UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
ASPECTOS ESTRUTURAIS, FARMACOLÓGICOS E BIOLÓGICOS
DE FUCANAS DA ALGA MARROM Sargassum vulgare
Natal (RN)
2012
CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
ASPECTOS ESTRUTURAIS, FARMACOLÓGICOS E BIOLÓGICOS
DE FUCANAS DA ALGA MARROM Sargassum vulgare
Tese
de
doutorado
apresentada
ao
Departamento de Bioquímica, da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de Doutor em
Bioquímica.
Orientadora: Profa. Drª. Edda Lisboa Leite.
Natal (RN)
2012
“Se vi mais longe foi por estar sobre ombros de gigantes”
(Isaac Newton)
À minha orientadora, Edda Lisboa Leite, por acreditar em mim, mesmo nos momentos em
que nem eu acreditava. Por ser um enorme exemplo de profissional e pessoa, pelas conversas
científicas e pessoais, por me deixar fazer parte de seu grupo e de sua vida. Muito obrigada
por tudo.
“Um professor afeta a eternidade. Ele nunca será capaz de dizer quando a sua influência se
detém”
(Henry Adanson)
“Não sei se a vida é curta ou longa demais para nós, mas sei que nada do que vivemos tem
sentido, se não tocamos o coração das pessoas. Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço
que envolve, palavra que conforta, silêncio que respeita. Alegria que contagia, lágrima que
corre, olhar que acaricia, desejo que sacia, amor que promove. E isso não é coisa de outro
mundo, é o que dá sentido à vida. É o que faz com que ela não seja curta nem longa demais,
mas que seja intensa, verdadeira, pura.”
(Cora Coralina)
A Deus. À Ele toda honra e toda Glória.
À toda minha família (Pinto- Guerra e Fontes- Dore), especialmente meus pais, Verônica e
Otávio e meu irmão, Daniel, por ser a minha base mais sólida, pela torcida, incentivo, apoio
e amor incondicional. Amo muito vocês!
Ao meu marido, Marcel, pessoa que escolhi para dividir a minha vida, por ser minha luz e
fortaleza. Obrigada por você estar sempre ao meu lado. O meu amor é seu.
Aos meus filhos Davi e João, por me ensinarem a ser mãe e por traduzir o real significado do
amor incondicional. Vocês são a razão da minha vida. Amo muito vocês.
“Saudade é um sentimento que quando não cabe no coração, escorre pelos olhos”
(Bob Marley)
À minha prima Liliane, que foi embora tão cedo e que me traz lembranças alegres da sua
risada gostosa, das danças na garagem, do seu companheirismo e carinho.
Á minha avó Maria Lourdes Ferreira da Silva pela sua delicadeza e educação rígida, das
músicas tocadas no piano e delícias preparadas para todos.
Ao meu avô José Guerra Ferreira da Silva, médico de alma e coração, que sempre se
preocupou com minha formação e que sempre queria saber da minha vida acadêmica.
Ao meu avô Jandir Susini Pinto, que se orgulhava em dizer que sua neta fazia doutorado,
mesmo sem saber direito o que isso significava. Às vezes é como se sua voz e seu perfume
ainda se fizessem presentes. Sei que você tá fazendo uma seresta aí no céu para comemorar
essa conquista.
“Não existe essa coisa de homem feito por si mesmo. Somos formados por milhares de outros”
(George Matthew Adams)
AGRADECIMENTOS
 A todos os professores e funcionários do Departamento de bioquímica da UFRN, que
sempre estiveram dispostos a me ajudar.
 Aos grandes amigos do laboratório de Glicobiologia Vegetal: Marília Nascimento,
Allison Castro, Luísa Will, Thuane Pinheiro, Kahena Florentin, Thiago Costa, Hugo
Wescley, Hanna Medeiros, Joedysson Magalhães, Almino Paiva, Leonardo Rêgo.
Por sermos uma equipe, por sempre poder contar com vocês não só nos assuntos do
laboratório, mas também pelas conversas, pelos conselhos, pelo apoio. Durante esses
anos acompanhei de perto momentos bons e ruins de cada um de vocês, foram risadas
e briguinhas, lágrimas e sorrisos, tantas coisas... Me sinto parte da história de vocês e
é muito bom me sentir assim. Sentirei saudades.
 A Marília Santos, meu total oposto, mas que sempre esteve por perto nos momentos
mais cruciais. Podendo revelar quão grande é o seu coração. Você é pura emoção, e
isso se reflete em tudo que faz.
 A Thiago Costa que sempre me irradiou com sua alegria. Sempre escutou todos os
meus lamentos científicos e pessoais. Você mora no meu coração!
 A minha querida Monique Alves, por compartilhar comigo seu imenso conhecimento.
Por sua sensatez.
 A Profª. Luciana Guimarães, que me acompanhou desde a iniciação científica, por me
ajuda enormemente a entender as fucanas de Sargassum vulgare.
 A minha banca de qualificação (Prof. Hugo Rocha, Profa. Suley Chavante e Profa.
Luciana da Matta) pelas grandes contribuições que fizeram para aprimorar a minha
tese e por compreenderem todas as dificuldades enfrentadas para que este trabalho
ficasse pronto.
 Ao Prof. Hugo Rocha pelo grande apoio e incentivo, pelas conversas informais e
conselhos.
 Aos amigos conquistados da UNIFESP, especialmente Camila Accardo, Leonardo
Nobre e Renan Cavalheiro.
 A Ana Katarina que com sua enorme competência e disponibilidade realizou os testes
de viabilidade celular , uma pessoa com enorme cultura científica que me ajudou
imensamente em todo o trabalho.
 Ao meu irmão do coração Fernando Roberto, que além de fazer parte da minha vida
científica, assume o papel de irmão mais velho, com direito a todo o amor que o cargo
exige.
 Às minhas queridíssimas Ariane Lacerda, Virgínia Penélope e Paula Ivani, pela
conversas, as risadas, os almoços e energia positiva.
 Aos meus colegas da turma pioneira do doutorado do DBq: Serginho, Bruna, Ana
Helena, Leandro, Raniere, Joana, Patrícia, Ticiana.
 Aos meus amigos de graduação, em especial, Juska Mendonça, Emília Teixeira,
Liliane Gurgel, Tatiana Moritz e Vanessa Evangelista.
 Alguma vez alguém disse que os amigos são os irmãos que escolhemos, então,
agradeço imensamente às minhas amigas- irmãs: Gioconda Moura, que desde sempre
está ao meu lado, dividindo experiências da faculdade, pós- graduação, filhos,
relacionamentos, alegrias e tristezas, seja em Natal ou em São Paulo, sempre me
ajudando. Amo você! ; Regina Venturini, Suênia de Carli, Denise Marinho, Alzeni
Fonseca, Flávia Lima, Claudinha, Catarina, Micheline, Sânzia, minhas amigas e
vizinhas que seguram as pontas quando não dá tempo de chegar em casa, que
compartilham de pertinho todas as dificuldades e alegrias e que torcem imensamente
pelo meu sucesso. Vocês são muito especiais! A minha grande tia- amiga Patrícia
Araújo, por me dar a oportunidade de fazer parte de sua vida de maneira
incondicional. Amo muito!
 A todos os colegas do laboratório BIOPOL , especialmente Ruth, Rafael, Nednaldo,
Moacir, Jailma, Mariana e Sarah.
 A Profª. Drª. Helena Bonciani Nader pela grande oportunidade que me deu de
desenvolver meus experimentos no seu laboratório, e por toda sua equipe que
contribuiu para que tudo se tornasse possível.
 Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ), a
Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Pró-reitoria de Pesquisa e
Pós-graduação da UFRN pelos recursos para a realização deste trabalho.
 A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho.
“Há dois tipos de sabedoria: a inferior e a superior: A sabedoria inferior
é dada pelo quanto uma pessoa sabe, e a superior é dada pelo quanto ela
tem consciência de que não sabe”
(Chico Xavier)
A pedidos da minha Orientadora:
De tudo ficaram três coisas: a certeza de
que estamos começando, a certeza de que é
preciso continuar e a certeza de que podemos
ser interrompidos antes de terminar. Fazer da
interrupção um novo caminho, da queda um passo
de dança, do medo uma escola, do sonho uma
ponte, da procura um encontro.
E assim terá valido a pena.
(Fernando Pessoa)
RESUMO
O presente estudo analisa a composição química e seus efeitos sobre os radicais
livres, inflamação, angiogênese, coagulação, VEGF e proliferação celular dos
polissacarídeos de uma alga Sargassum vulgare. O polissacárido sulfatado foi
extraído a partir de algas marrons por proteólise com a enzima maxataze. A
presença de proteínas e açúcares foram observados no cru de polissacarideos.
Fracionamento do o extrato bruto foi feito com concentrações crescente de acetona
(0,3-1,5 v), produzindo
quatro grupos de polissacarideos. Estes compostos
aniônicos da alga S. vulgare,
foram fracionados (SV1) e purificados (PSV1)
exibindo com alta açúcares totais e sulfatecontent e nível muito baixo de proteínas.A
fucana SV1 contém baixos níveis de proteína e de hidratos de carbono e alto teor de
sulfato. Este polissacarídeos prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada
(aPTT) a 50 ug (>240 s). não foi observado qualquer efeito de SV1 sobre o tempo de
protrombina (PT), que corresponde a via extrínseca da coagulação. SV1 exibiu alta
ação antitrombótica in vivo, com uma concentração 10 vezes maior do que a
heparina. SV1 promoveu a actividade de inibição enzimática direta da trombina e
estimulou a atividade enzimática do FXa. Mostrou também, atividade inibidora
optima de trombina (50,2 ± 0,28%) a uma concentração de 25 ug / mL. A sua acção
anti-oxidante de radicais scavenging por DPPH foi de (22%), indicando que o
polímero não tem qualquer ação citotóxica (hemolítica) em tipos de sangue ABO e
Rh, em diferentes grupos de eritrócitos e exibindo alta ação anti-inflamatória em
edema de pata de ratos Wistar em todas as concentrações testadas induzida por
carragenina. Tal processo foi demonstrado por edema e infiltração celular. A
angiogenese é um processo dinâmico de proliferação e diferenciação. Ele requer
proliferação endotelial, migração, e a formação do tubo. Neste contexto, as células
endoteliais são um alvo preferido para muitos estudos e terapias. A eficácia antiangiogenico de polissacarídeos foi examinada in vivo na membrana corioalantóica
pinto (CAM) usando-se ovos fertilizados. Diminuições na densidade dos capilares
foram avaliados e pontuados. Os resultados mostraram que SV1 e PSV1 tem um
efeito inibidor da angiogenese. Estes resultados foram também confirmados por
tubulogenesis inibição na célula endotelial da aorta de coelho (RAEC) em matrigel.
Células RAEC quando foram incubadas com SV1and PSV1 demonstraram inibição
da secreção de VEGF, a 25, 50 e 100 ug/mL. A secreção de VEGF com a linha de
células RAEC durante 24 h, foi mais eficaz para PSV1 a 50 ug / mL (71,4%) do que
SV1 100 ug / mL (75,9%). SV1 e PSV1 posuiram uma acção antiproliferativa (47%)
contra as células tumorais tipo HeLa. Estes compostos foram avaliados também, no
ensaio de apoptose (anexina V - FITC / PI) e a viabilidade celular pelo ensaio de
MTT de RAEC. Estes polissacarídeos não afetaram a viabilidade e não tiveram ação
apoptótica ou necrótica. Nossos resultados indicam que estes polissacarídeos
sulfatados têm ações antiangiogênica e antitumoral e constituem um importante alvo
biológico e farmacológico.
Palavras-chave: alga marrom, Fucana, hemostasia, angiogênese.
ABSTRACT
The present study examines the chemical composition and their effects on free
radicals, inflammation, angiogenesis, coagulation, VEGF effects and cellular
proliferation of a polysaccharides from alga Sargassum vulgare. The sulfated
polysaccharide was extracted from brown seaweed by proteolysis with enzymes
maxataze. The presence of proteins and sugars were observed in crude
polysaccharides. Fractionation of this crude extract was made with growing
concentration of acetone (0.3-1.5 v) and produced four groups of polysaccharides.
Anionic polysaccharides from brown seaweed Sargassum vulgare, SV1and PSV1
were fractionated (SV1) and purified (PSV1), and displayed with high total sugars
and sulfate content and very low level of protein. This fucan SV1 contains low levels
of protein and high carbohydrate and sulfate content. This polysaccharides prolonged
activated partial thromboplastin time (aPTT) at 50 µg (>240 s). SV1 was found to
have no effect on prothrombin time (PT), corresponding to the extrinsic pathway of
coagulation. SV1 exhibits high antithrombotic action in vivo, with a concentration ten
times higher than heparin. Polysaccharides from S. vulgare promoted direct inhibition
enzymatic activity of thrombin and stimulated enzymatic activity of FXa. SV1 showed
optimal inhibitory activity of thrombin (50.2±0.28%) at a concentration of 25 μg/mL.
Its antioxidant action on scavenging radicals by DPPH was (22%), indicating the
polymer has no cytotoxic action (hemolytic) on ABO and Rh blood types in different
erythrocyte groups and displays strong anti-inflammatory action on all concentrations
tested in the carrageenan-induced paw edema model, demonstrated by reduced
edema and cellular infiltration. Angiogenesis is a dynamic process of proliferation and
differentiation. It requires endothelial proliferation, migration, and tube formation. In
this context, endothelial cells are a preferred target for several studies and therapies.
The antiangiogenic efficacy of polysaccharides was examined in vivo in the chick
chorioallantoic membrane (CAM) model by using fertilized eggs. Decreases in the
density of the capillaries were assessed and scored. The results showed that SV1
and PSV1 have an inhibitory effect on angiogenesis. These results were also
confirmed by inhibition tubulogenesis in rabbit aorta endothelial cell (RAEC) in
matrigel. These compounds were assessed in Apoptosis assay (Annexin V - FITC /
PI) and cell viability by MTT assay of RAEC. These polysaccharides do not affect the
viability and do not have apoptotic or necrotic action. RAEC cell when incubated with
SV1 and PSV1showed inhibition of VEGF secretion, observed when compounds
were incubated at 25, 50 and 100 μg/μL. The VEGF secretion with the RAEC cell line
for 24 h, was more effective for PSV1 at 50 μg/μL(71.4%) than SV1 100 μg/μL
(75.9%). SV1 and PSV1 had an antiproliferative action (47%) against tumor cell line
HeLa. Our results indicate that these sulfated polysaccharides have antiangiogenic
and antitumoral actions.
Key-words: brown seaweed, fucan, hemostasis, angiogenesis
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Árvore diagramática representando a organização dos eucariotos em
seis grupos principais ................................................................................................21
FIGURA 2 – Representação esquemática da Cascata de Coagulação ..................25
FIGURA 3 – Esquema de diferenciação entre os processos de vasculogênese e
angiogênese ..............................................................................................................30
FIGURA 4 – Uma visão geral da família VEGF e seus receptores ..........................32
FIGURA 5 – Mecanismo de ação e cofatores necessários ás enzimas Superóxido
dismutase, Catalase e Glutatina peroxidase..............................................................37
FIGURA 6 – Esquema do teste de tromboplastina parcial ativada (aPTT) .............57
FIGURA 7 – Esquema do Tempo de Protrombina (PT).............................................58
FIGURA 8 – Rendimento das frações polissacarídicas extraídas de S. vulgare com
diferentes concentrações de acetona (0,3 0,5, 1,0 e 1,5v) .......................................63
FIGURA 9 – Perfil de eluição de SV1 em cromotografia de gel filtração Sepharose
CL-4B.........................................................................................................................65
FIGURA 10- Eletroforese em gel de agarose das frações de polissacarídeos
sulfatados de S. vulgare obtidas do fracionamento com acetona ...........................68
FIGURA 12– Espectroscopia de infra vermelho das frações SV1 (linha vermelha) e
fração purificada PSV1 (linha azul) de polissacarídeos sulfatados de S.
vulgare........................................................................................................................70
FIGURA 13 – Ensaio CAM para verificação do potencial antiangiogênico de SV1 e
PSV1..........................................................................................................................72
FIGURA 14 – Efeitos de SV1 e PSV1 na formação de tubos capilares de células
endoteliais da aorta de coelho (RAEC)......................................................................73
FIGURA 15- Inibição da secreção de VEGF..............................................................74
FIGURA 16 – Efeito de SV1 e PSV1 isolados de S. vulgare na proliferação de
células das linhas RAEC, HeLa, B16 e Raw 264.7....................................................76
FIGURA 17 – Análise da distribuição de células endoteliais da aorta de coelho
(RAEC) no ciclo celular..............................................................................................77
FIGURA 18 – Análise da Citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V e
PI em células endoteliais da aorta de coelho (RAEC) Histograma...........................78
FIGURA 19 – Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V e
PI em células endoteliais da aorta de coelho............................................................79
FIGURA 20 – Ação antiinflamatória de SV1 e PSV1 em um modelo de edema de
pata induzido por carragenana...................................................................................80
FIGURA 21 – Análises histológicas do edema de pata induzido por carragenana e
tratada com diferentes concentrações de SV1 e PSV1 ............................................82
FIGURA 22 – Ação anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de SV1............84
FIGURA 23 – Ensaio do substrato cromogênico da trombina ..................................85
FIGURA 24 – Ensaio do substrato cromogênico do Fator Xa ...................................86
FIGURA 25 – Atividade Antitrombótica dos polissacarídeos sulfatados de SV1 ...87
FIGURA 26 – Ação citotóxica de SV1 nos eritrócitos de diferentes tipos ABO e Rh
....................................................................................................................................90
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Valores de escore utilizados para avaliação do efeito antiangiogênico
no teste da membrana corioalantóica em ovos de galinha fertilizados..................50
TABELA 2 – Percentual dos monossacarídeos presentes nas frações extraídas de
S. vulgare ............................................................................................................64
TABELA 3 – Teores de açúcares totais, proteínas, compostos fenólicos e sulfato dos
polissacarídeos sulfatados, fucanas das frações extraídas com acetona 1,0 M (SV1)
e purificadas (PSV1) de S. vulgare............................................................................66
TABELA 4 – Percentual de varredura de Radicais DPPH pelos polissacarídeos de
SV1 e PSV1...............................................................................................................88
LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS
µg: micrograma
µl: microlitro
aPTT: Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada
CAM: Membrana corioalantóica
CAT: Catalase
CS: Condroitin sulfato
DS: Dermatan sulfato
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
eNOS: Óxido nítrico sintetase endotelial
ERMO: Espécies Reativas do Oxigênio Molecular
g: grama
GSH: Glutationa Reduzida
GSH-Px: Glutationa Peroxidase
GSH-Rd: Glutationa Redutase
h: hora
H2O: Água
H2O2: Peróxido de Hidrogênio
HE: Hematoxilina e Eosina
HS: Heparan sulfato
IL-1ß: Interleucina 1ß
IL-6: Interleucina 6
IL-8: Interleucina 8
Kg: quilograma
LDL: Low Density Lipoprotein
LPS: Lipopolissacarídeo
M: Molar
min: minuto
ml: mililitro
mM: milimolar
MTT: Brometo de 3- (4,5- dimetiltiazol)-2,5- difenil tetrazolium
NF-κB: Fator nuclear capa beta
NK: Natural killer
nm: nanômetro
nNOS: Óxido nítrico sintetase neuronal
NO: Óxido nítrico
NO2: íon nitrito
NO3: íon nitrato
O-2: Ânion superóxido
O2: Oxigênio molecular
ºC: graus centígrados
OH: Radical hidroxila
PBS: Tampão salina fosfato
PI: Iodeto de Propídeo
PDA: Diaminopropanoacetato
PT: Tempo de Pró-trombina
ROS: Espécies reativas do oxigênio
SOD: Superóxido Dismutase
TNFα: Fator de Necrose Tumoral α
v: volume
VCAM-1: Molécula de adesão de células vasculares 1
VEGF: Fator de Crescimento Endotelial Vascular
μM: Micromolar
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................18
1.1. Algas marinhas .......................................................................................18
1.2. Fucanas ...................................................................................................21
1.3. Hemostasia .............................................................................................22
1.4. Coagulação .............................................................................................24
1.5. Trombose ................................................................................................27
1.6. Angiogênese ...........................................................................................30
1.7. Inflamação ...............................................................................................33
1.8. Antioxidantes ..........................................................................................36
2. OBJETIVOS .........................................................................................................40
3. MATERIAIS E METÓDOS ...................................................................................41
3.1. Material Biológico ...................................................................................41
3.1.1. Alga Marinha..................................................................................................41
3.1.2. Plasma Humano.............................................................................................42
3.1.3. Células............................................................................................................42
3.1.4. Animais...........................................................................................................42
3.1.5. Ovos de galinha fertilizados.........................................................................43
3.2. Outros Materiais .....................................................................................43
3.2.1.
Kits e Reagentes .........................................................................43
3.2.2. Padrões .......................................................................................45
3.2.3. Aparelhos .....................................................................................45
3.3. Obtenção dos polissacarídeos sulfatados ..........................................46
3.4. Eletroforese em gel de agarose ............................................................47
3.5. Análises químicas ..................................................................................47
3.5.1. Dosagem de Açúcares Totais ......................................................47
3.5.2. Dosagem de Sulfato ....................................................................48
3.5.3. Dosagem de Proteínas ................................................................48
3.5.4. Dosagem de Compostos Fenólicos .............................................48
3.6. Purificação ..............................................................................................49
3.7. Análise de Infravermelho .......................................................................49
3.8. Composição Monossacarídica ..............................................................50
3.9. Ressonância Magnética Nuclear ...........................................................50
3.10. Avaliação das Atividades Biológicas .................................................50
3.10.1. Ensaios da avaliação da ação de SV1 e PSV1 na angiogênese.50
3.10.1.1. Método de CAM.................................................................50
3.10.1.2. Ação na tubulogênese in vitro............................................51
3.10.1.3. Dosagem do Fator de Crescimento Endotelial Vascular.52
3.10.2. Ação de SV1 e PSV1 na viabilidade celular in vitro (Ensaio de
MTT)..........................................................................................................53
3.10.3. Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo
celular
nas
células
endoteliais
da
aorta
de
coelho
(RAEC)......................................................................................................53
3.10.3.1. Ensaio da Apoptose( Anexina V-FITC/PI).......................54
3.10.3.2. Ensaio da distribuição das células no ciclo celular.......54
3.10.4. Atividade anticoagulante..............................................................55
3.10.4.1. Tempo de Tromboplastina Parcial ativada......................56
3.10.4.2. Tempo de Protrombina ...................................................57
3.10.5. Atividade Enzimática de fatores da coagulação (Ensaio do
substrato cromogênico).............................................................................58
3.10.5.1. Ensaio de atividade da trombina........................................58
3.10.5.2. Ensaio de atividade do Fator Xa........................................59
3.10.6. Atividade antitrombótica in vivo....................................................59
3.10.7. Atividade Antiinflamatória.............................................................60
3.10.8. Atividade Antioxidante- Sequestro de radicais DPPH..................60
3.10.9. Avaliação da ação citotóxica de SV1 e PSV1 sobre hemácias de
grupos sanguíneos ABO e Rh positivo e negativo (Hemólise direta).......61
3.10.10. Análise estatística.......................................................................62
4. RESULTADOS ....................................................................................................63
4.1. Extração e purificação dos polissacarídeos sulfatados da alga
marinha Sargassum vulgare ..........................................................................63
4.2. Perfil eletroforético de SV1 e PSV1 ......................................................66
4.3. Análises espectroscópicas ...................................................................67
4.3.1.
Espectroscopia de infravermelho de SV1 e PSV1 .....................67
4.3.2.
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de PSV1 ......................69
4.4. Atividades Biológicas ............................................................................71
4.4.1.
Atividade Antiangiogênica............................................................71
4.4.1.1.
Teste da Membrana Corioalantóica (CAM).......................71
4.4.1.2.
Tubulogênese em células da linhagem RAEC..................72
4.4.1.3.
Dosagem de fator de Crescimento Endotelial Vascular
secretado por células da linhagem RAEC................................73
4.4.2.
Ação de SV1 e PSV1 na viabilidade de diferentes linhagens
celulares in vitro.........................................................................................74
4.4.3.
Avaliação da ação de SV1 e PSV1 na apoptose e ciclo celular de
RAEC.........................................................................................................76
4.4.4.
Atividade anti-inflamatória
4.4.4.1.
Avaliação da ação de SV1 e PSV1 em um modelo de
edema de pata induzido por carragenana................................80
4.4.4.2.
Análises Histólogicas.........................................................81
4.4.5.
Atividade Anticoagulante..............................................................83
4.4.6.
Ensaio de atividade de fatores de coagulação.............................84
4.4.6.1.
Ensaio do substrato cromogênico da trombina..................84
4.4.6.2.
Ensaio do substrato cromogênico do Fator Xa..................85
4.4.7.
Avaliação da ação de SV1 na atividade antitrombótica in vivo...86
4.4.8.
Atividade Antioxidante..................................................................88
4.4.9.
Avaliação da Ação citotóxica de SV1 sobre hemácias do grupo
ABO e diferentes Rh .................................................................................89
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................91
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................103
REFERÊNCIAS .......................................................................................................104
1.0. INTRODUÇÃO
1.1. Algas marinhas
As algas são organismos cujas linhagens filogenéticas têm origem há mais de
3 bilhões de anos (HAN & RUNNEGAR, 1992; SCHOPF, 1993). Esses organismos
compreendem um agrupamento artificial que tem pouca coisa em comum, a não ser
o fato de serem seres aquáticos, desprovidos de um tecido constituído de células
estéreis envolvendo os órgãos de reprodução. Estes organismos são dotados de um
sistema diferenciado para condução de água. Por esta razão, são grupos polifiléticos
e não constituem uma categoria taxonômica definida existindo um amontoado de
categorias díspares, tão diversas que chegam a ser classificadas em 2 ou 3 reinos
diferentes. Tradicionalmente são conhecidos como Monera, Protista e Plantae, ou
ainda com diferentes denominações em outros sistemas apoiados em dados de
biologia molecular (SOGIN et al., 1989; BHATTACHARYA & MEDLIN, 1998). A
literatura taxonômica foi organizada de forma pedagógica, baseada no sistema
proposto por Whittaker, 1969. Estudos feitos por este pesquisador consideraram que
as espécies de organismos vivos seriam classificadas em cinco reinos: Animalia
(Metazoa), Plantae, Fungi, Protista (eucariotos) e Monera (procariotos). Entretanto,
os estudos realizados nos últimos anos mostram melhorias acentuadas na
compreensão das relações evolutivas, graças aos avanços na filogenética
molecular, bem como, no amadurecimento do conhecimento sobre várias
características das células eucarióticas. Os eucariontes podem ser divididos em
poucos grupos de origem monofilética, onde estão inseridas: Opisthokonta,
Amebozoa, Plantae, Chromalveolata, Rhizaria e Excavata (Figura 1).
Independente da taxonomia é inegável a enorme importância das algas para
a biosfera. Do ponto de vista de sua importância econômica, as algas marinhas são
utilizadas como alimentos para o homem e animais, e fornecem produtos
imprescindíveis para a vida do homem moderno, com valores que ultrapassam
alguns bilhões de dólares por ano. Por exemplo, o comércio de “nori” (gênero
Porphyra) foi responsável pela movimentação 1,8 bilhões de dólares/ano no começo
desta década (OLIVEIRA, 1996). Por serem organismos autótrofos, os gases
gerados pelo processo de fotossíntese são responsáveis pela estruturação da
atmosfera terrestre como a conhecemos possibilitando a vida dos organismos
aeróbios na superfície do planeta (KIRSHNER, 1994; DUVE, 1996). As algas têm
um papel fundamental na manutenção do ecossistema marinho, por serem os
produtores primários desse ecossistema e participarem de maneira direta na sua
enorme biodiversidade tanto na formação do fitoplâncton,como sendo elementos
formadores dos recifes de coral e estando presas a diferentes substratos. Desta
forma, as algas são fatores importantes para manutenção do ciclo do carbono e
assim, contribuem de forma significativa para a manutenção do clima do planeta
(OLIVEIRA, 1996). Devido à sua grande diversidade de habitats, as algas estão
sujeitas a grandes variações de umidade, temperatura, radiação solar e salinidade,
além de estarem expostas à rebentação e às forças abrasivas do movimento das
águas.
Além da sua enorme importância ecológica, as macroalgas marinhas ainda
produzem outros metabólitos com potencial econômico importante como ácidos
graxos, esteróides, carotenóides, lectinas, compostos halogenados, toxinas e,
principalmente, os polissacarídeos sulfatados presentes em sua matriz extracelular.
Esses compostos são alvo de pesquisas na área de farmacologia, e por seu uso
potencial nas diferentes indústrias (LEITE ET AL., 1998, ROCHA, et al., 2006;
MANDAL et al., 2008; LUO et al., 2009: MAKATENKOVA et al, 2009; POMIN, 2009,
CIANCIA et al., 2010, JIAO et al, 2011).
Polissacarídeos sulfatados compreendem um grupo de macromoléculas com
um grande numero de propriedades biológicas. Esses polímeros aniônicos têm uma
grande distribuição na natureza ocorrendo em uma grande variedade de organismos
como mamíferos e invertebrados (ANAHTHI et al 2008; ANNIE et al., 2006). As
algas marinhas são as fontes não animais mais importantes de polissacarídeos
sulfatados. Entretanto, o tipo e estrutura desses polímeros varia de acordo com a
espécie de alga. Desta forma, a cada novo polissacarídeo sulfatado de alga marinha
que
é
purificado,
tem-se
um
novo
composto
com
estrutura
única
e,
consequentemente, com potencial para novas atividades biológicas (BADMIS,
GUPTA & SURESH, 2003).
Figura 1. Árvore diagramática representando a organização dos eucariotos em seis grupos
principais. Fonte: adaptado de Simpson, Roger, (2004).
1.2. Fucanas
As algas da classe Phaeophyceae possuem em sua matriz mucilaginosa
polissacarídeos sulfatados que possuem como principal característica a presença de
unidades monossacarídicas constituídas por L-fucose e grupos sulfato (YANG et al,
2006). As fucanas se classificam quanto a sua composição monossacarídica em
homofucanas, contituídas apenas por unidades de L- fucose e heterofucanas
quando, além da fucose, são encontrados no polímero outros monossacarídeos
como xilose, galactose, ácidos urônicos, D-manose e D- glicose (LEITE et al, 1998;
DUARTE et al, 2001, PONCE et al, 2003).
No geral, as heterofucanas são heterogêneas e ramificadas, o padrão de
sulfatação é irregular, sendo bastante dificil propor estruturas para tais moléculas
(BILAN et al, 2002).Devido à grande quantidade de cargas negativas relacionadas
ao sulfato, as fucanas possuem um carater altamente higroscópico. Desta forma,
estariam relacionados com a proteção da alga contra desidratação quando esta é
submetida a longos períodos de exposição ao sol durante marés baixas. Além disso,
a natureza mucilaginosa das fucanas parece tornar a alga flexível o bastante para
crescer em ambiente líquido e rígida o suficente para permanecer estendida, de
forma a melhor captar a luz e nutrientes existentes (PERCIVAL & MC DOWELL,
1967).
1.3. Hemostasia
A hemostasia é uma resposta fisiológica protetora ao dano vascular
resultando na exposição de camadas subendoteliais da parede do vaso aos
componentes sanguíneos (MACKMAN, TILLEY, KEY, 2007). Este processo é
bastante dinâmico, tendo como objetivo a interrupção do sangramento em local de
lesão tecidual, no qual a coagulação do sangue é iniciada e terminada de forma
rápida e bastante regulada (NATHAN et al., 2003). O sistema hemostático mantém o
sangue em estado fluido sobre condições normais, e responde com rápida formação
de um coágulo quando há lesão vascular (MACKMAN, TILLEY, KEY, 2007). No local
de lesão são necessários mecanismos que restrinjam a formação de agregados
plaquetários e o coágulo de fibrina, visando à manutenção da fluidez do sangue
(HOFFBRAND, CATOVSKY, TUDDENHAM, 2005).
O sistema hemostático é constituído por plaquetas, vasos sanguíneos,
proteínas da coagulação, anticoagulantes naturais e o sistema de fibrinólise. O
equilíbrio funcional da hemostasia é garantido por vários mecanismos envolvendo
interações entre proteínas, respostas celulares complexas e regulação do fluxo
sanguíneo (ZAGO, FALCÃO, PASQUINI, 2004).
Vasos sanguíneos capilares são estruturas constituídas basicamente por uma
monocamada de células endoteliais, as quais se interconectam para formar tubos
que viabilizam o fluxo do sangue e a perfusão tecidual do organismo (TOBELEM,
1990; SWEENEY, 1998).
A resposta primária da hemostasia envolve o endotélio vascular e plaquetas,
formando o trombo plaquetário (de efeito transitório), que é reforçado pela fibrina
gerada pelas proteínas da coagulação. O sistema fibrinolítico dissolve o trombo
gradualmente visando à restauração do fluxo sanguíneo normal (ZAGO, FALCÃO,
PASQUINI, 2004) e promovendo a degradação da fibrina mediada pela plasmina.
Este sistema é composto por várias proteínas que regulam a formação da plasmina,
gerada a partir do plasminogênio e de seus ativadores (COLLEN, 1999).
No estado fisiológico não ocorre à formação e deposição de fibrina no
compartimento intravascular devido às propriedades anticoagulantes do endotélio, à
forma inativa das proteínas da coagulação e à presença de inibidores fisiológicos.
No entanto, a perda do equilíbrio dinâmico das reações da coagulação conduz a
distúrbios hemorrágicos ou trombóticos (COLMAN et al., 2001).
Os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, como as fucanas, se
destacam como fármacos promissores para um modelo semelhante a heparina, pois
além
de
possuirem
ação
anticoagulante/
antitrombótica,
possuem
grande
diversidade estrutural, podendo agir através de um mecanismo de ação diferente da
heparina ( LEITE et al., 1998;ROCHA et al, 2006).
1.4. Coagulação
A cascata de coagulação corresponde a várias seqüências de eventos
nas
vias extrínseca, intrínseca e via comum. Tais vias são catalisadas por enzimas
inativas que se tornam ativas. O fator tecidual inicia a via extrínseca enquanto que a
iniciação da via intrínseca é mediada pelo colágeno.
Esta teoria enfatiza as
proteínas procoagulantes sem considerar as células participantes na coagulação,
cujas superfícies são essenciais para várias interações proteína-proteína (BIGGS,
MACFARLANE, 1951, (MACFARLANE, 1964)).
Na via extrínseca do sistema de coagulação ocorre a exposição do fator
tecidual. Este fator é expresso por macrófagos, células epiteliais, e outros células t
que estão, fisiologicamente separados do sangue e dos fatores da coagulação
(OSTERUDE, 1998; GIESEN et al, 1999). O fator VII ativado (FVIIa) circulante se
liga ao fator tecidual e o complexo gerado FVIIa–TF converte o fator IX e fator X em
enzimas ativas, fator IX ativado (FIXa) e fator X ativado (FXa), respectivamente
(SCHENONE, FURIE, FURIE, 2004;
DAHLBACK, 2005). O FXa converte a
protrombina (II) em trombina (IIa), e então, esta se associa com o fator XIII e gera o
tampão de fibrina a partir do fibrinogênio (BIGGS, MACFARLANE, 1951).
A via intrínseca é iniciada quando o fator XII (fator de Hageman) entra
em contato com cargas negativas do endotélio subjacente, gerando o FXa através
de uma cascata de ativação de zimogênios. Este processo é denominado “ativação
por contato” e requer pré-calicreína (serina protease) e cininogênio de alto peso
molecular (cofator não enzimático) (JENNY, MANN, 1998; COLMAN et al, 2001b)
(Figura 2).
Essa cascata explica a interpretação de testes de coagulação preliminares
anormais como: o tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativada.
Observações experimentais e clínicas sugerem que esta teoria da cascata
não reflete com precisão os eventos hemostáticos in vivo (BIGGS, MACFARLANE,
1951).
Figura 2. Representação esquemática da cascata de coagulação. As letras pretas representam os
precursores inativos (protrombina, V, VII, VIII, IX,X, XIII. As proteínas ativas estão apresentadas em
vermelho. As setas em vermelho representam as vias de ativação de fatores da caogulação. As
setas em laranja representam vias de ativação. (VERLI, 2005)
No entanto, esta divisão da coagulação do sangue em via extrínseca e
intrínseca é inadequada, uma vez que a separação dos processos hemostáticos in
vivo não ocorre (JENNY, MANN, 1998; COLMAN et al., 2001). Outra teoria descreve
a separação de duas vias para a formação do coágulo é substituída por outra na
qual há ligação entre as duas vias e a existência de regulação por vários
retroreguladores positivos e negativos (MCVEY, 1999). Esta nova hipótese leva em
consideração as superfícies celulares dentro do processo da coagulação e que o
fator tecidual apresenta papel central no processo (MORRISSEY et al, 1993). Os
mecanismos
hemostáticos
estão
associados
a
complexos
enzimáticos
procoagulantes, que compreendem serinoproteases dependentes de vitamina K
(fatores II, VII, IX e X) e cofatores (V e VIII), localizados em uma superfície de
membrana contendo fosfolipídeos (JENNY, MANN, 1998; COLMAN et al., 2001b).
Esses complexos propagam o processo da coagulação e são formados na
superfície de fosfolipídios carregados negativamente. O complexo tenase tem como
constituinte o fator IXa e como seu cofator o fator VIIIa, enquanto que o complexo
protrombinase apresenta o fator Xa e como seu cofator o fator Va. Os fatores VIIIa e
Va derivam de proteínas precursoras circulantes e são convertidas, precocemente,
em suas formas ativadas pela trombina ou fator Xa, durante a coagulação
(SCHENONE, FURIE, FURIE, 2004; DAHLBACK, 2005; DAHLBACK, 2000; MANN,
KALAFATIS, 2003; NICOLAES, DAHLBACK, 2002).
O componente fosfolipídico é fornecido por tecidos celulares lesados, células
inflamatórias e plaquetas ativadas, sendo estas últimas o principal contribuinte,
expressando sítios de ligação para os complexos tenase e protrombinase. Ressaltase ainda, a necessidade dos íons cálcio para várias reações de coagulação
(DRAKE, MORRISSEY, EDGINGTON, 1989; WILCOX, 1989).
Os complexos tenase ativam o fator X, convertendo em FXa (forma ativada) e
o complexo protrombinase converte a protrombina (II) em trombina (IIa).
1.5.Trombose
Dentre as principais causas mundiais de morte (30% do total) estão as
doenças que envolvem o coração e vasos sanguíneos e, conseqüentemente,
trombose.
A
maioria
dos
processos
tromboembólicos
requerem
terapia
anticoagulante, o que explica os esforços atuais para desenvolver agentes
anticoagulantes e anti-trombóticos potentes e específico (OLSON & BJORK, 1993).
Desde a década de 1940, a heparina tem sido a droga predominante para o
tratamento e prevenção da trombose venosa e tromboembolismo. No entanto, um
efeito secundário da administração de heparina é a hemorragia (NADER et al, 2004).
Além
disso,
um
outro
agravante
seriam
as
preparações susceptíveis
a
contaminações, estando associadas a uma gama de efeitos adversos (GUERRINI et
al, 2008; LIMA et al, 2011; SASSAKI, et al, 2011).
O trombo pode ser definido como uma massa intravascular formada de
componentes sanguíneos. (ZAGO, 2004). Em alguns casos, a doença constitui uma
complicação de determinados tipos de cancro em fase avançada, sobretudo em
caso de extensos tumores malignos da próstata e pâncreas, pois os tumores
malignos, ao longo do seu rápido crescimento, podem corroer as paredes dos vasos
sanguíneos vizinhos e transpor para a circulação determinadas substâncias tóxicas,
elaboradas pelas próprias células tumorais, com a capacidade de ativar os
mecanismos da coagulação. A deficiência da proteína C ou da proteína S está
associada com um risco aumentado de trombose (COMP et al, 1984; GRIFFIN et al,
1981). É comum em doenças malignas, sendo a segunda causa mais comum de
morte em pacientes com câncer (RICKLES, LEVINE, 1998).
Em meados da década de 80, Colburn e Buonassi relataram que a superfície
das células endoteliais tem atividade antitrombótica.
Esses autores também
afirmaram que quando ocorriam mudanças na superfície destas células, existia a
possibilidade de formação de trombo. O heparam sulfato, um glicosaminoglicano
presente na superfície e na matriz extracelular de células endoteliais possuindo
atividade antitrombótica em vários modelos propostos por esses pesquisadores
(COLBURN, BUONASSISI, 1982). Análises prévias demonstraram que células
endoteliais quando na presença de heparina, aumentavam a síntese de heparam
sulfato antitrombótico da superfície celular, e do heparam sulfato liberado no meio
(NADER et al, 1989; PINHAL et al, 1995; PINHAL et al, 1994).
A possibilidade de transmissão de príons e vírus para os pacientes tratados
com este polissacarídeo é um fato, pois a heparina comercial é adquirida,
principalmente, do intestino de bovinos e porcos (SHANMUGAM, MODY, 2000;
BERTEAU & MULLOY, 2003). A atividade antitrombótica da heparina e de outros
agentes antitrombóticos ocorre, pelo menos em parte,
pela
a ação destes nas
células endoteliais estimulando a síntese de heparam sulfato antitrombótico
(NADER, et. al., 2001).
Heparina foi o primeiro composto usado como um agente anticoagulante e
antitrombótico. Este composto anticoagulante forma um complexo ternário com a
antitrombina III e com diferentes serina proteases da cascata de coagulação. A
inativação da trombina pela antitrombina é acelerada mais de 1000 vezes na
presença de heparina, que também potencializa o
cofator II da heparina que é
específico para trombina (SILVA& DIETRICH, 1975).
A heparina pode exercer sua atividade antitrombótica também através da via
do fator tecidual (TF), induzindo a síntese e liberação do TF pelas células endoteliais
e deslocamento do TF ligado a membranas celulares (HANSEN et al, 2000; LUPU et
al, 1999).
1.6. Angiogênese
A formação de vasos sanguíneos pode ocorrer a partir de diversos processos,
como a vasculogênese e a angiogênese, nos quais estão envolvidos diferentes
mecanismos celulares, como a migração e diferenciação (RISAU, 1997).
A vasculogênese é um processo definido como a formação de vasos
sanguíneos a partir da diferenciação in situ de células tronco mesenquimais
progenitoras de células endoteliais (angioblastos e hamangioblastos). Estas células
precursoras são recrutadas de áreas de mesoderma adjacentes ao embrião e/ou
originadas por divisão celular local, organizando ilhotas sanguíneas e estabelecendo
um plexo vascular primordial (RUITER et al., 1992) (Figura 3).
Figura 3. Esquema de diferenciação entre os processos de vasculogênese e
angiogênese.
Angiogênese é a formação de novos vasos capilares a partir de vasculatura
pré-existente, sendo regulada por interações complexas entre fatores estimuladores
e inibidores, incluindo fatores de crescimento, citocinas, enzimas proteolíticas,
integrinas e componentes da matriz extracelular (BURGERMEISTER, et al, 2002).
Algumas doenças são determinadas pela resposta angiogênica persistente devido a
um aumento dos mediadores angiogênicos ou deficiência de inibidores, como, por
exemplo, neoplasias, metástases, psoríase e artrite reumatóide. Os fatores
ativadores da angiogênese interagem com glicosaminoglicanos e proteoglicanas,
presentes na matriz extracelular, lâmina basal e receptores de superfície celular,
regulando o crescimento, a proliferação, a migração, a diferenciação e a
sobrevivência das células endoteliais sobre uma variedade de tipos celulares
(SOLIMENE et al., 1999, CHIPPERFIELD et al., 2002).
Os eventos teciduais que ocorrem nos processos de vasculogênese e
angiogênese incluem a perda de adesão de células vizinhas, proteólise da matriz
extracelular proximal, migração e proliferação celular, formação do tubo vascular
(tubulogênese) e deposição da membrana basal (D’AMORE & THOMPSON, 1897;
TOBELEM, 1990, KALLURI, 2003).
Substâncias antiangiogênicas produzidas no tumor são capazes de frear o
desenvolvimento de metástases em alguns tipos de tumores, o que confirmou as
observações feitas anteriormente relacionadas com o incremento da agressividade
das metástases após a exérese do tumor primário, fato esse que aumentou o
interesse na procura de drogas que imitassem a ação de tais substâncias
endógenas como são a Angiostatina e a Endostatina (O’RELLY et al, 1994,
O´RELLY, et al, 1997, GIMBRONE et al, 1974).
A angiogênese é um processo estritamente regulado, podendo ser
rapidamente estimulado ou inibido (HANAHAN & FOLKMAN, 1996). Durante a
resposta angiogênica, as células endoteliais, normalmente não proliferativas, são
ativadas (FOLKMAN,1995)
Um dos mais específicos e importantes fatores envolvidos na angiogênese é
o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o qual pode se ligar
especificamente a diversos receptores da membrana da célula endotelial
(FERRARA, et al,
2003). Além estimular a angiogênese, VEGF também é
importante para manutenção da integridade e permeabilidade dos vasos sanguíneos
(KECK, et al, 1989).
Os membros da família VEGF estimulam respostas celulares por ligação a
receptores da tirosina-quinase VEGFR na superfície da célula, causando-lhes a
possibilidade de dimerizar e tornar-se ativado por meio transfosforilação. Os
receptores de VEGF possuem uma porção extracelular consistindo de 7 domínios do
tipo imunoglobulina, uma região transmembrana única e uma porção intracelular que
contém um domínio da divisão tirosina-quinase . Na figura 4 observa-se um
esquema básico dos ligantes e receptores do VEGF.
Figura
4
.Uma visão geral da família VEGF e seus receptores (Fonte: Freitas et al., 2009)
Os Fatores de crescimento de fibroblasto (FGF) também são uma família de
fatores envolvidos na angiogênese e cicatrização de feridas. Existem evidencias
comprovando sua ação no desenvolvimento embrionário. São proteínas que se
ligam à heparina possuindo interações com heparan sulfato associados com
proteínas, fundamentais na transdução de sinais. Os FGFs são de grande
importância na proliferação e diferenciação de uma grande variedade de células e
tecidos (Freitas et al., 2009).
1.6. Inflamação
A inflamação ou flogose (do latim inflamare e do grego phlogos, que significa
pegar fogo) é uma reação dos tecidos vascularizados ao agente agressor
caracterizada pela saída de líquidos e de células do sangue para o interstício
(PEREIRA E BOGLIOLO, 1998). As causas para as reações inflamatórias são muito
variadas, entretanto os mecanismos de aparecimento são comuns. Pereira e
Bogliolo (1998) classificaram-nas em causas endógenas e exógenas. As endógenas
seriam aquelas derivadas de degenerações ou necroses tissulares e as derivadas
de alterações na resposta imunológica (por imunocomplexo ou autoimune).
Enquanto as exógenas poderiam ser atribuídas agentes físicos (calor e frio;
eletricidade; radiações; sons e ultra-sons; magnetismo; gravidade; traumas
mecânicos e atritos) e agentes Químicos (Inorgânicos e Orgânicos), ou até mesmo
agentes Biológicos (Infecciosos ou Parasitários).
A inflamação, tida essencialmente como uma resposta protetora que inicia o
processo de reparação tecidual, é uma resposta inespecífica do corpo a lesões. O
processo inflamatório envolve interações complexas entre as células inflamatórias
(neutrófilos, linfócitos e monócitos/macrófagos) e células vasculares (células
endoteliais e células da musculatura lisa) (DI ROSA, 1972).
Um mecanismo essencial na resposta inflamatória é o recrutamento de macrófagos
para atuar contra microorganismos invasores ou suas toxinas (HAVSTEEN, 2002).
Os macrófagos podem ser ativados por diferentes meios como a ativação
clássica e a ativação alternativa. A ativação clássica de macrófagos desencadeia a
produção de óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias, além de estimular a
fagocitose e a capacidade de eliminar o patógeno. Enquanto a ativação alternativa
leva a secreção de citocinas anti-inflamatórias e redução da fagocitose e capacidade
de eliminar o patógeno (GORDON, 2003).
Processos inflamatórios estão ligados aos processos patológicos da
angiogênese, porque induzem mediadores como o NF-kB que têm sítios de ligação
nas suas regiões promotoras (COSTA, INACIO, SOARES, 2007).
Durante a inflamação crônica, os microvasos neoformados são principalmente
capilares com uma única camada de células endoteliais bem diferenciadas e
formação de vasos de paredes finas desprovidos de músculos lisos (USHIO-FUKAI,
2006). Estudos indicaram que o crescimento do tumor não é apenas determinado
pela acumulação de alterações genéticas pelas células cancerosas malignas.
Numerosas células hospedeiras, tais como células inflamatórias, endoteliais e
fibroblastos
são
recrutadas
e
ativadas
no
microambiente
tumoral
em
desenvolvimento (DE VISSER, EICHTEN, COUSSENS, 2006; VAN KEMPEN et al.,
2002).
O sistema imunitário protege contra patógenos invasores e células
transformadas, incluindo o câncer, e divide-se nas principais componentes da
imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata consiste mecanismos de defesa
celulares, bioquímicos, físicos e estruturais que respondem rapidamente após os
eventos perigosos, tais como encontros com micróbios ou células transformadas. Os
componentes celulares da imunidade inata incluem as células dendríticas (DC),
macrófagos e monócitos, neutrófilos, mastócitos, natural killer (NK), γδ células T e T
células natural killer (NKT). As células do sistema imune inato reconhecem os
agentes infecciosos através dos receptores para os componentes específicos de
microorganismos patogênicos. As estruturas destes componentes são altamente
conservadas com padrões moleculares associados, incluindo os receptores tipo Toll
(TLRs) (LI et al, 2007). Ativação do TLR pode também conduzir, diretamente ou
indiretamente, a regressão do tumor (TNF mediada) através de uma maior
permeabilidade vascular (MARUYAMA et al, 2011), havendo o recrutamento de
leucócitos, a ativação da atividade lítica tumoral das células NK e linfócitos T
citotóxicos (CTL), e aumento da sensibilidade de eliminação de células tumorais por
moléculas efetoras, tais como TRAIL, TNF, e granzima B / perforina (MARUYAMA et
al, 2011; VANE & BOOTIN, 1987).
A angiogênese e a formação de nova vasculatura são cruciais para o
desenvolvimento e progressão tumoral. A grande distinção entre inflamação crônica
e tumor nos processos angiogênicos é que na inflamação os leucócitos infiltrantes e
plaquetas são principais fontes de fatores angiogênicos, enquanto que no câncer, os
principais produtores são as células tumorais com menor contribuição dos
leucócitos. A neovascularização tumoral parece ser um processo mais complexo que
inclui vasculogênese e linfangiogênese (CARMELIET & JAIN, 2000).
1.8. Antioxidantes
A formação de espécies reativas do oxigênio (ROS) é uma conseqüência
natural do metabolismo aeróbico e é parte integrante para a manutenção da
homeostase do oxigênio nos tecidos (Castro & Freeman, 2001). Cerca de 1-3% de
oxigênio consumido pelo organismo é convertido em ROS (SOHAL & WEINDRUCH,
1996). Três dos principais ROS (radical superóxido, peróxido de hidrogênio e radical
hidroxila) são subprodutos de metabólicos normais que são geradas continuamente
pelas mitocôndrias nas células em crescimento (MCCORD, 2000; LOPACZYNSKI &
ZEISEL, 2004). Modificação oxidativa do DNA, proteínas, lipídios e pequenas
moléculas celulares por espécies reativas do oxigênio (ROS) desempenham um
papel em uma grande variedade de doenças comuns e condições degenerativas
relacionadas à idade, o câncer e uma vasta gama de outras doenças humanas
(BOREK, 1993; REAVEN & WITZUM, 1996). Estresse oxidativo é o termo dado para
definir os distúrbios no equilíbrio entre mecanismos antioxidantes e pro- oxidantes
em favor da pró- oxidação, devido ao mecanismo de sinalização intracelular e a
defesa contra micoorganismos (MATES et al, 1999; HU et al, 2004). Outros sintomas
podem ser resultantes da produção de Espécies reativas do oxigênio associados
com a ativação do sistema imune (JIMENEZ et al, 2001).
O estresse oxidativo pode ser induzido por espécies reativas do oxigênio,
acreditando-se ser o fator primário em várias doenças degenerativas, bem como no
processo natural de envelhecimento (HALLLIWELL, GUTTERIDGE & CROSS,
1992). Os radicais livres podem facilmente iniciar a peroxidação de membranas
lipídicas, acarretando no acúmulo de peróxidos lipídicos provocando ações
deletérias no organismo. Em condições fisiológicas, todo o oxigênio molecular
captado nas mitocôndrias e processado na cadeia respiratória, tem o papel de
transportar elétrons a nível celular. Somente 1% a 5% destes escapam formando
oxirradicais. Portanto, a maioria dos radicais livres é derivada do metabolismo do
oxigênio (BANERJEE et al., 2005).
Essas ERMOs são capazes de agredir uma grande variedade de
biomoléculas (SINGH & RAIINI, 2004). Desta forma, podem ter um papel crítico
sobre muitas doenças, como câncer (MARAMATSU, et al.; 1995), aterosclerose
(STEINBERG, et al, 1989), úlcera gástrica (DAS, et al. 1997) e outras.
Os antioxidantes são substâncias que neutralizam ou previnem a oxidação de
substratos oxidáveis. O aumento desses efeitos podem causar a varredura das
ERMOs, ativando a bateria de proteínas detoxificantes ou prevenindo a geração
desses radicais livres (HALLIWELL, GUTTERIDGE & CROSS,1992).
Apesar da grande ação dos radicais livres nos sistemas biológicos, as células
possuem uma maquinaria
enzimática de
combate a
esses agressores,
defendendo-se dos mesmos em duas linhas principais. A primeira seria como
detoxificadora, aniquilando o agente agressor antes que cause a lesão. Nesta linha
tem-se a ação da glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e vitamina E. Na segunda linha a
ação é de reparar a lesão ocorrida, sendo constituída pelo ácido ascórbico,
glutationa
redutase
(GSH-Rd)
e
também
pela
GSH-Px
(FERREIRA
E
MATSUBARA, 1997). O mecanismo de ação dessas enzimas e os cofatores
necessários para sua ação estão demonstrados na Figura 5.
Glutationa
Peroxidase
(selênio)
Glutationa
Oxidada
Figura 5. Mecanismo de ação e cofatores necessários ás enzimas Superóxido
dismutase, Catalase e Glutationa peroxidase.
O ataque de radicais livres às membranas celulares gera uma variedade de
consequências como a perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo
de organelas e de enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos
citotóxicos tal como o malonilaldeído, culminando com a morte celular. A
lipoperoxidação também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento,
de câncer e à exacerbação da toxicidade de xenobióticos (ROSS & MOLDEUS,
1991). Assim como na formação das ERMOs, nem sempre os processos de
lipoperoxidação são prejudiciais, pois seus produtos são importantes na reação em
cascata a partir do ácido araquidônico (formação de prostaglandinas) e portanto, na
resposta inflamatória. Todavia, o excesso de tais produtos pode ser lesivo (ROSS &
MOLDEUS, 1991). Doenças, como a aterosclerose, podem ser resultante de um
processo inflamatório crônico. Este processo pode ser iniciado e mantido pela
oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL= do inglês low density
lipoprotein) da parede vascular (BASKIN
et al., 2003). A aterosclerose é um
processo multifatorial e muitos estudos vêm demonstrando um possível papel do
óxido nítrico (NO) neste processo (BASKIN, et al., 2003).
Não existe experimentalmente um conceito para “antioxidante”, a menos que
seja associado a noção do oxidante a ser neutralizado. Desta forma, o conceito de
antioxidante in vitro poderia ser extendido a células, organismos, animais ou
populações até que a evidência seja obtida (AZZI, DAVIES, KELLY, 2004).
Nos últimos anos, muitos recursos marinhos têm atraído atenção na busca de
compostos bioativos para desenvolver novos medicamentos e alimentos naturais.
Algas comestíveis são uma fonte rica de fibra alimentar, minerais e proteínas. As
algas marinhas marrons, dentre as demais, são dotadas de interessantes
propriedades biológicas e farmacológicas e diante desse contexto estão sendo
estudadas (KUDA et al., 2002; FLEURENCE, 1999).
2.0. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar as características estruturais de fucanas da alga Sargassum vulgare e
analisar seu eventual papel farmacológico e biológico.
Objetivos específicos
1- Analisar os aspectos estruturais das fucanas (SV1) e de sua subpopulação
(PSV1) isoladas de S. vulgare.
2- Observar a ação antiangiogênica das fucanas in vivo e in vitro.
3- Verificar a ação dos compostos na viabilidade de células das linhagens
RAEC, RAW 264.7, B16- F10 e HeLa.
4- Verificar a ação dos compostos sobre a apoptose e sua influência no ciclo
celular de células da linhagem RAEC
5- Observar a influência das fucanas sobre a secreção de VEGF em células
RAEC.
6- Avaliar a ação das fucanas sobre eventos da coagulação e trombose.
7- Analisar o potencial antioxidante dos polímeros SV1 e PSV1
8- Verificar a ação anti-inflamatória das fucanas
9- Avaliar a ação citotóxica de SV1 sobre hemácias do grupo ABO e diferentes
Rh
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Material Biológico
3.1.1. Alga Marinha
A alga marinha utilizada nesse estudo, Sargassum vulgare, foi coletada na
praia de Búzios (RN) em maré baixa (entre 0,0 e 0,2 metros). Logo após a coleta as
algas foram limpas e secas em estufa a 45ºC.
Classe: Phaeophyceae
Ordem: Fucales
Família: Sargassaceae
Gênero: Sargassum
Espécie: Sargassum vulgare
Após serem coletadas, as algas forma levadas ao laboratório, onde foram
lavadas e retiradas as epífitas e inclusões calcárias. Em seguida, foram secas em
estufa a 45ºC, trituradas e guardadas em recipientes adequados.
3.1.2. Plasma Humano
O sangue humano foi coletado com
citrato de sódio (concentração final
0,82%) sob agitação leve, em frasco de polietileno esterilizado. O plasma foi
separado por centrifugação e alíquotas de 10 mL foram estocadas a -20°C em
fracos de vidro esterilizados.
3.1.3. Células
A linhagem celular HeLa foi gentilmente doada pelo Departamento de
Genética da UFRN. A linhagem celular CLPS foi gentilmente doada pelo
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UNIFESP. A linhagem HeLa e
RAW foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) e a
linhagem CLPS foi cultivada em meio HAM F-12 (Cultilab). Em ambos, foram
adicionados Estreptomicina (5000μg/mL)/ Penicilina (5000 UI). As células foram
mantidas em ambiente estéril a 5% de CO2.
3.1.4. Animais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar aproximadamente 3 meses de
idade, pesando cerca de 250- 300g, obtidos do biotério do Departamento de
Bioquímica-UFRN. Todos os animais utilizados experimentalmente foram mantidos
em gaiolas individuais, submetidos a água e dieta ad libitum em condições
controladas de iluminação (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura constante a 25ºC.
Os animais foram acondicionados no laboratório durante no mínimo 2 h antes dos
testes e utilizados uma única vez para os experimentos. Uma vez utilizados
experimentalmente, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os
ensaios foram desenvolvidos de acordo com as normas vigentes, tendo sido
previamente aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da UFRN, protocolo Nº
039/2010.
3.1.5. Ovos de galinha fertilizados
Foram utilizados ovos de galinha fertilizados, coletados imediatamente após a
postura, em granjas localizadas na região metropolitana da região da grande Natal.
No laboratório, os ovos foram delicadamente higienizados com solução de
hipoclorito de sódio a 10% e posteriormente utilizados para os testes de
angiogênese. Os ensaios foram desenvolvidos de acordo com as normas vigentes,
tendo sido previamente aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da UFRN,
protocolo Nº 039/2010.
3.2. Outros materiais
3.2.1. Kits e Reagentes
 1,3 diamino propano, Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwake, WI, EUA).
 Acetona, metanol e etanol da Merck (São Paulo-SP)
 Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomassie brillant blue R250
(Aldrich Chemical Co. Inc. Milwake, WI, EUA), fosfato de sódio dibásico, fosfato de
sódio monobásico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio da CRq (Diadema,
SP, Brasil).
 Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da VETEC (Duque de Caxias, RJ,
Brasil)
 Azul de toluidina, vermelho de cresol, coomassie blue R250, da Sigma
Chemical Company (St. Louis, MO, EUA)
 Cloreto de ferro e Reagente de Folin- Ciocalteau da Merck (Darmstadt,
Alemanha);
 Estreptomicina/ Penicilina, Gibco Invitrogen (California, Estados Unidos);
 Fenol e molibdato de amônia da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas
S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil)
 Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e Kit de tempo de
protrombina da Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil);
 Kit de ELISA para VEGF da CalBiochem Novabiochem, Canadá;
 DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) e RPMI 1640 da Cutilab, SP;
 Maxatase (protease alcalina P126), da BIOCON do Brasil Industrial Ltda.
(Rio de Janeiro, RJ, Brasil)
 Membrana de PVDF (Millipores, Bedford, MA, USA);
 Substrato Cromogênico Fator Xa, Fator Xa Bovino, Trombina, substrato
cromogênico B2- FUR-pNa da Sigma Sigma Chemical Company (St. Louis, MO,
EUA).
 Bacto-gelatin da Difco Laboratories
 Heparina sódica 5000UI/ml (Ariston)
 Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) (Britsh Drug House
Chemical Ltd.; Poole , Inglaterra)
 Cloridrato de Xilazina a 2% e Cloridrato de ketamina 5% (Köning do
Brasil, Ltda)
3.2.2. Padrões
 L- fucose, D- xilose, D- galactose, D- manose, D- glucose, D-arabinose, ácido
d- glucurônico, ácido D- galacturônico, foram adquiridos da Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO, EUA).
3.2.3. Aparelhos
 Agitador de tubos mod AP 56 da Phoenix Ltda. (Araraquara, SP, Brasil);
 Agitador orbital mod. 255-B da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil).
 Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda. (São Paulo, SP,
Brasil).
 Bombas peristálticas Microperpex S mod. 2232 da LKB (Bromma, Suécia) e
Econo Pump mod. EP-1 da Bio Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA).
 Centrífuga refrigerada RC 2-B da Ivan Sorvall Inc. (Norwalk, CO, EUA).
 Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tóquio, Japão).
 Espectrofotômetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd.
(Springvale, Vico, Austrália) e Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão).
 Espectrômetro de infravermelho modelo FT1 6PC da Perkin Elmer (EUA)
 Evaporador rotatório Evapo-Mix da Buchler Instruments (Fort Lee, NJ, EUA).
 Medidor de pH, Orion Research model 701 A/ digital lonalyzer (Cambridge,
MA, EUA)
 Fontes de corrente contínua regulável desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa,
Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil).
 Coagulômetro da Drake (São Paulo, SP, Brasil)
 Citrometro de Fluxo FACSCalibur (Becton Dickison, USA)
 Bancada de fluxo laminar- Pachane Pa300, Piracicaba- São Paulo;
 Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model
3110- USA;
 Microscópio Nikon CFI60, Spectrum Bioengenharia Médica Hospitalar LTDA.
São Paulo- São Paulo- Brasil
3.3. Obtenção dos polissacarídeos sulfatados
A alga coletada foi acondicionada em sacos plásticos e conduzida até o
laboratório de Glicobiologia Vegetal - Departamento de Bioquímica/ UFRN.
Subsequentemente foram retiradas as epífitas, e a alga foi lavada em água corrente,
desidratada, triturada e verificada sua massa. Em seguida, a alga foi submetida ao
processo de extração e fracionamento para a obtenção dos polissacarídeos
sulfatados.
Para a remoção dos lipídios, incluindo os pigmentos, a alga foi dessecada,
pulverizada e foram adicionados 2 volumes de acetona. Posteriormente, a acetona
foi retirada por filtração, sendo a alga colocada a temperatura ambiente para
evaporação do solvente, obtendo-se desta forma, o pó cetônico.
Ao pó cetônico foram adicionados 2 volumes de NaCl 0,15 M, ajustando-se o
pH para 8,0. Em seguida, foi adicionada solução da enzima proteolítica maxatase
(15 mg de maxatase por grama de pó cetônico), mantendo-se sob agitação a 60ºC,
por 18 h. A suspensão foi então filtrada e o sobrenadante obtido foi denominado cru
de polissacarídeos, o qual foi centrifugado a 8000 x g por 15 min. Após
centrifugação, o precipitado foi desprezado. O sobrenadante foi fracionado com
concentrações crescentes de acetona (0,3; 0,5; 1,0; 2,0 v) sob centrifugação a 8.000
x g por 15 min. Uma alíquota do sobrenadante foi removida para obtenção da FT
(fração total) utilizando 3 v de acetona e centrifugação a 8.000 x g por 15 min
(DIETRICH et al., 1995). A fração obtida a 1,0 v de acetona teve o melhor
rendimento, sendo utilizada para maiores estudos. Essa fração foi chamada de SV1.
3.4. Eletroforese em gel de agarose
Para o preparo do gel, a agarose (0,6%) foi dissolvida em tampão 1,3
diaminopropanoacetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0 aquecido a 100 °C. Em seguida o gel
foi colocado sobre lâminas de vidro medindo 7,5 x 5,0 x 0,2. Cerca de 5 μL das
frações (10 mg/mL) foram aplicadas em poços no gel e submetidas à corrente
elétrica por volta de 1 h e 30 min a 100 V, em cuba resfriada a 4ºC (DIETRICH,
DIETRICH, 1976).
Após o tempo de migração, o gel foi submerso em CETAVLON 0,1%, por 12 h
a temperatura ambiente para a precipitação dos polissacarídeos. Depois desse
processo, o gel foi seco em corrente contínua de ar quente e corado em azul de
toluidina 0,06% por 15 min. O excesso do corante foi removido por solução
descorante. Em seguida, a lâmina seca a temperatura ambiente.
3.5. Análises químicas
3.5.1. Dosagem de açúcares totais
Os açúcares totais foram quantificados pelo método do fenol/ácido sulfúrico
de acordo com Dubois et al., (1956), empregando o monossacarídeo fucose como
padrão. As leituras foram realizadas a 490nm.
3.5.2. Dosagem de sulfato
A determinação do teor de sulfato foi realizada após hidrólise ácida (HCl 6N, 6
h, 100°C), pelo método turbidimétrico da gelatina-bário (DODGSON, PRICE, 1962).
Como padrão foi utilizado o sulfato de sódio (1 mg/mL), o qual foi submetido às
mesmas condições das amostras em estudo.
3.5.3. Dosagem de proteínas
O conteúdo protéico foi determinado pelo método de Bradford, (1976), usando
o reagente Coomassie Blue Brilliant e a albumina bovina como padrão, com leitura
realizada em espectrofotometro a 595 nm.
3.5.4. Dosagem de compostos fenólicos
A concentração de compostos fenólicos foi determinada pelo método de Folin
Ciocalteau (SWAIN, HILLS, 1959) com algumas modificações, usando 0,5 mL de
etanol, 2,5 mL de água destilada, 0,25 mL de reagente de Folin Ciocalteau, 0,5 mL
de carbonato de sódio, 0,5 mL das amostras de S. vulgare (1 mg/mL). A leitura foi
realizada a 755 nm. Uma solução de ácido gálico em água destilada foi usada para
elaboração da curva de concentração padrão.
3.6. Purificação
A massa molecular foi determinada por cromatografia de gel filtração em
Sepharose CL-4B (140×1.8 cm), utilizando para eluição solução de ácido acético 0,2
M. A massa molecular foi monitorada pela análise de açúcares totais (DUBOIS et al.,
1956) utilizando-se dextranas de diferentes tamanhos como padrões (Pharmacia) de
massas moleculares de 10.000, 40.000, 70.000, 133.000, 482.000 e 2.000.000 Da e
por identificação de compostos aromáticos a 280 nm/ UV (DAHMANE, LASIA,
ZHAO, 2008). A amostra coletada foi reunida e chamada PSV1. Esta amostra foi
gentilmente cedida pela Profª. Drª. Luciana Guimarães Alves Filgueira do
departamento de Bioquímica da UFRN.
3.7. Análise de Infravermelho
A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectômetro FT-IR ABB
Bomen modelo MB 104 (4000 a 400 cm -1). O composto foi analisado após secagem
sob a forma de pastilha de KBr, sendo necessário 10 mg do composto teste para a
análise.
3.8. Composição Monossacarídica
A composição monossacarídica dos polissacarídeos sulfatados da alga
Sargassum vulgare foi determinada através de cromatografia liquida de alta
performance (HPLC) contendo um detector de índice refrativo modelo L-2490. Os
polímeros foram hidrolisados (2M HCl, 100°C, 2h) e posteriormente analisados
quanto a composição monossacarídica. Os seguintes açúcares foram utilizados
como padrões de referência: galactose, glicose, fucose, manose, ácido glucurônico,
ácido manurônico, N- acetil glicosamina e xilose. A fase móvel constituiu de uma
mistura de 0,1mol/L de KH2PO4 (pH 10)- acetonitrila (80:20). O fluxo foi de 1.0
mL/min e a temperatura da coluna foi de 80°C.
3.9. Ressonância Magnética Nuclear
A espectroscopia de RMN de H1 e C13 foram realizadas a 500 MHz usando um
aparelho Varian Unity 500. A fucana sulfatada (PSV1) foi eluida na coluna de 10 cm
X 1 cm Dowex 50-X8 Na+, e as amostras foram dissolvidas em aproximadamente 0,7
mL de D2O 99.8%.
3.10. Avaliação das Atividades Farmacológicas
3.10.1. Ensaios de Avaliação da Ação de SV1 e PSV1 na angiogênese
3.10.1.1. Método de CAM
A inibição da angiogênese foi realizada pelo método da membrana
corioalantóica (CAM – chorioallantoic membrane assay) de acordo com DEOCARIS
(2005) com algumas modificações. Os ovos foram mantidos em uma incubadora a
37°C e 55% de humidade. No quarto dia, 5 mL de albumina foi aspirado e um orifício
de 1,5 cm2 foi aberto no quinto dia. Em seguida, o orifício foi fechado e a incubação
continuada até o sétimo dia com a inserção de diferentes concentrações (100 e 1000
µg/ovo ) de SV1 ou PSV1 em solução de agarose no CAM. Para o controle positivo
e negativo foram utilizados espirolactona e heparina na concentração de 10 µg/ovo,
respectivamente. Como branco foi utilizado a agarose, e as áreas neovascularizadas
do CAM foram fotografadas e analisadas com resultados expressos pela medição
por score (BURGERMEISTER et al., 2002).
Tabela 1: Valores de escore utilizados para avaliação do efeito antiangiogênico
no teste da membrana corioalantóica em ovos de galinha fertilizados
Score
Efeito observado
valor
0: sem efeito
Sem áreas livres de capilares
0,5: efeito muito fraco
Area com densidade de capilares
pouco reduzida ao redor do disco
Pequena area livre de lcapilares ou
1,0:
Efeito
fraco
médio
a
area com significante redução de
capilares. Efeito observado emu ma
area com o dobro do tamanho do
disco.
2,0: Efeito Forte
Area livre de capilares maior que o
dobro do tamanho do disco.
3.10.1.2. Ação na Tubulogênese in vitro
As células endoteliais da aorta de coelho (RAEC) na densidade de 20.000
células em 250 µL foram semeadas em placas de cultura 24 poços cobertas por uma
camada de 250 µL de matrigel (BD-Biosciences). As células foram incubadas em
estufa com 2,5% de CO2 e observadas com 4, 8, 12 e 24 h em microscópio invertido
para identificar a formação de túbulos capilares (SENEGAGLIA et al., 2008).
3.10.1.3. Dosagem do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF)
O VEGF foi mensurado a partir de um Kit de ELISA "sanduíche” que se
baseia em um imunoensaio enzimático empregando anticorpos policlonais. Um
anticorpo policlonal purificado por afinidade, específico para a proteína VEGF, foi
imobilizado na superfície dos poços de plástico fornecidos com o kit. A amostra a ser
ensaiada (amostras de teste, padrões e controles) foram pipetadas aos poços, tendo
a propriedade de ligar qualquer VEGF presente ao anticorpo de captura. O material
não ligado foi removido por lavagem e um anticorpo policlonal, conjugado com
anticorpo anti-VEGF foi adicionado aos poços. Após esta incubação, e um passo de
lavagem, um substrato cromogênico foi adicionado aos poços. A peroxidase catalisa
a conversão do substrato cromogênico tetra-methylbenzidine (TMB) a partir de uma
solução incolor a uma solução azul (ou amarelo depois da adição do reagente de
parada), a intensidade da coloração foi proporcional à quantidade de proteína VEGF
na amostra. O produto da reação colorimétrica foi quantificado utilizando um leitor de
microplacas
A quantificação foi conseguida através da construção de uma curva padrão
utilizando concentrações conhecidas de proteína VEGF (fornecido liofilizado).
Através da comparação da absorbância obtida a partir de uma amostra contendo
uma quantidade desconhecida de proteína VEGF com a obtida com os padrões, foi
possível estabelecer a concentração de proteína VEGF na amostra teste.
Assim, a cultura de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) foi exposta
a 25, 50, e 100 μg SV1 e PSV1 (triplicata) e incubando-se durante 24 h a 37 ° C.
Após a incubação, o meio de cultura foi aspirado. A quantidade de VEGF no meio
de cultura das células RAEC foi determinada utilizando-se o kit de ELISA, conforme
recomendam os protocolos do fabricante (Calbiochem, VEGF Elisa Kit).
3.10.2. Ação de SV1 e PSV1 na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT)
O método de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium)
é um ensaio de viabilidade celular utilizado para determinar a citotoxicidade após a
exposição das células a substâncias testes. A citotoxicidade de SV1 e PSV1 foi
medida como previamente descrita por Mosmann (1983) usando células endoteliais
da aorta de coelho (RAEC). As culturas foram expostas a 25, 50 e 100 μg das
fucanas (em triplicata) e incubadas a 37°C por 24 h. Após a incubação, 100 μL de
meio F-12 contendo MTT (concentração final de 5 mg/mL), foi adicionado a cada
poço, e as placas foram incubadas a 37°C por 4 h. Decorrido o tempo, o
sobrenadante foi removido e 100 μL de etanol P.A. foram adicionados a cada poço
para solubilizar os cristais de formazan. Após homogeneização, a leitura foi
realizada a 570 nm.
Os ensaios com as linhagem celulares HeLa, melanoma B-16 e Raw foram
procedidos da mesma maneira, entretanto o meio de cultura utilizado foi o DMEM.
3.10.3. Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular
nas células endoteliais da aorta de coelho (RAEC)
3.10.3.1. Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI)
A morte das células RAEC foi avaliada utilizando-se a anexina V- isotiocianato
de fluorosceína – anexina V-FITC (detecção da exposição da fosfatidilserina na
membrana celular) e o iodeto de propídio (PI), de acordo com o kit de detecção de
apoptose BD Pharmingen Annexin V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). As
células RAEC foram cultivadas em meio F-12, a 37°C sob atmosfera de 2,5% de
CO2. As células foram cultivadas em placas de 6 poços (100.000 células por poço) e
deixadas por 24 h, até atingirem confluência. Após a incubação, as células foram
carenciadas por 18 h e em seguida foram tratadas com 100 μg de SV1 e PSV1
(diluída em meio F-12) por 24 h. O sobrenadante, contendo as células não
aderentes, foi removido e reservado em um tubo Falcon, o qual foi centrifugado a
1000 g por 15 min. As células aderentes na placa foram lavadas 2 vezes com
tampão EBSS (contendo o indicador de pH vermelho de fenol) e em cada poço foi
adicionado uma solução da enzima viocase (pancreatina) para descolar as células
da placa. Em seguida, foi adicionado a cada poço meio F-12 contendo soro bovino
fetal e a suspensão de células descoladas foi transferida para o tubo Falcon
contendo as células não aderentes e que já foram submetidas ao processo de
centrifugação. A suspensão de células aderentes e não aderentes na placa foram
homogeneizadas e lavadas 2 vezes com tampão do kit diluído em PBS para ensaio
de anexina V-PI e as células foram ressuspendidas em 50 μL. As células foram
incubadas com 3 μL de anexina V e 5 μL de iodeto de propídio por 20 min a
temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, em cada tubo teste foi
adicionado 350 μL do tampão do kit e as células foram imediatamente analisadas
em citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado
em duplicata.
3.10.4.2. Ensaio da distribuição das células no ciclo celular
Para realização da análise da progressão do ciclo celular, as células
endoteliais da aorta de coelho (RAEC) foram submetidas a mesma metodologia
aplicada para o ensaio de apoptose anexina V-FITC/ PI. A suspensão de células
aderentes e não aderentes foram fixadas com formaldeído 2%, e incubadas a 4°C
por 30 min. Após incubação, as células foram lavadas com PBS (150 mM, pH 7,4).
Posteriormente,
foi
adicionado
PBS
contendo
0,01%
de
saponina,
para
permeabilizar as células. A seguir, foi adicionado uma solução estoque de RNase a
4 mg/mL em tampão acetato de sódio 0,05M, pH 5,0 contendo de MgSO 4 0,02 M. A
suspensão foi incubada por 1 h a 37°C. Após este tempo, foram adicionados 5 μL da
solução estoque de PI (5 mg/mL) a temperatura ambiente. As células foram
homogeneizadas e em seguida transferidas para tubos de FACS, aos quais foram
adicionados 300 μL de PBS. As células foram analisadas em citômetro de fluxo
FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em duplicata.
3.10.4. Atividade anticoagulante
O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e o tempo de protrombina
(PT) do pool de plasma citratado misturado a SV1 e PSV1 foram determinados por
kits comerciais da Labtest (São Paulo, SP). O teste de aPTT avalia a influência dos
compostos sobre os fatores da via intrínseca e comum da coagulação. O teste de PT
serve para avaliar a influência sobre os fatores da via extrínseca e comum da
coagulação.
O sangue humano, utilizado na avaliação da atividade anticoagulante de SV1
e PSV1, foi obtido de voluntários sadios que não haviam utilizado medicamento ao
longo de 2 semanas antes da coleta nem tinham feito uso de bebida alcoólica nos
últimos três dias, assim como mulheres que não faziam uso de anticoncepcional.
O sangue foi coletado por punção venosa e misturado cuidadosamente com
citrato de sódio a 3,2%, na proporção de 9:1. Em seguida, o sangue foi centrifugado
a 1000 x g por 10 min a temperatura ambiente. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi retirado e colocado em tubos plásticos siliconizados, representando
o pool de plasma citratado.
3.10.4.1.Tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT)
Para determinar o tempo de tromboplastina parcial ativada foram misturados 90 μL
do pool de plasma citratado com 10 μL da SV1 e PSV1 contendo 5, 10, 25, 50, 100,
150, 200 μg, e incubados por 3 min a 37°C. Após esse tempo, foram adicionados
100 μL de cefalina pré-aquecida a mistura anterior, e incubado por mais 3 min a
37°C. Em seguida, foram adicionados 100 μL de CaCl2 pré-aquecido e o tempo para
a formação do coágulo foi aferido em coagulômetro. Como controle foi utilizado 100
μL do pool de plasma citratado.
Figura 6: Esquema do teste de tromboplastina parcial ativada (aPTT)
3.10.4.2. Tempo de protrombina (PT)
Para a determinação do tempo de protrombina foram misturados 90 μL do pool de
plasma citratado com 10 μL da SV1 ou PSV1 contendo 50, 75, 100, 150, 200 μg, e
incubado por 3 min a 37°C. Após esse tempo, foram adicionados 200 μL do
reagente soluplastin pré-aquecido a 37°C e o tempo para a formação do coágulo foi
aferido em coagulômetro. Como controle foi utilizado 100 μL do pool de plasma
citratado.
Figura 7. Esquema do Tempo de Protrombina (PT)
3.10.5. Atividade enzimática de fatores da coagulação (Ensaio do substrato
cromogênico)
3.10.6.1. Ensaio de atividade da trombina
O ensaio do substrato cromogênico da trombina foi realizado em tubo de hemólise
com volume final de 1 mL de acordo com Gaspar et al., (1995). modificado,
utilizando trombina bovina a 8 NIH/mL em tampão TRIS-HCl 50 mM, pH 8,0. O
substrato
N-benzoyl-Phe-Val-Arg-γ-nitroamilidahydrochloride
foi
dissolvido
em
tampão e metanol em uma concentração de 3 mM. Para realização do ensaio 30 μL
de trombina 8 NIH/mL, 815 μL de tampão e 10 μL da SV1 (3,1, 6,2, 12,5, 25 e 50 μg)
foram incubados por 10 min a 37°C, e posteriormente foi adicionado 25 μL de
substrato cromogênico da trombina na concentração de 3 mM. Essa mistura foi
incubada por 20 min a 37°C. Após a incubação foi adicionado 120 μL de ácido
acético 30% para parar a reação. A absorbância foi medida a 405 nm. O branco da
amostra foi feito utilizando os mesmos reagentes, no entanto a adição do substrato
só foi realizada após a reação ter sido parada com o ácido acético a 30%. Para
avaliar a atividade total da enzima (100% de atividade enzimática), não foi
adicionada a amostra teste.
3.10.5.2. Ensaio de atividade do FXa
O ensaio do substrato cromogênico do FXa foi realizado em microplaca de 96
poços com volume final de 150 μL de acordo com Gaspar et al., (1995) modificado.
O FXa foi dissolvido em tampão PBS 150 mM pH 7,4, com concentração final de 0,2
U/mL.
O
substrato
cromogênico
N-benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide
foi
dissolvido em tampão PBS com concentração final de 1mM/mL. Para a ocorrência
da reação 75 μL de tampão PBS, 20 μL de FXa e 10 μL de SV1 (3,1, 6,2, 12,5, 25 e
50 μg) foram incubados por 10 min a 37°C. Posteriormente, foram adicionados 25 μL
de substrato cromogênico de FXa (1 mM/mL) e a mistura foi incubada por mais 30
min a 37°C. Após a incubação foi adicionado 25 μL de ácido acético a 30% para
finalizar a reação. A absorbância foi lida a 405 nm. O branco da amostra foi feito
utilizando os mesmos reagentes, no entanto o substrato somente foi adicionado
após a reação ter sido parada com o ácido acético a 30%. Para avaliar a atividade
total da enzima (100% de atividade enzimática), não foi adicionada a amostra teste.
3.10.6. Atividade Antitrombótica in vivo
A atividade antitrombótica foi determinada utilizando o método descrito por
Reyers et al., (1980). A amostra SV1 foi diluída em solução salina em doses
individuais para cada animal de 5 e 10µg/g. Nos animais do grupo controle positivo
foi administrado solução de heparina de baixo peso molecular a 1 µg/g, e o controle
negativo usou-se apenas salina. Os compostos foram administrados na veia caudal
em um volume total de 100 µL. Após 5 min., foi feita ligadura (fio Polycot) na veia
cava inferior, distalmente ao ponto da origem da veia renal esquerda. A cavidade
abdominal do animal foi então fechada com pontos simples (fio Monocryl). Após 1 h ,
a cavidade foi reaberta e nova ligadura foi feita 1 cm abaixo da primeira. O
fragmento da veia cava entre as duas ligaduras foi removido e colocado em uma
placa de Petri. O eventual trombo formado foi então retirado, lavado em solução
salina e colocado em papel de filtro previamente seco e pesado. O papel de filtro
contendo o trombo foi novamente secado à vácuo por 12 h e pesado. A diferença de
peso antes e depois de conter o trombo permitiu determinar o peso seco do trombo
formado.
3.10.7. Atividade Antiinflamatória
A ação anti-inflamatória das fucanas foi avaliada através do testes de edema
de pata induzido por carragenana. Ratos Wistar com 2 meses de idade foram
anestesiados, divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses
das amostras por via intraperitonial (25, 50 e 100 mg/kg de peso animal em 1 mL de
solução salina 0,9%). 30 minutos após o tratamento, o edema foi induzido por
apliacação de 0,1 mL de carragenana a 1% em solução salina na região subplantar
da pata dianteira esquerda dos animais. A variação da espessura da pata foi aferida
30 minutos antes e 1 a 4 horas depois da indução da inflamação com a utilização de
paquímetro digital (WINTER, RISLEY & NUSS, 1962). Por fim, os animais foram
eutanasiados. A inibição do edema foi expressa tendo como parâmetro o volume da
pata dos controles.
3.10.8. Atividade Antioxidante - Sequestro de radicais DPPH
A atividade seqüestradora de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi
determinada de acordo com o método de Ye et al., (2008) modificado. Assim, 0,1 mL
de concentrações variadas (0,08 – 5,0 mg/mL) das frações SV1 e PSV1 foram
adicionados em 1,5 mL de solução etanólica de DPPH (0,1 mM)8 Após 30 min em
temperatura ambiente, a absorbância foi mensurada a 517 nm. A atividade
seqüestradora de radicais DPPH foi determinada pela fórmula: atividade
seqüestradora (%)= (1- Aamostra/ Acontrole) x 100, onde Acontrole se refere a
absorbância da solução etanólica de DPPH na ausência da amostra, a qual foi
substituída por álcool etílico (absorbância do controle), e Aamostra se refere a
absorbância da solução etanólica de DPPH na presença da amostra teste
(absorbância da amostra).
3.10.9. Avaliação da ação citotóxica de SV1 e PSV1 sobre hemácias de grupos
sanguíneos ABO e Rh positivo e negativo (Hemólise direta)
O ensaio de atividade hemolítica direta foi realizado de acordo com
Belokoneva et al., (2003) com algumas modificações. O sangue foi coletado por
punção venosa e misturado ao anticoagulante EDTA. As hemácias foram lavadas
com tampão PBS (0,15 M, pH 7,4) e centrifugadas até que o sobrenadante
permanecesse transparente. Para o ensaio, foi utilizada uma suspensão de
hemácias a 10% v/v em tampão PBS, a qual foi incubada com diferentes massas
(25, 50 e 100 μg) de SV1 e PSV1 a temperatura ambiente por 1 e 6 h. Após a
incubação, as misturas foram centrifugadas a 800 x g por 5 min, e os sobrenadantes
lidos a 540 nm. Como controle positivo foi utilizado o Triton X-100 a 1% e como
controle negativo tendo o PBS substituido a amostra teste. O resultado foi expresso
em porcentagem de hemólise (%) = (A amostra – A PBS) / (A Triton X-100 a 1% - A
PBS), onde A amostra, A PBS e A Triton X-100 a 1% se referem às absorbâncias
das amostras testes, do controle negativo (PBS) e do controle positivo (Triton X-100
a 1%), respectivamente. As reações foram realizadas em triplicata usando sangue
de diferentes tipos sanguíneos (A, B, AB e O positivos) como também de diferentes
fatores Rh (A positivo e A negativo).
3.10. Análise estatística
As atividades farmacológicas testadas foram analisadas estatisticamente pela
Análise de variância (ANOVA) com nível de significância de p< 0,05 e pelo Teste de
Turkey-Kramer para determinar as diferenças entre os valores obtidos para os
grupos controle e experimentais (comparações múltiplas) com níveis de significância
de p<0,05.
4.0. RESULTADOS
4.1. Extração e purificação dos polissacarídeos sulfatados da alga marinha
Sargassum vulgare
Para a obtenção dos polissacarídeos sulfatados, a metodologia utilizada
combina digestão proteolítica, através de uma enzima de proteólise não específica
obtida de Sporobacillus, chamada maxatase, e precipitação com volumes crescentes
de acetona (DIETRICH et al., 1995). A variação gradual da proporção do solvente
diminui a constante diéletrica da água, promovendo a precipitação de diferentes
populações de polissacarídeos sulfatados a cada fração. Quatro diferentes
populações polissacarídicas foram obtidas (0,3; 0,5; 1,0 e 1,5v) a partir da
precipitação gradativa do cru de polissacarídeos obtido de Sargassum vulgare.
(Tabela 01). A fração eluída a 1,0v de acetona apresentou o melhor rendimento
(39%) e alto teor de açúcares totais, sendo a fração utilizada para os processos de
purificação (Figura 8).
Figura 8. Rendimento percentual das frações polissacarídicas extraídas de S. vulgare com
diferentes concentrações de acetona (0,3 0,5, 1,0 e 1,5v)
Observa-se
na figura
8
o
rendimento
das frações
resultantes
do
fracionamento em acetona. A fração de maior rendimento foi a fração precipitada
com acetona 1,0v denominada de SV1. Uma alíquota de 50 mg de SV1 foi eluída em
uma coluna de gel filtração Sepharose CL-4B. Desta forma, foi possível remover os
pigmentos presentes na amostra e também ter uma medida estimada de sua massa
molecular (Figura 9).
Na tabela 2 podemos observar que todas as frações possuem ácidos
glucurônicos principalmente, as frações 0,3 e 0,5v. As frações 1,0v e 1,5v
apresentaram um maior teor de sulfatos 14,2 e 17,3% respectivamente. Das quatro
frações analisadas a fração precipitada com 1,0 v de acetona (SV1) foi a que
apresentou um maior rendimento em massa e em valores de açúcares totais. Tais
dados foram similares aos obtidos por Alves em 2003, com essa mesma espécie de
alga.
Tabela 2. Percentual de monossacarídeos consituintes das frações de
polissacarídeos sulfatados de Sargassum vulgare.
Açúcares
Manose
Proteínas
Fração
Fucose
Totais
Galactose
Xilose
(%)
(%)
(%)
Ácido
Sulfato
Glucurônico(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
0.3v
16,6
0,7
2,0
1,3
3,4
n.d.
89,4
3,1
0.5v
27,8
1,5
4,0
3,5
14,8
5,3
62,8
10,4
1.0v
63,1
0,8
36,8
11,1
22,6
n.d.
53,1
15,6
17,3
12,4
17,1
8,1
(SV1)
1.5v
57,8
n.d (não detectado)
5,7
n.d.
3,1
A fração SV1 foi eluída em frações de 2 mL e monitorada pelas dosagens de
açúcares totais. As frações reunidas foram aquelas que apresentaram maior
dosagem de açúcares totais, sendo chamada de PSV1. A amostra apresentou um
peso molecular de 160 KDa e baixo teores de compostos fenólicos (0,9%) em
relação a SV1, parte desta fração purificada foi gentilmente cedida pela Profª. Drª.
Luciana Guimarães Alves Filgueira.
Figura 9: Perfil de eluição de SV1 em cromatografia de gel filtração Sepharose CL-4B. Cerca de
50mg de cada fucana foram submetidos a cronmatografia em coluna de gel filtração. As frações de
2mL foram coletada a partir de um coletor de fração acoplado a coluna e o acompanhamento do perfil
de eluição foi feito pela dosagem de açúcares totais.
A tabela 3 mostra a composição química geral da PSV1, mostrando que o
processo de purificação resultou numa perda da quantidade de proteína, açúcares
totais e sulfato em relação à fração SV1.
Tabela 3. Teores de açúcares totais, proteínas, compostos fenólicos e sulfato
da fucana purificada (PSV1) a partir da SV1
Açúcares
Proteínas (%)
Totais (%)
PSV1
Compostos
Sulfato (%)
Fenólicos (%)
50,2
n.d.
0,6
20,3
4.2. Perfil eletroforético das frações provenientes da acetona e de PSV1
O perfil eletroforético em gel de agarose, usando o sistema de tampão
1,3-diaminopropano e coloração com azul de toluidina, permitiu a observação de
quatro tipos de populações polissacarídicas diferentes. Entretanto, conforme é
caracterizado na literatura, as fucanas, de Sargassum vulgare, possuem perfil
polidisperso menor e metacromasia característica dos compostos sulfatados de
polissacarídeos de algas (Figura 10).
1
2
3
4
5
6
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose das frações de polissacarídeos sulfatados de S.
vulgare obtidas do fracionamento com acetona. Cerca de 50μg de cada fração forma submetidos
à eletroforese em gel de agarose 0,6% em tampão PDA 0,05M, pH 9,0. A revelação foi feita com azul
de toluidina 0,01%. Legenda: 1- Padrões de glicosaminoglicanos: CS- condroitim sulfato; DSdermatam sulfato; HS- heparam sulfato; 2- Fração eluída a 0,3v de acetona; 3- Fração eluída a 0,5v
de acetona; 4- Fração eluída a 1,0v de acetona (SV1); 5- Fração eluída a 1,5v de acetona.; 6- Fucana
purificada a partir de SV1 (PSV1).
4.3. Análises espectroscópicas
4.3.1. Espectroscopia de infravermelho de SV1 e PSV1
As amostras foram escaneadas em comprimentos de onda variando entre 500
e 4000 cm−1. Ambas amostras exibiram uma maior absorção de bandas na região
entre 3423 e 3028 cm−1, estando relacionadas a ligação O-H. Também foram
observadas picos 2143 e 1641 cm–1, correspondendo ao C-H do grupo metil da
fucose e grupo carboxil do ácido urônico, respectivamente. Absorções a
840 cm-1
estão relacionadas a uma região de particular importância, pois indicam a presença
do sulfato na posição axial do C4 da fucose (Figura 11 –linha vermelha), enquanto
que quando encontramos este grupamento na posição equatorial, observa-se um
pequeno pico na faixa 820 cm-l (DUARTE et al., 2001; OLSON et al., 1993). Uma
banda foi encontrada em todas as amostras, com picos na região de 1255 cm-1,
atribuída ao grupamento S=O e sugere a presença de ésteres de sulfato. Nos
espectros apresentados, esse sinal está largo e provavelmente se sobrepõem ao
sinal na faixa de 1044 cm-1, sendo esta marcação também relacionada ao sulfato.
Figura 11. Espectroscopia de infra vermelho
das frações SV1 (linha vermelha) e fração
purificada PSV1 (linha azul) de polissacarídeos sulfatados de S. vulgare.
4.3.2. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) da fucana purificada PSV1
A espectroscopia de RMN é um método bastante utilizado para a obtenção
da estrutura geral de polissacarídeos. As análises de RMN foram usadas para
determinar as características de PSV1. Estudos com esses polissacarídeos indicam
uma estrutura bastante complexa. O espectro de RMN de 1H de PSV1 possui sinais
na região anomérica a 5.0–5.5 ppm. O sinal a 4.61 ppm (Figura 12A) foi atribuído ao
resíduo 3-D-galactopiranosil, conforme citado Ale et al. Esta complexidade dos
polissacarídeos se reflete na qualidade do espectro.
O espectro de
13
C de PSV1 exibe uma considerável complexidade, mostrando
três sinais na região α-anomérica. Sinais entre 105 e 74 ppm corresponde aos
carbonos anomérico pertencente a um monossacarídeo que contenha uma
substituição de sulfato ou de outro monossacarídeo,em uma posição diferente do
C1. Enquanto que o grupo com sinais a 71-66 ppm estariam relacionados aos
carbonos sem substituição. No espectro de
13
C, sinais foram assinalados a 103.1 e
61.3 para galactoses e 100.8 para xilose (Figura 12).
Figura 12. Análise dos polissacarídeos sulfatados (SV1 e PSV1) da alga marinha S. vulgare. A
Fração SV1 foi analisada por espectroscopia de rmn de H1 e fração PSV1 por rmn de C13.
4.4. Atividades Biológicas
4.4.1. Atividade Antiangiogênica
4.4.1.1. Teste da Membrana Corioalantóica (CAM)
As frações SV1 e PSV1 foram testadas no ensaio de CAM para avaliar seu
potencial antiangiogênico. Um sistema de escore foi estabelecido de acordo com
metodologia empregada por Burgermeister, et al, 2002. O escore 0 representa o
crescimento normal de capilares e o escore 2 indica um forte efeito antiangiogênico
com uma grande área livre de capilares (Tabela 1) . SV1 e PSV1 foram
administrados em veículos de discos de agarose nas massas de 100 e 1000μg/
disco, e a heparina de baixo peso molecular usada como padrão. Nas
concentrações testadas, SV1 e PSV1 apresentaram forte ação antiangiogênica,
sendo atribuído escores 0.5 para heparina, 1.0 para SV1 100 e SV1 1000 e PSV1
100, e foi observado aumento no potencial antiangiogênico nos ovos tratados com
PSV1 1000, sendo atribuído a este escore 2,0 (Figura 13).
Figura 13: Ensaio CAM para verificação do potencial antiangiogênico de SV1 e PSV1. A: Branco
(agarose); B- Heparina; C- SV1 100; D- SV1 1000; E: PSV1 100; F: PSV1 1000.
4.4.8.2. Tubulogênese em células da linhagem RAEC
A figura 14 mostra que SV1 e PSV1 inibem a formação de tubos capilares.
Observa-se que não há diferença entre as concentrações testadas de SV1, sendo o
efeito das mesmas, semelhante ao apresentado pela heparina. Nas placas tratadas
com PSV1, observa-se um efeito dose- dependente, há uma maior eficiência na
inibição do contato entre as células quando estas são incubadas com concentrações
mais altas do composto.
Figura 14: Efeitos de SV1 e PSV1 na formação de tubos capilares de células endoteliais da
5
aorte de coelho (RAEC). RAECs (1×10 por poço) em meio contendo 10% de soro, foram semeadas
em placas com matrigel e tratadas com diferentes concentrações SV1 e PSV1 (A: Controle; B:
Heparina; C: SV1 25; D: SV1 50; E: SV1 100; F: PSV1 25; G: PSV1 50; H: PSV1 100. Fotomicrografia
de contraste de fase (X100).
4.4.1.3. Dosagem de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF)
secretado por células da linhagem RAEC
PSV1 e SV1 inibiram significativamente a secreção de VEGF no meio de
cultura das células RAEC incubadas com as amostras nas concentrações de 25, 50
e 100μg. Não há diferença estatística significante entre as amostras. Entretanto,
fazendo a comparação entre as concentrações da mesma amostra foi visto que
houve diferença significativa nas concentrações PSV1 25 (60,4%) e PSV1 50
(71,4%) (P˂0,001), PSV1 25 (60,4%) e PSV1 100 (69,3%) (P˂0,01), SV1 25 (66,9%)
e SV1 100 (75,9%) (P˂0.01) e entre SV1 50 (68,3%) e SV1 100 (P˂0,01). A inibição
da secreção de VEGF foi mais efetiva por PSV1 50 sendo da ordem de 71,4% e por
SV1 100 de 75,9% (Figura 15).
Figura 15. Inibição da secreção de VEGF. Valores expressos por média ± D.P. (n=3). Análise
estatística em comparação de PSV1 e SV1: (***): P˂0,001; (*):P˂0,05.
4.4.2. Ação de SV1 e PSV1 na viabilidade de diferentes linhagens celulares in
vitro
Considerando o efeito contra células de origem tumoral, compostos que
apresentam atividade citotóxica têm interessantes efeitos na quimioterapia somente
quando sua toxicidade é alta para células tumorais do que para as células não
tumorais. Então a ação dos polissacarídeos sulfatados de S. vulgare foi testada
sobre a viabilidade de células tumorais e não tumorais. A viabilidade celular foi
verificada em diferentes linhagens através do teste do MTT, que avalia a função
mitocondrial de células viáveis através da conversão deste sal no seu derivado, o
formazan.
A RAEC é uma linhagem de células endoteliais normais, provenientes da
aorta de coelho; A linhagem RAW 264.7 são macrófagos murinos; as linhagem HeLa
e B16- F10 são células tumorais, a primeira é originada da cérvix humana e a outra
é um melanoma de rato. O efeito das amostras analisadas frente às células
demonstrou que ambas possuem mesma ação antiproliferativa em células tumorais
(p˃ 0, 05) não apresentando diferença estatisticamente significante. Entretanto,
PSV1 e SV1 foram mais efetivas como inibidoras da proliferação em células HeLa.
Observou-se que PSV1 na concentração de 50 μg inibiu cerca de 47% da
proliferação dessas células. Desta forma, ocorreu uma ação antitumoral direta frente
às células HeLa. As amostras SV1 e PSV1 quando testadas com células endoteliais
normais, não apresentaram inibição da proliferação celular. Entretanto, SV1 na
concentração de 100 µg apresenta uma pequena inibição da proliferação, na ordem
de 20%. SV1 exibiu ação proliferativa sobre as células RAW 264.7. Quando esta
linhagem foi tratada com quantidades diferentes (25, 50, e 100 μg) de SV1 para 24,
48 e 72 h, a proliferação das células foi observada 127,67 ± 3,08%, quando as
células foram incubadas com 25 ug de SV1, durante 72 h. Não houve diferença
estatisticamente significativa com relação ao controle, quando essas células foram
tratadas com diferentes concentrações de PSV1 (p> 0,05) (Figura 16).
Figura 16. Efeito de SV1 e PSV1 isolados de S. vulgare na proliferação de células das linhas
RAEC, HeLa, B16 e Raw 264.7. Células tratadas com 25, 50 e 100 μg de SV1 ou PSV1 por 24 horas.
Nível de significância em relação ao controle: (***) p<0,001. Valores são médias ± desvio padrão
(n=3).
4.4.3. Avaliação da ação de SV1 e PSV1 na apoptose e ciclo celular de RAEC
Análises por citometria de fluxo demonstraram que células RAEC tratadas
com PSV1 possuem um perfil semelhante às não tratadas (Figuras 18 e 19). Não
existe diferença estatística significante entre as células não tratadas e aquelas
tratadas com PSV1, entretanto, isso não é visto nas células tratadas com SV1. De
acordo com a marcação das células, as viáveis são anexina V (-) PI (-), as células
em apoptose recente foram anexina V (+) PI (-), as células em apoptose tardia foram
anexina V (+) PI (+), e as células necróticas anexina V (-) PI (+). Desta forma, PSV1
não tem ação apoptótica e não ocasionou necrose. Entretanto, SV1 não possui este
comportamento, causando apoptose precoce e tardia nas células tratadas.
Análises do ciclo celular por citometria de fluxo mostrou que células RAEC
tratadas com PSV1 e SV1 por 24 h apresentaram uma proporção modificada entre
as fases do ciclo celular, com relação às células não tratadas (Figura 17). Assim,
PSV1 e SV1 promoveram um aumento no número de células na fase S do ciclo
celular, bloqueando a progressão para a fase G2. Indicando que os compostos são
citostáticos.
Fase do
Células não
Células tratadas
Células tratadas
Ciclo
tratadas (%)
com PSV1 (%)
com SV1 (%)
G1
83,79 ± 0,00
65,6± 2,77
64,83± 2,55
G2
7,81 ± 0,00
6,33 ± 1,01
6,27 ± 1.47
S
8,41 ± 0.00
28,26 ± 2,04
28,89 ± 1,08
G2/G1
2,00 ± 0,00
2,00 ± 0,00
2,00 ± 0,00
celular
Figura 17. Análise da distribuição de células endoteliais da aorta de coelho (RAEC) no ciclo
celular. Celúlas endoteliais não tratadas (A) Tratadas com PSV1 (B) e tratadas com SV1 (C) por 24
h.Valores são expressos em média ± D.P. (n=2).
Figura 18. Análise da Citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V e PI em células
endoteliais da aorta de coelho (RAEC). Histograma: A e B: Controle Negativo (sem tratamento); C
e D: Células tratadas com PSV1; E e F: Células tratadas SV1.
Quadrante superior esquerdo:
marcação negative para anexina V e positive PI (Células não viáveis- células necrótica); Quadrante
superior direito: marcação positive para anexina e PI (Células não viáveis- células em apoptose
tardia); Quadrante inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V e PI (células viáveis);
Quadrante inferior direito: marcação positiva para anexina V e negativa para PI (célula não viáveiscélulas em apoptose recente).
Figure 19. Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V e PI em células
endoteliais da aorta de coelho. Células Viáveis: marcação negative para anexina V e PI; Células
não viáveis: marcação positiva para anexina V e negative para PI (Células em apoptose recente);
Marcação positiva para anexina V e negativa para PI (Células necróticas); Marcação positiva para
anexina V e PI: Células em apoptose tardia. Nível de significância em relação ao controle (Células
não tratadas): ( ) P>0.05; (a) P˂0.001 Teste T Student’s . Valores expressos em média± D.P. (n=2).
4.4.4. Atividade Antiinflamatoria
4.4.4.1. Avaliação da açãode SV1 e PSV1 em modelo de edema de
pata induzido por carragenana
O papel de SV1 e PSV1 na inflamação aguda induzidas por carragenana foi
verificadas nas concentrações de 10, 30 e 50 mg/kg. O edema foi reduzido em todas
as concentrações testadas em ambas as frações. Com diferença significante com
relação ao controle (p<0,001) não havendo diferença estatísticamente significante
com relação à solução salina (controle negativo) e entre as concentrações nos
diferentes grupos (Figura 20).
Figura 20: Ação antiinflamatória de SV1 e PSV1 em um modelo de edema de pata induzido por
carragenana. Carragenana (Controle Positivo), Salina (Controle negativo), fração SV1 (10, 30 and 50
mg/kg) e fração PSV1 (10, 30 and 50 mg/kg). Nível de significância relacionado ao controle
negativo(*) p < 0,05. Valores expressos em média± D.P. (n = 6).
4.4.4.2. Análises Histológicas
As análises histológicas da região plantar dos animais demonstraram que
aqueles que receberam apenas solução salina (controle negativo) e coradas com HE
mostraram ausência de reação inflamatória (Figura 18- A). As lâminas dos animais
que foram administrados apenas carragenana (controle positivo) apresentaram
intenso infiltrado celular, característico de reação inflamatória (Figura 21- B).
Na figura 21 observam-se os efeitos SV1 e PSV1 nos grupos dos animais
tratados em concentrações de 10, 30 e 50 ,mg/kg, respectivamente. Pode-se notar
que as diferenças histológicas são visíveis, principalmente, quanto ao grau de
infiltrado celular do tecido analisado, sendo estas diferenças facilmente constatadas.
Pode-se perceber ainda, que a estrutura geral do tecido e o recrutamento de células
para o local da inflamação sofreram uma diminuição nas três concentrações dos
tratamentos testadas.
A
C
B
D
E
G
F
H
Figure 21. Análises histológicas do edema de pata induzido por carragenana e tratada com
diferentes concentrações de SV1 e PSV1. HE (X10) A) Controle Positivo (Carragenana);
B)
Controle Negativo (salina); C) Animais tratados com SV1 a 10mg/kg; D) Animais tratdos com SV1 a
30 mg/Kg; E) Animais tratados com SV1 a 50 mg/kg; F) Animais tratados com PSV1 a 10 mg/kg; G)
Animais tratados com PSV1 a 30 mg/Kg; H) Animais tratados com PSV1 a 50 mg/kg.
4.4.5. Atividade Anticoagulante
Os testes de PT e aPTT foram usados para distinguir os efeitos dos
polissacarídeos na via extrínseca e intrínseca da coagulação, respectivamente. A
atividade anticoagulante foi avaliada em diferentes concentrações das amostras.
Observou-se que SV1 aumentou drasticamente o tempo de coagulação relacionado
ao controle no teste de aPTT, sendo avaliada a ação deste composto sobre a via
intrínseca e comum da coagulação sanguínea (p<0,001). Os resultados mostram
que SV1 promoveu um aumento máximo no tempo de coagulação no teste de aPTT,
quando utilizados 50 e 100 µg. As análises realizadas também demonstraram que
SV1 não alterou o tempo de coagulação no teste de PT. A fração PSV1 não
apresentou efeito anticoagulante em nenhuma das concentrações testadas nos dois
testes.
Figura 22: Ação anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de SV1. Tempo de Tromboplastina
parcial ativada (aPTT) e Tempo de Protrombina (PT) do pool de plasmas tratados com diferentes
concentrações de SV1 (0; 6,7; 12,5; 25, 50 e 100 μg) Nível de significância relacionados ao controle
negativo p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Valores são expressos como média ± D.P. (n=3).
4.4.6. Ensaio de atividade de fatores da coagulação
4.4.6.1. Ensaio do substrato cromogênico da trombina
Considerando que apenas SV1 possui ação anticoagulante, apenas essa
fração foi utilizada para avaliar seus efeitos sobre a inibição direta de fatores da
coagulação. Utilizando-se o ensaio do substrato cromogênico da trombina, pode-se
observar que a SV1 quando utilizada as concentrações de 3,1; 6,2; 12,5; 25 e 50 μg/
10μL. SV1 mostrou atividade inibitória ótima para a trombina a 12,5 μg/ 10μL
(55,3±1.13%) e 25
μg/ 10μL (54,2±2,18%). Não há diferença estatisticamente
significante entre as concentrações 12,5 e 25 μg/ 10 μL (p < 0,05).
Figura 23: Ensaio do substrato cromogênico da trombina. Atividade inibitória da SV1 sobre a
atividade enzimática da trombina. Valores foram expressos por médias ± desvio padrão (n=3). Nível
de significância em relação ao controle (100% de atividade enzimática).
4.4.6.2. Ensaio do substrato cromogênico do Fator Xa
Utilizando o ensaio do substrato cromogênico do FXa, podemos observar que
SV1 quando utilizada as concentrações 3,1, 6,2, 12,5, 25 e 50 μg/ 10 μL mostrou
ação estimulatória de 19,2%, 30%, 31,7% e 38,9% sobre a atividade enzimática do
FXa (Figura 24), respectivamente nas quatro primeiras concentrações testadas, com
diferença estatisticamente significante quando comparada ao controle negativo
(p<0,01). O comportamento na concentração de 50 μg/ 10μL foi diferente, não houve
estimulação da atividade do FXa, não havendo diferença estatisticamente
significante com relação ao controle negativo (p>0,05).
Figura 24: Ensaio do substrato cromogênico do Fator Xa. Atividade estimulatória da SV1 sobre a
atividade enzimática do Fator Xa. Valores foram expressos por médias ± desvio padrão (n=3). Nível
de significância em relação ao controle (100% de atividade enzimática).
4.4.7. Avaliação da ação de SV1 na Atividade Antitrombótica in vivo
Considerando a forte ação anticoagulante e a inibição direta da trombina
gerada pela ação de SV1, foram realizados ensaios de atividade antitrombótica in
vivo em duas diferentes concentrações, utilizando-se como padrão de referência a
heparina,
fármaco
mais
utilizado
para
o
tratamento
de
distúrbios
da
coagulação/trombose. Os resultados mostram que SV1 possui efeito antitrombótico
similar ao da heparina, quando utilizado em concentrações dez vezes maior (10μg/ g
de peso corporal), (Figura 25) exibindo diferença estatisticamente significante com
relação ao controle (p < 0,001). Entretanto, quando os animais foram tratados na
dose de 5 μg/ g de peso corporal, esta atividade sofreu drástica diminuição,
comparando ao controle (p < 0,01).
Figura 25: Atividade Antitrombótica dos polissacarídeos sulfatados de SV1. Nível de
significância com relação ao controle negative (**) p < 0,01 e (***) p < 0,001. Nível de Significância
entre heparina e SV1 10 (#)p > 0,05. Valores são expressos em media ± D.P. (n = 3).
4.4.8. Atividade Antioxidante
O DPPH é um radical livre estável, utilizado frequentemente para estimar a
capacidade de varredura de radicais livres de substâncias antioxidantes (JIMENEZESCRIG
et al., 2001).
Foi avaliada a ação de SV1 e PSV1 em diferentes
concentrações (0.15, 0.3, 0.6, 1,2 e 2,5 mg/mL). Conforme mostrado na tabela 03,
SV1 possui atividade varredora de radicais na ordem de 22,2% a 2,5 mg/mL. A
capacidade antioxidante de PSV1 foi menor, tendo sua atividade máxima em torno
de 13,9% na concentração de 3,0 mg/mL.
Tabela 04: Percentual de varredura de Radicais DPPH pelos polissacarídeos de
SV1 e PSV1
Massa de
Varredura de radicais DPPH
Varredura de radicais
polissacarídeo
por SV1 (%)
DPPH por PSV1 (%)
0,15
10,0±0.7
4,5 ±0,07
0,3
11,2±0.4
4,8 ±0,76
0.6
11,9±0.2
7,9 ±0,72
1,2
12,3±1.8
8,1 ± 1,0
2.5
22,2±0.4
10.3 ±0,07
3,0
22,0±0.6
13,9 ± 2,7
(µg)
4.4.9. Avaliação da Ação citotóxica de SV1 sobre hemácias do grupo ABO e
diferentes Rh
De acordo com a metodologia aplicada, foi demonstrado que SV1 não possui
ação citotóxica em eritrócitos, mostrada pela ausência de hemólise significativa nas
concentrações testadas (25, 50 e 100 μg). Não foi detectada hemólise significativa
nas hemácias de diferentes grupos sanguíneos ABO (A+, B+, AB+ e O+) e Rh (A+ e
A-). Avaliando primeiramente a ação de SV1 nos nas hemácias de grupo Rh
diferente, foi demonstrado maior ação citotóxica com 7,5 ± 0,7% de hemólise sobre
hemácias A+ tratadas com 100 μg de SV1 por 1 h. O menor percentual de hemólise
(3,8 ± 0,1%) provocado pela SV1 foi visualizado quando as hemácias A+ foram
incubadas com 25 μg da fração por 1 h (Figura 26). Não foram encontradas
diferenças estatisticamente significantes (p>0,05) entre as hemácias dos grupos Rh
positivo e negativo entre todas as massas testadas da SV1 (25, 50 e 100 μg),
quando foi avaliado o mesmo tempo de incubação (1 ou 6 h). Isto demonstra que
não existe influência do fator Rh na ação que a SV1 exerce sobre as hemácias.
Também, não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre as
hemácias dos grupos B+, AB+ e O+ (p>0,05). Porém, a SV1 promove hemólise
estatisticamente diferente (p<0,01) sobre hemácias do grupo A+ quando comparada
com o percentual de hemólise provocado pela fração em estudo sobre as hemácias
dos outros grupos ABO testados (B+, AB+ e O+). Assim, SV1 não provocou danos
significativos nas membranas de hemácias dos grupos sanguíneos ABO e Rh como
pode ser visualizado na Figura 26.
Figura 26: Ação citotóxica de SV1 nos eritrócitos de diferentes tipos ABO e Rh (A) Hemólise
direta nos eritrócitos A positivo e A negativo. Eritrócitos foram incubados por 1h a 6h usando
diferentes concentrações de SV1. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos
Rh testados (p > 0,05). Nível de significância entre A+ e A− na primeira hora (**) p < 0,01. (B)
Hemólise direta nos grupos de eritrócitos A, B, AB e O positivo. Eritrócitos foram incubados por 1h
com 50 μg de SV1.Não houve diferença estatística significante entre os grupos B, AB e O(p > 0,05),
diferença significante entre o grupo A e os demais grupos (***)p < 0,01. Valores expressos pela
média ± D.P.
5.0. DISCUSSÃO
No presente estudo foram extraídas quatro frações polissacarídicas da alga
marinha marrom Sargassum vulgare. Após a determinação da composição
monossacarídica verificou-se a presença de fucose em todas as frações, isto aliado
ao fato de se ter encontrado sulfato em todas as frações e outros tipos de
monossacarídeos, que se apresentam em proporções diferentes em cada fração,
leva a preposição de que a alga em estudo sintetiza mais de um tipo de
heterofucana e que elas se encontram distribuídas nas frações obtidas. Uma
varredura na literatura com relação à estrutura de fucanas de algas demonstra que
algas sintetizando mais de um tipo de fucanas não é uma exceção e sim uma regra.
Os dados das pesquisas feitas pelo grupo em que está inserido esta tese, também
não fogem a esta regra, todas as algas estudadas até o momento sintetizam mais de
um tipo de fucana, como Lobophora variegata, Dictyota mertensis (Farias 1992),
Dictyota menstrualis (Albuquerque et al., 2004), Padina gymnospora, (Silva et al.,
2005), Canistrocarpus cervicornis (Câmara et al., 2011), Sargassum filipendula
(Costa et al., 2011), Spatoglossum schroederi (Leite et al., 1998, Rocha et al., 2005).
Semelhante a essas fucanas a SV1 também é uma heterofucana composta
por xilose, fucose, manose, galactose e ácido glucurônico. Devido a sua
contaminação por proteínas, ela foi submetida a outro passo de purificação. . Pois, a
variabilidade do teor protéico nas fucanas estaria relacionado com o método de
extração e com a espécie de alga analisada. Hussein e col. (1980) encontraram em
fucanas de Padina povonia um elevado teor de proteínas (67%) enquanto que
Detrich e col. (1995) obtiveram para Padina gymnospora valores compreendidos
entre 1,6-7,5%. Já as fucanas de Fucus vesiculosus apresentaram índices de
contaminação protéica variando entre 0,16% - 0,24%, (Carvalho, 2001). Outras
fucanas que foram extraída de S. schröederi apresentaram contaminação inferior a
5,8% (Leite et al., 1998). Vale salientar, que nestes dois últimos casos as fucanas
foram obtidas por metodologias semelhantes as utilizadas neste trabalho.
Geralmente, as fucanas extraídas de algas encontram-se contaminadas com
proteínas, entre tanto, a fucana PSV1 não apresentou contaminação que pode ser
atribuído a metodologia de purificação utilizada.
Devido a grande diversidade estrutural das fucanas, representantes dessa família
têm sido descritos com as mais variadas massas moleculares. Massas de 500
kDa foram observadas para fucanas extraídas da alga Lessonia nigrescens
(Percival et al., 1984). Já da alga Sargassum horneri, Preeprame et al., (2001)
obtiveram uma fucana de 270 kDa. Por outro lado Nishino et al., (1994)
descreveram uma heterofucana com uma massa molecular de 6.8 kDa. Já
fucanas de S. schröederi apresentaram massas moleculares em torno de 21 kDa
(Leite et al., 1998; Rocha et al., 2005). Por tanto, não há um consenso com
relação a definição do que seriam fucanas de alta e baixa massa molecular, o que
revela a contradição devido a grande variação de massas moleculares
apresentadas.. Um exemplo disso, é a descrição de uma fucana de baixa massa
molecular de 56 kDa (Nagaoka et al., 1999). Dentro desse contexto, a fucana
PSV1 é considerada de alta massa molecular. Discrepâncias como essas deixam
evidente a necessidade de uma melhor definição do que seriam fucanas de alta,
média ou baixa massas moleculares.
A composição monossacarídica realizada por HPLC de PSV1 mostrou que
esta é composta por resíduos de fucose, galactose, xilose e manose, esses dados
corroboram com os obtidos anteriormente por Alves, 2003, que analisou as fucanas
presentes em difentes porções (folíolo, flutuador e talo) da alga S. vulgare. Análise
dos monossacarídeos presentes numa fração polissacarídica de Sargassum
stenophyllum mostrou que esta era composta por resíduos de α- L- fucose, β-Dgalactose, β- D- manose e β- D- xilose (DIAS et al., 2008). As algas do gênero
Sargassum se encontram na ordem fucales, onde é muito comum encontrar algas
que sintetizam homofucanas como Fucus vesiculosus (NISHINO, et al, 1994) e
Ascophylum nodosum (JIANG, et al, 2011). Contudo, não há na literatura descrição
de homofucanas sintetizadas por algas do gênero Sargassum, há apenas descrição
de heterofucanas. Esta característica faz com que alguns autores passem a chamar
as fucanas de Sargassum de sargassanas, estas são ricas em ácido glucuronico,
xilose, manose e galactose, além de fucose (Kloareg e Quatrano, 1988).
Composição semelhante foi observada nas heteofucanas de S. vulgare, o que indica
que esta alga, assim como as demais sargassales, também sintetiza sargassanas.
As fucanas possuem estruturas muito complexas devido às muitas
possibilidades de combinações de diferentes açúcares e posições de sulfatação,
o que aliado ao fato da presença de altas massas moleculares criam dificuldades
para sejam determinadas todas as características estruturais desses
polissacarídeos e faz com que mesmo técnicas modernas de estudos estruturais,
como RMN de alto campo, fiquem no limite de suas capacidades, sem que com
isso promovam uma resolução da estrutura de fucanas (Chevolot et al., 2001;
Bilan et al., 2002). As fucanas de sargassum são complexas, como mostrado por
Duarte e col. (2001). Estes autores demonstraram que a heterofucana da alga
Sargassum stenophyllum era formada por uma estrutura central de -1-galactose6 e pequenas quantidades de (12), (13) e (14) -galactoses e -1-manose2. Podendo ocorrer sulfatação em C3 de -1-galactose-6, em C2 de -1-galactose4 e em de C4 das -1-galactose-2. As cadeias laterais eram formadas por -1fucose-2SO4-4 e/ou -1-fucose-4SO4-3, -1-ácido glucurônico-4, tendo -xilose e
as vezes -glicose com açúcar na posição terminal não redutor. As -1-galactose6 poderiam estar dissubistituídas por cadeias laterais em C2 e C3 ou C2 e C4 e as
-1-manose-2 substituídas em C4. Portanto, não foi surpreendente o fato de que
os espectros de RMN de PSV1 serem bastante complexos, com várias
sobreposições de picos. Contudo, como visto em resultados, alguns sinais
caracteristicos de heterofucanas foram detectados, e que indicaram a presença
de galactoses, fucose, xilose e ácido glucurônico em PSV1.
A espectroscopia de infravermelho foi realizada com SV1 e PSV1, de maneira
comparativa os picos apresentados em ambas
frações estão em regiões
semelhantes, entretanto as marcações são mais intensas na fração purificada.
Nestes espectros, destaca-se o sinal para o grupo sulfato substituído ao C-4 da
fucose. Os espectros mostram sinais semelhantes aos encontrados em outros
estudos, como os encontrados por Duarte et al, 2001. Uma fração polissacarídica
de Sargassum hemiphyllum apresentou um alto teores de carboidratos 86,4% e
baixos teores de proteínas. Os resultados experimentais mostraram que essa fração
consistia, principalmente, de xilose e glucose com pequenas quantidades de
galactose, arabinose, ramnose e frutose (Ou, et al, 2006). Foi realizada uma
varredura nas atividades farmacológicas de SV1 e PSV1.
seus
efeitos
anticoagulantes,
antitrombóticos,
Foram considerados
citotóxicos
sobre
hemácias,
antioxidantes, antiinflamatórios, sobre a viabilide de células normais e tumorais e
seu papel frente ao processo angiogênico.
A angiogênese no tumor tem sido uma área intensamente investigada ao
longo da última década, pois é um componente essencial no crescimento e
propagação do câncer, sendo um importante alvo para investigações para seu uso
na terapia (FOLKMAN, 1990). Avanços nessa área estão relacionados à descoberta
de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) que regulamenta especificamente a proliferação de células endoteliais
(FERRARA, 2000). É importante considerar que a vasculatura tumoral não é uma
simples linha de fornecimento de nutrientes para tumores, ele governa a
fisiopatologia do tumor, e assim, o crescimento, metástase e resposta a várias
terapias (FUKUMURA & JAIN, 2007). Nesse contexto, PSV1 e SV1 se destacam por
serem compostos que atuam diretamente sobre a inibição da angiogênese in vivo e
in vitro.
O ensaio da CAM em embriões de galinha,
é talvez o mais largamente
utilizado no modelo in vivo para o estudo do desenvolvimento de vasos. Com
relação aos ensaios in vitro a avaliação da interferência de compostos sobre o
processo de tubulogênese de células endoteliais cultivadas sobre matrigel é
amplamente reconhecido e aplicado para avaliar o papel antiangiogênico (Dias et al.,
2008; Yancopoulos et al., 2000).
Nesse contexto, o presente trabalho demonstra que SV1 e PSV1, possuem
ação inibitória sobre a angiogênese, testadas in vivo em embriões de galinha e in
vitro sobre a tubulogenêse de células endoteliais de aorta de coelho. O ensaio de
tubulogênese em células RAEC demonstrou que as frações estudadas SV1 e PSV1
apresentam ação inibitória sobre esse processo de forma semelhante a heparina de
baixo peso molecular. Corroborando com esses resultados no modelo in vivo foi
possível observar que a fração PSV1 possui um maior potencial antiangiogênico
quando comparado com a SV1, uma vez que promoveu uma maior inibição na
formação de capilares na membrana corioalantóica de embriões de galinha.
O estudo de Khorana et al., 2003 demonstra que a heparina de acordo com
seu peso molecular apresenta ação diferente sobre a formação do tubo pelo método
in vitro do matrigel em células em cultura, no qual a heparina não fracionada não
exibiu efeito significativo na formação do tubo, entretanto na presença de heparina
de baixo peso molecular só foi observada mínima tubulogênese. Os dados mostram
que ação antiangiogênica de SV1 e PSV1 não é dependente de massa molecular,
pois SV1 é composta tanto por moléculas de alta massa quanto de baixa massa
molecular, e apresentou potencial semelhante a PSV1na tubulogênese.
Dias e col., 2008, isoloram uma fucana da alga S. stenophyllum denominada
Sarg. Este polímero inibiu o desenvolvimento das redes capilares em ensaio de
CAM. A inibição conferida pela dose mais elevada de Sarg (1500 g /disco) foi
aproximadamente o dobro que o alcançado por hidrocortisona (156 g/ disco). Os
autores propõem que o mecanismo de ação desse composto é semelhante ao da
heparina, ou seja, o Sarg compete com proteoglicanos pela associação ao bFGF.
Uma vez que o bFGF se associa ao Sarg ele tem sua ação angiogênica bloqueada.
Testes dessa natureza não forma possíveis de serem realizados, por tanto não se
pode destacar a probabilidade de SV1 e PSV1 possam atuar por esse mesmo
mecanismo de ação também. Entretanto, as fucanas testadas nesse estuda
apresentaram ação antiângiogenica com uma massa 15 vezes menor que a testada
por Dias e colaboradores. O que leva a pensar num mecanismo de ação diferente do
proposto por esses autores.
Recentemente, Liu et al., 2012 mostraram que fucanas extraídas de Undaria
pinnatifida teve sua ação antiangiogênica relacionada a inibição da proliferação de
células endoteliais humnas. Desta forma, investigou-se a ação direta de SV1 e PSV1
em relação à linhagem de células RAEC, onde apenas a fração SV1 promoveu
inibição da proliferação, causando apoptose precoce e tardia.
Como PSV1 não apresentou atividade antiproliferativa, o seu mecanismo de
ação pode estar relacionado com outros fatores. Vários autores têm relatado que
agentes antiangiogênicos desempenham sua atividade por interferir na ação de
várias proteínas da família do VEGF (QI-ZHEN, ZHI-BIN, 2006). Desta forma, foi
analisado a ação das fucanas estudadas na secreção de VEGF por células RAEC.
Observou-se que as células RAEC incubadas com PSV1 e SV1 apresentaram
secreção de VEGF inibida. Desta forma propõem-se que o mecanismo de ação
antianagiogênico de PSV1 está relacionado com sua capacidade de inibir a
secreção de VEGF. Já com relação a SV1,o seu efeito sobre a secreção de VEGF
deve ser observada com ressalvas, pois apesar da inibição de VEGF por SV1,
acredita-se que esta também está relacionada com a capacidade desse polímero de
causar morte celular nas RAECs, o que por si só causaria diminuição da secreção
de VEGF.
Nierodzic & Karpalin, 2006, constataram que fatores da cascata de
coagulação estão diretamente relacionados à angiogênese, TF/FVIIa e trombina
induzem a angiogênese durante a progressão do câncer. Em contraste FXa não
promove a tubulogênese in vitro. Neste contexto é importante destacar que SV1
inibiu diretamente a atividade da trombina, e estimula a ação de FXa. Desta forma,
pode-se inferir que SV1 tem também sua ação antiângiogênica relacionada à ação
direta sobre fatores de coagulação. Os dados mostraram que SV1 apresenta três
mecanismos de ação antiangiogênicos: por inibição de fatores de coagulação,
inibição de proliferação celular e inibição da secreção de VEGF. Entretanto, eles não
foram capazes de torna-la mais potente que PSV1 que apresenta apenas
capacidade de inibir a secreção de VEGF. A hipótese proposta para justificar tais
dados é que SV1 é uma mistura de várias fucanas (Ver Figura 9), que seriam
responsáveis por estes diferentes mecanismos de ação, e que não estariam atuando
de forma sinérgica.
Na investigação do potencial anticoagulante, SV1 e PSV1 foram testados
quanto a sua ação nas vias extrínseca e intrínseca da coagulação sanguínea.
Apenas SV1 apresentou atividade anticoagulante, entretanto esta se restringe a via
intrínseca da coagulação, analisada pelo teste de aPTT. Poucos compostos
anticoagulantes possuem ação sobre a via extrínseca da coagulação. Costa et al.,
2010, analisando a ação de polissacarídeos extraídos de 11 espécies de algas sobre
a coagulação, encontram em apenas uma espécie polissacarídeos com ação sobre
a via extrínseca da coagulação. A literatura relata que peso molecular, ramificações,
densidade de cargas e estrutura tridimensional de polissacarídeos sulfatados
influencia nas suas interações com as proteínas da coagulação sanguínea (OLSON,
BJORK, & BOCK, 2002). Analisando-se o perfil de eluição de SV1, constatou-se que
este apresenta populações de alta e baixa massa molecular, entretanto, essas
últimas estão ausentes em PSV1, o que leva a proposição que são essas
populações de baixa massa molecular que dão atividade anticoagulante a SV1.
Outro fator importante para atividade anticoagulante de SV1 foi identificado no
espectro de IV, onde se observou a presença de sulfatação na posição 4 de
monossacarídeos dessa fração, o que não foi observado em PSV1.
Um bom anti-hemostático seria aquele que viesse a interferir em um ou mais
dos elementos que detêm o extravasamento de sangue após lesão no vaso:
vasoconstricção, agregação plaquetária e a coagulação sanguínea.
Diversas espécies de algas marrons cujas fucanas foram extraídas por vários
métodos por Grauffel et al., (1989) demonstraram que estes polímeros impediam a
ação de trombina sobre o fibrinogênio mais eficazmente do que a heparina. Essa
atividade é dependente da antitrombina (AT) e do cofator II da heparina (HC II). Em
outro artigo foi demonstrado que a ação inibitória destes compostos sobre a
formação do coágulo de fibrina seria mediada pelo HC II e pela interação das
fucanas com o fibrinogênio (NISHINO et al.,1992)
Testes in vitro foram realizados para verificar a ação de SV1 sobre inibição
direta da trombina e Fator Xa, através da realização do ensaio do substrato
cromogênico. SV1 inibiu a trombina e estimulou a ação do Fator Xa. Os dados
relacionados a ação da SV1 na atividade enzimática da trombina e do FXa estão de
acordo com estudo de Farias, (2011) onde foi visto a ação de galactanas sulfatadas
extraídas da alga verde Codium isthmocladum com ação inibitória sobre a trombina
e ação estimulatória sobre a atividade enzimática do FXa, sendo avaliada em
sistema purificado pelo método do substrato cromogênico na presença de
antitrombina,
mostrando
que
galactanas
sulfatadas,
bem
como
outros
polissacarídeos de algas, podem interagir diretamente com a trombina e FXa, e/ ou
com a antitrombina. Desta forma, ao avaliar a ação antitrombótica de SV1 in vivo,
pode-se inferir que esta está diretamente relacionada a capacidade deste polímero
inibir diretamente a trombina, ou seja pela sua ação anticoagulante.
Várias fucanas apresentam ação anti-inflamatória como por exemplo as
fucanas de Fucus vesiculosus e Lobophora variegata, que apresentaram ação
inibitória sobre o processo inflamatório na peritonite induzida por tioglicolato de sódio
em ratos (Medeiros et al., 2008). O potencial anti-inflamatório foi testado para as
duas frações SV1 e PSV1, através da ação destes compostos no edema de pata
induzido por carragenana
como proposto por Silva et al., 2010. Todas as
concentrações testadas diminuíram significativamente o edema na região plantar
dos animais. Existe uma relação direta entre a coagulação e a inflamação. Desta
forma, compostos que agem sob as duas vias têm vantagens adicionais para seu
uso como fármacos.
Considerando o efeito contra células cancerosas, compostos que apresentam
atividade citotóxica apresentam interessantes efeitos na quimioterapia somente
quando sua toxicidade é mais alta para células cancerosas do que para as células
não cancerosas.
PSV1 e SV1 foram mais efetivas como inibidoras da proliferação em células
HeLa.
Outras fucanas de Saragassum também apresentaram
atividade
antiproliferativa. Fucanas de Sargassum filipendula foi testada na proliferação de
células HeLa, HepG2 (Hepatocarcinoma) e células PC3 (Carcinoma de Próstata)
utilizando o teste MTT. Essas heterofucanas exibiram uma
forte inibição
em
células HeLa. As frações SF-1.0 e SF-1.5 exibiram uma atividade considerável, com
um valor de IC50 de 15,69 e 13,83 mM, respectivamente (Costa et al, 2011).
Além disso foi testada a ação de SV1 e PSV1 em células tumorais e não
tumorais. A viabilidade celular foi verificada em diferentes linhagens também,
através do teste do MTT. As amostras SV1 e PSV1 quando testadas com células
endoteliais normais, não apresentaram inibição da proliferação celular. Entretanto,
SV1 na concentração de 100 μg provocou uma inibição na proliferação de células
RAEC (Figura 18 e 19). Esta seletividade contra linhagens cancerosas específicas é
um dos pré-requisitos para o desenvolvimento de novos fármacos com menores
efeitos colaterais.
O crescimento tumoral é dependente do suprimento vascular em expansão, e
o desenvolvimento de metástase envolve a passagem transvascular de células
malignas e o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos no sítio de crescimento
do tumor. Este crescimento de neo-vasos se dá através do processo angiogênico
(Carmeliet, Jain, 2000). A angiogênese é um processo dinâmico de proliferação e
diferenciação. Este processo requer proliferação endotelial, migração e formação do
tubo, desta forma as células endoteliais representam um alvo preferencial para a
terapia (CHEN, et al, 2005).
As células vermelhas do sangue (hemácias) são os tipos mais diversos de
células sanguíneas. Elas possuem em sua constituição hemoglobina, que permite
que seja feita o transporte de oxigênio do pulmão para todos os tecidos do corpo. A
hemólise das células vermelhas do sangue leva a liberação da hemoglobina
circulante no plasma. Este evento é deletério e pode levar a anemia e hipóxia
(MATON, et al, 1993). Considerando estes fatos, dados na literatura afirmam que a
ocorrência de hemólise em eritrócitos se dá em consequência a danos oxidativos na
membrana celular (CHUKHLOVIN, 1996). SV1 não apresentou ação citotóxica sobre
eritrócitos. Esse dado pode ser relacionado ao potencial antioxidante deste
composto, conforme visto pelo teste de varredura de radicais DPPH, contudo são
necessários novos experimentos para confirmar essa hipótese. Apesar de não haver
significância quanto ao potencial hemolítico, foi observado diferenças significativas
na hemólise dos diferentes eritrócitos no grupo ABO. Esta diferença pode ser
explicada pela constituição monossacarídica diferente dos grupos sanguíneos ABO,
em que o antígeno A apresenta na extremidade da sua estrutura a Nacetilgalactosamina (ZAGO, FALCÃO, PASQUINI, 2004), que poderia provocar uma
maior interação entre suas cargas positivas com as cargas negativas da SV1.
Portanto SV1 e PSV1 são fucanas sulfatadas que atuam sobre a proliferação
de células HeLa, tendo efeito antiangiogênico, possuindo também ação antihemostática. Esses dados em conjunto mostram o potencial dessas fucanas como
modelos para identificação de compostos que poderão ser utilizados na clínica
médica.
6.0. CONCLUSÕES
Os resultados mostrados neste trabalho permitem concluir que:
 A alga marrom Sargassum vulgare sintetiza uma heterofucana
sulfatada
constituída
por
manose,
xilose,
galactose
e
ácido
glucurônico, com peso molecular de 160 KDa.
 A ação antiangiogênica de SV1 é devido a sua capacidade de inibir a
proliferação de RAEC, ao contrário de PSV1 que tem sua ação
relacionada diretamente a inibição da secreção de VEGF.
 SV1 e PSV1 inibiram a viabilidade de células tumorais, principalmente
as da linhagem HeLa. PSV1 não possui ação significativa sobre a
viabilidade de células endoteliais da linhagem RAEC, e causa a
proliferação de macrófagos RAW 264.7
 PSV1 não tem ação apoptótica e não ocasionou necrose, ao contrário
de SV1 que causou apoptose precoce e tardia nas células RAEC
tratadas.
 SV1 foi capaz de inibir diretamente a trombina, estando essa ação
associada ao seu potencial antitrombótico e anticoagulante.
 SV1 possui ação antioxidante verificada pela varredura de radicais
DPPH. E ausência de citotoxicidade de hemácias, considerando a
proteção a danos na membrana dessas células.
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