0694 esta relacionado a
proteínas semelhante a Tioredoxina e está envolvida com processos de oxidação
e o domínio PRK11190 esta envolvido com o transporte do ânion gliconato
(Figura 9D). Para o mutante Gdosm2 (Figura 9B), semelhante ao já descrito para
esta seqüência no genoma de G. diazotrophicus, a maioria dos domínios
encontrados estão relacionados com a família de proteínas de estresse universal.
Adicionalmente, foi observado também um domínio C-terminal de uma subfamília
de transportadores antiporter Na+/H+. Entretanto, o valor do E-value para este
domínio foi considerado alto e portanto de baixa confiabilidade (Figura 9D). As
análises do mutante Gdoms3 (Figura 9C) revelaram similaridade com domínios de
proteínas envolvidas com o processo de replicação e reparo do DNA.
Com o objetivo de verificar a similaridade das proteínas mutadas com
proteínas de outros microrganismos foi realizado um alinhamento no banco de
dados do NCBI utilizando a ferramenta Blastp. A seqüência mutada no mutante
Gdosm1 apresentou 73% de similaridade com uma proteína NFU formadora de
grupamentos Fe-S de Granulibacter bethesdensis. O E-value observado para esta
comparação foi de 2e-69. A seqüência mutada no mutante Gdosm2 apresentou
56% de similaridade com uma proteína com domínio UspA de Acidiphilium
cryptum JF-5. O E-value observado para esta comparação foi de 2e-86. A
seqüência interrompida no mutante Gdosm3 apresentou similaridades menores
que 50% com proteínas hipotéticas de diferentes organismos. Entre estas, a
proteína hipotética SMc02759 de Sinorhizobium meliloti apresentou 34% de
similaridade com a seqüência mutada e valor de E-value igual a 3e-104.
37
A)
B)
C)
D)
Descrição dos domínios
E-value
pfam08712, Nfu_N, Proteína modular Nfu/NifU N terminal.
7e-28
COG0694, Proteínas e domínios semelhantes a Thioredoxina
3e-21
pfam01106, NifU, Domínio semelhante a NifU
9e-15
PRK11190, Proteína associada ao transporte de gliconato
6e-04
Cd 00293, USP_Like, Família de proteínas de estresse Universal
3e-07
pfam00582, Usp, Proteína de estresse Universal UspA
2e-08
COG0589, UspA, Proteína de estresse Universal UspA e proteínas que se
ligam a nucleotídeos
Cd01988, Na_H_Antiporter_C, O domínio C-terminal de uma subfamília
de transportadores antiporter Na+/H+.
COG3893, Superfamília I inativadora de helicase
3e-07
3e-40
COG3893, Superfamília I inativadora de helicase
8e-17
COG2887, Exonuclease da família RecB
2e-15
0,001
Figura 9. Domínios conservados nos genes interrompidos pelo transposon Tn5. Em A),
B) e C) pode-se observar os domínios conservados nos mutantes Gdosm1, Gdosm2 e
Gdosm3 respectivamente. Em D) Um resumo da descrição de cada um dos domínios e o
respectivo coeficiente de confiabilidade (E-value) de cada um deles. Foi utilizada a ferramenta
“Conserved domain search” do site do NCBI.
38
proteínas hipotéticas de diferentes organismos. Entre estas, a proteína hipotética
SMc02759 de Sinorhizobium meliloti apresentou 34% de identidade com a
seqüência mutada e valor de E-value igual a 3e-104.
Devido a similaridade da proteína nifU mutada no genoma de G.
diazotrophicus com uma proteína de formação de grupos Fe-S de um organismo
não fixador de nitrogênio, foi realizada uma busca no genoma para verificar a
possível presença de outra nifU que estivesse relacionada com organismos
fixadores de nitrogênio. Como pode ser observado na Figura 10, foram
encontradas três ORFs anotadas como nifU em três regiões distintas do genoma
de G. diazotrophicus. A comparação da seqüência de aminoácidos codificada
pela ORF nifU localizada dentro da ilha nif (Figura 10A), revelou 61% de
similaridade (E-value= 4e-111) com a proteína nifU de Methylobacterium sp. 4-46.
A ORF localizada próximo aos genes suf (Figura 10B) revelou 51% de
similaridade (E-value = 7e-28) com uma proteína formadora de grupos Fe-S do
sistema SUF de Acidiphilium cryptum JF-5. A terceira ORF anotada como nifU,
que corresponde ao gene interrompido pelo transposon no mutante Gdosm1, foi
localizada na região entre 1,396Mpb e 1,399Mpb ao lado da ORF anotada como
rutE.
39
A)
MWEYSDKVKDYFFNPKNAGVMEDASGVGEVGAIACGDALKLMIKVDPQDERITEARFQTFGCGS
AIASSSALTEIIIGKTLDQALEISNQDIADFLGGLPPEKMHCSVMGYEALRAAVANYRGEVWED
DHEDGALLCRCFGVDEGMVERAIRNNGLTSMEQVAQFTKATGSCGTCVEGVEGVLERTNAAMVA
EGLLDPVQAFVPGGAAPVRGRAQKTSPVAPPARTGGKMTTVQKIRAIEEVLEELRPALRNDGGD
CELVDVEDNRVMVRLTGACVNCQLAAVTVQGIQGRIAERLGTPVRVIPVQAGQ
B)
MDQDGLYQRQVIERARAPVHAGPLDGATHQGEGTNPMCGDRVRLGVTLDAAGRVVMVRHQTRGC
AICVASADMMADLAPGRSVAELGVLSRAFTDMLRTGGDAPNPELATFAGLHRHRSRIRCATLPW
SALDDALNESKEG
C)
MFIETEDTPNPATLKFLPGRTIVPGRATADFVSPDAVAGRSKLADALFGQPGVARVFLGGDFVA
VTKDEATDWSVLKPQLLSVLVDFFVSGMPAIEDDAAVEEELIAPEDEEIVRQIKELLDTRVRPA
VAGDGGDIVFRGYRDGVVRLTMQGACSGCPSSRATLKHGVENMLRHYVPEVVSVEQVDA
Figura 10. Seqüências anotadas como nifU e suas respectivas posições no genoma de
G. diazotrophicus. Em A) nifU inserida na ilha nif; em B) nifU próximo aos genes suf; e em C)
nifU interrompida pelo transposon Tn5. Os resíduos de cisteína de cada uma das proteínas
foram destacados em verde. A região em azul claro representa o genoma de G. diazotrophicus
com aproximadamente 3,94Mb. Regiões em rosa representam seqüências codificantes (CDS)
e regiões em cinza representam genes. Destaque em azul escuro para a região pretendida do
genoma. A barra vermelha mostra o fragmento referente à seqüência desejada. Figuras
obtidas a partir do site do NCBI.
40
5 – DISCUSSÃO.
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria endofítica de cana-deaçúcar. Sua ocorrência no interior da planta tem sido relatada em todos os tecidos
vegetais, incluindo o xilema (James e Olivares, 1998; James et al., 2001). Por ser
uma bactéria endofítica G. diazotrophicus experimenta uma vantagem adaptativa
em relação aos demais microorganismos. No espaço apoplástico dos colmos de
cana-de-açúcar a concentração de sacarose pode ultrapassar de 10%, o que,
para muitos microrganismos, é considerada como uma concentração inibitória.
Adicionalmente, foi visto que em laboratório esta bactéria cresce em
concentrações de até 30% (~ 875mM) de sacarose (Cavalcante e Döbereiner,
1988). Portanto, a capacidade de G. diazotrophicus de crescer em altas
concentrações de sacarose pode ser uma das características que permitam o
sucesso de colonização desta bactéria.
No presente trabalho, a característica de G. diazotrophicus tolerar altas
pressões osmóticas causadas por açúcar foi estudada. Neste sentido, uma
biblioteca de mutantes de inserção (Intorne, 2008) foi escrutinada na presença de
altas concentrações de sorbitol e permitiu a identificação de quatro mutantes
sensíveis a 1,1M de sorbitol em meio DYGS líquido. As análises moleculares
destes mutantes revelaram que três genes diferentes foram mutados, uma vez
que os mutantes Gdosm3 e Gdosm4 apresentaram mutações no mesmo gene
(Tabela 3).
Com o intuito de identificar a função dos genes mutados, foram realizadas
análises de seqüência utilizando as informações disponíveis no banco de dados
do NCBI. As análises de seqüência através de BLAST, do mutante Gdosm1,
revelaram similaridade com o gene nifU que codifica uma possível proteína que
participa do processo de fixação de nitrogênio (Tabela 3). A proteína NifU foi
identificada primeiramente em Azotobacter vinelandii e a mutação deste gene
levou a perda de atividade tanto da Fe-Nitrogenase como da FeMo-Nitrogenase
(Jacobson et al., 1989). Proteínas NifU, envolvidas na fixação de nitrogênio,
possuem muitos resíduos de cisteína conservados. Estas cisteínas participam da
estabilização dos átomos de ferro e são consideradas importantes para a
formação dos complexos grupamentos Fe-S requeridos pela nitrogenase
(Johnson et al., 2005). A observação da existência de três seqüências abertas de
41
leitura anotadas como nifU no genoma de G. diazotrophicus (Figura 10) levanta a
hipótese de que a seqüencia mutada não esteja envolvida com o processo de
fixação de nitrogênio. Como pode ser observado na figura 10A, uma das ORFs
anotadas como nifU se encontra localizada dentro do operon nif, e esta proteína
apresenta similaridade com a proteína nifU de Methylobacterium sp. 4-46, um
microrganismo fixador de nitrogênio (Jaftha et al., 2002). Em contrapartida, a
proteína mutada em Gdosm1 apresentou maior similaridade com NFU, uma
proteína formadora de grupos Fe-S, presente em organismos não fixadores de
nitrogênio como Granulibacter bethesdensis. Além disso, pode-se observar uma
grande diferença no número de cisteínas entre a proteína mutada e a proteína
codificada pelo gene presente no operon nif. Sendo assim, é provável que a
seqüência mutada em Gdosm1 não esteja envolvida com o processo de fixação
de nitrogênio e que este mutante ainda seja capaz de formar o complexo da
nitrogenase para fixar o nitrogênio utilizando a proteína nifU codificada pelo
operon nif.
Hwang et al (1996), analisando a similaridade entre diferentes proteínas
semelhantes à nifU, presentes em organismos distantes evolutivamente, sugerem
que essas proteínas participem de funções celulares básicas e possam estar
entre as proteínas mais conservadas durante a evolução. Uma vez que,
grupamentos Fe-S são um dos grupos prostéticos mais comuns na biologia, e são
requeridos para sustentar a maioria dos processos vitais básicos (Fontcave et al.,
2008), a mutação em nifU, ocorrida no mutante Gdosm1, poderia influenciar a
atividade de diversas proteínas Fe-S. Semelhante ao ocorrido neste trabalho,
onde uma proteína formadora de grupos Fe-S está relacionada a resposta de G.
diazotrophicus ao estresse osmótico, Höper et al (2006), estudando a adaptação
de Bacillus subtilis ao estresse salino observaram uma indução na síntese de
enzimas envolvidas na assimilação de sulfato e na formação de grupos Fe-S em
resposta ao estresse. Estudos posteriores, buscando analisar quais as principais
proteínas Fe-S tiveram a sua atividade afetada pela mutação ocorrida em
Gdosm1 permitirão avaliar melhor o papel da proteína nifU na resposta de G.
diazotrophicus ao estresse osmótico.
Análises de seqüência para o mutante Gdosm2 revelaram homologia com
uma proteína de estresse universal com domínio UspA. A proteína de estresse
universal A (UspA) pertence a um grupo de proteínas ancestrais conservadas que
42
são encontradas em bactéria, Archea, fungos, insetos e plantas. Em E. coli a
proteína UspA é expressa em resposta a diferentes variações que ocorram no
meio extracelular. Além disso, UspA é encontrada como uma das proteínas que
mais se acumulam no citoplasma de células de E. coli que tenham o seu
crescimento impedido por algum fator (Kvint et al., 2003). Um mutante de
Azospirillum brasilense defectivo para uma proteína semelhante a Usp apresentou
um fenótipo pleiotrópico com respeito a diferentes condições de estresse.
Mutações nesta proteína levaram a um aumento da sensibilidade das células a
falta de carbono e a choque térmico. Entretanto, o mutante apresentou um
aumento da tolerância a agentes que causam estresse oxidativo. Adicionalmente,
foi observado que este mutante foi impedido em sua capacidade de floculação e
que parte da camada de exopolissacarídeos presente na superfície do tipo
selvagem foi perdida no mutante (Blaha e Schrank, 2003). A função exata da
proteína Usp de G. diazotrophicus ainda permanece por ser estabelecida.
Estudos posteriores, que submetam o mutante Gdosm2 a outros estresses, como
alta temperatura, falta de nutrientes e estresse oxidativo, além do estresse
osmótico permitirão avaliar se em G. diazotrophicus este gene também tem um
efeito pleiotrópico, semelhante ao ocorrido com Azospirilum brasilense.
Análises de seqüência do mutante Gdom3 revelaram homologia com uma
proteína de função desconhecida. Além disso, a busca por similaridade com
outros organismos revelou comparações de baixa similaridade com proteínas
hipotéticas de diferentes organismos. Entre os alinhamentos obtidos foi possível
identificar uma proteína de Sinorhizobium meliloti 1021, denominada proteína
hipotética SMc02759, com 34% de identidade. Em trabalho publicado por Wei et
al. (2004), quando o gene SMc02759 foi interrompido, obteve-se o mutante W10.
Este mutante se mostrou altamente sensível à salinidade e pouco sensível a
estresse provocado por glicose. A seqüência de aminoácidos deduzida para a
seqüência interrompida revelou similaridade com helicase I de Magnetospirillum
sp. e exonuclease RecB de Rhodospirillum rubrum (Wei et al., 2004). Similar ao
ocorrido com SMc02759, a busca por domínios conservados na seqüência
interrompida no mutante Gdosm3 revelou a presença de domínios helicase e
exonuclease RecB (Figura 9C). Tais domínios estão envolvidos com processos de
replicação e reparo do DNA. Sendo assim, provavelmente a mutação tenha
43
afetado a capacidade de a bactéria corrigir os danos causados pelo estresse na
maquinaria de replicação e recombinação do DNA.
Devido ao escrutínio dos mutantes ter sido realizado em larga escala e o
crescimento dos mutantes avaliado apenas visualmente, fez-se necessário uma
análise posterior através de curvas de crescimento. O objetivo de tal experimento
foi confirmar os fenótipos sensíveis e verificar diferenças no crescimento dos
mutantes na situação controle e estressada por sorbitol. Os dados apresentados
na figura 3A demonstraram que os mutantes Gdosm1 e Gdosm2 apresentaram
uma cinética de crescimento semelhante à cepa selvagem na situação controle.
Tal resultado sugere que, nas condições de cultivo testadas, os genes nifU e Usp
não estejam envolvidos em funções celulares básicas pois o crescimento dos
mutantes na situação controle não foi afetado. Em contrapartida, os mutantes
Gdosm3 e Gdosm4, que possuem inserção no mesmo gene, apresentaram um
retardo do crescimento com relação a cepa selvagem e ao demais mutantes. Tal
observação concorda com os dados de que a proteína mutada em Gdosm3 esteja
envolvida na maquinaria de replicação e reparo do DNA. Uma vez que a
maquinaria de replicação e reparo do DNA tenha sido parcialmente afetada, pois
os mutantes ainda foram capazes de crescer na situação controle, a tendência é o
aumento do intervalo de tempo até que as bactérias consigam entrar em
crescimento exponencial. Quando as bactérias foram testadas para o crescimento
na presença do agente estressante (Figura 3B), nenhum dos mutantes
apresentou crescimento no período de 60 horas do ensaio. Para os mutantes
Gdosm1 e Gdosm2, estes dados confirmam a importância dos genes nifU e Usp
na resposta de G. diazotrophicus ao estresse osmótico. Entretanto, para os
mutantes Gdosm3 e Gdosm4 isto não pode ser afirmado com uma maior certeza.
Isto porque, os danos causados pelo estresse a maquinaria de replicação podem
ter sido muito maior do que a capacidade da célula em se recuperar na ausência
do gene mutado. Sendo assim o gene mutado em Gdosm3 e Gdosm4 teria uma
participação indireta no processo de osmotolerância em G. diazotrophicus.
Para avaliar a resposta dos mutantes a diferentes concentrações de
sorbitol e sacarose foi realizado um ensaio utilizando meio de cultivo sólido. O
método de avaliação utilizado foi a diferença entre o crescimento das colônias no
meio de cultura com os agentes estressantes e no meio de cultura controle. Na
presença destes agentes osmóticos, as cepas, selvagem e mutantes, tiveram um
44
padrão de resposta semelhante para sorbitol e sacarose. A bactéria tipo
selvagem, como esperado, foi capaz de crescer até 800mM (27%) de sacarose
(figura 4B), e portanto, dentro do limite dos 30% de sacarose já descritos como
não inibitório para esta bactéria (Cavalcante de Döbereiner, 1988). Embora os
mutantes Gdosm2 e Gdom3 tenham apresentado forte redução do crescimento,
na concentração de sorbitol utilizada para o seu isolamento (1,1 M) em meio
líquido, quando concentrações inferiores a 1 M de sorbitol em meio sólido foram
utilizadas o crescimento destes foi semelhante a cepa selvagem (Figura 4A).
Além disso, estes dois mutantes apresentaram nível de crescimento similar a
cepa selvagem na concentração de 800mM de sacarose (Figura 4B). Diferente
destes, o mutante Gdosm1 demonstrou um nível de sensibilidade dose
dependente, uma vez que o seu crescimento foi diminuindo gradativamente com o
aumento da concentração de açúcar.
A
diferença
de
sensibilidade
apresentada
pelos
mutantes
nos
experimentos em meio sólido quando comparada com a alta sensibilidade
apresentada, durante o escrutínio e o ensaio de curva de crescimento, em meio
líquido poderia ser explicada pelo fato de que, em meio líquido, as bactérias
poderiam estar mais expostas ao agente estressante que em meio sólido. Neste
último, a formação da colônia e a formação de biofilme poderiam proteger as
células do contato direto com o estresse osmótico permitindo assim a tolerância e
o crescimento.
Após a análise da resposta dos mutantes ao estresse osmótico provocado
por altas concentrações de açúcar, buscou-se também fazer uma análise do
crescimento da cepa selvagem e dos mutantes na presença de estresse salino
provocado por NaCl, KCl e Na2SO4. A substituição de altas concentrações de
açúcares por diferentes sais em diversas concentrações demonstrou alterações
no padrão de crescimento de G. diazotrophicus quando comparado ao estresse
osmótico (Figura 4 e 6). Os resultados obtidos para cepa selvagem na presença
de NaCl e KCl confirmaram a característica de sensibilidade a estresse salino já
descrito para G. diazotrophicus (Reis e Döbereiner, 1998) (Figura 6A e 6B).
Entretanto, a utilização de Na2SO4 para a confirmação do efeito prejudicial do íon
sódio para esta bactéria demonstrou que mesmo na concentração de 250mM de
Na2SO4 ainda ocorreu o crescimento da bactéria selvagem (Figura 6C). Tal
resultado leva a hipótese de que o efeito prejudicial do estresse salino relatado
45
para G. diazotrophicus (Reis e Dobereiner, 1998; Tejera et al., 2003) seja
provocado principalmente pelo íon cloreto (Cl-). Tal resultado apresentou-se como
uma interessante descoberta, uma vez que não existem relatos a respeito da
toxicidade do íon cloreto para esta bactéria.
O crescimento dos mutantes no estresse salino foi semelhante para os
diferentes sais utilizados, exceto para o mutante Gdosm1 que se apresentou mais
tolerante que a cepa selvagem na presença de KCl (Figura 6B). Entretanto, este
resultado presente no gráfico de crescimento da figura 6B e confirmado na figura
7C só foi observado quando foram utilizados inóculos sem diluição. Quando as
diferentes diluições de inóculo deste mutante foram crescidas no meio sólido
(Figura 7C), o mutante Gdosm1 passou a ser mais sensível que a cepa selvagem,
semelhante ao ocorrido com os outros agentes estressantes. O mutante Gdosm2
apresentou índices de crescimento semelhante a cepa selvagem em todos as
concentrações de sais utilizadas. A comparação destes resultados com os obtidos
para estresse osmótico, onde o crescimento deste mutante também foi similar a
cepa selvagem em praticamente todas as concentrações de açúcares testadas,
fornece evidências iniciais para a participação da proteína Usp na resposta de G.
diazotrophicus a estresses em geral. Para o mutante Gdosm3, a resposta foi
diferente ao estresse provocado por sal em relação ao estresse osmótico. Para
todos os sais e concentrações utilizadas, este mutante foi o mais sensível à
salinidade (Figura 6 e 7). Associado a observação de que este mutante é capaz
de tolerar 1M de sorbitol e 800mM de sacarose de maneira semelhante a cepa
selvagem (Figura 4), pode-se hipotetizar que o gene mutado esteja mais
envolvido com o estresse iônico do que com o estresse osmótico. Esta hipótese
corrobora com o observado por Wei et al (2004) para o mutante W10 de
Sinorhizobium meliloti SMc02759 que foi mais sensível a NaCl do que ao estresse
provocado por glicose.
Com o objetivo de estudar um possível papel protetor da sacarose contra
o estresse salino, foi realizado um ensaio utilizando meio de cultivo adicionado de
NaCl e Sacarose. Os dados demonstraram que a sacarose foi capaz de recuperar
o crescimento da cepa selvagem a níveis próximos a situação controle. Além
disso, também foi observada uma grande recuperação do crescimento dos
mutantes Gdosm1 e Gdosm2. A recuperação do crescimento no mutante Gdosm3
foi considerada como mínima. Embora não se tenha descrito um mecanismo de
46
internalização de sacarose para G. diazotrophicus, uma vez que esta bactéria
utiliza a enzima levanosucrase para hidrolisar a sacarose no espaço
periplasmático, não se pode descartar a possibilidade de que esta bactéria possa
internalizar a sacarose por alguma outra via. Neste caso, a bactéria poderia esta
utilizando a sacarose como um estabilizador osmótico e assim sendo capaz de
tolerar ao estresse osmótico provocado pelo sal. Uma segunda hipótese poderia
envolver a sacarose com o efeito provocado pelo íon cloreto sobre as células de
G. diazotrophicus. Em um estudo com canais de cloro envolvidos com a doença
fibrose cística foi observado que altas concentrações de sacarose intracelular são
capazes de inibir o canal impedindo assim o transporte de cloreto em células de
mamíferos (Linsdell e Hanrahan, 1996). Portanto, se um sistema semelhante
pudesse ser utilizado, a sacarose poderia estar promovendo um efeito protetor a
partir da inibição da entrada de cloreto na célula. Estudos posteriores para a
quantificação de sacarose e cloreto no interior de G. diazotrophicus permitirão
observar se ocorre ou não um acúmulo de sacarose no citoplasma e se isto
interfere na quantidade de cloreto no interior das células.
Embora a identificação das seqüências mutadas permita a realização de
inferências iniciais a respeito da participação destes genes no processo de
osmotolerância de G. diazotrophicus, a comprovação do envolvimento das
proteínas nifU, Usp e da proteína hipotética GDI0714 na resposta desta bactéria
ao estresse osmótico e salino deverá ser obtida através da complementação
funcional dos genes mutados. A transformação dos mutantes com os respectivos
genes mutados e o restabelecimento do fenótipo semelhante à cepa selvagem,
permitirá concluir que os fenótipos observados não foram originados por outras
mutações ocorridas ao acaso ao longo do genoma.
Inesperadamente, neste trabalho não puderam ser isolados mutantes
defectivos para sistemas tidos como comuns no processo de osmotolerância de
bactérias, como sensores e transportadores de potássio e as proteínas
transportadoras de solutos compatíveis. Tal fato talvez tenha ocorrido devido a
principalmente duas hipóteses. A primeira, seria com relação ao número de
mutantes escrutinado. Uma vez que a biblioteca analisada é somente parcial e
uma grande parte dos genes envolvidos com a osmotolerância pode não estar
presente. Para contornar esta situação o aumento da biblioteca e a realização de
uma nova busca se fazem necessárias. Uma segunda hipótese poderia estar
47
relacionada ao método de escrutínio utilizando açúcar como agente estressante.
Como a bactéria selvagem é altamente tolerante a altas concentrações de açúcar,
provavelmente esta possui diferentes rotas para lidar com este tipo de estresse
provocado. Sendo assim, quando um gene esteve ausente, outra via poderia
suprir a sua falta não afetando totalmente o crescimento deste em sorbitol. Um
escrutínio utilizando, por exemplo, Na2SO4 como agente estressante poderia levar
ao isolamento de mais mutantes defectivos para proteínas já caracterizadas,
envolvidas no processo de osmotolerância.
48
6 – CONCLUSÕES.
O presente trabalho identificou 4 mutantes de G. diazotrophicus a
partir do escrutínio de uma biblioteca contendo 1630 mutantes. Tais mutações
levaram a identificação de genes envolvidos com a sensibilidade de G.
diazotrophicus a estresse osmótico.
Os genes
identificados sugerem a participação de proteínas
formadoras de grupos Fe-S, uma proteína de estresse universal e uma proteína
envolvida na maquinaria de reparo de DNA na osmotolerância de G.
diazotrophicus.
A seqüência aberta de leitura mutada no mutante Gdosm1, anotada no
genoma com nifU codifica uma proteína que não é essencial ao processo de
fixação biológica de nitrogênio.
Durante os ensaios com estresse salino, o íon cloreto demonstrou uma
alta toxicidade para a bactéria G. diazotrophicus.
Sacarose foi capaz de diminuir o efeito do NaCl sobre o crescimento
da bactéria selvagem e de dois dos mutantes
49
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
ALVAREZ, B. e MARTÍNEZ-DRETS, G. Metabolic characterization of Acetobacter
diazotrophicus. Can J Microbiol. 41: 918-924. 1995.
ANISHKIN, A., KUNG, C. Microbial mechanosensation. Cur Opin Neurobiol. 15:
397-405. 2005.
ARRIETA, J. G., SOTOLONGO, M., MENÉNDE, C., ALFONSO, D., TRUJILLO, L.
E., SOTO, M., RAMÍREZ, R. HERNÁNDEZ, L. A type II protein secretory pathway
required for levansucrase secretion by Gluconacetobacter diazotrophicus. J
Bacteriol. 186: 5031-5039. 2004.
ASPEDON, A., PALMER, K. WHITELEY, M. Microarray analysis of the osmotic
stress response in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 188: 2721-2725. 2006.
ATTWOOD, M. M., VAN DIJKEN, J. P., PRONK, J. T. Glucose metabolism and
gluconic acid production by Acetobacter diazotrophicus. J Ferment Biogen. 72:
101-105. 1991
BALDANI J.I. E BALDANI V.L.D. History on the biological nitrogen fixation
research in graminaceos plants: special emphasis on the brazilian experience. An
Acad Bras Ciênc. 77: 549-579. 2005.
BASTIÁN, F., COHEN, A., PICCOLI, P., LUNA, V., BARALDI, R., BOTTINI, R.
Production of indole-3-acetic acid and gibberellins A1 and A3 by
Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum seropedicae in chemically
defined culture media. Plant Growth Regul. 24: 7-11. 1998.
BELLONE, C. H., DE BELLONE, S. D. V. C., PEDRAZA, R. e MONZON, M. A.
Cell colonization and infection thread formation in sugar cane roots by Acetobacter
diazotrophicus. Soil Biol Biochem. 29: 965-967. 1997.
BLAHA, C. A. G., SCHRANK, I. S. An Azospirillum brasilense Tn5 mutant with
modified stress response and impaired in flocculation. Antonie van Leeuwnhoek.
83: 35-43. 2003
BODDEY, R. M., URQUIAGA, S., REIS, V. M., DÖBEREINER, J. Biological
nitrogen fixation associated with sugarcane. Plant Soil. 37: 111-117. 1991.
BONIOLO, F. S. Papel do osmoprotetor glicina betaína na resposta
fisiológica de Gluconacetobacter diazotrophicus PAl5 ao estresse salino.
Dissertação de Mestrado (Biociências e Biotecnologia) – Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ. 2006
CALAMITA, G., KEMPF, B., BONHIVERS, M., BISHAI, W. R., BREMER, E.,
AGRE, P. Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ. Proc Natl
Acad Sci USA. 95: 3627-3631. 1998.
50
CAVALCANTE, V. A. e DOBËREINER, J. A new acid-tolerant nitrogen-fixing
bacterium associative with sugarcane. Plant Soil. 108: 23-31. 1988
CHOWDHURY, S. P., NAGARAJAN, T., TRIPATHI, R., MISHRA, M. N. LE
RUDULIER, D. e TRIPATHI, A. K. Strain-specific salt tolerance and
osmoregulatory mechanisms in Asospirillum brasilense. FEMS Microbiol Lett.
267: 72-79. 2007.
COJHO, E.H., REI, V. M., SCHENBER, A. C. e DÖBEREINER, J. Interaction of
Acetobacter diazotrophicus with an amylolytic yeast in nitrogen-free batch culture.
FEMS Microbiol Lett. 106: 341-346. 1993.
CSONKA, L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress.
Microbiol Rev. 53: 121-147. 1989.
DELATORRE, E. O. Análise do efeito dos solutos compatíveis glicinabetaína, prolina e colina em cultura descontínua de Gluconacetobacter
diazotrophicus PAl5 sob estresse salino. Monografia (Bacharelado em
Ciências Biológicas) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
Campos dos Goytacazes, RJ. 2007.
DOBBELAERE, S. VANDERLEYDEN, J. OKON, Y. Plant growth-promoting
effects of diazotrophs in the rhizosphere. Crit Rev. Plant Sci. 22: 107-149. 2003.
DONG, Z, CANNY, M. J., MCCULLY, M. E., ROBOREDO, M. R., CABADILLA, C.
F., ORTEGA, E., RODES, R. A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stem.
Plant Physiol. 105: 1139-1147. 1994.
DONG, Z, MCCULLY, M. E., CANNY, M. J. Does Acetobacter diazotrophicus live
and move in the xylem of sugarcane stems? Anatomical and physiological data.
Ann Bot-London. 80: 147-158. 1997
FLORES-ENCARNACIÓN, M., CONTRERAS-ZENTELLA, M., SOTO-URZÚA, L.,
AGUILAR, G. R., BACA, B. E., ESCAMILLA, J. E. The respiratory system and
diazotrophic activity of Acetobacter diazotrophicus PAl5. J Microbiol. 181: 69876995. 1999.
FONTCAVE, M., OLLAGNIER-DE-CHOUDENS, S. Iron-sulfur cluster biosynthesis
in bacteria: Mechanisms of cluster assembly and transfer. Arch Biochem
Biophys. DOI: 10.1016/j.abb.2007.12.014. 2008
FUENTES-RAMIREZ, L. E.; JIMENEZ-SALGADO, T.; ABARCA-OCAMPO, I. R. e
CABALLERO-MELLADO, J. Acetobacter diazotrophicus, an indolacetic acid
producing bacterium isolated from sugarcane cultivar of México. Plant Soil. 154:
145-150. 1993.
GILLIS, M., KERSTERS, K., HOSTE, B., JANSSENS, D., KROPPENSTEDT, R.
M., STEPHAN, M. P., TEIXEIRA, K. R. S., DÖBEREINER, J e DELEY, J.
Acetobacter-Diazotrophicus Sp-nov, a nitrogen-fixing acetic-acid bacterium
associated with sugarcane. Int J Syst Bacteriol. 39: 361-364. 1989.
51
GORYSHIN, I. Y., JENDRISAK, J. J., HOFFMAN, L. M., MEIS, R., RESNIKOFF,
W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5
transposition complexes. Nat Biotechnol. 18: 97-100. 2000.
HAYES, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and
proteomics. Annu Rev Genet. 37: 3-29. 2003
HÖPER, D., BERNHARDT, J., HECKER, M. Salt stress adaptation of Bacillus
subtilis. A physiological proteomics approach. Proteomics. 6: 1550-1562. 2006.
HWANG, D. M., DEMPSEY, A. TAN, K. T., LIEW, C. C. A modular domain of NifU,
a nitrogen fixation cluster protein, is highly conserved in evolution. J Mol Evol. 43:
536-540. 1996
HIETER, P. E BOGUSKI, M. Functional Genomics: It’s All How You Read It.
Science. 278: 601-602. 1997.
HOFFMAN, L. M. In vivo transposition of transposon/transposase complexes into
the genome of saccharomyces. Curr Genet. 35: 305. 1999.
HOFFMAN, L. M., JENDRISAK, J. J., MEIS, R. J., GORYSHIN, I. Y., REZNIKOF,
S. W. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial
genomes. Genetica. 108: 19-24. 2000.
INTORNE, A. C. Identificação e caracterização de mutantes de
Gluconacetobacter diazotrophicus defectivos para solubilização de fosfato e
zinco Dissertação de Mestrado (Biociências e Biotecnologia) – Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ. 2008
IYER, V. R., HORAK, C. E., SCAFE, C. S., BOTSTEIN, D., SNYDER, M.,
BROWN, P. O. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors
SBF and MBF. Nature. 409: 533–538. 2001.
JACOBSON, M. R., CASH, V. L., WEISS, M. C., LAIRD, N. F., NEWTON, W. E.,
DEAN, D. R. Biochemical and genetic analysis of the nifUSVWZM cluster from
Azotobacter vinelandii. Mol Gen Genet. 219: 49-57. 1989.
JAFTHA, J. B., STRIJDOM, B. W., STEYN, P. L. Characterization of pigmented
methylotrophic bacteria wich nodulate Lotononis bainesii. Syst App Microbiol. 25:
440-449. 2002.
JAMES, E. K., REIS, V. M., OLIVARES, F. L., BALDANI, J. I. e DÖBEREINER, J.
Infection of sugarcane by nitrogen-fixing bacterium Acetobacter diazotrophicus. J.
Exp Bot. 45: 757-766. 1994.
JAMES, E. K., OLIVARES, F. L., OLIVEIRA, A. L. M., REIS JR, F. B., SILVA, L. G.
e REIS, V. M. Further observation on the interaction between sugar cane and
Gluconacetobacter diazotrophicus under laboratory and greenhouse conditions. J
Exp Bot. 52: 747-760. 2001.
52
JIANG, J. Q., WEI, W., DU, B. H., LI, X. H., WANG, L., YANG, S. S. Salt-tolerance
genes involved in cation efflux and osmoregulation of Sinorhizobium fredii RT19
detected by isolation and characterization of Tn5 mutants. FEMS Microbiol Lett.
239: 139-146. 2004.
JIMENEZ-SALGADO, T.; FUENTES-RAMIREZ, L. E.; TAPIA-HERNANDEZ, A.;
MASCARUA-SPARZA, M. A.; MARTINEZ-ROMERO, E. e CABALLEROMELLADO, J. Coffea arabica L., a new host plant for Acetobacter diazotrophicus,
and isolation of other nitrogen-fixing acetobacteria. Appl Environ Microbiol. 63:
3676-3683. 1997.
JOHNSON, D. C., DEAN, D. R., SMITH, A. D., JOHNSON, M. K. Structure,
function, and formation of biological iron-sulfur clusters. Annu Rev Biochem. 74:
247-281. 2005.
KUKLINSKY-SOBRAL, J. ARAÚJO, W. L., MENDES, R., GERALDI, I. O.,
PIZZIRANI-KLEINER, A. A., AZEVEDO, J. L. Isolation and characterization of
soybean-associated bacteria and their potential for plant growth promotion.
Environ Microbiol. 12: 1244-1251.
KVINT, K., NACHIN, L., DIEZ, A., NYSTRÖM, T. The bacterial universal stress
protein: function and regulation. Curr Opin Microbiol. 6: 140-145. 2003
LINSDELL, P. e HANRAHAN, J. W. Flichery block of singe CFTR chloride
channels by intracellular anions and osmolytes. Am J Physiol. 271: C628-634.
1996.
LONGANATHAN, P. SUNITA, R. PARIDA, A. K. e NIR, S. Isolation and
characterization of two genetically distinct groups of Acetobacter diazotrophicus
from a new host plant Eleusine coracana L. J. Appl Microbiol. 87: 167-172. 1999.
LUNA, M.F., BERNARDELLI, C. E., GALAR, M. L., BOIARDI, J. L., Glucose
metabolism in batch and continuous cultures of Gluconacetobacter diazotrophicus
PAL3. Curr Microbiol. 52: 163-168. 2006
MCMAHON, M. A. S., XU, J., MOORE, J. E., BLAIR, I. S., MCDOWELL, D. A.
Environmental stress and antibiotic resistance in food-related pathogens. Appl
Environ Microbiol. 73: 211-217. 2007.
MILLER, K. J. e WOOD, J. M. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu
Rev Microbiol. 50: 101-36. 1996
MILLER, J. H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY. 1972.
MOWADE, S., BHATTACHARYYA, P. Resistance of P-solubilizing Acetobacter
diazotrophicus to antibiotics. Curr Sci. 79: 1591-1594. 2000.
MUTHUKUMARASAMY,
R.,
REVATHI,
G.,
SESHADRI,
S.
e
LAKSHMINARASIMHAN, C. Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter
53
diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics. Curr Sci India. 83:
137-145. 2002.
MUTHUKUMARASAMY, R., CLEENWERCK, I., REVATHI, G., VADIVELU, M.,
JANSSENS, D., HOSTE, B., GUM, K. U., PARK, K. D., SON, C. Y., SA, T. M.,
CABALLERO-MELLADO, J. Natural association of Gluconacetobacter
diazotrophicus and diazotrophic Acetobacter peroxydans with wetland rice. Syst
Appl Microbiol. 28: 277-286. 2005.
NCBI – National Center for Biotechnology Information – Genome Result
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&Ter
mToSearch=21712 . Disponível em 13 de setembro de 2007.
NCBI – National Center for Biotechnology Information – Genome Project Statistic.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/gpstat.html. Disponível em Fevereiro
de 2008.
PAULA, M. A., REIS, V. M., DÖBEREINER, J. Interactions of Glomu clarum with
Acetoacter diazotrophicus in infection of weet potato (Ipomea batatus, sugarcane
(Saccharum sp.) and seet sorghum (Sorghum bicolor). Biol Fertil Soils. 11: 111115. 1991.
PEDRAZA, R. O. Recent advance in nitrogen-fixing acetic acid bacteria. Int J
Food Microbiol. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.079. 2007.
PETRINI, O. Fungal endophytes of tree leaves. In: ANDREWS, J e HIRANO, S.
(Eds), Microbial ecology of leaves. New York: Springer Verlag, p. 179-197. 1991
POOLMAN, B., BLOUNT, P., FLGERING, J. H. A., FRIENSEN, R. H. E.; MOE, P.
C. e VAN DER HEIDE, T. How do membrane proteins sense water stress?. Mol
Microbiol. 44: 889-902. 2002.
POOLMAN, B. e GLAASKER, E. Regulation of compatible solute accumulation in
bacteria. Mol Microbiol. 29:397-407. 1998.
REIS, M. R. e DÖBEREINER, J. Effect of high sugar concentration on nitrogenase
activity of Acetobacter diazotrophicus. Arch Microbiol. 171: 13-18. 1998.
RIEDEL, K. e LEHNER, A. Identification of proteins involved in osmotic stress
response in Enterobacter sakazakii by proteomics. Proteomics. 7: 1217-1231.
2007.
RIOGENE – Instituto de Pesquisa Genômica Virtual. http://www.riogene.lncc.br/.
Disponível em dezembro de 2006.
RODRIGUES NETO, J.; MALAVOLTA Jr, V. A.; VICTOR, O. Meio simples para
isolamento e cultivo de Xanthomonas campestris pv. citri tipo B. Summa
Phytopathol. 12: 16. 1986.
ROUWS, L. F. M., SIMÕES-ARAÚJO, J. L. HEMERLY, A. S., BALDANI, J. I.
Validation of a tn5 transposon mutagenesis system for Gluconacetobacter
54
diazotrophicus through characterization of a flagellar mutant. Arch Microbiol.
DOI: 10.1007/s00203-007-0330-x. 2007.
SAMBROOK, J.; RUSSEL, W. D. (2001) Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.
SANTOS, C. C. R. DOS, PERIN, L., BALDANI, J. I., REIS, V. M. Isolation of
Gluconacetobacter spp. in different soil types. Pesq Agro Bras. 41: 85-92. 2006
SARAVANAN, V.S.; MADHAIYAN, M.; OSBORNE, J.; THANGARAJU, M. e As,
T.M. Ecological occurence of Gluconacetobacter diazotrophicus and nitrogenfixing Acetobacteraceae members: Their possible role in plant growth promotion.
Microb Ecol. DOI: 10.1007/s00248-007-9258-6. 2007 a.
SARAVANAN, V. S., MADHAIYAN, M., THANGARAJU, M. Solubilization of zinc
compounds by the diazotrophic, plant growth promoting bacterium
Gluconacetobacter diazotrophicus. Chemosphere. 66: 1794-1798. 2007 b.
SARAVANAN, V. S., OSBORNE, J., MADHAIYAN, M., MATHEW, L., CHUNG, J.,
AHN, K., SA, T. Zinc metal solubilization by Gluconacetobacter diazotrophicus and
induction of pleomorphic cells. J Microbiol Biotechnol. 17:1477-82. 2007c
SCHWIKOWSKI, B., UETZ, P., FIELDS, S. A network of protein–protein
interactions in yeast. Nat Biotechnol 18: 1257–1261. 2000.
SCHLÖSSER, A., MELDORF, M. STUMPE, S., BAKKER, E. P., EPSTEIN, W.
TrkH and its homolog, TrkG, determine the specificity kinetics of cation transport
by Trk system of Escherichia coli. J Bacteriol. 177: 1908-1910. 1995
SEVILLA, M., BURRI, R.H., GUANAPALA, N. e KENNEDY, C. Comparison of
benefit to sugarcane plant growth and 15N2 incorporation following inoculation of
sterile plants with Acetobacter diazotrophicus wild type and nif-mutants strains.
Mol Plant-Microbe Interact. 14: 358-366. 2001.
SLEATOR, R. D. e HILL, C. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolyte in
bacterial tress and virulence. FEMS Microbiol Rev. 26: 49-71. 2001.
STEPHAN, M. P., OLIVEIRA, M., TEXEIRA, K. R. S.; MARTINEZ-DRETS, G. e
DÖBEREINER, J. Physiology and dinitrogen fixation of Acetobacter
diazotrophicus. FEMS Microbiol Lett. 77: 67–72. 1991.
SUMAN, A., SHASANY, A. K., SINGH, M., SHAHI, H. N., GAUR, A., KHANUJA,
S. P. S. Molecular assessment of diversity among endophytic diazotrophs isolated
from subtropical Indian sugarcane. World J Microbiol Biotechnol. 17: 39-45.
2001.
TANAY, A., STEINFEL, I., KUPIEC, M. e SHAMIR, R. Integrative analysis of
genome-wide experiments in the context of a large high-throughput data
compendium. Mol Sys Biol. DOI: 10.1038/msb4100005. 2005
55
TAPIA-HERNÁNDEZ, A., BUSTILLOS-CRISTALES, M. R., JIMÉNEZ-SALGADO,
T., CABALLERO-MELLADO, J. e FUENTES-RAMÍREZ, L. E. Natural endophytic
occurrence of Acetobacter diazotrophicus in pineapple plants. Microb Ecol. 39:
49–55. 2000.
TEJERA, N. A., ORTEGA, E., GONZÁLES-LÓPEZ, J. e LLUCH, C. Effect of some
abiotic factors on the biological activity of Gluconacetobacter diazotrophicus. J
Appl Microbiol. 95: 528-535. 2003
URQUIAGA, S. CRUZ, K. H., BODDEY, R. M. Contribution of nitrogen fixation to
sugarcane: nitrogen-15 and nitrogen balance estimate. Soil Sci Soc Am J. 56:
105-114. 1992.
YAMADA, Y. HOSHINO, K. e ISHIKAWA, T. The phylogeny of acetic acid bacteria
base don the partial sequences of 16S ribosomal RNA: the elevation of the
subgenus Gluconacetobacter to the generic level. Biosci Biotechnol Biochem.
61: 1244-1251. 1997.
WEI, W., JIANG, J., LI, X. WANG, L. e YANG, S. S. Isolation of salt-sensitive
mutants from sinorhizobium meliloti and characterization of genes involved in salt
tolerance. Lett Appl Microbiol. 39: 278-283. 2004.
WOOD, J. M. Osmosensing by bacteria: signals and membranes based sensors.
Mol Biol Rev. 63: 230-262. 1999.
WOOD, J. M. Osmosensing by bacteria. Sci STKE. 357: pe43. DOI:
10.1126/stke.3572006pe43. 2006.