Márcia Regina Ferreira Geraldo
Efeitos do óleo de nim [Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)]
na produção de zearalenona e ácido fusárico “in vitro” em
Fusarium spp.
.
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação
em
Ciências
Biológicas (Área de concentração Biologia Celular e Molecular) da
Universidade Estadual de Maringá,
para obtenção do grau de Doutor em
Ciências Biológicas
Maringá
2009
Márcia Regina Ferreira Geraldo
Efeitos do óleo de nim [Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)]
na produção de zearalenona e ácido fusárico “in vitro” em
Fusarium spp.
Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier
Orientador
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Geraldo, Márcia Regina Ferreira
G354e
Efeitos do óleo de Nim [Azadirachta indica A. Juss
(Meliaceae)] na produção de zearalenona e ácido
fusárico "in vitro" em Fusarium spp. / Márcia Regina
Ferreira Geraldo. -- Maringá, 2009.
36 f. : figs., tabs.
Orientador : Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, 2009.
1. Fungos. 2. Micotoxinas. 3. Azadirachta indica.
4. Zearalenona. 5. Ácido fusárico. 6. Fusarium spp. I.
Kemmelmeier, Carlos, orient. II. Universidade Estadual
de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas. III. Título.
CDD 21.ed. 571.295677
Expresso a minha profunda gratidão e o meu
reconhecimento:
ao meu Deus, ao qual eu devo a minha vida;
aos meus pais, pelo grande amor, carinho e
incentivo;
à minha amada filha Giovanna, pelo amor,
alegria, carinho e paciência;
ao meu amado Job, pelo incentivo, ajuda,
apoio, compreensão, paciência, dedicação e
amor.
Ao
professor
Dr.
Carlos
Kemmelmeier pelo apoio, pela
compreensão, pela paciência, pelos
valiosos
ensinamentos,
pela
disposição com que sempre me
orientou e, especialmente, pela
amizade demonstrada em todos os
momentos.
AGRADECIMENTOS
Quero deixar os meus sinceros agradecimentos:
À querida Carla, pela amizade, companheirismo, auxílio e disposição em ajudar.
Às grandes amigas Christiane e Simone, pelo apoio, carinho e amizade e pelos
momentos que passamos juntas.
À minha família, pelo amor, incentivo e apoio.
Aos colegas das disciplinas cursadas durante o curso, pela amizade.
Aos professores Dr. Oswaldo Ferrarese Filho e Dra. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese
(Departamento de Bioquímica), pela colaboração nas análises por HPLC.
Aos professores, técnicos e colaboradores do Curso de Pós-graduação em Ciências
Biológicas pela colaboração e pelos ensinamentos ministrados, em especial ao Armando
Luiz de Sá Ravagnani, pela ajuda com as análises em espectrofotometria e a Aparecida
Maria Dantas Ramos, nas análises por HPLC.
À Universidade Tecnológica do Paraná, pelo tempo cedido a mim para a realização
deste trabalho, em especial aos professores que contribuíram efetivamente para isto.
A todos que tenham contribuído, de uma forma direta ou indireta, para a realização
deste trabalho.
Márcia Regina Ferreira Geraldo
BIOGRAFIA
Márcia Regina Ferreira Geraldo nasceu em Mandaguari-PR em 23/10/1973. Possui
graduação em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Estadual de Ponta Grossa
(1995) e Mestrado em Biologia Celular pela Universidade Estadual de Maringá (2004).
Atualmente, é Professora efetiva do Curso de Tecnologia de Alimentos e Engenharia de
Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (Campus de Campo
Mourão-PR). Possui experiência na área de: Bioquímica, Microbiologia e Microscopia
de Alimentos.
APRESENTAÇÃO
Esta tese é composta de dois artigos científicos. Inicia com o artigo “Efeito do óleo de
de nim [Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)] na produção ‘in vitro’ de
zearalenona por Fusarium graminearum”, que investiga, em condições laboratoriais,
a eficácia de três diferentes concentrações de extrato oleoso de nim (Azadirachta indica)
na redução da produção de zearalenona por Fusarium graminearum. E encerra com o
artigo “Efeitos do óleo de nim [Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)] sobre
Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium subglutinans e a produção de
ácido fusárico”. Ele avalia os efeitos do óleo de nim no diâmetro das colônias, no
peso seco, na produção de esporos, na viabilidade dos esporos e na produção de ácido
fusárico em isolados de Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium
subglutinans. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas, os artigos foram redigidos respectivamente de acordo com as
revistas: Indian Journal of Experimental Biology e World Journal of Microbiology
and Biotechnology.
Márcia Regina Ferreira Geraldo
Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier
RESUMO GERAL
Fungos do gênero Fusarium são bem conhecidos como patógenos de plantas. São
causadores de grande variedade de doenças vasculares, estão largamente distribuídos em solos,
em particular os cultivados, e são ativos na decomposição de material celulósico. Eles também
são os principais causadores de deterioração em frutas e vegetais e estão comumente associados
com cereais contaminados antes da colheita. Dentre eles: o Fusarium graminearum Schwabe
[sexual state: Gibberella zeae (Schwein.) Petch] é patógeno de cereais, o Fusarium oxysporum
f. sp. medicagenes um sério patógeno da alfafa (Medicago sativa L.) e o Fusarium subglutinans
patógeno do milho, da cana de açúcar e outras gramíneas. Estes fungos são micotoxigênicos, ou
seja, produtores de micotoxinas em produtos alimentícios, resultando em potencial toxicidade
aos animais e seres humanos. Micotoxinas (do grego Múkes: fungo; e do latim Toxicum:
veneno) são metabólitos secundários tóxicos produzidos por fungos toxigênicos. Várias
micotoxinas produzidas por estes fungos geralmente estão presentes nas culturas afetadas.
Dentre as diversas micotoxinas produzidas por estes fungos, destacamos a zearalenona
produzida por Fusarium graminearum e o ácido fusárico (ácido 5-butilpicolínico) produzido
por Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium subglutinans. Zearalenona é uma
micotoxina estrogênica não-esteroidal, biossintetizada por meio da via policetídica por uma
variedade de fungos pertencentes ao gênero Fusarium, dentre eles Fusarium graminearum,
principalmente em países de clima temperado e úmido. Está frequentemente implicado em
desordens reprodutivas em determinados animais e síndromes hiperestrogênicas em humanos e
tem demonstrado efeitos hepatotóxicos, hematotóxicos, imunotóxicos e genotóxicos. Por causa
das perdas econômicas e seu impacto na saúde humana e animal, várias estratégias para seu
controle têm sido descritas na literatura. O ácido fusárico é produzido por várias espécies de
Fusarium, muitos dos quais são patógenos comuns em uma grande variedade de “commodities”
agrícolas, podendo ocorrer naturalmente em muitos gêneros alimentícios. Foi um dos primeiros
metabólitos fúngicos implicados nos sintomas de patogênese por Fusarium oxysporum em
plantas hospedeiras. Pode agir em mamíferos, aves, artrópodes, crustáceos e plantas. Os efeitos
sobre mamíferos são diversos e podem ocorrer nos sistemas nervoso, cardiovascular e imune. O
ácido fusárico parece interferir com o consumo de alimentos dos animais, e age sobre a
utilização do triptofano pelo cérebro. Possui efeito hipotensor por inibir a dopamina-ßhidroxilase, diminui a norepinefrina no coração e na suprarrenal e também a diminuição da
noradrenalina no sistema angiovascular. O ácido fusárico possui a capacidade de potencializar a
toxicidade de outras micotoxinas. Compostos químicos sintéticos são frequentemente utilizados
no controle de pragas na cultura de plantas e agentes químicos inibidores fúngicos. Existe,
entretanto, uma série de problemas relacionados com o desenvolvimento de resistência fúngica
a esses compostos. Seu uso intensivo tem favorecido o surgimento de pragas secundárias, sem
conseguir eliminar os problemas já existentes. Na tentativa de resolver esse obstáculo, foram
utilizadas concentrações crescentes desses produtos, o que aumentou o risco de altos níveis de
resíduos tóxicos, prejudiciais ao ambiente, à saúde humana e animal. Por causa de todas essas
desvantagens associadas ao uso desses agentes, existe uma tendência mundial para a redução de
seu uso em grãos e gêneros alimentícios. Extratos naturais de plantas podem fornecer uma
alternativa para o uso desses agentes químicos sintéticos. Vários estudos têm examinado o
efeito de compostos bioativos presentes em extratos de plantas como praguicidas naturais, e
grande parte desses compostos tem demonstrado efeito inibitório. Compostos de origem vegetal
surgem como importantes agentes de controle de pragas, por serem de fácil obtenção e
utilização, terem baixo custo e sem os problemas apresentados pelos produtos químicos
sintéticos. O nim, ou Amargosa (Azadirachita indica A. Juss) é uma árvore frondosa que
pertence à família Meliaceae. É uma planta de origem asiática, natural de Burma e das regiões
áridas do subcontinente indiano, onde existem, aproximadamente, 18 milhões de árvores. É
cultivada atualmente nos Estados Unidos, na Austrália, nos países da África e na América
Central. Seus extratos biologicamente ativos, obtidos a partir de folhas, sementes, frutos e
tronco, são reconhecidos por suas múltiplas propriedades terapêuticas, inseticidas, nematicidas,
antimicrobianas e fungicidas. Por causa destas propriedades, o nim vem se tornando importante
como terapia alternativa. Dentre seus compostos ativos, estão a azadiractina, triterpenóides,
geduninas, nimbinim, e limnóides. Estudos mostram que o óleo de nim promoveu um grande
efeito negativo no fungo entomopatogênico Beauveria bassiana, inibindo a germinação, o
diâmetro da colônia e a conidiogênese. Aspergillus niger, Phytophthora nicotianae, Aspergillus
flavus também demonstraram algum tipo de inibição por extratos de nim. Efeitos fungitóxicos
indicam que extratos desta planta bloqueiam a via de biossíntese de aflatoxina em Aspergillus
parasiticus, citrinina em Penicillium citrinum, ácido penicílico em Penicillium cycplopium,
patulina em Penicillium expansum “in vitro” e em maçãs contaminadas. Dessa forma, houve um
interesse na verificação dos efeitos desta planta sobre os fungos Fusarium graminearum,
Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium subglutinans, como tentativa de controle
destes patógenos e da produção das micotoxinas zearalenona e ácido fusárico. Este trabalho teve
por objetivo investigar, em condições laboratoriais, a eficácia de três diferentes concentrações
do óleo de nim na redução da produção de zearalenona por Fusarium graminearum e avaliar os
efeitos sobre o diâmetro das colônias, peso seco, produção de esporos, viabilidade dos esporos e
produção de ácido fusárico sobre os isolados de Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e
Fusarium subglutinans. O extrato oleoso de nim foi testado nas concentrações de 0,1%, 0,25% e
0,5% em meio de arroz (5 g arroz e 3 ml de água) após incubação do fungo à 25ºC por 28 dias
para a produção de zearalenona. Para a quantificação de zearalenona, foi utilizada cromatografia
líquida de alta performance. Os efeitos do óleo de nim sobre os isolados de Fusarium
oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium subglutinans foram verificados nas concentrações de
0,25%, 0,5% e 1% em meio “Czapek Yeast Agar”. A produção de ácido fusárico foi
determinada qualitativamente por cromatografia em camada delgada e quantificada por
espectrofotometria. O óleo de nim reduziu a produção de zearalenona nos meios tratados com o
extrato, onde a maior inibição (59.05%) ocorreu na concentração de 0,1%, por causa
provavelmente de melhor solubilidade do extrato oleoso em água, o que indicou que, em
concentrações menores, pode ter ocorrido um maior contato e absorção do extrato oleoso de nim
pelo fungo. Para os isolados testados de Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis e Fusarium
subglutinans, o óleo de nim apresentou efeitos inibitórios, porém esses efeitos variaram
conforme o isolado e a concentração do óleo. Dependendo da concentração, o óleo de nim foi
efetivo em reduzir o diâmetro das colônias e o peso seco. Na redução da esporulação este óleo
foi efetivo em concentrações maiores. A germinação dos esporos foi afetada pelo óleo de nim
tanto quando os esporos vindos de meios sem nim foram germinados em meio com nim, como
quando os esporos vindos de meios com nim foram germinados em meio sem nim. O óleo de
nim reduziu ou até mesmo inibiu a produção de ácido fusárico nos isolados testados.
Considerando-se que estes isolados são patógenos de plantas e produtores de zearalenona e
ácido fusárico, o óleo de nim poderia ser implantado como parte de um manejo integrado de
pragas, como tentativa de redução destas substâncias tóxicas nas plantas hospedeiras. Mas, para
isso, serão necessários novos estudos in vitro e in vivo com as plantas hospedeiras.
GENERAL ABSTRACT
Fungi of the genus Fusarium, known to be plant pathogens and the cause of several
varieties of vascular diseases, are distributed in soils, mainly cultivated ones, and are
highly active in the decomposition of cellulose material. They cause fruit and vegetable
deterioration and are usually associated to pre-harvest contaminated cereals. In fact,
Fusarium graminearum Schwabe [sexual state: Gibberella zeae (Schwein.) Petch] is a
cereal pathogen; Fusarium oxysporum f. sp. medicagenes is a serious alfafa pathogen
(Medicago sativa L.) and Fusarium subglutinans is a pathogen of maize, sugarcane and
other grasses. Since they are mycotoxigenic or producers of mycotoxin in food
products, they may cause toxicity in animals and in humans. Mycotoxins (Greek múkes:
fungus; Latin toxicum: poison) are secondary toxic metabolites produced by toxigenic
fungi. Several fungi caused mycotoxins are usually present in diseased cultures.
Zearalenone produced by Fusarium graminearum and fusaric acid (5-butylpicolinic
acid) produced by Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis and Fusarium subglutinans
are among the several mycotoxins produced by these fungi. Zearalenone is a non steroid
estrogenic mycotoxin biosynthesized through the polyketide pathway by a series of
fungi of the genus Fusarium, among which Fusarium graminearum, that mainly thrives
in temperate and humid countries. It frequently causes reproductive disorders in certain
animals and hyperestrogen syndromes in humans, with hepatotoxic, hematotoxic,
immunotoxic and genotoxic effects. Owing to financial losses and its impact on human
and animal health, several controlling strategies have been described in the literature.
Fusaric acid is produced by several Fusarium species most of which are pathogens
usually found in a great number of agricultural commodities and may occur naturally in
many types of food. It was one of the first fungus metabolite in Fusarium oxysporumcaused pathogenesis symptoms in host plants, and may attack mammals, fowls,
arthropods, crustaceans and plants. Effects on mammals are numerous and may occur in
the nervous, cardiovascular and immunological systems. Fusaric acid may interfere with
animals’ feed by affecting the employment of tryptophan by the brain. Since it inhibits
dopamine-ß-hydroxylase, it has a hypotension effect, decreasing norepinephrine in the
heart and kidney and noradrenalin in the angiovascular system. Fusaric acid increases
toxicity of other mycotoxins. Chemical synthetic compounds are frequently used in
plant culture pest control and as fungus inhibiting chemical agents. However, there are
problems related to the development of fungus resistance to these compounds and their
intense use has triggered secondary pests without eliminating those already existing.
Although graded concentrations of the product have been used to solve the problem,
high levels of toxic residues, pernicious to the environment and to human and animal
health, have increased the risk. Due to all the above mentioned disadvantages associated
to these agents, a worldwide trend exists to reduce their use in grains and food. Natural
plant extracts may be alternatives to these synthetic chemical agents. Several studies
have actually examined the effects of bioactive compounds as natural pesticides in plant
extracts, many of which proved to be inhibitory. Vegetal originating compounds are
important agents in pest control due to their low cost, easy acquisition and use; besides
they are free from problems found in synthetic chemical products. Neem (Azadirachita
indica A. Juss) is a dense leaved tree of the Meliaceae family, of Asian origin, natural
of Burma and the arid regions of the Indian subcontinent where some eighteen million
trees of this species exist. It is currently cultivated in the United States, Australia, and in
some countries in Africa and Central America. Its biologically active extracts from
leaves, seeds, fruits and trunk have several therapeutic, insecticide, nematicide,
antimicrobial and fungicide qualities. Owing to such qualities, the neem has become an
important alternative therapy since its active compounds comprise azadiractin,
triterpenoids, gedunins, nimbinim, limnoides and others. Research has shown that neem
oil produced a great negative effect on the entomopathogenic fungus Beauveria
bassiana. It actually inhibited its germination, colony diameter and conidiogenesis.
Aspergillus niger, Phytophthora nicotianae, Aspergillus flavus also showed some
inhibition with neem extracts. Fungus-toxic effects show that neem extracts block the
biosynthesis pathways of aflatoxin in Aspergillus parasiticus, citrinin in Penicillium
citrinum; penicillic acid in Penicillium cycplopium; patulin in vitro in Penicillium
expansum and in contaminated apples. Consequently, the verification of the plant’s
effects on the fungi Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis
and Fusarium subglutinans was deemed of interest within the context of pathogen
control and the production of mycotoxins zearalenone and fusaric acid. Current research
investigates
in
laboratory conditions
the
efficaciousness
of
three
different
concentrations of neem oil in the decrease of zearalenone production by Fusarium
graminearum and evaluates its effects on the colonies’ diameter, dry weight, spore
viability and the production of fusaric acid on isolates of Fusarium oxysporum f. sp.
medicagenis and Fusarium subglutinans. Neem oil extract was tested at concentrations
0.1%, 0.25% and 0.5% in a rice medium (5 g rice and 3 ml water) after fungus
incubation, at 25ºC, during 28 days, for the production of zearalenone. Amount of
zearalenone was determined by High Performance Liquid Chromatography. Effects of
neem oil on Fusarium oxysporum f. sp. medicagenis and Fusarium subglutinans isolates
were verified at concentrations 0.25%, 0.5% and 1% in a Czapek Yeast Agar medium.
Production of fusaric acid was determined by Thin Layer Chromatography and amount
was evaluated by spectrophotometry. Neem oil decreased amounts of zearalenone in the
extract-treated media. Highest inhibition (59.05%) occurred at concentration 0.1%,
probably due to the better solubility of oil extract in water. This fact shows that higher
contact and absorption of the neem oil extract may have occurred in lower
concentrations by the fungus. Neem oil had inhibitory effects in Fusarium oxysporum f.
sp. medicagenis and Fusarium subglutinans isolates, although the effects varied
according to isolates and oil concentration. Neem oil was concentration-dependent in
reducing colonies’ diameter and dry weight, whereas it was effective in higher
concentrations for sporulation decrease. Germination of spores was dependent on neem
oil not only when the spores were cultivated in a neem medium but also when they
emerged from a culture in a neem medium. Neem oil decreased or even inhibited the
production of fusaric acid in the isolates under analysis. Since isolates are plant
pathogens and producers of zearalenone and fusaric acid, neem oil may be a factor in
the integrated management of pests to reduce toxic compounds in host plants. Further
studies in vitro and in vivo with host plants are required.