UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
JUARANA DAL MAS
NANOEMULSÃO CONTENDO EXTRATO DA CASCA DE
Rapanea ferruginea COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA
Itajaí (SC)
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
JUARANA DAL MAS
NANOEMULSÃO CONTENDO EXTRATO DA CASCA DE
Rapanea ferruginea COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do
grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Prof. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva
Co-orientadora: Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin
Itajaí (SC)
Março de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
D15n
Dal Mas, Juarana, 1981Nanoemulsão contendo extrato da casca de Rapanea ferruginea
com atividade anti-inflamatória tópica / Juarana Dal Mas, 2015.
167f. ; il., tab. ; fig.; quad.
Anexos
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora : Profª . Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva ”
Bibliografia : p. 153-166
1. Química farmacêutica. 2. Extratos vegetais – Uso terapêutico.
3. Nanoemulsão. 4. Myrsinaceae (Rapanea ferruginea). I. Título.
CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
CDU: 612.78
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir seguir em frente e iluminar
mais esta conquista profissional.
Aos meus pais, Janaina e Wladimir, pelo apoio e incentivo para que eu
alcançasse meus objetivos.
Ao meu irmão Samuel, pelos conselhos e incentivo nos momentos de
insegurança e dúvida.
À minha orientadora e co-orientadora, Ruth M. Lucinda da Silva e Tania M. B.
Bresolin, que com as suas experiências souberam me guiar durante o meu trabalho,
com paciência e competência.
À professora Ângela Malheiros, que forneceu as cascas da R. ferruginea e
também me orientou em algumas dúvidas sobre a planta e seus marcadores, sempre
solícita e paciente.
À professora Márcia M. de Souza, que se dispôs à nos auxiliar, realizando o
primeiro ensaio farmacológico do trabalho.
À professora Kathryn A. B. S. da Silva, que com sua paciência e experiência,
me orientou e auxiliou durante a realização dos ensaios farmacológicos. Agradeço
também a amizade, conselhos e risadas.
Aos professores Angélica Couto, Clóvis Rodrigues e Daisy Netz pelas
sugestões realizadas ao longo do trabalho.
À professora Dra. Joana Lea Meira Silveira que permitiu o acesso ao Centro de
Microscopia Eletrônica na UFPR, para realização da análise morfológica das
amostras. Gostaria de agradecer a todos os técnicos do laboratório que me auxiliaram
na execução das análises.
Às colegas Liliani e Bruna que me auxiliaram na execução do teste de irritação
cutânea. Muito obrigada!
Aos colegas e amigos, Tailyn, Roseni, Adriana, Marcel, Ângela, Fabile, Bruna,
Thamiris, Gislaine, Silmara, Viviane pelas conversas animadas, pelos almoços, pelos
jantares, pelas comemorações, pelos desabafos, pelos conselhos, pelas risadas,
pelos momentos de filosofar sobre a origem de tudo. Espero que consigamos construir
uma amizade cada vez mais sólida. Adoro todos vocês!
À colega e amiga Tailyn Zermiani, por todo auxílio e paciência durante as
análises por CLAE e em desvendar os mistérios da R. ferruginea!
À Helenize Heyse Moreira e Juliano dos Santos da secretaria do Programa de
Mestrado em Ciências Farmacêuticas, por todo auxílio todas as vezes em que
precisei.
Aos colaboradores da UNIVALI, Carla, Núbia, Joel, Viviane e Pedro por todo
auxílio nos laboratórios. Aos auxílios prestados pelos técnicos do Biotério Central da
UNIVALI.
À empresa Gattefossé pela doação dos tensoativos Labrafil® M 1944 CS,
Labrasol® e Capryol® 90, e à empresa Oxiteno pela doação do tensoativo Alkest® CSO
400..
Ao apoio financeiro do CNPQ, CAPES, FAPESC.
Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram e me
acompanharam durante a realização deste trabalho. Muito obrigada!
“Sempre permaneça aventureiro.
Por nenhum momento se esqueça
de que a vida pertence aos que investigam.
Ela não pertence ao estático. Ela pertence ao que flui.
Nunca se torne um reservatório, sempre permaneça um rio.”
(OSHO)
NANOEMULSÃO CONTENDO EXTRATO DA CASCA DE
Rapanea ferruginea COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA
Juarana Dal Mas
Março/2015
Orientadora: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doutora.
Co-orientadora: Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Número de Páginas: 167.
Nanoemulsões são dispersões com tamanho de gota em escala nanométrica, as quais vêm
sendo empregadas como veículo tópico para fármacos com o objetivo de potencializar a
atividade farmacológica. Estudos prévios com a casca da Rapanea ferruginea, demonstraram
a atividade anti-inflamatória do extrato bruto quando administrado por via oral e endovenosa.
O presente estudo teve por objetivo desenvolver uma nanoemulsão contendo extrato da casca
de R. ferruginea e avaliar a atividade anti-inflamatória tópica. O extrato mole das cascas de
R. ferruginea foi obtido e caracterizado. A partir da seleção do miristato de isopropila como
fase oleosa, dos tensoativos Alkest® CSO400 e Span® 80 e da construção de diagramas de
fases pseudoternários, foi desenvolvida uma nanoemulsão pelo método de inversão de fases
por baixa energia. As nanoemulsões foram inicialmente caracterizadas quanto ao tamanho da
fase interna, polidispesibilidade, homogeneidade, morfologia, potencial zeta, pH e
comportamento reológico. As análises de teor dos marcadores do extrato (AMA e AMB) por
CLAE, estabilidade acelerada, liberação in vitro, permeação cutânea empregando pele de
porco em modelo de célula de Franz, irritação cutânea pelo método agarose overlay e ensaio
pré-clínico da atividade anti-inflamatória em modelo de edema de orelha induzido pelo óleo
de cróton em camundongos foram realizadas com as nanoemulsões contendo o extrato
incorporado na fase oleosa. A obtenção da nanoemulsão foi confirmada pelo tamanho médio
da fase interna de 47,88 ± 8,20 nm, com índice de polidispersibilidade de 0,228, potencial zeta
de -34,7 ± 1,15 mV e forma esférica das gotículas, observada por microscopia eletrônica de
transmissão. O pH foi adequado para aplicação tópica (5,25 ± 0,02) e o teor de AMA e AMB
foi de 54,10 ± 0,08 µg/g (103,87%) e 53,03 ± 0,03 µg/g (109,25%) de formulação,
respectivamente. O sistema apresentou comportamento pseudoplástico tixotrópico. O estudo
de estabilidade acelerada demonstrou a influência do extrato diminuindo a estabilidade da
nanoemulsão, havendo a necessidade de futuras adequações na formulação. Os marcadores
do extrato apresentaram liberação in vitro mais retardada quando o extrato foi incorporado na
nanoemulsão, demonstrando controle na sua cedência para o meio. Os marcadores do extrato
não permearam a pele de porco, sendo detectados somente na formulação remanescente. O
teste de irritação cutânea in vitro demonstrou grau moderado de irritação. O ensaio
farmacológico in vivo evidenciou atividade anti-inflamatória tópica, sendo que a nanoemulsão
apresentou um efeito 1,6 vezes superior ao do creme convencional contendo 0,13% do extrato
incorporado. O mecanismo de ação anti-inflamatória envolveu a redução da liberação das
citocinas TNF e MPO. Este trabalho demonstrou que a nanoemulsão desenvolvida é um
veículo adequado à aplicação tópica do extrato de R. ferruginea potencializando a sua
atividade anti-inflamatória tópica em modelo animal in vivo, requerendo a necessidade de
futuras melhorias farmacotécnicas com o objetivo de melhorar a sua estabilidade e melhor
compreensão acerca da permeação cutânea dos compostos ativos.
Palavras-chave: Nanoemulsão. Rapanea ferruginea. Anti-inflamatório tópico.
NANOEMULSION CONTAINING STEAM BARK EXTRACT OF Rapanea
ferruginea WITH TOPICAL ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY
Juarana Dal Mas
March 2015
Supervisor: Ruth Meri Lucinda da Silva, Dr.
Co-supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr.
Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.
Number of Pages: 167.
Nanoemulsions are dispersed systems with droplet size in nanometric scale, that have been used
as topical carrier for drugs with the aim of improving the pharmacological activity. Previous studies
with the steam bark of the Rapanea ferruginea showed anti-inflammatory activity of the extract when
administered orally and intravenously. This study aimed to develop a nanoemulsion containing R.
ferruginea steam bark extract, and to evaluate the topical anti-inflammatory activity. The soft extract
of stem bark of R. ferruginea was obtained and characterized. After selection of isopropyl myristate
as oil phase and the surfactants Span 80 and Alkest® CSO400, and construction of pseudo ternary
phase diagrams, the nanoemulsion was developed using the low-energy phase inversion method.
The nanoemulsions were characterized initially by droplet size, polydispersity, homogeneity,
morphology, zeta potential, pH and rheological behavior. The content analysis of the extract markers
(MAA and MAB) by HPLC, accelerated stability, in vitro release, cutaneous permeation using porcine
skin by the Franz cell model, skin irritation by the agarose overlay method, and preclinical assay of
anti-inflammatory activity using the croton oil-induced ear oedema model were conducted with the
nanoemulsions containing the extract incorporated in the oil phase. The nanoemulsion obtained was
confirmed by the average droplet size of 47.88 ± 8.20 nm, with a polydispersity index of 0.228, zeta
potential of -34.7 ± 1.15 mV, and spherical shape of the droplets, observed by microscopy electronic
transmission. The pH was suitable for topical use (5.25 ± 0.02) and the content of the MAA and MAB
was 54.10 ± 0.08 µg/g (103.87%) and 53.03 ± 0.03 µg/g (109.25%) of the formulation, respectively.
The system showed pseudoplastic and thixotropic rheological behavior. The accelerated stability
study shows that the extract decreases the nanoemulsion stability, requiring further adjustments in
the formulation. The extract markers showed slower in vitro release when the extract was
incorporated in the nanoemulsion, demonstrating control in its diffusion to the medium. The extract
markers did not permeate the porcine skin, being detected only in the remaining formulation. The in
vitro skin irritation assay showed a moderate degree of irritation. The in vivo pharmacological
analysis showed topical anti-inflammatory activity. The nanoemulsion was 1.6 times more efficient
than the conventional cream containing 0.13% of the extract. The mechanism of anti-inflammatory
activity evolved a reduction in the release of the cytokines TNF and MPO. This work showed that
the nanoemulsion developed is a suitable carrier for topical use of R. ferruginea extract, improving
its topical anti-inflammatory activity in the animal model. Further technological improvements are
needed, to adjust the stability and acquire a better understanding of the skin permeation of the active
compounds.
Keywords: Nanoemulsion. Rapanea ferruginea. Topical Anti-inflammatory.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aspecto visual de uma nanoemulsão O/A e a estrutura das gotas........... 34
Figura 2 - Representação esquemática demonstrando o método de emulsificação por
baixa energia, em que a quantidade de água adicionada à emulsão A/O é
aumentada progressivamente até que a inversão de fase ocorra e a emulsão O/A
seja formada. .................................................................................................................. 37
Figura 3 - Esquema demonstrando as diferentes formas de desestabilização de uma
nanoemulsão. ................................................................................................................. 42
Figura 4 - Foto da árvore Rapanea ferruginea................................................................ 46
Figura 5 - Estruturas químicas dos ácidos mirsinoicos A, B e C. ................................ 47
Figura 6 - Foto demonstrativa da montagem da célula de Franz com nanoemulsão.
........................................................................................................................................... 79
Figura 7 - Foto demonstrativa do detalhe do sistema das células de difusão de Franz
fechado e da coleta das amostras. ............................................................................. 79
Figura 8 - Perfil cromatográfico da solução extrativa e do extrato mole das cascas de
R. ferruginea por CCD................................................................................................... 91
Figura 9 - Perfis cromatográficos por CLAE dos padrões de ácidos mirsinoicos A (a)
e B (b); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB................................................. 92
Figura 10 - Perfil cromatográfico por CLAE da solução extrativa das cascas de R.
ferruginea. ....................................................................................................................... 92
Figura 11 - Perfil cromatográfico por CLAE do extrato mole das cascas de R.
ferruginea. ....................................................................................................................... 93
Figura 12 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R.
ferruginea em diferentes óleos: (1) e (2) Poly: triglicérides de ácido cáprico e
caprílico (TCC); (3) e (4) MI: miristato isopropila; (5) e (6) Cap 90: Capryol 90; (7)
e (8) CeV: Cetiol V; (9) e (10) Ce868: Cetiol 868. .................................................... 95
Figura 13 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R.
ferruginea com óleo miristato de isopropila com diferentes tensoativos: (1) e (2)
óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO
400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11) e (12) óleo +
Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90. ............................................................... 97
Figura 14 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R.
ferruginea com o óleo triglicérides cáprico caprílico com diferentes tensoativos: (1)
e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest®
CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11) e (12) óleo
+ Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90. ............................................................ 97
Figura 15 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das
nanoemulsões de miristato de isopropila, Capryol 90 e Alkest CSO 400, usando
métodos diferentes: titulação e ponto a ponto......................................................... 101
Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das
nanoemulsões de miristato de isopropila, Alkest CSO 400 e Span 80, usando
métodos diferentes: titulação e ponto a ponto......................................................... 103
Figura 17 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das
nanoemulsões de miristato de isopropila, Capryol 90 e Tween 80, usando métodos
diferentes: titulação e ponto a ponto. ........................................................................ 105
Figura 18 - Gráficos representativos da distribuição do tamanho da fase interna da
nanoemulsão sem extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B), com seus
respectivos gráficos de taxa de correlação correspondentes (A1 e B1). ............ 119
Figura 19 - Micrografias eletrônicas obtidas após coloração negativa da nanoemulsão
sem extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B). Aumento de 15.000x........ 120
Figura 20 - Perfil de viscosidade da nanoemulsão veículo (imagem à esquerda) e da
nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole das cascas de R. ferruginea
(imagem à direita)......................................................................................................... 121
Figura 21 - Perfis cromatográficos por CLAE do extrato mole de R. ferruginea, da
nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole de R. ferruginea e da nanoemulsão
veículo, em 270 nm. ..................................................................................................... 122
Figura 22 - Fotografia demonstrando o aspecto visual das nanoemulsões branco e
com extrato após o término do estudo de estabilidade acelerada, expostas a
temperatura ambiente e a 40 °C. ............................................................................... 125
Figura 23 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato
(NE branco) durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero, e após
exposição a temperatura ambiente nos tempos 30, 90 e 180 dias...................... 126
Figura 24 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato
(NE branco) durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero e após
exposição a temperatura de 40 °C nos tempos 30, 90 e 180 dias. ..................... 127
Figura 25 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro
para as nanoemulsões e cremes contendo extrato de R. ferruginea.................. 132
Figura 26 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro
para o extrato mole da casca de R. ferruginea a 0,25% em DMSO.................... 132
Figura 27 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do extrato mole
de R. ferruginea 0,13% em propilenoglicol. n= 6 células. ..................................... 134
Figura 28 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB da nanoemulsão
com 0,13% de extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células. ................................. 135
Figura 29 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do creme com
0,13% de extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células. .......................................... 135
Figura 30 - Efeito dos cremes contendo extrato mole de R. ferruginea (RF 0,25%,
0,5% e 1,0%) e AMB (0,5% e 0,1%) administrados topicamente sobre edema de
orelha induzido pelo óleo de cróton. ......................................................................... 142
Figura 31 - Efeito das nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R. ferruginea
e dexametasona administrados topicamente sobre edema de orelha induzido por
óleo de cróton. O edema de orelha foi mensurado após 6 h da indução com óleo
de cróton. ....................................................................................................................... 143
Figura 32 - Fotomicrografias dos cortes histológicos das orelhas dos camundongos,
corados em hematoxilina-eosina (HE), 6 horas após a indução do edema com óleo
de cróton 2,5% (4x e 10x). (A) naive, (B) controle negativo, (C) controle positivo
tratado com dexametasona 0,1%, (D) tratamento com veículo-creme,
(E)
tratamento com creme 0,13% extrato de R. ferruginea, (F) tratamento com veículonanoemulsão, (G) tratamento com nanoemulsão 0,13% extrato de R. ferruginea.
As setas indicam a presença de infiltrado celular e as barras vermelhas indicam a
espessura dérmica....................................................................................................... 146
Figura 33 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R.
ferruginea
sobre a
atividade
da mieloperoxidase
no
sobrenadante
de
homogeneizados das orelhas tratadas com óleo de cróton 2,5%. A atividade da
MPO foi mensurada após 6 h da indução pelo óleo de cróton............................. 148
Figura 34 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R.
ferruginea sobre a inibição da quimiocina derivada de queratinócitos (KC) induzida
por óleo de cróton 2,5% em orelhas de camundongos. ........................................ 149
Figura 35 - Efeito da nanoemulsão e do creme contendo 0,13% de extrato de R.
ferruginea sobre a produção de IL-1β e TNF, induzida por óleo de cróton 2,5% em
orelhas de camundongos. ........................................................................................... 150
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Teor de marcadores AMA e AMB nas soluções extrativas das cascas de R.
ferruginea. ....................................................................................................................... 89
Tabela 2 - Resultados das análises realizadas nos derivados vegetais das cascas da
R. ferruginea. .................................................................................................................. 90
Tabela 3 - Valores de transmitância e absorbância da mistura de óleo e extrato mole
de R. ferruginea no teste de solubilidade................................................................... 95
Tabela 4 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de
solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em miristato de isopropila e
diferentes tensoativos.................................................................................................... 98
Tabela 5 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de
solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em triglicérides de ácido cáprico e
caprílico e diferentes tensoativos. ............................................................................... 99
Tabela 6 - Formulações
e características
dos sistemas nanoemulsionados
selecionados para o estudo de estabilidade preliminar. ........................................ 107
Tabela 7 - Resultados das análises no tempo inicial (ti) e final (tf) das nanoemulsões
sem extrato submetidas aoestudo de estabilidade preliminar.............................. 108
Tabela 8 - Resultados do estudo de estabilidade preliminar para as amostras com e
sem extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, com e sem
Sepigel®. ........................................................................................................................ 113
Tabela 9 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as
formulações com o extrato de R. ferruginea incorporado na fase aquosa (linhas
em cinza) e na fase oleosa com diferentes concentrações de propilenoglicol (linhas
em branco). ................................................................................................................... 114
Tabela 10 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as
nanoemulsões com 0,25% e 0,13% de extrato de R. ferruginea, incorporados na
fase oleosa (linhas cinzas) e na fase aquosa (linhas brancas). ........................... 116
Tabela 11 - Análise da constante de Ostwald-de-Waele (K) e do índice de
comportamento de fluxo (n) para a nanoemulsão veículo e para a nanoemulsão
com extrato de R. ferruginea. ..................................................................................... 121
Tabela 12 – Resultado do estudo de estabilidade acelerada das nanoemulsões nas
temperaturas ambiente e 40 ºC. ................................................................................ 124
Tabela 13 - Análise dos dados obtidos com o ensaio de liberação in vitro do AMB e
AMA a partir do extrato mole em propilenoglicol, do creme e da nanoemulsão
contendo extrato. .......................................................................................................... 138
Tabela 14 - Resultados do estudo de permeação cutânea para a nanoemulsão e
creme contendo extrato de R. ferruginea e para o extrato de R. ferruginea em
propilenoglicol, em modelo de célula de Franz, usando pele de porco. ............. 139
Tabela 15 - Porcentagem de inibição e média da espessura do edema de orelha
induzido pelo óleo de cróton 2,5% nos grupos tratados com as nanoemulsões e
cremes contendo extrato mole de R. ferruginea. .................................................... 144
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Condições cromatográficas para análise dos derivados vegetais de R.
ferruginea por CLAE. ..................................................................................................... 68
Quadro 2 - Combinações de tensoativos e suas respectivas proporções empregadas
no desenvolvimento das nanoemulsões. ................................................................... 70
Quadro 3 - Formulações dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o estudo
de estabilidade preliminar. ............................................................................................ 71
Quadro 4 - Composição do creme convencional utilizado nos ensaios farmacológicos,
liberação in vitro e permeação cutânea in vitro......................................................... 73
Quadro 5 - Composição das nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea
e com e sem Sepigel® testadas no estudo de estabilidade preliminar.................. 74
Quadro 6 - Composição da nanoemulsão selecionada para incorporação do extrato
mole de R. ferruginea. ................................................................................................... 75
Quadro 7 - Grau de reatividade para teste de difusão em ágar................................... 78
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AAPH – 2,2’ – azobis (2-amidinopropano) dicloridrato
ABTS+ - 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico
AFM – Atomic Force Microscopy
AMA – Ácido mirsinoico A
AMB – Ácido mirsinoico B
AMC – Ácido mirsinoico C
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COX-2 – Ciclooxigenase 2
DLS – Dynamic Light Scattering ou Espalhamento Dinâmico de Luz
DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s médium
DMSO - Dimetilsulfóxido
DPPH – 2,2 difenil-1-picrilhidrazil
EHL – Equilíbrio Hidrófilo-lipófilo
ELISA – Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay
ESEM – Environmental Scanning Eletron Microscopy
FDA – Food and Drug Administration
GRAS – Generally Recognized as Safe
HE – Hematoxilina-eosina
HELA – Adenocarcinoma de colo de útero
HPLC – High-performance Liquid Chromatography
HRP – Horseradish peroxidase
IFN – Interferon
IFN-γ – Interferon γ
IL-1 – Interleucina 1
IL-1α – Interleucina 1α
IL-1β – Interleucina 1β
IL-2 – Interleucina 2
IL-8 – Interleucina 8
K562 – Leucemia mieloide/eritroleucemia Ph+
KC – Quimiocina derivada dos queratinócitos
L929 – Linhagem de fibroblastos murino
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MFA – Microscopia de Força Atômica
MIP-2 – Proteína inflamatória dos macrófagos-2
MPO - Mieloperoxidase
NF-kB – Fator de Transcrição Nuclear kB
NK – Células Natural Killer
NO – Óxido Nítrico
OECD – Organization for Economic Co-operation and Development
OMS – Organização Mundial da Saúde
ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity
PAF – Fator de Ativação Plaquetária
PBS – Tampão salina fosfato
PFA - Paraformaldeído
PDI – Índice de Polidispersibilidade
PIC – Phase Inversion Composition Methods ou Método de Inversão por
Composição
PIT – Phase Inversion Temperature Methods ou Método de Inversão por
Temperatura
PMSF – Phenylmethanesulfonylfluoride
PTFE - Politetrafluoretileno
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio
SEM – Scanning Eletron Microscopy
TCC – Triglicérides de ácido cáprico e caprílico
TEM – Transmission Eletron Microscopy
TNF – Fator de Necrose Tumoral
TPA – 12-O-tetradecanoilforbol acetato
TSEM – Transmission Scanning Eletron Microscopy
UV - Ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 27
2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29
2.1 Objetivo Geral....................................................................................... 29
2.2 Objetivos Específicos: ......................................................................... 29
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 31
3.1 Nanoemulsões...................................................................................... 31
3.1.1 Desenvolvimento de Nanoemulsões ................................................................... 35
3.1.2 Caracterização das Nanoemulsões ..................................................................... 37
3.1.3 Estabilidade de Nanoemulsões ............................................................................ 41
3.2 Plantas Medicinais de Uso Tópico ...................................................... 43
3.3 Rapanea ferruginea Mez. (Myrsinaceae) ............................................. 45
3.4 Resposta Inflamatória .......................................................................... 50
3.4.1 Inflamação cutânea .................................................................................................. 54
3.4.2 Tratamento da Inflamação cutânea...................................................................... 56
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 61
4.1 Material ................................................................................................. 61
4.2 Análise das cascas pulverizadas de R. ferruginea ............................. 65
4.3 Obtenção e caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.
ferruginea ................................................................................................... 65
4.3.1 Obtenção ..................................................................................................................... 65
4.3.2 Caracterização ........................................................................................................... 66
4.4 Estudos de pré-formulação das nanoemulsões ................................. 68
4.4.1 Determinação da solubilidade do extrato .......................................................... 68
4.4.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato ...................................... 69
4.5 Desenvolvimento das nanoemulsões ................................................. 69
4.5.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário ......................................... 69
4.5.2 Estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica das
nanoemulsões sem extrato .............................................................................................. 71
4.5.3 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo
extrato .................................................................................................................................... 72
4.6 Caracterização das nanoemulsões ...................................................... 75
4.6.1 Aspecto visual e estabilidade física .................................................................... 75
4.6.2 Análise morfológica ................................................................................................. 76
4.6.3 Análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta ...................... 76
4.6.4 Comportamento reológico ...................................................................................... 76
4.6.5 Quantificação dos marcadores da R. ferruginea por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) .................................................................................................. 76
4.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão............................ 77
4.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R.
ferruginea ................................................................................................... 77
4.9 Análise de liberação in vitro da nanoemulsão contendo extrato da R.
ferruginea ................................................................................................... 78
4.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo
extrato de R. ferruginea ............................................................................. 80
4.11 Ensaios farmacológicos da atividade anti-inflamatória .................... 82
4.11.1 Animais ...................................................................................................................... 82
4.11.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo da R. ferruginea e do AMB
incorporados em creme convencional e nanoemulsão ........................................... 83
4.11.3 Dosagem de citocinas em pele inflamada tratada com creme e
nanoemulsões contendo R. ferruginea......................................................................... 84
4.11.4 Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO) em pele inflamada
tratada com creme e nanoemulsões contendo R. ferruginea................................. 85
4.11.5 Análise histológica em pele inflamada tratada com creme e nanoemulsões
contendo R. ferruginea ...................................................................................................... 86
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 87
5.1 Material vegetal..................................................................................... 87
5.1.1 Determinação de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido ...................... 87
5.1.2 Perda por dessecação ............................................................................................. 87
5.2 Obtenção e Caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.
ferruginea ................................................................................................... 88
5.3 Estudos de pré-formulação .................................................................. 93
5.3.1 Determinação da solubilidade do extrato .......................................................... 93
5.3.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato mole............................ 99
5.4 Desenvolvimento das nanoemulsões ................................................100
5.4.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário ....................................... 100
5.4.2 Estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica das
nanoemulsões ................................................................................................................... 107
5.5 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo
extrato de R. ferruginea .................................................................................................. 111
5.6 Caracterização das nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea ...... 117
5.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão ..........................122
5.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R.
ferruginea ..................................................................................................131
5.9 Análise de liberação in vitro da nanoemulsão contendo extrato da R.
ferruginea ..................................................................................................133
5.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo
extrato de R. ferruginea ............................................................................139
5.11 Ensaios farmacológicos ...................................................................141
6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 151
REFERÊNCIAS................................................................................................................... 153
ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS – CEUAUNIVALI ............................................................................................................................... 167
27
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de novos veículos emulsionados para carrear ativos para
aplicação tópica, visando solucionar problemas de biodisponibilidade ou ainda de
estabilidade, é uma constante na indústria farmacêutica. Sistemas nanoestruturados,
como lipossomas, microemulsões,
nanoemulsões,
nanopartículas
lipídicas e
poliméricas, são exemplos de carreadores para a liberação de ativos na pele, com o
objetivo de modificar os perfis de liberação, permeação ou oclusão da pele
(STRÖHER; ARMIJO; RAFFIN, 2010).
As formulações lipossomadas apresentam certas limitações de aplicação,
quanto à capacidade de incorporação do fármaco e à estabilidade. Já as
microemulsões, exibem baixa capacidade relativa de concentração de ativos para a
alta concentração de tensoativos, o que tem sido geralmente reconhecido como
indutor de irritações cutâneas. Recentemente, por apresentarem vantagens como
controle do tamanho da fase interna da emulsão, menor concentração de tensoativos
e capacidade de dissolução de fármacos lipofílicos, as nanoemulsões têm sido muito
estudadas como veículos para fármacos para diferentes vias de administração
(endovenosa, tópica, oral ou ocular) e aplicações terapêuticas (ZHOU et al., 2010).
A nanoemulsão se apresenta como uma emulsão transparente ou translúcida
(TADROS et al., 2004) com tamanho de gota em escala nanométrica. Como as
emulsões convencionais, as nanoemulsões, estão termodinamicamente em estado de
não equilíbrio, no entanto, a cinética de desestabilização das nanoemulsões é lenta,
aproximadamente meses, sendo consideradas cineticamente estáveis (ANTON;
VANDAMME, 2011). Isto se deve ao tamanho reduzido das gotas que confere
estabilidade frente à sedimentação ou cremeação, além de prevenir a floculação e a
coalescência (ANTON; VANDAMME, 2011; SOLANS; SOLÈ, 2012).
As características físico-químicas
das nanoemulsões
irão depender do
tamanho da gota, viscosidade, densidade, inversão de fase, turbidez, índice de
refração, sendo estas características mensuradas por várias técnicas, tais como:
espectrofotômetro de luz dispersa, potencial Zeta, microscopia de transmissão
eletrônica, concentração do fármaco, medida da viscosidade, entre outras (THAKUR
et al., 2012).
28
Considerando as inúmeras aplicabilidades das nanoemulsões
e suas
vantagens, diversos estudos investigam a incorporação de ativos para aplicação
tópica (ALAM et al., 2013; ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011; BIDONE et al., 2014;
FERNÁNDEZ-CAMPOS et al., 2013; HARWANSH et al., 2011; KHURANA; JAIN;
BEDI, 2013; MÜLLER, 2013; PATHAN; SETTY, 2011; QUINTÃO et al., 2013;
SAKEENA et al., 2010; SANDIG et al., 2013; SHAKEEL et al., 2010; ZHOU et al.,
2010). Várias espécies vegetais têm sido estudadas como fonte de novos fármacos e
seus extratos incorporados em sistemas nanométricos com o objetivo de aumentar
seu potencial terapêutico (ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011; BIDONE et al., 2014;
FASOLO, 2007; HARWANSH et al., 2011; LIANG et al., 2012; OLIVEIRA, 2008;
QUINTÃO et al., 2013; SAKULKU et al., 2009; WANG et al., 2008), havendo pouca
literatura quanto à incorporação de extratos vegetais em nanoemulsões para uso
tópico.
A Rapanea ferruginea é uma espécie vegetal da família Mirsinaceae, conhecida
popularmente como capororoca. Em algumas espécies foram isolados compostos
chamados ácidos mirsinoicos A, B e C (BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998; FRONZA;
GIURADELLI, 2009; HIROTA et al., 2002; JANUÁRIO et al., 1992). Estudos realizados
por pesquisadores no Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da
Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), isolaram o ácido mirsinoico B (AMB) do
extrato clorofórmico das cascas de R. ferruginea (TURMINA, 2005) e o ácido
mirsinoico A (AMA) do extrato etanólico dos frutos da R. ferruginea. Os extratos mole
e seco da R. ferruginea apresentaram ação antinociceptiva, via oral e intraperitoneal,
em dor de origem inflamatória, assim como o composto isolado AMB que apresentou
ação anti-hipernociceptiva em modelos animais de dor persistente de origem
inflamatória (ANTONIALLI et al., 2012). Estudos também demonstram a ação antiinflamatória tópica do AMA e AMB em edema de orelha induzido por TPA (DONG et
al., 1999; HIROTA et al., 2002). Não havendo estudos a respeito da ação anti inflamatória tópica do extrato das cascas de R. ferruginea.
Considerando o efeito antinociceptivo de origem inflamatória dos extratos da
casca de R. ferruginea e o potencial das nanoemulsões como veículos para uso
tópico, no presente estudo foi realizado o desenvolvimento de nanoemulsão contendo
o extrato mole de R. ferruginea e avaliada a atividade anti-inflamatória tópica in vivo.
29
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver nanoemulsão contendo extrato mole da casca de Rapanea
ferruginea e avaliar a atividade anti-inflamatória tópica em modelo farmacológico in
vivo.
2.2 Objetivos Específicos:
 Preparar e caracterizar quali e quantitativamente o extrato mole da casca
de Rapanea ferruginea;
 Desenvolver a nanoemulsão contendo o extrato mole da casca de Rapanea
ferruginea;
 Caracterizar a nanoemulsão com e sem extrato quanto aos aspectos físicos
e físico-químicos;
 Avaliar in vitro a liberação e a permeação cutânea dos marcadores químicos
do extrato incorporados na nanoemulsão;
 Avaliar a irritação cutânea da formulação usando modelo celular in vitro;
 Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica da nanoemulsão e do creme
contendo extrato da casca de R. ferruginea através do modelo de edema
de orelha em camundongos, análise histológica dos tecidos inflamados e
quantificação das citocinas (TNF, IL-1β, KC e MPO) nos tecidos inflamados.
30
31
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Nanoemulsões
A nanotecnologia tem desempenhado importante papel no desenvolvimento de
novas alternativas para potencializar a ação de fármacos já presentes no mercado ou
inovadores. A possibilidade que a nanotecnologia oferece de manipular fármacos e
outros materiais em escala nanométrica pode alterar suas propriedades básicas e sua
bioatividade. No caso dos veículos para fármacos, as características que podem ser
manipuladas são a solubilidade, aumento da área superficial, controle de liberação e
direcionamento para o sítio de ação (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012). Isso é de
grande aplicabilidade para o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos, já que
os extratos vegetais e fitoconstituintes apesar de demonstrarem grande potencial in
vitro, possuem pouca ou nenhuma ação in vivo, devido à pobre solubilidade lipídica
ou tamanho molecular impróprio ou ambos e, portanto são menos absorvidas e
biodisponíveis (KESARWANI; GUPTA, 2013).
A efetividade de qualquer medicamento fitoterápico depende da liberação de
uma quantidade efetiva dos seus compostos ativos. Os extratos vegetais, em que
existem vários componentes que favorecem sua ação sinérgica, os quais, em sua
maioria, são solúveis em água, característica que reduz a biodisponibilidade dos
extratos, podem ser incorporados em diferentes sistemas de liberação que aumentam
o seu fluxo de liberação, assim como a capacidade de atravessar membranas
biológicas ricas em lipídeos, melhorando a biodisponibilidade (KESARWANI; GUPTA,
2013).
Como sistemas nanométricos empregados para melhorar a biodisponibilidade
dos derivados vegetais podem ser citados os lipossomas, as microesferas, as
nanopartículas,
as transferossomas,
os etossomas, as nanoemulsões
e as
microemulsões. Os sistemas de liberação baseado em fosfolipídeos, como os
lipossomas, tem sido promissor para a efetividade e eficácia de plantas medicinais
(KESARWANI; GUPTA, 2013). Na literatura são encontradas poucas referências às
nanoemulsões como veículo para a incorporação de extratos vegetais.
Os sistemas nanométricos possuem grande aplicabilidade quando se quer
administrar medicamentos por via tópica. Embora a pele seja uma excelente via para
32
administração de medicamentos com ação tópica, local ou sistêmica, esta constitui
uma importante barreira que dificulta a penetração de ativos, já que muitos não
apresentam características que facilitam a sua penetração na pele (ESCOBARCHÁVEZ et al., 2012).
As nanoemulsões são emulsões com tamanho das gotas da fase
dispersa em escala nanométrica, encontrando-se na literatura variações entre 20, 100,
200, 300 nm e até acima de 500 nm, sendo estabelecido como critério a propriedade
óptica e a aplicação, sendo as nanoemulsões do tipo óleo em água (O/A) mais
estudadas que as nanoemulsões água em óleo (A/O) (SOLANS; SOLÈ, 2012).
As nanoemulsões têm recebido enorme atenção nos últimos anos para
aplicação em produtos de cuidados pessoais assim como veículo para administração
de vacinas, antibióticos, anticonvulsivantes, anti-hipertensivos, anti-inflamatórios,
cosméticos e preparações tópicas, podendo ser administrada por diferentes vias
(GUGLIELMINI, 2008; GUTIÉRREZ et al., 2008; THAKUR et al., 2012). Extensas
pesquisas têm surgido para o desenvolvimento, caracterização e aplicação de
nanoemulsões já que são consideradas excelentes veículos para dissolução e
transporte de ativos hidrofóbicos e/ou hidrofílicos, derivados vegetais e fitofármacos,
proteinas e peptídeos (LU; QI; WU, 2012).
O aumento do interesse na escolha das nanoemulsões como veículo na área
farmacêutica se deve as suas vantagens como (SOLANS et al., 2005; TADROS et al.,
2004; THAKUR et al., 2012):
-
possuem estabilidade frente a sedimentação ou cremeação, floculação e
coalescência;
-
não são tóxicas nem irritantes quando comparadas às microemulsões,
possibilitando a administração de fármacos por diferentes vias;
-
podem veicular fármacos hidrofílicos e lipofílicos;
-
como o tamanho das gotas é na escala nanométrica, a sua grande área
interfacial aumenta a taxa de absorção ou permeação e reduz a variabilidade,
aumentando a biodisponibilidade dos fármacos;
-
são adequadas para uso humano e animal;
-
protegem os fármacos da hidrólise e oxidação devido a sua encapsulação em
gotas de óleo e pode também mascarar o sabor no caso da administração oral;
-
aumentam a permeação de ativos através da pele;
33
-
o aspecto transparente, a fluidez e a ausência de pegajosidade fornecem às
nanoemulsões características sensoriais mais agradáveis para aplicação em
cosméticos;
-
empregam, relativamente, baixa concentração de tensoativos;
-
podem ser aplicadas como substitutas para lipossomas, os quais são muito
mais instáveis.
Na literatura o termo nanoemulsão
pode aparecer referenciado como
miniemulsões, emulsões ultrafinas, emulsões submicrométricas, etc. O termo
nanoemulsão é preferível pois dá uma ideia de tamanho de nanoescala para as gotas,
embora provoque erros de interpretação com o termo microemulsão (SOLANS et al.,
2005). Os dois sistemas, nanoemulsão e microemulsão, são basicamente diferentes
em termos de estabilidade termodinâmica. As microemulsões apresentam-se como
um sistema termodinamicamente estável, já as nanoemulsões são instáveis
termodinamicamente,
porém
estáveis
cineticamente
pois
sua
cinética
de
desestabilização é lenta, em torno de meses. As gotículas das microemulsões são
fortemente afetadas, se rompendo mediante mudanças na temperatura e/ou diluições,
enquanto as gotas das nanoemulsões se mantém estáveis nestas condições. Estas
diferenças trazem consequências para as aplicações de um ou outro sistema, já que
variando a via de administração poderão ocorrer mudanças termodinâmicas que
interferem na estabilidade do sistema escolhido (ANTON; VANDAMME, 2011).
Outro ponto que deve ser observado na diferenciação entre nanoemulsão e
microemulsão é a ordem de adição dos componentes durante a sua formação. Na
formulação de uma nanoemulsão esta ordem é muito importante, já que a mesma é
formada somente se os tensoativos são misturados primeiro com a fase oleosa. Se
eles forem misturados primeiramente com a água antes da adição da fase oleosa, irá
formar somente uma macroemulsão. Já as microemulsões independem da ordem de
adição dos componentes, após o período de equilíbrio (ANTON; VANDAMME, 2011).
Visualmente a nanoemulsão apresenta-se com aspecto transparente ou
translúcido, devido a característica do tamanho das gotas, conforme observado na
Figura 1 (SOLANS et al., 2005). Burguera e Burguera (2012) relatam aspecto
transparente com tamanho de gota entre 50 e 200 nm e translúcido ou turvo com
tamanho de gota acima de 500 nm, sendo este aspecto visual dependente do raio da
gota e da diferença no índice de refração entre as gotas e a fase contínua .
34
Contradizendo estes dados, diversos autores relatam que gotículas com tamanho
acima de 100 nm apresentam coloração branca perdendo a transparência (KLANG et
al., 2012), confirmado em diversos trabalhos que demonstram aspecto leitoso com
gotas de tamanho variando entre 200 e 220 nm (SCHALBART; KAWAJI; FUMOTO,
2010), entre 150 e 212 nm (KELMANN et al., 2007) e entre 112 e 196 nm (ARAÚJO
et al., 2011) e com aspecto transparente ou translúcido com tamanho de gota abaixo
de 30 nm (MCCLEMENTS, 2012), azulada e transparente com tamanho de gota de
aproximadamente 20 nm (PENG et al., 2010; SANDIG et al., 2013).
Figura 1 - Aspecto visual de uma nanoemulsão O/A e a estrutura das gotas.
Fonte: Gutiérrez et al., 2008.
Segundo a definição de sistemas nanométricos da Agência Européia de
Medicamentos (EMA – European Medicines Agency), estes deverão estar na faixa
próximo de 0,2 nm até em torno de 100 nm (EMA, 2006). Já de acordo com as
recomendações da Comissão Européia (EU Commission), um nanomaterial deve
possuir pelo menos um dos seguintes critérios: uma ou mais das dimensões externas
das partículas deverão estar na faixa entre 1-100 nm para mais que 1% do número de
partículas; suas estruturas superficiais ou internas deverão ter suas dimensões na
faixa de tamanho entre 1 e 100 nm; ou ter uma área superficial específica por volume
maior que 60 m²/cm³, excluindo materiais que possuem partículas menores que 1 nm
(MIHRANYAN; FERRAZ; STROMME, 2012). Considerando também que o aspecto
visual de uma nanoemulsão é transparente ou translúcido e, os trabalhos que
35
demonstram que o tamanho de gotículas maior que 100 nm caracteriza uma
nanoemulsão leitosa (MASON et al., 2006; MCCLEMENTS, 2012; SANDIG et al.,
2013; SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET; L'ALLORET, 2004), o tamanho das gotas
de uma nanoemulsão terá que ser menor que 100 nm.
O
tamanho
dos
nanosistemas
também
podem
caracterízá-los
toxicologicamente. Baseado no tamanho dos sistemas nanométricos e a sua
biodegradabilidade, Keck e Müller (2013) propõem um sistema de classificação,
dividindo estes sistemas em quatro classes. Nanosistemas com tamanho acima de
100 nm e pouco abaixo de 1000 nm, biodegradáveis, pertencem à classe I, indicando
nenhum ou menor risco toxicológico. Alguns podendo ser considerados sem nenhum
risco em princípio, pois podem possuir baixo risco ao provocar efeitos adversos
quando interagem com o sistema imune. À classe II pertencem os nanosistemas com
tamanho maior que 100 nm, porém não-biodegradáveis. Nanosistemas com tamanho
menor que 100 nm biodegradáveis, fazem parte da classe III. Sistemas pertencentes
a classe II e III possuem médio risco toxicológico. Já sistemas com alto risco
toxicológico, estão classificados na classe IV, com tamanho menor que 100 nm,
podendo acessar todas as células, e não são biodegradáveis (KECK; MÜLLER, 2013).
De acordo com esta proposta de classificação, nanoemulsões com tamanho da fase
interna menor que 100 nm possuindo componentes biodegradáveis, são consideradas
de médio risco toxicológico, pertencendo a classe III de risco.
3.1.1 Desenvolvimento de Nanoemulsões
A composição básica das nanoemulsões utiliza óleo, tensoativo e fase aquosa
(THAKUR et al., 2012), sendo a concentração do tensoativo menor do que o
necessário para a formulação de microemulsões (cerca de 20-25% de tensoativo), ou
seja, 5-10% de tensoativo para uma nanoemulsão (TADROS et al., 2004; THAKUR et
al., 2012; ZHOU et al., 2010).
Existem dois métodos principais que podem ser usados para a formação de
uma nanoemulsão, métodos que empregam baixa energia e métodos de alta energia.
Os métodos de alta energia são comumentes empregados para a geração de
nanoemulsões. Eles empregam equipamentos como agitadores com alto poder de
cisalhamento, homogeneizadores de alta pressão e métodos de sonicação, para a
geração de pequeníssimas gotículas, no entanto, o alto custo devido a grande
36
quantidade de energia necessária para a formação das nanogotículas, tornam estes
métodos não atrativos (SOLANS; SOLÈ, 2012).
No método de baixa energia há formação espontânea de gotículas minúsculas
em misturas de tensoativo-óleo-água quando as condições da formulação ou do
ambiente são alteradas, ou por mudança da composição ou alteração de temperatura,
isto é, inversão de fase e métodos de emulsificação espontânea (MCCLEMENTS,
2012). A grande vantagem do método de baixa energia é que não exige fornecimento
de energia, ou seja, as propriedades fisico-químicas intrínsecas dos componentes
geram pequenas gotículas, sendo apenas necessário uma simples agitação (ANTON;
VANDAMME, 2011; SOLANS; SOLÈ, 2012).
Em um estudo com três modelos de sistema ternário, água/tensoativo não
iônico/óleo, Anton e Vandamme (2009) indicaram que os métodos de baixa energia
seguem um simples mecanismo universal controlado pelo rápido deslocamento dos
tensoativos do óleo para a fase aquosa, dando origem a nano-emulsificação
espontânea. Isto é, a porção hidrofílica do tensoativo contido na fase oleosa é
rapidamente dissolvida na porção aquosa, em temperatura ambiente, ocasionando a
ruptura do óleo em nanogotículas, as quais são estabilizadas pelos tensoativos. O
tamanho das gotas formadas é dependente da relação de peso óleo/tensoativo
(ANTON; VANDAMME, 2011).
A inversão de fase pode ser causada por mudanças na temperatura ou na
composição. O método de inversão por temperatura (PIT – Phase Inversion
Temperature Methods) é útil na preparação de nanoemulsão usando tensoativos não
iônicos polietoxilados, sensíveis a alteração de temperatura que induz a mudanças na
hidratação das cadeias polietoxiladas alterando a curvatura do tensoativo (SOLAN;
SOLÈ, 2012). As cadeias polietoxiladas tornam-se desidratadas com o aumento da
temperatura, tornando-se mais lipofílico, invertendo a fase da nanoemulsão O/A para
A/O. Neste método o tamanho das gotas e a tensão interfacial tendem ao mínimo (LU;
QI; WU, 2012). No método de inversão por mudanças na composição (PIC – Phase
Inversion Composition Methods), a transição de fase é induzida por mudanças na
composição durante a emulsificação, em temperatura constante. O método consiste
na adição progressiva de um dos componentes (água) sobre a mistura dos outros
componentes (óleo-tensoativo) e se aplica para utilização de outros tensoativos além
daqueles
do
tipo
etoxilado.
Inicialmente,
quando
a
água
é
adicionada
progressivamente à fase oleosa, geralmente é uma microemulsão A/O; com o
37
aumento da proporção de água, o grau de hidratação das cadeias polietoxiladas do
tensoativo aumenta
progressivamente, alterando
a curvatura
espontânea do
tensoativo de negativa para zero, equilibrando as propriedades hidrofílicas-lipofílicas
do tensoativo (Figura 2). É um método considerado com grande potencial para a
produção industrial, por ser de fácil execução, além de possibilitar o emprego de
substâncias sensíveis à temperatura (SOLANS; SOLÈ, 2012).
Figura 2 - Representação esquemática demonstrando o método de emulsificação por baixa energia,
em que a quantidade de água adicionada à emulsão A/O é aumentada progressivament e
até que a inversão de fase ocorra e a emulsão O/A seja formada.
Fonte: Mcclements e Rao, 2011.
3.1.2 Caracterização das Nanoemulsões
Para a caracterização das nanoemulsões são utilizadas diversas técnicas em
que são avaliadas a aparência visual, pH, tamanho de partícula, carga da superfície
da partícula, estabilidade química dos excipientes usados e localização do fármaco
veiculado no sistema (KLANG et al., 2012).
As nanoemulsões podem ser caracterizadas pela especificidade molecular dos
constituintes, quantidade destes constituintes, e os tamanhos das estruturas de gotas
após a formação da emulsão por agitação (MASON et al., 2006). Métodos
espectrométricos são normalmente usados para monitorar a distribuição do tamanho
38
das gotas das nanoemulsões, dando informação sobre o tamanho de gota da
população em tamanho nanométrico (BURGUERA; BURGUERA, 2012).
O tamanho e a distribuição de tamanho das gotas são frequentemente
analisados para caracterizar a estabilidade das nanoemulsões. Estes parâmetros
podem ser determinados pela técnica de espalhamento dinâmico da luz (dynamic light
scattering – DLS) ou também denominado espectroscopia de correlação de fótons.
Como resultado, obtém-se a média do tamanho das gotas e o índice de
polidispersibilidade (PDI). A distribuição do tamanho das gotas representa a
homogeneidade do sistema nanoemulsionado, sendo um pequeno PDI, inferior a 0,2,
indicativo de uma distribuição estreita no tamanho das gotículas e maior estabilidade
(KLANG et al., 2012).
Na análise por DLS, a dinâmica numa dispersão, como o movimento browniano
das moléculas, provoca alterações na intensidade da difusão da luz com o tempo da
análise, sendo que estas alterações aumentam com a diminuição do tamanho das
gotas pelo fato de haver maior movimento browniano. Assim uma correlação entre as
diferentes intensidades é possível em curtos intervalos de tempo. Com isso esta
técnica traz algumas particularidades para uma análise completa, exigindo a forma
esférica da gota em análise, diluição suficiente da amostra e grande diferença no
índice de refração entre as fases (MÜLLER-GOYMANN, 2004). Estas particularidades
trazem algumas limitações para a técnica, de acordo com Klang et al. (2012), como:
-
falha no reconhecimento de pequenas concentrações de grandes gotículas
presentes em nanoemulsões, assim como a não detecção de outros
agregados de tensoativos (vesículas lipossomais e estruturas lamelares);
-
variações na forma das gotas em análise não são inteiramente representadas;
-
podem ocorrer problemas de desestabilização do sistema como floculação ou
a aparência de grandes agregados, em função da necessidade da diluição do
sistema para suficiente transparência necessária à precisa determinação do
tamanho das gotículas.
As análises por microscopia eletrônica também são empregadas para estudar
o tamanho das gotículas, além de identificar características morfológicas, como a
estrutura interna. As técnicas de microscopia eletrônica comumente utilizadas na
caracterização de nanoemulsões são microscopia eletrônica de transmissão – MET
(transmission eletron microscopy - TEM), microscopia eletrônica de varredura – MEV
39
(scanning eletron microscopy - SEM) e microscopia de força atômica - MFA (atomic
force microscopy - AFM) (KLANG et al., 2012). Pode-se, também, associar mais de
uma técnica, como usar a MEV com um detector de transmisão de elétrons,
microscopia eletrônica de varredura e transmissão (transmission scanning eletron
microscopy - TSEM), assim como MET equipado com uma unidade de scanner
(KLANG; VALENTA; MATSKO, 2013).
Na MEV a imagem é formada ponto a ponto pelo escaneamento de uma
emissão de elétrons concentrados sobre uma amostra sólida. A grande vantagem
desta técnica é a profundidade do foco combinada ao método de formação da
imagem, projetando áreas sombreadas e áreas recuadas mais escuras, tornando a
imagem melhor interpretada pelo olho humano. As desvantagens são o tempo de
exposição da amostra à emissão de elétrons para a geração da imagem, o que pode
levar a danos, falta de detalhes internos da amostra e resolução limitada (KLANG et
al., 2012; KLANG; VALENTA; MATSKO, 2013). O preparo das amostras consiste na
secagem ou desidratação, podendo empregar álcool e congelamento, além do
revestimento com partículas de ouro. Uma alternativa para análise de nanoveículos
hidratados usando MEV é a microscopia eletrônica de varredura ambiental –
MEVambiental (environmental scanning eletron microscopy, ESEM). Esta técnica se
baseia no uso de um sistema a vácuo graduado de múltiplas aberturas, mantendo a
pressão em torno de 5000 Pa. As amostras podem ser vistas sob vapor de água ou
outros gases auxiliares. Porém a resolução não é suficiente para visualizar estruturas
em nanoescalas (KLANG et al., 2012).
A MET é análoga à microscopia óptica, porém não utiliza a luz para visualizar
a amostra e, sim, emissão de elétrons. Esta técnica emprega o vácuo e a imagem
obtida é resultado da interação da amostra com os elétrons, ou seja, dispersão de
elétrons. A resolução na MET é proporcional à aceleração da voltagem dos elétrons,
sendo que para sistemas coloidais são usadas voltagens entre 80 e 200 kV, e
resolução entre 0,3 e 1,0 nm. Na análise de nanoemulsões, o preparo da amostra
através do congelamento é mais adequado para a obtenção das imagens. Porém, se
este método não está disponível, a técnica convencional empregando um contraste
negativo pode ser uma opção (KLANG et al., 2012).
A técnica de contraste negativo é frequentemente empregada para obter
imagens de sistemas coloidais por MET, em que se pode visualizar o tamanho, a
forma e a estrutura interna da amostra (KLANG et al., 2012). São usados como
40
agentes de contraste sais de metais pesados como tungstênio, molibdênio ou urânio,
sendo que para nanoemulsões são frequentemente usados ácido fosfotúngstico ou
suas soluções salinas ou acetato de uranila (ARAÚJO et al., 2011; BALI; ALI; ALI,
2010; DESAI; VYAS; AMIJI, 2008; GANTA; AMIJI, 2009; HATANAKA et al., 2010;
KLANG et al., 2012; PATHAN; SETTY, 2011). Os metais pesados como constraste
não devem interferir na secagem da amostra e formarem uma fina camada
transparente e resistente aos danos da emissão de elétrons, ou seja, além de criarem
um contraste, criam um suporte físico protetor para a amostra.
Para a preparação da amostra, uma gota de nanoemulsão é colocada sobre
uma grade de cobre revestida com carbono, em que é rapidamente adsorvida e,
posteriormente, a solução aquosa do sal de metal pesado é aplicada para contrastar.
A amostra é então secada e observada por MET a temperatura ambiente. A forte
dispersão dos íons metálicos formam um escudo amorfo que envolve as gotas de óleo
fracamente dispersas para melhorar o contraste na microscopia eletrônica, assim um
grande contraste é visto nas imagens por MET, ou seja, as gotículas claras contrastam
com o fundo mais escuro (KLANG et al., 2012).
Na análise de nanoemulsões, os fatores que podem afetar a integridade
estrutural da amostra são os mesmos tanto para MEV quanto para MET. Ambas as
técnicas empregam etapas de secagem e fixação que afetam a estrutura e a
morfologia, provocam encolhimento e agregação dos componentes do sistema,
devendo-se, portanto, ter cuidado ao interpretar as imagens obtidas. Na MET o uso
do vácuo pode provocar a evaporação dos componentes hidratados da nanoemulsão.
O emprego de metais pesados como contraste pode levar a uma aparência seletiva
da amostra dependendo do alcance ou reação deles com a amostra para ser
detectado, podendo algumas partes do sistema ficarem invisíveis. O contraste
aumentado na interface das gotas de óleo está relacionado a afinidade do agente
contrastante com os componentes interfaciais. Deve-se otimizar a melhor técnica para
o uso do contraste, como tipo e quantidade (KLANG et al., 2012).
Estas técnicas podem resultar em imagens de um sistema alterado que não
tem semelhança alguma com o sistema realmente formado. Em análises com MET
em temperatura ambiente, a qualidade das imagens obtidas depende da eficácia do
tensoativo em estabilizar as gotas de óleo. Destaca-se que o uso do congelamento na
preparação de amostras para as técnicas MET e MEV (crio-MET e crio-MEV)
proporciona uma visualização exata da morfologia das gotículas de óleo. O tratamento
41
criogênico de nanoemulsões antes da análise por MEV e MET resulta no estudo do
seu estado morfológico inicial e imagens livres de artefatos (KLANG et al., 2012).
Outras avaliações que podem ser realizadas para as nanoemulsões são
potencial zeta, para mensurar a carga da superfície, e comportamento reológico
(THAKUR et al., 2012). O potencial zeta está relacionado à estabilidade das
dispersões coloidais, indicando a força de repulsão entre as partículas adjacentes
igualmente carregadas. Um alto potencial zeta confere estabilidade quando o tamanho
das gotículas é pequeno, indicando que o sistema será resistente à agregação das
partículas. O valor alto para potencial zeta pode ser alto no sentido positivo (+30 mV)
e negativo (-30 mV). Valores negativos para potencial zeta indicam que a formulação
está negativamente carregada (BALI; ALI; ALI, 2010). Uma emulsão alcança o
máximo de estabilidade quando o potencial zeta é maior que ± 30 mV (ARAÚJO et al.,
2011).
Vários
fatores
como
tamanho
médio,
estrutura
das
gotículas,
polidispersibilidade e viscosidade de cada fase da emulsão afetam sua estabilidade e
propriedades, e os efeitos provocados por estes fatores são estudados pela reologia
(EL-DIN et al., 2013; GILBERT et al., 2013). As emulsões e nanoemulsões podem
variar em sua consistência de aspecto fluido para aspecto semissólido, exigindo
medições sob várias deformações (ou tensões), sendo três diferentes medidas
reológicas aplicadas: agitação em estado estacionário,
estresse
constante
(deformação) e dinâmico (oscilatório). É muito importante realizar estas medições em
função da temperatura para obter informações sobre a estabilidade física e
consistência do produto. Estas medições reológicas empregadas para predizer a
estabilidade de emulsões, relacionam-se com o estudo de estabilidade a longo prazo
(6-12 meses) (TADROS, 2004). As propriedades do filme interfacial também podem
ser estudadas a partir da reologia do filme interfacial, tais como a sua viscosidade e
elasticidade. Estes estudos resultam em um entendimento sobre os vários processos
de quebra ou separação de fases em emulsões (TADROS, 1994).
3.1.3 Estabilidade de Nanoemulsões
Embora o tamanho pequeno das gotículas em uma nanoemulsão a torne
resistente a desestabilização física, a perda de estabilidade das nanoemulsões pode
ocorrer
de
muitas
maneiras
(figura
3),
como
separação
gravitacional
42
(cremeação/sedimentação), floculação, coalescência e maturação de Ostwald
(MCCLEMENTS, 2012; WOOSTER; GOLDING;
facilmente visível
SANGUANSRI,
2008) sendo
qualquer indício de instabilidade por serem transparentes
(SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET; L'ALLORET, 2004).
Figura 3 - Esquema demonstrando as diferentes formas de desestabilização de uma nanoemulsão.
Fonte: McClements e Rao, 2011.
As nanoemulsões podem perder a transparência com o tempo, devido ao
aumento do tamanho da gota. Esta alteração pode estar relacionada com a
preparação não adequada do sistema na análise de distribuição das gotas, e se não
for estabilizada quanto à maturação de Ostwald, sendo este talvez o problema de
instabilidade mais sério nas nanoemulsões (TADROS et al., 2004).
A taxa de maturação de Ostwald se dá pela coalescência das gotas, com
aumento no tamanho das nanogotículas como consequência da difusão molecular do
óleo entre as gotículas através da fase contínua, levando a sua desestabilização com
consequente sedimentação das mesmas (AMANI et al., 2010; WOOSTER; GOLDING;
SANGUANSRI, 2008). A maturação de Ostwald segue o efeito de Kevin, em que
emulsões com pequenas gotas tem maior solubilidade local do óleo que gotas
grandes, devido à diferença nas pressões de Laplace provocada pela quebra do
tamanho das gotículas pela intensa agitação durante o processo de formação da
nanoemulsão (WOOSTER; GOLDING; SANGUANSRI, 2008). Esta desestabilização
é proporcional à solubilidade do óleo na fase aquosa em emulsões O/A (SOLANS et
43
al., 2005). A adição de um segundo óleo ao sistema que tenha baixa solubilidade na
fase aquosa (TADROS et al., 2004) e/ou o uso de um segundo tensoativo com o
mesmo tamanho de cadeia alquil e maior grau de etoxilação que o primeiro
(IZQUIERDO et al., 2005) podem ser soluções para a prevenção da maturação de
Ostwald.
Para a determinação da estabilidade das nanoemulsões leva-se em conta
alguns fatores como a carga de superfície das gotículas (potencial Zeta), estrutura
molecular dos tensoativos, proporção dos componentes hidrofílicos e lipofílicos,
proporção de tensoativos e proporção na combinação dos mesmos, e estrutura
molecular do óleo (AMANI et al., 2010). Em estudos para verificação de fatores que
influenciam na estabilidade e que controlam o tamanho das gotículas em uma
nanoemulsão contendo budesonida, triglicerídeos de cadeia média como óleo,
polissorbato 80 como tensoativo e etanol como co-tensoativo, foi constatado que a
energia total empregada durante a formação do sistema é um fator dominante no
controle do tamanho das gotículas finais em uma nanoemulsão e a concentração do
álcool controla o crescimento do tamanho das gotículas, neste sistema desenvolvido
(AMANI et al., 2008; AMANI et al., 2010).
A nanoemulsão inicial deve apresentar tamanho pequeno de gotículas, o que
irá assegurar uma longa estabilidade cinética. Controlando a distribuição do tamanho
das gotas e adicionando estabilizadores na formulação,
como tensoativos,
modificadores reológicos, ou retardatores de maturação de Ostwald, aumenta-se a
estabilidade cinética das nanoemulsões (MCCLEMENTS, 2012).
3.2 Plantas Medicinais de Uso Tópico
O uso de plantas para tratamento de doenças é milenar e teve origem na Índia
e China. Segundo estimativa da OMS, o mercado mundial de medicamentos
fitoterápicos e produtos naturais vale 62 bilhões de dólares e vai chegar aos 5 trilhões
em 2050, com crescimento de cerca de 7% ao ano (PINTO, 2013).
No Brasil, país com maior biodiversidade do planeta, tem-se importante
conhecimento tradicional sobre o uso de plantas medicinais e potencial para
pesquisas para o desenvolvimento de tecnologias e terapêuticas adequadas para o
seu uso. Por meio da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,
aprovada pelo Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, o governo brasileiro
44
estabeleceu as diretrizes para atuar na área de plantas medicinais e fitoterápicos
(BRASIL, 2006).
O uso de plantas medicinais pela população tem aumentado na busca por
terapias alternativas. Nos EUA estima-se que 50% da população utilize alguma forma
de medicina
alternativa,
e
muitos
desses sem informar
ao seu médico
(BEDI;SHENEFELT, 2002). Na Alemanha, país onde se consome metade dos
extratos vegetais comercializados na Europa, a auto-medicação com esta classe de
medicamentos é muito comum também, embora 70% dos clínicos gerais alemães
prescrevem ervas licenciadas (VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). Esta busca
pela medicina alternativa vem de alguma falha da medicina tradicional ou porque os
efeitos adversos são pouco percebidos pelos usuários quando os produtos são
naturais (BEDI; SHENEFELT, 2002).
Produtos a base de plantas são frequentemente usados na composição de
produtos de uso tópico, na Alemanha 15% das plantas medicinais utilizadas pela
população são para tratar doenças de pele (VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).
Plantas usadas na área da dermatologia vem sendo testadas e pesquisadas,
demonstrando significativa evidência científica para tratamento de patologias como
psoríase, acne, dermatite atópica e outros problemas dermatológicos. No entanto, são
poucos os dados científicos de estudos clínicos sobre o uso de plantas para
tratamento dermatológico , pois o seu uso é grandemente baseado no conhecimento
tradicional (BEDI; SHENEFELT, 2002; PINTO,
2013; REUTER;
MERFORT;
SCHEMPP, 2010).
As plantas indicadas no tratamento de doenças cutâneas podem ter atividades
antioxidante,
anti-inflamatória,
antibacteriana,
antifúngica,
anti-histamínica,
estimulante da imunidade e fotoprotetora, além de reduzirem inflamação e prurido,
acelerar a cicatrização de feridas, fortalecer os cabelos e agir como promotores
antitumorais. Apesar do grande uso popular de plantas medicinais, existem
numerosos casos de potenciais efeitos adversos em particular reações adversas
cutâneas como dermatite alérgica de contato, dermatite de contato irritante, reações
de fototoxicidade e urticária de contato (CORAZZA et al., 2009). Medicamentos à base
de plantas geralmente contém diversos compostos ativos farmacologicamente
exigindo um teste de eficácia muito mais complexo do que para medicamentos que
empregam drogas sintéticas. Uma proposta para avaliação destes medicamentos é
considerar o extrato da planta como um princípio ativo, no entanto, o extrato deve
45
estar suficientemente caracterizado. Esta caracterização é frequentemente realizada
através da padronização do extrato através de um dos seus componentes chave, que
pode ser a substância farmacologicamente ativa ou, quando não conhecida, um
marcador desta substância. A padronização, no entanto, traz como incoveniente a
consideração somente de uma ou duas substâncias, ficando os diversos outros
componentes em segundo plano, e isto pode influenciar na eficácia e segurança do
fitoterápico (ERNST, 2005).
Isso demonstra a importância de mais pesquisas
empregando plantas medicinais com o objetivo de evidenciar cientificamente suas
propriedades terapêuticas e sua segurança.
3.3 Rapanea ferruginea Mez. (Myrsinaceae)
A planta Rapanea ferruginea é uma das espécies da família Myrsinaceae,
conhecida popularmente como canela-azeitona,
camará,
capororocaçu,
capororoca-vermelha,
capororoca, azeitona-do-mato,
pororoca
e
capororoca-mirim
(BACCARIN, 2010; PASCOTTO, 2007). R. ferruginea é uma espécie pantropical,
encontrada no Brasil especialmente nas regiões litorâneas, como Bahia, Espírito
Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul e Santa
Catarina (COSTA, 2011). É uma árvore de porte médio com 6-12 m de altura e tronco
de 30-40 cm de diâmetro (FRONZA; GIURADELLI, 2009), apresenta frutos pequenos
3-5 mm de diâmetro, globosos e de cor negro-arroxeadas quando estão maduros
servindo de alimento para aves (PASCOTTO, 2007). As folhas são simples,
alternadas no caule (FREITAS; CARRIJO, 2008), a casca externa é áspera de cor
cinzento-rosada com a parte interna vermelha (LORENZI, 1992).
Na medicina popular as folhas e as cascas da R. ferruginea são preparadas na
forma de chás e indicada como diurética, no combate a doenças do trato urinário,
pruridos, eczemas, erupções, urticária, reumatismo e doenças do fígado, no
tratamento de processos inflamatórios e dolorosos, estes dois últimos confirmados por
estudos biológicos (ANTONIALLI et al., 2012; CECHINEL FILHO et al., 2013; HESS
et al., 2010).
46
Figura 4 - Foto da árvore Rapanea ferruginea.
Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.
Existem aproximadamente
100 espécies da família
Myrsinaceae, que
apresentam ácidos terpeno-p-hidroxibenzoicos e triterpenoides (HARDEN, 1990).
Todas as espécies de Rapanea possuem como princípios ativos os derivados dos
ácidos benzoico prenilados, os ácidos mirsinoicos. Há relatos de três espécies
estudadas no Brasil, R. umbellata, R. lancifolia, R. guyanensis, das quais foram
isolados os compostos ácidos mirsinoicos A (AMA), B (AMB) e C (AMC), figura 5
(HIROTA et al., 2002; JANUÁRIO et al., 1992), além de outros metabólitos
secundários, como as benzoquinonas, entre elas a bis-(2,5-diidroxi-4-undecil-3,6benzoquinona) (FRONZA; GIURADELLI, 2009). Ácidos benzoicos prenilados foram
isolados também da espécie R. myricoides Schltdl. (Myrsinaceae), incluindo o AMB
(BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998).
47
Figura 5 - Estruturas químicas dos ácidos mirsinoicos A, B e C.
Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.
Em estudos fitoquímicos das cascas da R. ferruginea foram isolados os ácidos
benzoicos prenilados AMA, AMB e AMC (FRONZA; GIURADELLI, 2009).
O AMB é um ácido benzoico prenilado de nome químico 5-carboxi-7-(3”, 3”dimetilalil)-2-(1-hidroxi-1, 5 dimetilex-4-enil) 2,3-dihidrobenzeno-furano encontrado em
grandes concentrações nos extratos da raiz e cascas de R. ferruginea (BACCARIN,
2010; SILVA, 2013; TESTONI, 2004) e que pode ser quantificado por técnica
cromatográfica líquida de alta eficiência (CLAE) (BACCARIN et al., 2011).
Demonstrou-se que o AMB isolado da R. ferruginea apresenta efeito
antinociceptivo tanto em relação à dor induzida quimicamente quanto por estímulo
térmico, além da ação na reversão de processos hiperalgésicos (HESS, 2006), em
modelos de hiperalgesia em animais com neuropatia diabética (GALVAN, 2007) e em
modelos animais de dor persistente de origem inflamatória neuropática (ANTONIALLI,
2009; ANTONIALLI et al., 2012). Também evidenciou-se a ação anti-hiperglicemiante
do AMB em animais diabéticos induzidos com aloxano (MATTOS, 2006), atividade
antitumoral em Tumor Ascítico de Ehrlich (TESTONI, 2004) e ação anticolinesterásica
(FILIPPIN, 2010). Esta última, inferior ao efeito do AMA em todos os tecidos cerebrais
em ratos (FILIPPIN, 2010). Constatou-se sua atividade antileishmaniose (CECHINEL
FILHO et al., 2013) e, juntamente com o AMA, apresentou atividade antibacteriana
48
contra bactérias gram-positivas (CRUZ et al., 2013). O AMB isolado a partir do extrato
etanólico das cascas de R. ferruginea, apresentou citotoxicidade frente às linhagens
K562 (33,38 ± 5,28 µg/mL) e NALM6 (44,77 ± 33,32 µg/mL) (TOMIO, 2011).
Trabalhos realizados com o AMB isolado da espécie Myrsine seguinii,
demonstraram atividade inibidora da produção de sulfeto de hidrogênio por patógenos
periodontais in vitro e metilmercaptano envolvidos em problemas de halitose (ITO;
NARISE; SHIMURA, 2008; ITO et al., 2010). Em extratos metanólicos desta mesma
espécie, foram isolados os ácidos mirsinoicos A, B, C e F, os quais apresentaram
atividade anti-inflamatória pela supressão do edema de orelha em ratos induzidos por
TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato). A porcentagem de inibição do edema para
a dose de 1,4 µmol aplicado topicamente foi de 65% para o AMA, 83% para o AMB,
68% para o AMC e na dose de 0,56 µmol, 77% para o ácido mirsinoico F (HIROTA et
al., 2002).
O AMA isolado a partir do extrato etanólico dos frutos da R. ferruginea, segundo
estudos realizados por Gazoni (2009), apresenta atividade anticolinesterásica in vitro
através de ensaio bioautográfico em placas cromatográficas e em tecido cerebral de
ratos (FILIPPIN, 2010), sendo estes resultados comprovados em estudo in vivo com
melhora da cognição em modelo animal (COSTA, 2011). O AMA, do extrato etanólico
das cascas da R. ferruginea, foi citotóxico frente à linhagem K562 (170,13 ± 32,67
µg/mL) (TOMIO, 2011).
Estudo realizado para confirmar se o efeito anti-inflamatório do AMA suprime a
proliferação celular usando o modelo do edema de orelha em ratos induzido por TPA,
demonstrou, in vitro, que o AMA é um inibidor seletivo da DNA polimerase em
mamíferos, sendo seu efeito maior frente a polimerase β em comparação com a
polimerase α. In vivo, uma solução metanólica do AMA a 500 µg/40 µL, apresentou
65% de efeito inibitório sobre a inflamação induzida em orelhas de ratos, com forte
ação inibitória sobre ambas as polimerases. Este estudo demonstrou que os efeitos
inibitórios sobre as polimerases mostram relação com a supressão do efeito
inflamatório induzido pelo TPA (MIZUSHINA et al., 2000). A aplicação de 500 µg de
AMA isolado de um extrato metanólico de folhas e caules de Myrsine seguinii,
topicamente em orelhas de ratos, também resultou em 65% de efeito inibitório à
inflamação induzida pelo TPA, em estudo realizado por Dong et al. (1999). Esta
atividade anti-inflamatória foi semelhante a do ácido glicirrízico (77% de efeito
inibitório), já a aspirina com 1% de efeito inibitório demonstrou menor atividade
49
inibitória que o AMA, mesmo sendo também um derivado do ácido hidroxibenzoico
como o AMA. Provavelmente este efeito deve-se as porções lipofílicas dos terpenos
as quais podem influenciar na maior atividade anti-inflamatória observada para o AMA
(DONG et al., 1999).
Baccarin (2010) desenvolveu e padronizou o extrato seco de R. ferruginea por
spray drying, empregando cascas secas da planta, as quais foram caracterizadas
através de métodos farmacopeicos. Definiu-se como melhor condição de extração das
cascas, solução hidroalcoólica 90 °GL por um período de 2 h por maceração dinâmica
(aproximadamente 300 rpm), pois resultou em maior quantidade de resíduo seco
(BACCARIN et al., 2014). Para a obtenção do extrato seco por spray dryer as
melhores condições encontradas foram teor de sólidos de 5%, com 30% de Aerosil®,
um fluxo de alimentação de 4 mL/min e temperatura de entrada de 170 °C. Ainda
neste estudo, avaliou-se a atividade antinociceptiva dos extratos mole e seco por via
oral e intraperitoneal usando como fármaco de referência a indometacina. Constatouse que as maiores doses aplicadas dos dois extratos resultaram em melhor inibição
de resposta dolorosa envolvida na dor inflamatória do que na dor neurogênica, sendo
esta resposta maior na administração oral. Outro dado importante, deste estudo, é
que o resultado do estudo farmacológico foi maior no lote de extrato seco que não
obteve maior concentração de AMB, sugerindo sinergia entre os componentes do
extrato (BACCARIN, 2010). Estudo realizado por Tomio (2011) evidenciou atividade
citotóxica do extrato etanólico das cascas da R. ferruginea frente às células HELA
(28,30 ± 13,09 µg/mL), L929 (56,04 ± 14,24 µg/mL), K562 (mais que 100 µg/mL) e
NALM-6 (98,90 ± 0,00 µg/mL).
Barretta (2011) analisou a atividade antioxidante dos extratos etanólico e
clorofórmico das cascas, galhos, folhas e frutos da R. ferruginea. Neste trabalho o
extrato clorofórmico da casca e dos frutos, o extrato etanólico dos galhos e os
compostos isolados AMA e AMB da R. ferruginea, apresentaram maior atividade
antioxidante pelo método antioxidante direto, ORAC (Oxygen Radical Absorbance
Capacity, ou capacidade de absorção do radical oxigênio), assemelhando-se ao
controle positivo Trolox®. Os extratos etanólicos dos frutos e casca na concentração
de 10 µg/mL, apresentaram atividade antioxidante superior aos demais extratos
avaliados quanto à capacidade de sequestrar os radicais livres DPPH e ABTS +. Neste
estudo ainda observou-se maior conteúdo de compostos fenólicos no extrato etanólico
das cascas (43,74%) e nos frutos (33,63%), os quais demonstraram ainda relação
50
direta com a porcentagem da atividade antioxidante nos métodos DPPH e ABTS +, foi
concluído também que todos os extratos obtidos foram capazes de quelar o metal
ferro, tendo proteção adicional contra o estresse oxidativo. A avaliação da
citotoxicidade dos extratos etanólico de frutos e folhas demonstrou ausência de
toxicidade nas concentrações de 0,01, 1 e 10 µg/mL, apresentando redução da
viabilidade celular somente a 100 µg/mL. O AMA apresentou possível efeito citotóxico
na concentração de 10 µg/mL. Os extratos etanólico dos frutos e folhas e o composto
AMA demonstraram ação protetora contra a formação de espécies reativas na
avaliação da atividade citoprotetora contra o agente estressor AAPH. O extrato dos
frutos em concentrações inferiores a 100 µg/mL apresentou maior proteção gênica
que os demais extratos avaliados, na análise da atividade antigenotóxica.
Com base nos dados da atividade anti-inflamatória dos ácidos mirsinoicos por
via tópica e ação antinociceptiva de origem inflamatória do extrato mole da R.
ferruginea por via oral, convém investigar a ação do extrato mole da casca da R.
ferruginea veiculado em nanoemulsão, quanto à atividade de supressão da inflamação
tópica induzida in vivo, a fim de verificar se há atividade tópica anti-inflamatória do
extrato e se a nanoemulsão favorece a absorção dos marcadores na pele,
potencializando sua ação.
3.4 Resposta Inflamatória
A inflamação é uma resposta patofisiológica dos tecidos frente a uma agressão
que leva ao acúmulo local de fluídos e células, tendo como principal objetivo a
resolução da infecção ou reparação ao dano tecidual e estabelecimento do estado de
homeostasia (BARTON, 2008; SOSA et al., 2002). Mesmo sendo um meio de defesa
do organismo, a inflamação pode induzir, manter ou agravar muitas doenças devido a
sua complexidade e o envolvimento de mediadores inflamatórios (SOSA et al., 2002).
Quanto ao tempo de duração, a inflamação pode ser dividida em duas
categorias, aguda e crônica. A inflamação aguda é relativamente de curta duração,
caracterizando-se por vasodilatação, exudação plasmática e migração de células
primariamente realizada por neutrófilos, sendo estas fases parte da resposta imune
inata. A inflamação crônica, por sua vez, é caracterizada por um tempo de resolução
prolongado e até mesmo sem resolução, onde a inflamação está ativa e a destruição
e a reparação tecidual ocorrem simultaneamente, apresentando histologicamente
51
infiltração de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) e fibrose
tecidual (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
A vasodilatação, como um aspecto clássico da inflamação aguda, caracteriza se clinicamente por vermelhidão e calor no local da lesão, e facilita a liberação local
de mediadores solúveis e células inflamatórias, sendo mediada primeiramente pelo
óxido nítrico (NO) e prostaglandinas vasodilatadoras. A vasodilatação envolve,
inicialmente, arteríolas seguido pelo surgimento de novos microvasos. A formação de
edema, como outro clássico sinal de inflamação, é causada por alterações nas
funções de barreira dos pequenos vasos sanguíneos, aumentando a permeabilidade
dos capilares a um fluido rico em proteínas e água como consequência da ação de
histaminas, bradicinina, leucotrienos,
componentes do sistema complemento,
substância P e fator de ativação plaquetária (PAF) (SHERWOOD; TOLIVER-KINSK Y,
2004).
Os eventos da vasodilatação e edema são acompanhados pela marginação,
adesão e migração leucocitária, sendo os neutrófilos os primeiros e mais abundantes
leucócitos a serem liberados no local da inflamação (SHERWOOD; TOLIVERKINSKY, 2004). O extravasamento leucocitário é controlado por proteínas que incluem
moléculas de adesão, proteases, citocinas e quimiocinas. Para garantir a migração
adequada dos leucócitos aos locais de inflamação, existem mecanismos que
controlam este movimento como a regulação das quimiocinas ou expressão dos
genes dos receptores das quimiocinas. Estes mecanismos regulatórios podem
aumentar ou diminuir a resposta inflamatória em relação a função e disponibilidade
das quimiocinas (MORTIER; DAMME; PROOST, 2012). Durante a migração, os
leucócitos podem encontrar, em sequência ou simultaneamente, várias quimiocinas.
O extravasamento leucocitário é influenciado, também, pela cooperação entre as
quimiocinas e as citocinas, que levam ao acúmulo e ativação dos leucócitos nos locais
da inflamação (GOUWYA et al., 2012).
As quimiocinas fazem parte de uma família de citocinas quimiotáticas
indispensáveis no tráfego de leucócitos, guiando-os ou retirando-os do local da
inflamação e coordenando a recirculação de linfócitos, além de influenciar na
sobrevivência dos leucócitos e funções como degranulação. Estas citocinas
quimiotáticas são induzíveis, portanto expressas em resposta a infecção, lesão
tecidual ou estresse. Estruturalmente as quimiocinas são divididas em 4 subgrupos
(CXC, CC, CX3C e C), em função da localização dos resíduos de cisteína NH 2-
52
terminal (MORTIER; DAMME; PROOST, 2012). As quimiocinas murinas, quimiocina
derivada dos queratinócitos (KC) e proteína inflamatória dos macrófagos 2 (MIP-2),
são as maiores quimioatraentes responsáveis por recrutarem neutrófilos (FILIPPO et
al., 2008) e estão relacionadas com a interleucina-8 (IL-8) de humanos e a CINC1/CXCL-1 de ratos (PIRES, 2009).
Citocinas são polipeptídeos produzidos por vários tipos de células que regulam
as respostas imunes e inflamatórias (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). As
citocinas são multifuncionais e o bloqueio de uma única citocina terá efeitos limitantes
sobre a resposta inflamatória global. As citocinas atuam como indutoras e reguladoras
do crescimento, divisão e diferenciação celular, como estimulantes da migração
celular e controladoras da função celular e da interação entre a expressão de
moléculas de adesão e receptoras de citocinas (CORSINI; GALLI, 2000). Exemplos
clássicos de citocinas são o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1 (IL-1),
ambas induzem a febre, estimulam a produção de proteínas de fase aguda pelo fígado
e promovem a ativação de células endoteliais (SHERWOOD; TOLIVER-KINSK Y,
2004). A expressão da IL-1 é regulada a nível transcricional pelo NF-κB, que também
é responsável pela expressão da TNF (FELDMEYER et al., 2010). Além disso, TNF e
IL-1β atuam sinergicamente no aumento do rolamento leucocitário durante a infiltração
celular (ZHANG et al., 2001).
O TNF é liberado primeiramente por macrófagos presentes no sítio da lesão e
modula uma variedade de eventos imunológicos e metabólicos. No local da infecção
ou inflamação, o TNF inicia uma resposta imune que ativa mecanismos de defesa
antimicrobiano e, após a erradicação da infecção, ele repara o tecido. Esta citocina
atua como um potente ativador de neutrófilos e fagócitos mononucleares, servindo
também como
um
fator
de crescimento
para
fibroblastos
e
angiogênico
(SHERWWOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). O TNF é um regulador importante das
moléculas de adesão e quimiocinas, que juntas coordenam a resposta inflamatória.
Embora o TNF seja um potente indutor da infiltração de neutrófilos, ele é um fraco
quimioatraente e o seu efeito sobre o tráfego de leucócitos no tecido, parece ser
dependente da indução e secreção de quimiocinas. Estudos demonstram que o TNF
regula a expressão de MIP-2 e KC na pele e pulmões (ZHANG et al., 2001). No
entanto, a liberação sistêmica de TNF pode ativar uma cascata destrutiva de eventos
que pode resultar em dano tecidual, disfunção do orgão afetado e morte
(SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
53
IL-1β é uma citocina altamente inflamatória, secretada por macrófagos,
monócitos e células dendriticas, linfócitos B e células natural killer (NK) (JOOSTEN;
NETEA; DINARELLO, 2013). Esta citocina estimula a expressão de ciclo-oxigenase2 (COX-2) que leva a formação e liberação de prostanoides importantes na
sensibilização do nociceptor, ou seja, a IL-1β atua como um mediador hipernociceptivo
(PIRES, 2009). A IL-1β tem um papel central na defesa contra patógenos, no entanto,
a sua expressão pode ser desencadeada por fatores causadores de estresse do
hospedeiro ou do ambiente celular e irritantes cutâneos. É um mediador das respostas
inflamatórias, corroborando para a sobrevivência de células T, super regulação do
receptor dos linfócitos para IL-2, aumento da produção de anticorpos das células B
além da sua proliferação, e promoção da diferenciação das células T-helper 17
(ABRAMOVITS; BEJARANO; VALDECANTOS, 2013).
Outro
componente
que
regula
o
extravasamento
leucocitário
é
a
mieloperoxidase (MPO), uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos
onde se expressam em maior proporção, também está ativa nos monócitos, porém
em menor extensão. Quando há a diferenciação dos monócitos em macrófagos, a
expressão da MPO é geralmente perdida, podendo ser reiniciada sob certas
condições. A MPO está diretamente envolvida na homeostasia celular e é um fator
importante na iniciação e progressão de várias doenças inflamatórias. Quando ativa,
a MPO em associação ao peróxido de hidrogênio e cloro, produz um potente oxidante,
o ácido hipocloroso (HOCl), que é a chave para atividade microbicida dependente de
oxigênio dos neutrófilos. Além desta função, estudos tem demonstrado que o HOCl
pode ativar o fator de transcrição nuclear-κB (NF-κB) e a fosfoliração da tirosina em
células T e B, levando ao aumento da sinalização de cálcio e a produção do TNF. A
atuação do oxidante formado a partir da ação da MPO inclui ainda, a modulação da
resposta imune das reações inflamatórias, afetando interações célula-célula e a
adesão celular dos leucócitos, desempenhando papel importante na migração e
infiltração leucocitária (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009). A MPO, através da
produção do HOCl e radicais livres, promove danos teciduais, ativa NF-kB e outros
fatores de transcrição, modula o tônus vascular pelo óxido nítrico (NO), sendo seus
níveis representativos da progressão da doenças inflamatórias crônicas (MEOTTI et
al., 2008). A MPO através da sua função sinalizadora da sobrevivência dos neutrófilos
pode influenciar na duração de uma resposta inflamatória (VEEN; WINTHER;
HEERINGA, 2009).
54
3.4.1 Inflamação cutânea
A pele agindo como primeira linha de defesa do corpo frente a grandes lesões,
invasão por micro-organismos e traumas, possui muitos mecanismos de defesa.
Desequilíbrios nos mecanismos de defesa da pele, seja por atividade imunológica
inadequada ou por agressão através de agentes, leva a alterações na estrutura e
função cutânea ocasionando o aparecimento de doenças de pele de origem
inflamatória, que também podem estar relacionadas à diversas doenças sistêmicas. A
inflamação cutânea é um problema comum de pele que apresenta diversas
modificações morfológicas e fisiológicas neste tecido (ABDEL-MOTTALEB et al.,
2012; BICKERS; ATHAR, 2006; LEE et al., 2009).
Estímulos externos como alérgenos por contato e radiação UV são indutores
da inflamação cutânea, que é provocada e mantida pela interação de várias
populações de células (BARKER et al., 1991; LEE et al., 2009). A pele é
imunológicamente ativa e é capaz de reagir frente a estímulos antigênicos (KIMBER
et al., 1999). Após o contato com substâncias irritantes ou alérgenas, em menos de 2
h, mecanismos celulares são ativados na pele humana para aumentar a infiltração de
linfócitos T, independente da sensibilidade imune específica, refletindo a capacidade
da pele em responder a irritação química (FUCHS et al., 2001), a atividade das
citocinas e outros mediadores da inflamação determinam a magnitude da resposta
imune inata (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Os componentes celulares
primários do sistema imune inato são macrófagos, células dendríticas, células natural
killer (NK) e neutrófilos (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Em relação a
sensibilização de contato, as células dendríticas, especialmente as células de
Langerhans epidérmica, são os mais importantes componentes do sistema imune
cutâneo, além das citocinas que regulam seus movimentos, maturação e função. As
células de Langerhans, células imunocompetentes, se encontram na epiderme e
formam uma contínua rede que captura os antígenos que se encontram na pele, sendo
então responsável pela interação, internalização, processamento e transporte de
antígenos. Durante o transporte dos antígenos, as células de Langerhans adquirem a
habilidade de apresentar o antígeno para os linfócitos T, reguladas e estimuladas
pelas citocinas epidérmicas, as quais são induzidas ou mantidas pela sensibilização
55
da pele. A partir disso os linfócitos T se dividem e se diferenciam, representando a
base da sensibilização cutânea (KIMBER et al., 1999).
As células da epiderme e derme são conhecidas como produtoras de uma
grande variedade de citocinas, e o queratinócito é o principal produtor de muitas das
citocinas identificadas e moléculas de adesão, seja esta expressão constitutiva ou por
indução de vários estímulos (GRÖNE, 2002; KIMBER et al., 1999). Queratinócitos são
ativados através da indução por agentes alérgenos e irritantes, sintetizando e
secretando citocinas (FUCHS et al., 2001). Algumas citocinas são produtos exclusivos
das células de Langerhans, enquanto outras são produzidas por queratinócitos e
somente algumas citocinas são expressas por estas duas células (KIMBER et al.,
1999).
As citocinas produzidas pelos queratinócitos incluem as interleucinas -1, -6, -7,
-8, -10, -12, -15, -18, e -20, o TNF e interferons (IFN) alfa, beta e gama (GRÖNE,
2002). Das citocinas produzidas pelos queratinócitos, somente as citocinas IL-1α, IL1β e TNF ativam um número suficiente de mecanismos efetores de forma
independente para provocar a inflamação cutânea (CORSINI; GALLI, 2000). A
produção de citocinas pelos queratinócitos tem como consequências a ativação de
células
endoteliais microvasculares
da derme, acúmulo
seletivo de células
mononucleares específicas da derme e epiderme, podendo, ainda, ter efeito sistêmico
sobre o sistema imune, sobre a proliferação de queratinócitos e processos de
diferenciação, além de afetar a produção de outras citocinas pelos queratinócitos
(BARKER et al., 1991; GRÖNE, 2002). Os queratinócitos também são responsivos às
citocinas derivadas das células T e das células dendríticas (FELDMEYER et al., 2010).
Estudos sugerem que os queratinócitos são a maior fonte de IL-1 na pele,
citocina que tem importante papel em doenças inflamatórias e alérgicas da pele, como
a psoríase ou dermatite de contato (FELDMEYER et al., 2010). A IL-1 existe em duas
formas, IL-1α e IL-1β, sendo a primeira predominantemente produzida e armazenada
nos queratinócitos, enquanto a segunda é essencialmente sintetizada por macrófagos
e monócitos (FUCHS et al., 2001). A IL-1, de maneira geral, induz a expressão de
moléculas de adesão sobre as células endoteliais que juntamente com a indução de
quimiocinas, estimula a infliltração de células inflamatória e imunocompetentes
(FELDMEYER
et al.,
2010) tais
como
monócitos,
linfócitos
e
leucócitos
polimorfonucleares, assim como estimula a produção de outras citocinas (FUCHS et
al., 2001).
56
O TNF está armazenado nos monócitos da derme da pele e influenciado por
um estímulo, esta citocina pode ser produzida por queratinócitos e células de
Langerhans, atuando através da induçãoda expressão de moléculas de adesão
cutânea e endoteliais (CORSINI; GALLI, 2000) e da habilidade em aumentar a
permeabilidade vascular (MURAKAWA et al., 2006).
Níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de
oxigênio (ROS) contribuem para os mecanismos patofisiológicos associados a várias
patologias inflamatórias da pele (LEE et al., 2009), como psoríase, dermatite atópica
e dermatite de contato (FUCHS et al., 2001). Muitos agentes externos ou são por si
oxidantes ou catalisam a produção de ROS, direta ou indiretamente (BICKERS;
ATHAR, 2006). ROS podem ser liberadas durante a infiltração dérmica com células
inflamatórias ou podem ser produzidas pelos queratinócitos em resposta a alguma
exposição química. A produção constitutiva de ROS pelos queratinócitos se dá por
processos específicos e pode ser induzida por várias citocinas, fatores de crescimento
e outros estímulos fisiológicos. Já a exposição dos queratinócitos à substâncias
químicas irritantes, que tem ROS como mediadores, levam ao aumento da síntese de
citocinas (FUCHS et al., 2001) formando um ciclo. As citocinas IL-1 e TNF induzem a
produção celular de ROS, perpetuando sua própria formação e ação (FUCHS et al.,
2001).
3.4.2 Tratamento da Inflamação cutânea
O tratamento tópico de doenças cutâneas é muito interessante devido a
redução da ação sistêmica e dos efeitos colaterais sistêmicos das substâncias ativas,
quando comparadas a adminsitração oral ou parenteral. Além disso, a aplicação
tópica de medicamentos permite maior flutuação dos níveis plasmáticos típicos da
administração repetida de substâncias rapidamente eliminadas, e evita eliminação
pela primeira passagem através do fígado (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT;
KORTING, 2007).
Os tratamentos atuais para reações inflamatórias cutâneas se concentram no
alívio dos sintomas da doença cutânea, reparando a função de barreira, reduzindo o
prurido, as infecções secundárias e a inflamação. Para tratar inflamações cutâneas ,
os veículos atualmente usados para a administração dos fármacos, empregam
formulações clássicas como pomadas e cremes, e muitos destes medicamentos são
57
uma combinação de hidratantes, anti-histamínicos, antibióticos e glucocorticoides,
alguns trazendo reações não desejáveis (ABDEL-MOTTALEB et al., 2012; LEE et al.,
2009). Os glucocorticoides representam a terapia padrão para a redução da
inflamação e da ativação da resposta imune em doenças dermatológicas, sendo a
terapia mais amplamente usada na dermatologia (SCHÄCKE; DÖCKE; ASADULLAH,
2002). A atuação dos glucocorticoides é através da redução da transcrição gênica
para IL-2, interferindo também na transcrição de TNF, IFN-γ, IL-1 (RAUH, 2008). No
entanto, esta terapia traz inúmeros efeitos adversos na pele como atrofia da epiderme
e derme, hipertricose, acne, dermatite perioral, distúrbios na pigmentação da pele,
eritema e telangiectasias (SCHÄCKE; DÖCKE; ASADULLAH, 2002).
Por outro lado, aproximadamente 50% dos medicamentos utilizados são
obtidos a partir de fontes naturais. O uso de medicamentos fitoterápicos aumentou
devido a melhor atividade terapêutica e menores efeitos colaterais quando comparado
ao medicamentos sintéticos (GUNASEKARAN et al., 2014). As plantas medicinais são
amplamente empregadas na medicina popular para tratar doenças inflamatórias
cutâneas. Estudo realizado por Sosa (2002) demonstrou que a maioria dos extratos
de algumas plantas selecionadas em Belize, na América Central, são empregadas
tradicionalmente pela população local em desordens cutâneas, demonstraram
atividade anti-inflamatória tópica em modelo de edema de orelha induzido pelo óleo
de cróton. Terapias empregando plantas tem obtido êxito no tratamento de doenças
dermatológicas por milhares de anos na Europa e Ásia, sendo usadas ainda nos dias
de hoje pela sua eficácia e algumas possuem comprovação ciêntífica para o seu uso
(BEDI; SHENEFELT, 2002).
Embora os fitoterápicos demonstrem admirável atividade terapêutica in vitro,
possuem menor eficácia in vivo por consequência de várias características como
pobre solubilidade lipídica, ocasionando baixa absorção e consequentemente, pobre
biodisponibilidade (KESARWANI; GUPTA, 2013). Além disso, deve ser considerada a
grande complexidade da composição dos derivados vegetais, como os extratos, em
que a presença de componentes com diversas características químicas e o sinergismo
que exite entre os mesmos influenciando na sua ação terapêutica, é um desafio tanto
relacionado à tecnologica farmacêutica como à avaliação da eficácia do fitoterápico
desenvolvido (KESARWANI; GUPTA, 2013).
O uso de veículos convencionais, como cremes e pomadas, para substâncias
ativas tem alguns inconvenientes como a baixa porcentagem do fármaco absorvida
58
associada a alta taxa de variações na absorção entre indivíduos, gerando doses
subterapêuticas do medicamento na pele de alguns indivíduos e indução de efeitos
colaterais locais ou sistêmicos indesejáveis em outros. A pele possui uma função de
barreira muito eficiente devido a camada córnea da pele, que dificulta a absorção de
ativos, sendo um grande desafio no desenvolvimento de medicamentos tópicos
garantir uma adequada penetração cutânea, mesmo considerando que a penetração
de ativos é facilitada nas desordens cutâneas como psoríase e dermatite (SCHÄFERKORTING; MEHNERT; KORTING, 2007).
Desta forma, veículos que facilitam a penetração na barreira formada pelo
estrato córneo cutâneo
(SCHÄFER-KORTING;
MEHNERT; KORTING,
2007),
melhoram a atividade e superam os problemas relacionados às plantas medicinais
que podem comprometer a sua absorção e eficácia (GUNASEKARAN et al., 2014) é
uma alternativa promissora.
Nas últimas décadas tem-se intensificado o estudo de novos veículos para a
administração de derivados vegetais, que devem liberar o princípio ativo em uma
concentração adequada às necessidades do corpo durante o período de tratamento e
direcioná-lo para o local de ação. O uso de nanocarreadores tem inúmeras vantagens
para a administração de derivados vegetais e fitofármacos, como o aumento da
solubilidade e biodisponibilidade, proteção à toxicidade, aumento da atividade
farmacológica, aumento da estabilidade, manutenção da liberação do princípio ativo
e proteção da degradação física e química (GUNASEKARAN et al., 2014).
Na literatura encontram-se poucos trabalhos que trazem a incorporação de
extratos vegetais em nanoemulsões para aplicação tópica. Em trabalho recentemente
publicado, verificou-se que a nanoemulsão é um veículo adequado para incorporação
de extratos etanólicos líquido e seco da planta macela (Achyrocline satureioides), para
tratamento tópico de desordens cutâneas (BIDONE et al., 2014). Nanoemulsões
também se mostraram promissoras para veicular topicamente extratos hidroalcoólicos
de folhas e cascas de Vellozia squamata, demonstrando a mesma ação antioxidante
que os extratos (QUINTÃO et al., 2013). Sugumar e colaboradores (2014) verificaram
que o óleo de eucalipto incorporado em nanoemulsão para aplicação tópica,
demonstrou atividade antibacteriana para Stafilococos aureus e cicatrizante sem
causar irritação cutânea em ratos.
59
No entanto, para os fármacos classicamente empregados no tratamento da
inflamação cutânea, existem diversos trabalhos estudando nanocarreadores como
veículos tópicos.
Um estudo experimental empregando nanopartículas com tamanho entre 50 e
1000 nm, com e sem incorporação de betametasona, em orelhas de ratos saudáveis,
demonstrou a influência do tamanho das partículas. As partículas menores que 100
nm tiveram uma deposição seletiva nos folículos pilosos e glândulas sebáceas na pele
inflamada, sugerindo uma estratégia quando se quer veículos cujo alvo sejam locais
específicos da pele inflamada, redução dos efeitos adversos locais e da exposição da
pele saudável. Quando investigadas as nanopartículas contendo betametasona,
verificou-se aumento do efeito terapêutico com a redução do tamanho das partículas
(ABDEL-MOTTALEB et al., 2012). Sandig et al. (2013), avaliou o efeito analgésico
tópico in vivo de nanoemulsões com imipramina e doxepina, em ratos. O efeito
analgésico foi maior com a doxepina, sugerindo uma alternativa para terapia
analgésica tópica.
Subramanian et al. (2008), em estudo incorporando aspirina em nanoemulsões
para administração tópica com o objetivo de reduzir os efeitos adversos do fármaco,
comparou a atividade anti-inflamatória da aspirina em nanoemulsão e em suspensões
pela aplicação tópica em orelhas inflamadas de camundongos, no modelo de edema
de orelha induzido por óleo de cróton. A veiculação da aspirina em nanoemulsão
aumentou sua atividade anti-inflamatória no modelo testado quando comparado com
a veiculação em suspensão. A redução da inflamação, neste estudo, está associada
com alterações no acúmulo de citocinas pró-inflamatórias na orelha, sugerindo uma
alternativa para redução dos efeitos adversos associados à altas dosagens de aspirina
administradas oralmente.
Os nanocarreadores apresentando-se como alternativas para administração de
fármacos através
do estrato córneo (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012), e
reconhecendo as inúmeras vantagens que estes veículos possibilitam aos derivados
vegetais, torna este trabalho de desenvolvimento de uma nanoemulsão contendo
extrato vegetal com ação anti-inflamatória, uma promissora alternativa na terapia antiinflamatória cutânea.
60
61
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Material vegetal
As cascas de R. ferruginea foram coletadas em Blumenau (SC), em parceria
com a Profa. Dra. Angela Malheiros, em outubro de 2013 de uma árvore com 35 cm
de diêmetro de tronco e a uma altura de 20 cm do solo. As cascas foram secas em
estufa de ar circulante a 45 ºC por 3 dias.
A droga vegetal foi pulverizada em moinho de facas e posteriormente tamisada
manualmente em tamis de malha de 2 mm, selecionando as partículas menores que
2 mm para a preparação da solução extrativa conforme item 4.3, de acordo com os
dados da análise granulométrica para otimização da extração de AMB das cascas de
R. ferruginea obtida por Baccarin e colaboradores (2014).
4.1.2 Materiais e reagentes

3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina, Sigma®, lote: #0001432567-V

Acetato de etila P.A., Vetec®, lote: 1203375

Acetonitrila, grau HPLC, Tedia ®, lote: 1202016

Ácido fosfórico, Merck®, lote: K36616573641

Ácido mirsinoico A (AMA)

Ácido mirsinoico B (AMB)

Ácido sulfúrico, Merck®, lote: K37546331 729

Água purificada, obtido por destilação

Água ultrapura grau I, obtido pelo sistema Milli-Q® – sistema de obtenção de
água

Albumina, Applichem®, lote: 8M006877

Álcool etílico absoluto, Synth®, lote: 165608

Alkest® CSO 400, Oxiteno®, lote: 130501C114759

Aprotinina, Applichem®, lote: 7V003064

Capryol® 90, Gattefossé®, lote: 134950

Células NCTC clone 929, fibroblastos L-929 provenientes do Banco de Células
do Rio de Janeiro BCRJ: 0188, lote: 001163
62

Cetiol® 868, Audaz®, lote 1204889

Cetiol® V

Cloreto benzetônio, Fluka Biochemika ®, lote: 1144892

Cloreto de potássio, Merck®, K37429936745

Cloreto de sódio PA, Merck®, lote: K38447104 807

Cromatoplaca sílica gel 60 F254, Merck ®, lote: HX066874

D-Glicose, Nuclear®, lote: 02040651

Dimetilsulfóxido, Dinâmica®, lote: 35574

EDTA dissódico, Merck®, lote: K37886918 743

Eosina amarelada CI 4538, Vetec®, lote: 1100662

Fluoreto de fenildimetilsulfonil (PMSF), Sigma ®, lote: 028K0766

Fosfato de potássio monobásico PA, Vetec ®, lote: 0604392

Fosfato de sódio PA, Nuclear®, lote: 08061008

Fosfato de sódio dibásico PA, Nuclear®, lote: 08071042

Grades de cobre 400 mesh com filme FormVar/carbono para microscopia
eletrônica de transmissão

Hexadeciltrimetilamônio brometo, Fluka ®, lote: 1312661

Hexano P.A., Lafan®, lote: 13280

Hidróxido de sódio PA, Merck®, lote: B0183698 749

Labrafil® M1944CS, Gattefossé®, lote: 136228

Labrasol®, Gattefossé®, lote: 139960

Membrana de diálise, Sigma-Aldrich®, lote 07796ME

Metanol, grau HPLC, J.T. Baker®, lote: M04CO2

Metanol P.A., Vetec®, lote: 1204283

Miristato de Isopropila, Casa das Essências®, lote: R3G121051214

Nitrogênio líquido

Óleo de cróton, Sigma®, lote: 065K1429

Pele de orelha de porco provenientes do Frigorífico Antônio Carlos (Antônio
Carlos – SC)

Peróxido de hidrogênio, Vetec ®, lote: 0805129

Phenonip®, Pharma Special®, lote: GBG0007304

Placa para cultura de células de 96 poços 3599, Costar®

Placa para cultura de tecidos de 6 poços 92006, TPP ®
63

Propilenoglicol, Via Farma, lote: 3252*ZL2731A003

Sepigel® 305, Fagron®, lote: 13125101ª

Solução de hematoxilina de Harris, Dinâmica®, lote: 40277

Span® 80, Sigma®, lote: 33706125

Streptavidina-HRP kit mouse IL-1β, R&D Systems, lote: AEM 4907031

Streptavidina-HRP kit mouse CXCL1/KC, R&D Systems, lote: AEM 6309021

Streptavidina-HRP kit mouse TNF-α, R&D Systems, lote: AEM 6409042

Tamis, abertura 2 mm/µm, Bertel®

Triglicérides Cáprico Capril, Embrafarma ®, lote: 14038 (FI)

Triton® X-100, Sigma®, lote: 29085

Tween® 20, Vetec®, lote: 022911

Tween® 80, Dinâmica Química®, lote: 36668

Xileno PA, Cromato Produtos Químicos LTDA, lote: 0604.05/10
4.1.3 Equipamentos

Agitador magnético Mg-Multi Marte®

Agitador mecânico Fisatom® 713D

Aparato de permeação cutânea Microette Q-PakTM, composto por: células de
Franz Hanson Research, placa de agitação magnética MIXdrive com controle
MIXcontrol 2Mag Magnetic e Motion, banho de circulação programável Hanson
Research.

Autoclave Quimis® modelo 190.22

Balança analítica Bel® UMark 250ª

Balança Infravermelho Mettler-Toledo® LJ 16

Banho maria com circulação Marconi ® MA 159

Banho ultrassônico Ultracleaner 800A Unique®

Câmara de ultravioleta Dist®

Capela de exaustão Permution® modelo CE0701

Centrífuga Hermle® Z300

Centrífuga Micro Fanem® Mod. 243

Chapa de aquecimento Fisatom®

Cromatógrafo Shimadzu® LC 20-AC com uma bomba quaternária LC-20AT
Shimadzu®, detector de varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de
64
fotodiodos (diodo array) SPD-M20A Shimadzu®, injetor automático SIL-20AHT
Shimadzu®, software LC Solution®

Espectrofotômetro de UV/VIS Shimadzu® modelo UV-1601

Estufa com 5% de CO2, 85% de umidade relativa e 37 ± 1 °C, Ultrasafe ® ,
modelo HF 212UV

Estufa de ar circulante Quimis®

Estufa de cultura Quimis® modelo 316.22

Estufa de secagem Fanem® modelo 315 SE

Estufa Fanem® 502C

Fluxo laminar Veco® modelo VLFS-12 série 8195

Freezer -80°C

Lâminas para microscopia 26,0x76,0 mm, Precision® Glass Line

Lamínula 24,0x32,0 mm Glasscyto®

Leitor de microplaca Spectro Star Nano, BMG Labtech

Microcentrífuga de velocidade refrigerada Vision® modelo VS-15000CFNII

Micrômetro digital Mitutoyo® modelo APB-2D

Microscópio eletrônico de transmissão Jeol modelo JEM-1200EXII

Microscópio óptico Olympus® CBA

Microscópio Olympus modelo CKX41 com sistema digital de imagem Q colors
3

Micropipeta automática Labmate® 100 µL e 50 µL

Micropipeta de precisão Microman Gilson® 250 µL

Micropipeta multicanal (12 canais 30-300 µL) Eppendorf® Research

pHmetro AJMicronal® AJX-512

Potenciômetro Digimed® modelo DM20

Triturador de tecidos Tissue TearorTM modelo 985370 Biospec® Products

Viscosímetro rotacional Haake ® modelo VT 550, K10, DC30, tipo cone placa,
acoplado a um banho de água termostatizado e software Rheowin® 4 Data
Manager 430.0013 e Rheowin® 4 Job Manager

Vortex Biomixer® QL-901

Zetasizer Nano ZS Modelo ZEN3600 Malvern®
65
4.2 Análise das cascas pulverizadas de R. ferruginea
As cascas da R. ferruginea foram analisadas quanto ao do teor de cinzas totais,
cinzas insolúveis em ácido e perda por dessecação.
Para a determinação dos teores de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido
das cascas pulverizadas, foi empregado método farmacopeico (ANVISA, 2010), em
triplicata.
Para cinzas totais, foi pesado 3 g da planta pulverizada, em triplicata, e
transferida para cadinho previamente tarado e seco, ficando a droga uniformemente
distribuída. A droga contida no cadinho foi incinerada a temperatura máxima de 600
°C, até a eliminação de todo carvão. Após, foi resfriada em dessecador e pesada. Este
procedimento foi repetido até que a amostra atingisse peso constante. A porcentagem
de cinzas foi calculada em relação a droga seca e o resultado expresso em média ±
desvio padrão.
Para a determinação das cinzas insolúveis em ácido, o resíduo obtido na
determinação de cinzas totais foi fervido por 5 minutos com 25 mL de ácido clorídrico
a 7% (p/V) em cadinho coberto com vidro de relógio. Após, o vidro de relógio foi lavado
com água quente, juntando a água de lavagem ao cadinho. O resíduo insolúvel em
ácido foi recolhido sobre papel filtro isento de cinzas, lavando-o com água quente até
que o filtrado se tornasse neutro. O papel filtro contendo o resíduo foi transferido para
o cadinho original e secado em chapa quente, após foi incinerado a cerca de 500 °C
até peso constante. A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido foi calculada em
relação a droga seca e expressa em média ± desvio padrão.
Para avaliação da perda por dessecação, foi empregado cerca de 1 g das
cascas pulverizadas e tamisadas em balança de infravermelho a 105 °C. A droga foi
uniformemente distribuída sobre o prato da balança, em triplicata. A perda por
dessecação foi expressa em porcentagem, sendo calculada a média e desvio padrão.
4.3 Obtenção e caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.
ferruginea
4.3.1 Obtenção
A solução extrativa das cascas de R. ferruginea foi obtida pelo método de
maceração dinâmica. A droga vegetal na proporção planta/solvente 10% (p/V) foi
66
macerada empregando-se solvente hidroalcoólico 90 °GL, à temperatura ambiente,
sob agitação em agitador mecânico (800 ± 30 rpm), sem renovação do líquido extrator,
por 2 h, conforme padronizado por Baccarin e colaboradores (2014). Posteriormente
a solução foi filtrada em três camadas de tecido Sontara®. A solução extrativa obtida
foi filtrada novamente a vácuo em filtro de papel. Após este processo foi calculado o
rendimento da solução extrativa obtida e expresso em porcentagem.
Para obtenção do extrato mole, o volume da solução extrativa foi reduzido até
cerca de 50% em banho-maria a 45 °C. Após, foi concentrado em estufa de ar
circulante a 45 °C até apresentar aspecto xaroposo. Ao término deste processo foi
calculado o rendimento, que foi expresso em porcentagem.
4.3.2 Caracterização
4.3.2.1 Aspectos organolépticos
Para análise dos aspectos organolépticos foi observado a cor e odor dos
derivados vegetais.
4.3.2.2 Determinação do pH
O pH da solução extrativa foi determinado por leitura direta em potenciômetro
calibrado a 25 °C. O resultado foi calculado pela média de três determinações.
Para a determinação do pH do extrato mole, foi realizado a diluição do mesmo
em água destilada na proporção de 1:10 (p/V), e o valor de pH determinado em
triplicata, calculando-se a média ± desvio padrão.
4.3.2.3 Determinação do resíduo seco (BRASIL, 2010)
O resíduo seco para derivados vegetais obtidos foi determinado em triplicata
empregando 2 mL da solução extrativa e aproximadamente 0,5 g do extrato mole. As
amostras foram transferidas para pesa-filtros e evaporadas até secura em chapa de
aquecimento. Depois foram dessecadas em estufa a 100-105 °C, por 3 h, resfriadas
em dessecador e pesadas. O procedimento foi repetido até peso constante. O resíduo
seco foi calculado em porcentagem sobre a massa pesada e sobre o volume de 2 mL,
sendo calculado a média e o desvio padrão.
67
4.3.2.4 Perfil qualitativo dos derivados vegetais de R. ferruginea por Cromatografia em
Camada Delgada (CCD)
Na análise do perfil qualitativo por CCD, a solução extrativa foi analisada sem
prévia diluição ou concentração e o extrato mole foi diluído para obtenção de uma
solução a 5 mg/mL em metanol. Os ácidos mirsinoicos AMA e AMB foram empregados
como marcadores sendo dissolvidos em acetona. Foram utilizadas cromatoplacas de
sílica gel e como sistema de eluição, uma mistura de hexano e acetato de etila (1:1)
(BACCARIN et al., 2014).
As soluções dos padrões de AMA e AMB e dos extratos foram aplicados com
capilares na forma de manchas circulares. Os cromatogramas foram desenvolvidos
de forma ascendente, em cubas saturadas com o sistema eluente até a altura de
aproximadamente 10 cm. Após a secagem, à temperatura ambiente, a cromatoplaca
foi visualizada em câmara de UV em 254 nm, e posteriormente realizada a revelação
com anisaldeído sulfúrico com posterior aquecimento da placa cromatográfica
(BACCARIN et al., 2014).
4.3.2.5 Determinação do teor de AMA e AMB
O teor de AMA e AMB (mg/g) nos derivados vegetais foi determinado
empregando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) usando metodologia
desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2014). As análises foram realizadas em
parceria com a mestranda Tailyn Zermiani. A detecção por varredura de espectro foi
realizada na faixa de comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm e os
comprimentos de onda de 260 e 270 nm foram selecionados para quantificação dos
marcadores AMA e AMB, respectivamente.
A fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa Kinetex XB®
C18, 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 µm. A fase móvel
utilizada foi uma mistura de acetonitrila (ACN), metanol e água acidificada com ácido
fosfórico a pH 2,5 (Quadro 1). Todos os solventes usados foram de grau HPLC e os
componentes da fase móvel foram filtrados a vácuo com membrana de celulose
regenerada com 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em
banho de ultrassom. Foi usado o método gradiente apresentado no Quadro 1, com
fluxo de 0,9 mL/min, volume de injeção de 20 L e temperatura de 35 °C.
68
Quadro 1 - Condições cromatográficas para análise dos derivados
vegetais de R. ferruginea por CLAE.
Tempo
Acetonitrila
*Água
Metanol
(min)
(%)
(%)
(%)
0
5
70
25
2
5
70
25
5
30
45
25
10
60
15
25
12
70
5
15
15
84
1
15
25
84
1
15
30
5
70
25
35
5
70
25
*Água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5.
Para a análise da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, diluiu-se a
amostra na proporção de 1:5 com metanol. Posteriormente as soluções foram filtradas
com membrana de PTFE modificada de 0,45 μm, colocadas em frasco do tipo vials
(1,5 mL), e injetadas em triplicata. Para análise do extrato mole, foi pesado 1 mg do
extrato e dissolvido em 1 mL de metanol, filtrado em membrana de PTFE modificada
de 0,45 μm, colocadas em frasco do tipo vials e injetado em triplicata. Os padrões
AMA e AMB foram injetados na concentração de 50 µg/mL em metanol.
A determinação do teor de AMB e AMA nos extratos foi determinada pelo
cálculo da área dos seus picos encontradas no cromatograma obtido pela análise das
soluções amostra, em comparação com a área dos mesmos nas soluções padrão.
4.4 Estudos de pré-formulação das nanoemulsões
4.4.1 Determinação da solubilidade do extrato
A partir dos óleos e tensoativos selecionados com base na literatura
pesquisada, que podem ser empregados no desenvolvimento da nanoemulsão, a
solubilidade do extrato mole na concentração de 10 mg/mL foi testada em 5 mL de
cada óleo e na mistura de óleo:tensoativo na proporção de 1:2 em um frasco com
tampa. Os frascos foram agitados em agitador vortex e mantidos por 24 h sob agitação
magnética a 25 ± 2 °C. A mistura obtida teve a absorbância analisada em
69
espectrofotômetro UV/Visível com varredura nos comprimentos de onda entre 190 nm
a 800 nm para seleção da melhor absorbância. Como branco foi usado o óleo ou
óleo:tensoativo correspondente. A partir do resultado encontrado para a absorbância,
foram selecionados os óleos e tensoativos para o desenvolvimento da nanoemulsão.
4.4.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato
O coeficiente de partição do extrato mole foi determinado usando o método de
agitação do frasco, conforme De Carli (2007).
O coeficiente de partição (P) é definido como a razão das concentrações em
equilíbrio de uma substância dissolvida em um sistema de duas fases, composto de
dois solventes imiscíveis, n-octanol e água, usando a equação 1.
𝑃=
𝐶𝑛−𝑜𝑐𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝐶á𝑔𝑢𝑎
(1)
O n-octanol foi saturado com uma quantidade idêntica de água, para isso, a
mistura dos dois solventes foi agitada por aproximadamente 12 h, em agitador
magnético a 400 rpm. A fase aquosa foi separada em funil de separação e
centrifugada 1400 rpm por 10 minutos.
Após a saturação, 10 mL de uma solução aquosa contendo 100 µg/mL do
extrato mole de R. ferruginea foi adicionado em 10 mL do n-octanol saturado. Esta
mistura sofreu agitação por 30 min, em banho-maria a 37 ± 0,5 °C, foi transferida para
um funil de separação e mantida em repouso por 5 minutos. Após o repouso, a fase
aquosa foi retirada e centrifugada por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi
analisado em triplicata por CLAE.
4.5 Desenvolvimento das nanoemulsões
4.5.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário
O processo de obtenção das nanoemulsões foi otimizado utilizando o diagrama
de fases pseudoternário a fim de determinar a melhor combinação e proporção entre
os componentes (fase oleosa, fase aquosa e sistema tensoativo).
Antes de dar início à construção do diagrama de fases, foi necessário
determinar a combinação de tensoativos selecionados com base no teste de
solubilidade e as suas proporções para que o valor de EHL (equilíbrio hidrófilo-lipófilo)
70
fosse semelhante ao EHL do óleo selecionado, miristato de isopropila (EHL 11,5)
(CONVERGENT COSMETICS, 2013). Foram realizadas três misturas contendo dois
tensoativos cada, sendo que a combinação considerou a mistura de um tensoativo
com valor de EHL alto e outro tensoativo com EHL baixo, conforme apresentado no
Quadro 2.
Quadro 2 - Combinações de tensoativos
desenvolvimento das nanoemulsões.
Combinação de Tensoativos
Capryol® 90 (EHL= 6) +
Alkest® CSO 400 (EHL= 13)
Capryol® 90 (EHL= 6) +
Tween® 80 (EHL= 15)
Alkest® CSO 400 (EHL= 13) +
Span® 80 (EHL= 4,3)
e suas respectivas
proporções
empregadas
no
Proporção
1,5:5,5
3,5:5,5
7,2:1,5
Para a mistura dos componentes na combinação de Capryol® 90 e Tween® 80
a temperatura foi a ambiente, já para as outras duas combinações a temperatura foi
de 45 °C para uma perfeita homogeneização dos tensoativos.
O diagrama foi estudado empregando dois métodos distintos, o método da
titulação e o método ponto a ponto. No método da titulação, baseado nos trabalhos
realizados por Shafiq-un-Nabi e colaboradores (2007) e Li e colaboradores (2005), as
misturas de óleo:tensoativo foram fixadas em diferentes proporções, como segue:
(1:9), (2:8), (3:7), (4:6), (5:5), (6:4), (7:3), (8:2), (9:1). Estas misturas receberam
concentrações adicionais de água em intervalo de 24 h, para que o volume total diário
em mL fosse: 1,1; 1,2; 1,25; 1,3; 1,35; 1,4; 1,45; 1,5; 1,55; 1,6; 1,65; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0;
2,2; 2,3; 2,5; 2,7; 3,0; 3,2; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 e 10,0. A água foi adicionada
com o auxílio de uma micropipeta, sob agitação, em vortex, mantendo-se a agitação
por 2-3 minutos após a sua completa adição. A cada adição de água, os sistemas
foram armazenados em estufa a 25 ± 2 °C por 24 h e após tiveram o seu aspecto
visual analisado a olho nu.
Os sistemas foram visualmente classificados como: FU – Fluido Turvo; FT –
Fluido Transparente; FL – Fluido Translúcido; FB: Fluido Branco, leitoso; SF:
Separação de Fases; GT: Gelificado Transparente; GL – Gelificado Translúcido; GU:
71
Gelificado Turvo; GR: Gelificado com Ressonância; EG: Emulsão Gelificada; E:
Emulsão. O diagrama foi plotado usando software Sigma Plot® 12.0.
Partindo dos resultados obtidos pelo diagrama de fases por titulação, excluíramse os pontos com separação de fases e com formação de emulsão e os demais pontos
foram preparados individualmente. Baseando-se no trabalho realizado por Peng et al.
(2010), ou seja, cada proporção dos componentes, óleo, mistura de tensoativos e
água, foram preparadas individualmente, misturando-se a proporção de óleo e mistura
de tensoativos primeiramente e após adicionando-se a quantidade total de água gota
a gota, sob agitação em vortex. O sistema foi mantido em agitação por 2-3 minutos
seguido de repouso por 24 h. O aspecto físico foi analisado visualmente a olho nu e
mensurada a distribuição do tamanho das gotículas por DLS após diluição em água.
A partir dos resultados encontrados foram selecionadas as formulações para
estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica.
4.5.2 Estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica das
nanoemulsões sem extrato
A partir do resultado obtido no diagrama de fases usando miristato de isopropila
como fase oleosa e a mistura de Alkest® CSO 400 e Span® 80 como tensoativos,
foram selecionadas 3 formulações que apresentaram tamanho médio de gotas menor
que 100 nm, com baixo índice de polidispersibilidade, com aspecto fluido e com baixa
concentração de tensoativo. As formulações escolhidas estão detalhadas no Quadro
3. As formulações selecionadas foram preparadas em duplicata para verificar a
reprodutibilidade do método de preparo, na quantidade total de 30 g.
Quadro 3 - Formulações dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o
estudo de estabilidade preliminar.
Fórmula
Óleo (% )
Tensoativos* (% )
Água (% )
4:6:20
13,3
20,0
66,7
5:5:70
6,3
6,3
87,5
6:4:20
20,0
13,3
66,7
*Alkest ® CSO 400 e Span® 80 (7,2:1,5).
O método de preparo consistiu na pesagem de todos os componentes e da
mistura do óleo com a combinação de tensoativos Alkest® CSO 400: Span® 80 na
proporção de 7,2:1,5, respectivamente. Os recipientes contendo a água e a mistura
72
de óleo e tensoativos foram mantidas em banho-maria até atingirem a temperatura de
80 °C. Após aquecimento, a água foi gotejada lentamente na fase oleosa contendo
tensoativos, sob agitação em agitador mecânico com velocidade constante de 600
rpm. Após o término da adição de água, o sistema foi mantido sob agitação por mais
5 minutos com aquecimento, e, posteriormente, mais 3 minutos sem aquecimento.
As amostras ficaram em repouso por 24 h e, após este período, foram
analisadas quanto ao aspecto físico, diâmetro médio das gotas por DLS, índice de
polidispersibilidade, pH e separação de fases após centrifugação a 3000 rpm por 15
min, para visualização de qualquer sinal de instabilidade física. Após estas análises,
as amostras foram submetidas ao estudo de estabilidade preliminar em 6 ciclos de 24
h a 40 ± 2 °C e 4 ± 2 °C. Ao término do período, as amostras foram analisadas
novamente quanto aos aspectos verificados no tempo inicial.
As formulações que não apresentaram sinais de instabilidade, após o teste de
centrifugação no término do ciclo, foram encaminhadas para o ciclo gelo/degelo para
verificação da estabilidade termodinâmica. Este teste foi adaptado da metodologia
empregada por Shafiq-Un-Nabi e colaboradores (2007). As amostras passaram por 3
ciclos de 48 h a temperaturas de -4 ± 2 °C e 25 ± 2 °C.
4.5.3 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo
extrato
A partir dos resultados encontrados, o extrato mole das cascas da R. ferruginea
foi incorporado na concentração de 0,5% nas formulações 5:5:70 e 6:4:20 para
averiguar a compatibilidade entre as formulações e o extrato. A escolha da
concentração de 0,5% do extrato baseou-se no resultado obtido em estudo
farmacológico preliminar de atividade anti-inflamatória tópica no modelo de edema de
orelha induzido por óleo de cróton, Figura 30 do item 5.11, realizado em parceria com
a Profa. Dra. Marcia Maria de Souza do Laboratório de Farmacologia in vivo da
UNIVALI, descrito no item 4.11.2.
Neste estudo o extrato foi incorporado nas concentrações de 0,25%, 0,5% e
1,0% em creme convencional. A formulação do creme é apresentada no Quadro 4.
Para a incorporação do extrato na formulação do creme, o mesmo foi previamente
dissolvido em propilenoglicol em quantidade suficiente, e adicionado à formulação
pronta do creme.
73
Quadro 4 - Composição do creme convencional utilizado nos ensaios farmacológicos, liberação in vitro
e permeação cutânea in vitro.
Fase
Oleosa
Aquosa
Agente de
consistência
Componente/Função
Concentração
Vaselina líquida/emoliente
1,0%
Crodalan®/emoliente
13,3%
Miristato de isopropila/emoliente
2,0%
Álcool cetoestearílico/emulsionante
3,0%
BHT/antioxidante
0,1%
Phenonip®/conservante
0,7%
Água destilada/veículo
Qsp
EDTA/sequestrante
0,1%
Sepigel®/polímero
7,5%
Para a incorporação do extrato nas nanoemulsões, inicialmente o extrato foi
adicionado na fase oleosa composta por tensoativos e óleo. As fases oleosa e aquosa
(água q.s.p.) foram levadas ao aquecimento em banho-maria até a temperatura de 80
°C. Devido à ocorrência de precipitação do extrato com aderência no fundo do
recipiente, foram realizados diversos testes para a dispersão do extrato na fase oleosa
(dispersão somente na mistura de tensoativos e depois adição de óleo; dissolução em
propilenoglicol com posterior adição da mistura de tensoativos seguida pela adição do
óleo). Por não ter sido possível adicionar diretamente o extrato na fase oleosa, optouse pela prévia dissolução do extrato mole em propilenoglicol e posterior adição da
água, com homogeneização sob aquecimento em banho-maria, método este que
permitiu a completa dispersão do extrato.
Assim o extrato mole da casca da R. ferruginea foi incorporado nas formulações
dissolvido na fase aquosa, a qual foi gotejada sob agitação a 600 rpm e sob
aquecimento a 80 °C sobre a fase oleosa da formulação acrescida de 0,75% de
preservante Phenonip® (composto por butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno,
fenoxietanol e propilparabeno). A mistura permaneceu sob agitação a 600 rpm por
mais 5 min, sob aquecimento e posteriormente mais 3 min sem aquecimento. Este
procedimento foi repetido para cada uma das formulações (5:5:70 e 6:4:20) em
duplicata, para estudo da estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo extrato.
Para aumento da viscosidade das nanoemulsões, nas formulações com e sem
extrato foi incorporado Sepigel® 305, um espessante polimérico pré-neutralizado em
74
emulsão inversa. A adição do Sepigel® 305 foi progressiva até a obtenção de uma
formulação com consistência adequada para aplicação tópica, por isso para cada
formulação a quantidade adicionada do agente de consistência variou de acordo com
as características individuais de cada formulação. Além disso a incorporação do
Sepige® foi após o esfriamento da nanoemulsão. A formulação de cada amostra
contendo ou não Sepigel® está representada no quadro 5.
Quadro 5 - Composição das nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea e com e sem
Sepigel® testadas no estudo de estabilidade preliminar.
Amostra
Óleo Tensoativo
Água Extrato Propilenoglicol Sepigel®
%
%
%
%
%
%
5:5:70
6,3
6,3
87,5
-
-
-
5:5:70 S
6,3
6,3
87,5
-
-
0,96
5:5:70 RF
6,3
6,3
85,4
0,5
1,0
-
5:5:70 RFS
6,3
6,3
85,4
0,5
1,0
1,50
6:4:20
20,0
13,3
66,7
-
-
-
6:4:20 S
20,0
13,3
66,7
-
-
0,85
6:4:20 RF
20,0
13,3
64,7
0,5
1,0
-
6:4:20 RFS
20,0
13,3
64,7
0,5
1,0
0,85
Nota: S: com Sepigel®; RF: com extrato mole de R. ferruginea; RFS: com extrato mole de R. ferruginea
e Sepigel®, somente números: sem extrato e sem Sepigel ®
Após o preparo de cada uma das amostras, as mesmas permaneceram 24 h
em repouso, e foram avaliadas quanto ao aspecto físico, pH, teste de centrifugação,
tamanho das gotículas e índice de polidispersibilidade (PDI). As análises foram
realizadas no tempo inicial (t0) e no tempo final (tf ) do estudo.
Devido à instabilidade observada no estudo preliminar com as nanoemulsões
contendo extrato incorporado na fase aquosa com concentração de 0,5%, foram
realizados estudos com a incorporação do extrato na fase oleosa, usando 2 ou 5% de
propilenoglicol para prévia dissolução do extrato.
Novamente as formulações demonstraram perda de estabilidade. Decidiu-se
realizar novo estudo de estabilidade preliminar, reduzindo a concentração do extrato
para 0,25% e 0,13%, usando 2% de propilenoglicol para sua prévia dissolução e
incorporação na fase oleosa.
75
4.6 Caracterização das nanoemulsões
Partindo dos resultados obtidos no estudo de estabilidade preliminar, a
formulação escolhida para a continuidade dos estudos para etapa de caracterização
foi a 6:4:20, representada no Quadro 6.
Quadro 6 - Composição da nanoemulsão selecionada para incorporação do extrato mole de R.
ferruginea.
Fase
Oleosa
Componente/Função
Concentração
Miristato de Isopropila/emoliente
20%
Alkest® CSO 400 + Span® 80 (7,2:1,5)/tensoativos
13,3%
Phenonip®/conservante
0,75%
Água destilada/veículo
65,95%
Sepigel®/polímero
0,85%
Aquosa
Agente de
consistência
O extrato foi incorporado na fase oleosa na concentração de 0,25% e 0,13% e,
após estudo de eficácia em modelo farmacológico, conforme metodologia descrita no
item 4.11.2, os estudos de caracterização foram conduzidos com a formulação
contendo 0,13% de extrato.
O extrato foi incorporado na nanoemulsão na fase oleosa após prévia
dissolução em 2% de propilenoglicol, sob aquecimento. Esta solução foi adicionada à
fase oleosa contendo os tensoativos e conservantes. A fase aquosa foi adicionada
gota a gota, sob agitação a 600 rpm e 85 °C. Após o término da adição da fase aquosa,
o sistema permaneceu sob agitação por 5 min, foi retirado do aquecimento e agitado
por mais 3 min. O Sepigel® foi adicionado ao sistema após o resfriamento do mesmo.
As nanoemulsões obtidas, com e sem extrato, foram caracterizadas usando os
métodos descritos a seguir.
4.6.1 Aspecto visual e estabilidade física
Após 24 h de preparo, as nanoemulsões foram analisadas quanto aos aspectos
visuais: cor, separação de fases e cremeação.
A estabilidade física foi verificada por percepção direta de cor e separação de
fases das nanoemulsões após centrifugação a 3000 rpm por 30 min (ANVISA, 2004).
76
4.6.2 Análise morfológica
O aspecto morfológico das nanoemulsões foi analisado usando microscopia
eletrônica de transmissão (MET). A nanoemulsão foi diluída na proporção de 1:100,
em água destilada, e uma gota desta solução foi depositada sobre uma grade de cobre
de 400 mesh coberta com filme FormVar/Carbono, e deixado em repouso por 1 h para
permitir a secagem. Sobre a grade com a nanoemulsão, foi adicionado 1 gota de
contraste negativo à base de acetato de uranila a 2% e deixado em contato por 10
minutos. O excesso de contraste foi retirado com papel filtro e a grade foi analisada
diretamente no MET a temperatura ambiente e 80 kV. A análise foi feita no Centro de
Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná (UFPR) em parceria com
a Profa. Dra. Joana Lea Meira Silveira.
4.6.3 Análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta
O tamanho médio da fase interna, a distribuição de tamanho e o potencial zeta
das nanoemulsões
desenvolvidas foram determinados por espectroscopia de
correlação de fótons (DLS) no Laboratório de Pesquisa em Tecnologia Farmacêutica
da UNIVALI.
Para a análise do tamanho das gotículas a amostra foi diluída na proporção
1:100 em água ultrapura. O resultado foi expresso como média de 3 aferições. As
análises foram realizadas a 25 ± 2 ºC.
4.6.4 Comportamento reológico
A análise do comportamento reológico das nanoemulsões com e sem extrato
de R. ferruginea foi realizada em viscosímetro rotacional tipo cone-placa a 25 °C. A
amostra foi analisada em 3 etapas: rotação de 0-80 1/s por 180 segundos; rotação
constante de 80 1/s por 180 segundos e rotação de 80-0 1/s por 180 segundos,
retornando ao ponto estático (CZEPULA, 2006). Em cada etapa foram coletados 100
dados.
4.6.5 Quantificação dos marcadores da R. ferruginea por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE)
Para análise quantitativa das formulações por CLAE foi usada metodologia
analítica desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2014). Foi pesado 0,5 g da
77
formulação dissolvido em 5 mL de acetonitrila e submetido ao banho de ultrassom por
20 minutos. A solução foi então centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos e o
sobrenadante filtrado e analisado em triplicata. A partir do resultado da triplicata das
áreas obtidas nas análises dos padrões de AMA e AMB, foi calculado o teor médio e
o desvio padrão nas amostras.
4.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão
Amostras de nanoemulsões com e sem extrato foram avaliadas quanto à
estabilidade acelerada. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente (23 ± 2
°C) e a 40 ± 2 °C por 6 meses e foram avaliados aspectos como aparência (cor,
separação de fases), tamanho de gota por DLS, potencial zeta, reologia, pH e
quantificação dos marcadores do extrato por CLAE. As avaliações foram realizadas
no tempo zero, 30, 90 e 180 dias.
4.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R. ferruginea
As nanoemulsões e cremes contendo ou não o extrato de R. ferruginea tiveram
o seu potencial de irritação cutânea avaliados em duplicata pelo método da difusão
em gel de agarose (Agarose overlay) de acordo com o Guia para Avaliação de
Segurança de Produtos Cosméticos (ANVISA, 2003) e a Farmacopeia Americana
(UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007), seguindo o método desenvolvido pelo
Laboratório de Farmacologia In Vitro da Univali. O ensaio foi feito em parceria com a
doutoranda Liliani Thiesen.
A suspensão celular de fibroblastos (L929) a 300.000 células/mL foi tripsinizada
e transferida na concentração de 2 mL/poço em placa de 6 poços. Após 24 h, o meio
de cultura foi substituído por DMEM contendo 0,01% de vermelho neutro como corante
vital e mantido por 1 h no escuro até aparecimento de coloração vermelha celular.
Após este período, o excesso de corante vital foi removido e cada poço lavado com
PBS. Em cada poço foi adicionado 3 mL de uma mistura na proporção 1:1,2 de meio
agarose:meio DMEM (mistura overlay). As placas permaneceram por 15 minutos em
temperatura ambiente para secagem.
As amostras das nanoemulsões e cremes foram incorporadas em discos de
papel (0,54 cm), previamente lavados com PBS e secos, com posterior autoclavação
78
(121 °C/20 min). Como controle positivo foi usada a solução de Triton X-100 e como
controle negativo o meio DMEM. As placas foram incubadas por 24 h em estufa a 37
°C com 5% de CO2.
O grau de irritação foi avaliado pela zona de lise (zona com ausência de
incorporação do corante vital), usando um paquímetro e a avaliação seguiu a
classificação
descrita
pela
Farmacopéia
Americana
(UNITED
STATES
PHARMACOPEIA, 2007), conforme quadro 7.
Quadro 7 - Grau de reatividade para teste de difusão em ágar.
Grau Reatividade
Descrição da Zona de Reatividade
0
Nenhuma
1
Leve
2
Médio
Zona limitada a área embaixo da amostra
3
Moderado
A zona se estende de 0,5 a 1,0 cm além da amostra
4
Severo
A zona se estende mais que 1,0 cm além da amostra
Nenhuma zona detectável em torno ou embaixo da amostra
Algumas células malformadas ou degeneradas embaixo da
amostra
Fonte: United States Pharmacopeia, 2007.
4.9 Análise de liberação in vitro da nanoemulsão contendo extrato da R.
ferruginea
O estudo de liberação dos marcadores do extrato de R. ferruginea incorporados
na nanoemulsão e creme e do extrato mole a 0,13% em propilenoglicol, foi conduzido
em células de difusão de Franz (n=6), com área de difusão de 1,53 cm² e com volume
do compartimento receptor de 6,5 mL, interligadas a um banho termostatizado
estabilizado a 32 °C e dispostas sobre uma placa magnética para promover agitação
constante do meio receptor a 600 rpm.
A escolha do meio receptor foi realizada mediante ensaio de solubilidade do
extrato mole na concentração de 3,482 mg/mL, ou seja, 10 vezes a concentração dos
marcadores no extrato usado na formulação, para garantir a condição sink do ensaio.
Foram testadas diversas soluções para garantir a solubilidade, como álcool 25%, 50%
e 70% e tampão fosfato pH 7,2 com 30% de PEG 400. Como melhor meio receptor,
foi selecionado o sistema solvente álcool 70%.
79
O compartimento receptor de cada célula de Franz foi preenchido com o meio
receptor. Sobre este compartimento, a membrana de acetato de celulose (membrana
de diálise), previamente hidratada por 12 h em água destilada, foi disposta de maneira
a evitar a formação de bolhas. Acima da membrana, foi disposto um disco de teflon
que teve seu orifício completamente preenchido com 300 mg de cada formulação e
do extrato mole em solução. A oclusão da formulação e da solução de extrato foi feita
com disco de acrílico, demonstrado na Figura 6. Cada célula foi selada com anel
metálico e fechada com trava de metal, conforme demonstrado na Figura 7. Só então
a placa magnética foi acionada para que a agitação ocorresse. A agitação foi cessada
a cada coleta das amostras.
Figura 6 - Foto demonstrativa da montagem da célula de Franz com nanoemulsão.
Figura 7 - Foto demonstrativa do detalhe do sistema das células de difusão de Franz fechado e da
coleta das amostras.
80
A coleta das amostras foi realizada adicionando 1 mL de meio receptor fresco,
armazenado em béquer com circulação externa de água a temperatura constante de
32 °C, com auxílio de seringa, através da válvula localizada no braço inferior da célula.
Assim igual volume do meio receptor contido no compartimento receptor da célula, foi
coletado através da cânula de amostragem localizada no braço superior da célula,
demonstrado na Figura 7. As amostras foram coletadas nos tempos de 1, 2, 4, 6, 8,
12 e 24 h. As amostras foram analisadas por CLAE para quantificação dos marcadores
AMA e AMB, após filtração. A massa dos marcadores acumulada no compartimento
receptor em cada tempo foi calculada considerando a área efetiva para a liberação na
célula.
Para avaliação da cinética de liberação, os perfis de liberação obtidos a partir
das formulações foram ajustados aos modelos matemáticos de ordem zero, primeira
ordem, modelo de Higuchi e equação geral de liberação (BIDONE et al., 2014;
BRUSCHI et al., 2007).
4.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo extrato
de R. ferruginea
O ensaio de permeação cutânea também foi realizado em células de difusão
de Franz (n=6) empregando nanoemulsão e creme convencional contendo 0,13% de
extrato de R. ferruginea e extrato mole a 0,13% em propilenoglicol. A solução
receptora foi composta de solução hidroalcoólica a 70% garantindo a condição sink,
determinado em ensaio de solubilidade do extrato descrito no item 4.9. O
procedimento da análise foi realizado nas mesmas condições dos estudos de
liberação in vitro (item 4.9).
Como membrana foi utilizada pele de orelha de porco. As orelhas foram obtidas
no Frigorífico Antônio Carlos (Antônio Carlos-SC). Antes do ensaio, as orelhas foram
limpas em água corrente, secas com papel toalha e embrulhadas em papel alumínio.
As orelhas limpas foram armazenadas em congelador até o momento do uso.
Antes do uso, as orelhas foram descongeladas à temperatura ambiente. A pele
da face anterior da orelha foi depilada com lâmina e seccionada em círculos em áreas
sem a presença de lesões, vasos sanguíneos e manchas. Os cortes foram realizados
com auxílio de bisturi e pinça, evitando a retirada do tecido adiposo. Os cortes de pele
foram hidratados por 12 h em solução tampão fosfato pH 7,2.
81
Os cortes circulares de pele foram dispostos sobre cada célula de Franz
preenchida com o meio receptor, evitando a formação de bolhas. Acima da membrana,
foi colocado um disco de teflon que teve seu orifício completamente preenchido com
300 mg de cada formulação e do extrato mole em solução. O procedimento de
oclusão, fechamento e condução do ensaio foi semelhante ao realizado para o ensaio
de liberação in vitro (item 4.9).
Amostras da solução receptora (1 mL) foram coletadas em diferentes intervalos
de tempo (1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h), com reposição simultânea, como descrito no item
4.9, filtradas e quantificadas por CLAE, empregando metodologia descrita no item
4.6.5. Além da análise de quantificação dos marcadores AMA e AMB na solução
receptora, foi realizada análise da formulação remanescente na pele ao final do ensaio
(tempo de 24 h), no estrato córneo e na pele.
Para análise da formulação remanescente, foi retirado o seu excesso sobre a
pele com o auxílio de uma gaze umedecida em água destilada e com 2 fitas adesivas
que foram aderidas sobre a pele e retiradas em sequência. A formulação em excesso
juntamente com a gaze e as fitas foram colocadas em um tubo tipo Falcon contendo
5 mL de acetonitrila para extração em banho de ultrassom por 1 h.
O estrato córneo da área da pele que ficou em contato com a formulação foi
retirado por tape stripping e a pele viável coletada. As amostras foram analisadas
quanto à retenção dos marcadores AMA e AMB. Para o tape stripping foram utilizadas
10 fitas adesivas. As fitas foram aderidas sobre a pele, permanecendo em contato por
30 segundos, realizando uma pressão com um peso padrão de 200 g, e então
retiradas e colocadas, todas juntas, em um tubo tipo Falcon contendo 5 mL de
acetonitrila para extração, conforme descrito anteriormente. A pele viável foi cortada
em pequenos pedaços com um bisturi e colocados em um tubo tipo Falcon com 5 mL
de acetonitrila para extração, conforme descrito anteriormente.
Após a extração, o líquido foi transferido para outro tubo tipo Falcon e
centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi analisado por CLAE
conforme metodologia descrita no item 4.6.5. Os resultados foram expressos em
concentração do marcador em função do tempo (OECD, 2004).
82
4.11 Ensaios farmacológicos da atividade anti-inflamatória
Os ensaios farmacológicos para avaliação da atividade anti-inflamatória tópica
do extrato, das nanoemulsões e do creme contendo o extrato, bem como a
quantificação de mediadores químicos e análise histológica foram realizados nos
laboratórios de Farmacologia in vivo e Farmacologia in vitro do Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI com auxílio da Pós-doutoranda
Kathryn A. B. S. da Silva.
4.11.1 Animais
Para os ensaios farmacológicos foram utilizados camundongos Swiss fêmeas
entre 2 a 3 meses de idade (25 a 30 g), oriundos do Biotério Central da Univali. Os
animais foram mantidos no biotério setorial em caixas com maravalha, com no máximo
20 animais/caixa com ciclo claro/escuro de 12 h, aclimatados a temperatura de 22 ± 2
°C e tratados com água e ração ad libitum, inclusive durante os experimentos. As
caixas foram trocadas em dias alternados por técnico responsável conforme rotina
interna do biotério. Os animais permaneceram no biotério por no máximo 3 dias.
Durante os experimentos, os mesmos foram conduzidos para a sala experimental e
permaneceram em ambientação por um período mínimo de 1 h. Água e comida foram
oferecidas, livremente, inclusive durante os experimentos. Os experimentos foram
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UNIVALI sob Nº de
Parecer: 03/2014 (ANEXO A).
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato incorporado em creme
para definição da concentração de extrato a ser incorporado nas nanoemulsões,
conforme item 4.5.3, cada grupo experimental teve 8 animais, os quais integraram os
seguintes grupos experimentais: G1 – controle negativo (animais sem tratamento); G2
– grupo tratado com o creme veículo sem o extrato; G3 – grupo tratado com o creme
contendo 1,0% do extrato; G4 – grupo tratado com o creme contendo 0,5% do extrato;
G5 – grupo tratado com o creme contendo 0,25% do extrato; G6 – grupo tratado com
o creme contendo AMB 0,5%; G7 – grupo tratado com o creme contendo AMB 0,1%;
G8 – grupo tratado com o creme contendo 0,1% de dexametasona.
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato incorporado nas
nanoemulsões, cada grupo experimental teve um número de 6 animais, os quais
integraram os seguintes grupos experimentais: G1- controle negativo (animais sem
83
tratamento); G2-grupo tratado com nanoemulsão sem extrato da planta; G3-grupo
tratado com nanoemulsão contendo 0,13% do extrato da planta; G4 –grupo tratado
com nanoemulsão contendo 0,25% do extrato da planta; G5 - grupo tratado com
creme sem extrato da planta; G6 – grupo tratado com creme contendo 0,13% do
extrato da planta; G7 – grupo tratado com creme contendo 0,25% do extrato da planta;
G8 – grupo tratado com creme contendo 0,50% do extrato da planta; G9 - (controle
positivo) grupo tratado com creme contendo 0,1% de dexametasona. Foram portanto,
9 grupos de 6 animais para cada experimento.
4.11.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo da R. ferruginea e do AMB
incorporados em creme convencional e nanoemulsão
A avaliação com o creme convencional contendo o extrato e o AMB, foi
realizada previamente ao desenvolvimento da nanoemulsão, com o objetivo de definir
a concentração do extrato para incorporação na nanoemulsão, conforme item 4.5.3.
Os cremes e as nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea e o composto isolado
AMB foram avaliados quanto a ação anti-inflamatória de acordo com o método de
edema de orelha induzido pelo óleo de cróton em camundongos, descrito por Carlson
e colaboradores (1985) com algumas modificações. Foi empregado como controle
negativo a formulação sem extrato e como controle positivo creme contendo 0,1% de
dexametasona. As orelhas (esquerda e direita) tiveram suas espessuras medidas com
o auxílio de um micrômetro digital 6 h após a aplicação do óleo de cróton. Os animais
foram tratados com os cremes através da aplicação direta de 50 µL da formulação na
superfície interna do pavilhão de cada orelha direita. O óleo de cróton a 2,5% (v/v) foi
dissolvido em acetona PA e, 20 µL desta solução foi aplicado na superfície externa da
orelha direita, após 30 minutos dos respectivos tratamentos. Os animais foram
eutanasiados por decapitação para a medida das espessuras das orelhas. A medida
da espessura das orelhas foi realizada utilizando um micrômetro digital, aplicado no
centro do lóbulo de cada orelha. A diferença de espessura das orelhas esquerda e
direita foi calculada para cada tratamento para posterior análise do efeito anti edematogênico e os valores foram expressos em µm. Os dados obtidos foram
analisados estatisticamente usando análise de variância e o Teste de Comparação
Múltipla Newman-Keuls usando GraphPad Prism software versão 5. O nível de
significância foi p < 0.05.
84
4.11.3 Dosagem de citocinas em pele inflamada tratada com creme e
nanoemulsões contendo R. ferruginea
Nova indução do processo inflamatório foi realizada conforme descrito no item
4.11.2. Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha
pela aplicação do óleo de cróton, fragmentos com 6 mm2 de diâmetro foram coletados,
com o auxílio de um perfurador de metal, das orelhas direita de cada animal e imersos
em nitrogênio líquido e armazenados a - 80 °C. Os tecidos foram preparados seguindo
metodologia descrita por Otuki e colaboradores (2005), com algumas adaptações.
Os tecidos removidos das orelhas foram homogeneizados em tampão fosfato
salina (PBS) contendo 0,05% de Tween® 20, fluoreto de fenilmetilsulfonila 0,1 mM,
cloreto de benzometônio 0,1 mM, EDTA sódico 10 mM, e aprotinina A 2 ng/mL. Em
seguida, o homogeneizado foi centrifugado a 3.000 g por 10 minutos a 4 ºC, e o
sobrenadante armazenado a -80 ºC até o momento da análise. Os níveis teciduais
das citocinas interleucina 1β (IL-1β), quimiocina derivada de queratinócitos (KC) e
fator de necrose tumoral (TNF), foram determinados usando um kit de ensaio
imunoenzimático
ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) seguindo as
recomendações do fabricante.
Resumidamente, uma placa de 96 poços foi incubada por aproximadamente 16
h com anticorpo de captura. Posteriormente, a placa passou por 3 lavagens com wash
buffer (tampão fosfato salina (PBS) contendo 0,05% de Tween® 20) e incubada por 1
h com 300 µL de tampão de bloqueio em cada poço da placa. Após 3 lavagens, 100
µL de diluições seriadas da citocina em estudo e das amostras foram adicionadas a
cada poço da placa e incubada por 2 h. Após 3 lavagens foi adicionado 100 µL de
anticorpo de detecção em cada poço, e a placa foi novamente incubada por 2 h. A
placa foi lavada por 3 vezes e foi adicionado 100 µL de streptavidina em cada poço,
seguido da incubação da placa por 20 minutos ao abrigo da luz. Após 3 lavagens foi
adicionado 100 µL de solução de substrato em cada poço seguido da incubação da
placa por 20 minutos ao abrigo da luz. Ao término deste tempo, a reação foi
interrompida com a adição de 50 µL da solução de bloqueio (H2SO4 à 2N), com
posterior leitura dos resultados em leitor de microplaca em dois comprimentos de
onda, 450 nm e 550 nm. Os resultados foram expressos como pg de citocina/mg de
tecido. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente usando análise de
variância e o Teste de Comparação Múltipla Newman-Keuls usando GraphPad Prism
software versão 5. O nível de significância foi p < 0.05.
85
4.11.4 Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO) em pele inflamada
tratada com creme e nanoemulsões contendo R. ferruginea
Nova indução do processo inflamatório foi realizada conforme descrito no item
4.11.2. Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha
pela aplicação do óleo de cróton, fragmentos com 6 mm2 de diâmetro foram coletados,
com o auxílio de um perfurador de metal, das orelhas direita de cada animal 6 h após
a aplicação do óleo de cróton e imersos em nitrogênio líquido e armazenados a -80
°C. Os fragmentos congelados do tecido removido das orelhas foram preparados de
acordo com metodologia descrita por Otuki e colaboradores (2005), com algumas
modificações.
Inicialmente, os tecidos foram homogeneizados com tampão I pH 4,7 (contendo
0,58% de cloreto de sódio, 0,56% de EDTA, 0,3% de fosfato de sódio (NaH2PO4) e
0,28% de fosfato dissódico (Na 2HPO4), na proporção de 100 mL de tampão I para
cada 5 g de pele. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos a 4
°C. O sobrenadante foi descartado e a amostra foi ressuspendida com 111 µL de
tampão I, utilizando um vortex. A cada amostra foi adicionado 333 µL de solução de
NaCl 0,2% com agitação em vortex. Após 30 segundos, foi adicionado à amostra, 333
µL de solução de glicose a 5% contendo NaCl 1,6%, como posterior agitação em
vortex. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4 °C. O
sobrenadante foi desprezado e a amostra foi ressuspendida com adição tampão II pH
5,4 (contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio, 0,78% de NaH2PO4 e
0,71% de Na2HPO4), na proporção de 100 mL de tampão II para cada 5 g de amostra.
As amostras ressuspendidas passaram por 3 ciclos de congelamento em nitrogênio
líquido e descongelamento em banho-maria a 37 °C, sendo posteriormente
centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4 °C.
Duplicatas de 25 µL de amostra do sobrenadante resultante foram adicionadas
a uma placa com 96 poços, seguido de uma duplicata do branco (solução de NaPO 4
0,08 M). A reação teve início com a adição de 25 µL de solução a 3,8 mg/mL de
brometo de hexadeciltrimetilamônio em dimetilsufóxido (DMSO) em todos os poços
ao abrigo da luz, com incubação a 37 °C por 5 minutos. Posteriormente foi adicionado
100 µL de peróxido de hidrogênio diluído em NaPO4 0,08 M, em todos poços com
incubação da placa a 37 °C por 5 minutos. A atividade enzimática foi determinada
colorimetricamente usando leitor de microplaca em 650 nm. Os resultados foram
86
expressos em densidade óptica/mg de tecido. Os dados obtidos foram analisados
estatisticamente usando análise de variância e o Teste de Comparação Múltipla
Newman-Keuls usando GraphPad Prism software versão 5. O nível de significância
foi p < 0.05.
4.11.5 Análise histológica em pele inflamada tratada com creme e nanoemulsões
contendo R. ferruginea
Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha pela
aplicação do óleo de cróton, descrito no item 4.11.2, foram coletados fragmentos de 6
mm2
das orelhas
direitas, seccionados
longitudinalmente
e
mantidos
em
paraformaldeído 4% (PFA) por 24 h. O processamento dos tecidos foi realizado
através da desidratação por passagens sucessivas em etanol de concentrações
crescentes (etanol 70%, etanol 80%, etanol 90% e, finalmente, etanol absoluto) e em
seguida dois banhos de xilol por 30 minutos, com a finalidade de tornar os tecidos
translúcidos (etapa de clareamento ou diafanização). Quando os tecidos tornaram-se
translúcidos, foram colocados na parafina, na qual passaram por três banhos de 1 h
até o processo de inclusão (montagem do bloco e posicionamento do tecido).
Foram realizados cortes com espessura de 4 µm em micrótomo disponibilizado
pelo LAFEX (Laboratório de Farmacologia Experimental – UFSC), e posteriormente
foram corados em coloração de hematoxilina e eosina (HE) para avaliação dos sinais
de inflamação, como por exemplo infiltrado celular e edema (espessura dérmica). Um
corte foi selecionado como representativo para análise qualitativa da resposta
inflamatória mediada por células. Para este experimento foi incluído um naive para
comparação com os demais grupos do experimento.
87
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Material vegetal
A coleta das cascas de R. ferruginea foi realizada em árvores com 35 cm de
diâmetro e na porção inferior do tronco, a 20 cm do solo, baseado nos resultados
encontrados para o teor de marcadores nas soluções extrativas (item 5.2).
As cascas coletadas foram analisadas quanto ao teor de cinzas totais e
insolúveis em ácido e quanto à perda por dessecação, como segue.
5.1.1 Determinação de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido
A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de impurezas
inorgânicas não-voláteis que podem estar presentes, como contaminantes (FARIAS,
2004). As cinzas insolúveis em ácido compreendem o resíduo obtido das cinzas totais
com ácido clorídrico diluído após filtragem, lavagem e incineração. O método destinase à determinação de sílica e constituintes silícicos da droga.
As cascas coletadas apresentaram teor de cinzas de 7,25% ± 0,12 para cinzas
totais e de 1,78% ± 0,11 para cinzas insolúveis em ácido. Em estudo realizado por
Baccarin e colaboradores (2014), o valor de cinzas totais encontrado foi de 7,95% e
para cinzas insolúveis em ácido foi de 0,51%. Comparando os resultados obtidos na
análise realizada neste estudo com os dados já descritos, o valor para cinzas totais
ficou próximo do encontrado anteriormente e o valor para cinzas insolúveis em ácido
ficou acima do encontrado anteriormente. Porém como não existe monografia
específica na literatura para as cascas da R. ferruginea, esses dados são importantes
para, juntamente com a realização de mais determinações, estabelecer os parâmetros
de qualidade para a droga vegetal.
5.1.2 Perda por dessecação
A perda por dessecação das cascas de R. ferruginea foi de 8,2% ± 0,17%, em
trabalho anterior realizado por Baccarin e colaboradores (2014), a perda por
dessecação foi de 7,82% ± 0,40. Os dois resultados se mostram próximos e a
inexistência de monografia que estabeleça os parâmetros de qualidade para as
88
cascas da R. ferruginea, coloca o resultado dentro das variações farmacopéicas, de
8-14% (FARIAS, 2004).
5.2 Obtenção e Caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.
ferruginea
Na obtenção da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, nomeado neste
estudo como abril/2013, foi usado o material vegetal coletado em Blumenau (SC) em
outubro de 2009, o qual estava armazenado em embalagens lacradas ao abrigo da
luz em sala climatizada, sem referência ao diâmetro da árvore em que foi realizada a
coleta. Na quantificação por CLAE do teor de AMB na solução extrativa obtida (7,93
mg/g) foi obtido um teor menor do que o obtido no estudo de Baccarin e colaboradores
(2014), 70 mg/g, no qual foram usadas cascas de árvore com diâmetro de 20-25 cm.
A partir deste resultado, foi realizado um estudo para verificação da variação
do teor de marcadores em diferentes diâmetros da árvore da R. ferruginea (15, 21, 25,
35, 38, 59 cm) e também em diferentes condições da árvore como diâmetro com 38
cm na região de calo, em uma árvore caída e em uma árvore morta. Conforme
apresentado na Tabela 1, os resultados demonstraram que o maior teor de marcador
encontrado foi na casca coletada da árvore com 35 cm de diâmetro de tronco (78,28
mg/g), cujo valor foi semelhante ao obtido por Baccarin et al. (2014)..
Portanto, foram coletadas cascas da parte mais superior do tronco, onde se
inicia a formação de galhos, de uma árvore com diâmetro de 35 cm. O resultado
encontrado para o teor de AMB foi muito baixo novamente (0,79 mg/g), motivando a
realização de pesquisa da variação do teor de AMB na casca da árvore com 35 cm de
diâmetro com coleta em 3 regiões diferentes do tronco: próxima ao solo (20 cm),
superior (próxima dos galhos) e região intermediária entre estas duas. Os resultados
encontrados demonstraram que a região mais próxima ao solo possui maior teor de
AMB e AMA (21,21 e 22,41 mg/g, respectivamente). Esta foi então a região
especificada para a coleta das cascas: árvore com tronco de 35 cm de diâmetro e
altura entre 20 e 100 cm do solo.
Os resultados das análises foram comparados ao resultado encontrado por
Baccarin e colaboradores (2014). Inicialmente, foi considerado somente o teor de
AMB, pois de acordo com estudo anterior, este era o marcador majoritário nas cascas
de R. ferruginea (TURMINA, 2005). No entanto, com os resultados obtidos no presente
89
estudo, observou-se que a concentração de AMA se assemelha a do AMB nas cascas
da R. ferruginea e, conforme revisão bibliográfica, o AMA apresenta igualmente efeito
anti-inflamatório (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; MIZUSHINA et al., 2000),
assim sendo, foram considerados como marcadores para este estudo o AMA e o AMB.
A média dos resultados encontrados para o teor de marcadores AMB e AMA
em todas as soluções extrativas preparadas encontram-se na Tabela 1. Em algumas
amostras de cascas analisadas, foi encontrada maior concentração do marcador AMA
do que do AMB.
Tabela 1 - Teor de marcadores AMA e AMB nas soluções extrativas das cascas de R. ferruginea.
Teor* AMA
Teor* AMB
Resíduo Seco
(mg/g)
(mg/g)
(%)
Abril/2013
12,00 ± 0,05
7,93 ± 0,14
0,791 ± 0,008
15 cm
12,11 ± 0,07
8,09 ± 0,08
0,356 ± 0,362
21 cm
7,97 ± 0,26
6,75 ± 0,06
0,407 ± 0,003
25 cm
48,22 ± 0,87
48,03 ± 0,24
0,580 ± 0,014
35 cm
44,53 ± 0,56
78,28 ± 0,38
0,560 ± 0,040
38 cm
20,65 ± 0,17
12,51 ± 0,06
1,110 ± 0,021
38 cm – calo
261,27 ± 1,78
153,68 ± 0,28
1,110 ± 0,092
59 cm
39,05 ± 0,27
23,91 ± 0,10
1,320 ± 0,030
Árvore Caída
9,06 ± 0,10
19,57 ± 0,08
0,156 ± 0,014
Árvore Morta
11,74 ± 0,27
13,54 ± 0,03
0,115 ± 0,007
0,21 ± 0,03
0,79 ± 0,01
0,900 ± 0,021
3,35 ± 0,09
4,46 ± 0,01
0,575 ± 0,018
11,64 ± 0,05
15,18 ± 0,13
0,520 ± 0,014
22,41 ± 0,10
21,21 ± 0,16
0,753 ± 0,005
Droga vegetal
35 cm – Próximo dos
galhos
35 cm – Parte Superior
35 cm – Parte
Intermediária
35 cm – Parte Inferior 20
cm do solo
*Teor de marcadores expressos em mg/g de resíduo seco.
De acordo com estes achados, há grande variabilidade no teor de marcadores
AMA e AMB nas cascas da R. ferruginea. Esta variabilidade aparenta estar
relacionada à idade da planta (diâmetro do tronco) e da região do tronco. Isso traz
embasamento para estudos mais aprofundados a respeito da padronização na coleta
das cascas de R. ferruginea. Os resultados encontrados neste trabalho abrem
90
caminho para novas investigações para padronização da região de coleta das cascas
de R. ferruginea com o objetivo de extração de maior concentração de marcadores.
A partir dos resultados obtidos (Tabela 1), a solução extrativa foi preparada
usando 475 g de cascas pulverizadas da R. ferruginea coletadas da árvore com 35
cm de diâmetro e da região próxima ao solo (20 cm de altura). O rendimento da
solução após filtração foi de 75,78% (V/V). O processo de maceração dinâmica com
possível evaporação do líquido extrator e os processos de filtração (tecido e papel)
podem ter influenciado na redução do rendimento da solução extrativa.
Após concentração da solução extrativa em estufa de ar circulante, obteve-se
o extrato mole com um rendimento de 6,60% (p/p), em relação a droga vegetal seca.
Os derivados vegetais obtidos foram analisados quanto aos aspectos
organolépticos como cor e odor, pH, resíduo seco, perfil qualitativo em CCD e teor
dos marcadores AMA e AMB por CLAE. Os resultados obtidos são apresentados na
Tabela 2 e Figura 8.
Tabela 2 - Resultados das análises realizadas nos derivados vegetais das cascas da R. ferruginea.
Derivado
Aspectos
organolépticos
Resíduo
pH
(%)
Solução
Avermelhado,
5,83 ±
Extrativa
odor alcoólico
0,03
Vinho escuro,
4,21 ±
odor adocicado
0,01
Extrato Mole
Seco
0,48 ± 0,02
51,17 ± 0,53
Teor AMA*
Teor AMB*
(mg/g)
(mg/g)
42,14 ±
36,88 ±
0,04
0,06
40,06 ±
37,34 ±
0,02
0,09
*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido.
Os resultados demonstram a presença dos ácidos mirsinoicos nos derivados
obtidos a partir das cascas da R. ferruginea, com redução do pH no extrato mole,
devido a concentração do mesmo e a presença dos ácidos mirsinoicos. O processo
de concentração praticamente não provocou alteração no teor de marcadores
analisados, demonstrando a estabilidade do extrato frente à temperatura.
91
Figura 8 - Perfil cromatográfico da solução extrativa e do extrato mole
das cascas de R. ferruginea por CCD.
Nota: AMA - padrão ácido mirsinoico A; AMB -padrão ácido mirsinoico B -; sistema
eluente: hexano:acetato de etila (1:1); revelador anisaldeído sulfúrico.
Nos estudos realizados por Baccarin e colaboradores (2014), os extratos das
cascas de R. ferruginea foram quantificados usando somente o AMB como marcador,
e este apresentava maior área do que o pico correspondente ao AMA, o que foi
deduzido como tendo o extrato maior concentração de AMB do que AMA. No presente
trabalho, além do AMB, usou-se também o AMA como marcador (Figura 9). Conforme
apresentado no cromatograma da solução extrativa (Figura 10), embora a área do
pico correspondente ao AMA seja menor do que a do AMB, a concentração deste é
maior. Esta diferença provavelmente está relacionada com a absortividade desta
substância no comprimento de onda usado na análise.
O ácido mirsinoico A foi detectado com tempo de retenção de 16,22 minutos
(Figura 9a), confirmando sua presença na solução extrativa e no extrato mole das
cascas de R. ferruginea no pico 3 (Figura 10 e Figura 11), bem como a do ácido
mirsinoico B, detectado com tempo de retenção de 15,79 minutos (Figura 9b),
correspondendo ao pico 1 (Figura 10 e Figura 11).
92
Figura 9 - Perfis cromatográficos por CLAE dos padrões de ácidos mirsinoicos A (a) e B (b); 260 nm
para o AMA e 270 nm para o AMB.
Pureza: 76,2%
Pureza: 98,9%
Figura 10 - Perfil cromatográfico por CLAE da solução extrativa das cascas de R. ferruginea.
93
Para o extrato mole obteve-se a concentração dos marcadores AMA e AMB,
igualmente a partir da determinação do tempo de retenção e do cálculo das áreas dos
picos para os marcadores, conforme Tabela 2. O perfil cromatográfico do extrato mole
está representado na Figura 11.
Figura 11 - Perfil cromatográfico por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea.
5.3 Estudos de pré-formulação
5.3.1 Determinação da solubilidade do extrato
Uma seleção adequada dos óleos e tensoativos e as suas concentrações
ótimas é de extrema importância para se obter nanoemulsões estáveis e clinicamente
aceitáveis. O teste de solubilidade do ativo em óleo é tido como um critério de seleção
do melhor óleo. A solubilidade do extrato no óleo influencia na manutenção do extrato
na forma de solução na fase interna da nanoemulsão (AZEEM et al., 2009). Para a
determinação da solubilidade do extrato mole da casca da R. ferruginea em óleo foram
selecionados 4 tipos de óleos. A seleção foi baseada na biocompatibilidade, não
toxicidade e aceitação clínica dos componentes para uso tópico. Os óleos
selecionados estão descritos abaixo:
-
Triglicérides de ácido cáprico e caprílico (TCC), que são triglicerídes de cadeia
média, constituídos principalmente por ésteres de ácidos caprílicos e cápricos
derivados do óleo de coco. O que influenciou sua escolha foi a sua alta
compatibilidade com a pele, sendo bastante permeável e considerado
94
toxicologicamente e dermatologicamente inócuo e é classificado como GRAS
(Generally Recognized As Safe) pelo FDA (EMBRAFARMA).
-
Miristato de isopropila, é um éster de origem sintética, obtido a partir da reação
de esterificação do ácido mirístico com o álcool isopropílico. Com baixo ponto
de turvação, é muito usado na formulação de cosméticos, tem excelente
emoliência e é um ótimo diluente para óleos vegetais.
-
Capryol® 90 (monocaprilato de propilenoglicol), tensoativo água/óleo (EHL= 6),
solubilizante. Usado em muitos trabalhos como fase oleosa em nanoemulsões.
-
Cetiol® V (oleato de isodecila), éter emoliente com baixo espalhamento, no
entanto, possui composição semelhante aos lipídios da pele.
-
Cetiol® 868 (estearato de octila), éster emoliente com excelente espalhamento ,
lubricidade e sobre-engorduramento para a pele. Dá sensação de emoliência
sem toque de oleosidade.
O teste de solubilidade foi realizado em duplicata para cada tipo de óleo
selecionado. Após 24 h do teste, as amostras apresentaram diferenças visuais
características (Figura 12). Os tubos contendo os óleos Capryol® (amostras 5 e 6),
miristato de isopropila (amostras 3 e 4) e triglicérides cáprico e caprílico (amostras 1
e 2) apresentaram coloração avermelhada homogênea, cor esta característica do
extrato mole, demonstrando que o mesmo dispersou nestes óleos. Para confirmar
esta informação, as amostras foram analisadas quanto
a porcentagem de
transmitância e absorbância em espectrofotômetro UV/Visível. Inicialmente foi
encontrado o comprimento de onda de maior absorbância da amostra por meio da
varredura nos comprimentos de onda entre 190 nm e 800 nm. A transmitância e a
absorbância foram analisadas no comprimento de onda selecionado para cada
amostra, desconsiderando a absorbância do óleo puro. Os resultados para
transmitância e absorbância das amostras são apresentados na Tabela 3.
95
Figura 12 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em
diferentes óleos: (1) e (2) Poly: triglicérides de ácido cáprico e caprílico (TCC); (3) e (4) MI: miristato
isopropila; (5) e (6) Cap 90: Capryol 90; (7) e (8) CeV: Cetiol V; (9) e (10) Ce868: Cetiol 868.
Tabela 3 - Valores de transmitância e absorbância da mistura de óleo e extrato mole de R. ferruginea
no teste de solubilidade.
Amostra
Comprimento de
Onda (nm)
Absorbância
Transmitância (T%)
Poly (1)
320,5
0,590
25,6
Poly (2)
320,5
0,757
17,5
MI (3)
320,5
0,667
21,7
MI (4)
320,5
0,807
15,6
Cap 90 (5)
320,5
0,877
13,3
Cap 90 (6)
320,5
0,978
10,5
Ce V (7)
356,5
0,261
55,1
Ce V (8)
356,5
0,127
74,3
Ce 868 (9)
320,5
0,246
56,5
Ce 868 (10)
320,5
0,039
91,6
Nota: Poly 1 e 2: extrato mole + triglicérides do ácido cáprico e caprílico; MI 3 e 4: extrato mole +
miristato de isopropila; Cap 90 5 e 6: extrato mole + Capryol 90 ®; Ce V 7 e 8: extrato mole + Cetiol
V®; Ce 868 9 e 10: extrato + Cetiol 868®.
Analisando os resultados para a transmitância e absorbância, foi observado
que os menores valores de transmitância e os maiores valores de absorbância foram
para as amostras que se apresentaram visualmente com coloração avermelhada
homogênea, ou seja, as amostras 1, 2, 3, 4, 5 e 6, onde a luz teve menor penetração
e maior absorção devido a coloração, indicando melhor dispersão do extrato.
Confirmando que os óleos triglicérides de ácido cáprico e caprílico, miristato de
96
isopropila e Capryol® 90 dispersaram melhor o extrato mole da R. ferruginea. As
amostras 5 e 6 contendo o Capryol® 90 apresentaram a menor transmitância e a maior
absorbância entre todas as amostras, isto provavelmente se deve a sua função
tensoativa, com valor baixo de EHL, o que confirma o seu maior poder de dissolução
do extrato. Com isso, este composto foi testado como tensoativo para a análise
seguinte de solubilidade. Seguindo estas considerações, os óleos selecionados foram
os triglicérides de ácido cáprico e caprílico e o miristato de isopropila.
A segunda etapa dos testes de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea foi
realizada com a mistura de cada um dos dois óleos escolhidos com diferentes
tensoativos na proporção de 1:2. A seleção dos tensoativos foi feita baseada em
revisão bibliográfica e em estudos anteriores sobre o desenvolvimento
de
nanoemulsões, levando em conta a biocompatibilidade e não-toxicidade. Baseado
nestes critérios foram selecionados 7 tensoativos, sendo 6 não-iônicos devido a
capacidade desta classe de tensoativos sofrerem menor influência do pH e alterações
na força iônica (AZEEM et al., 2009). Desta forma, foram usados 7 tensoativos
diferentes para cada óleo selecionado, realizando-se o teste em duplicata para cada
uma das misturas. Os tensoativos escolhidos foram: Labrafil® M 1944 CS, Labrasol®,
Alkest® CSO 400, Tween® 80, Span® 80, Tween® 20, Capryol® 90. Após 24 h de teste,
observou-se que a temperatura de 25 °C não foi adequada para a realização da
análise com os tensoativos Alkest® CSO 400, Tween® 80, Tween® 20, e Span® 80,
devido a consistência muito viscosa dos mesmos não permitir a adequada
homogeneização das amostras. Assim o teste foi realizado por mais 24 h a uma
temperatura de 30 °C para as amostras que empregavam estes tensoativos.
As misturas na proporção de 1:2, em duplicata, foram identificadas usando
números da seguinte forma: (1) e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo +
Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo
+ Span® 80; (11) e (12) óleo + Tween® 20 e (13) e (14) óleo + Capryol® 90.
A análise visual das amostras após o teste demonstrou que as misturas de
miristato de isopropila (MI) com os tensoativos, amostras 6, 7, 8, 13 e 14 apresentaram
coloração mais avermelhada e homogênea, evidenciando que o extrato ficou melhor
disperso nestas misturas (Figura 13). A diferença de coloração entre as amostras 5 e
6, e 13 e 14 pode estar relacionada com a ineficiência da agitação durante o teste nas
amostras 5 e 13 por causa da aderência do extrato à barra magnética e o vidro do
frasco, dificultando a agitação.
97
Figura 13 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea com óleo
miristato de isopropila com diferentes tensoativos: (1) e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo +
Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest ® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11)
e (12) óleo + Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol ® 90.
Já no teste realizado com triglicérides de ácido cáprico e caprílico, as amostras
7, 8, 13 e 14 apresentaram, visualmente, maior dispersão do extrato, quando o óleo
foi misturado ao Tween® 80 (amostras 7 e 8) e ao Capryol® 90 (amostras 13 e 14),
conforme mostrado na Figura 14.
Figura 14 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea com o óleo
triglicérides cáprico caprílico com diferentes tensoativos : (1) e (2) óleo + Labrafil ® M 1944 CS; (3) e (4)
óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest ® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span®
80; (11) e (12) óleo + Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol ® 90.
Para confirmar os resultados encontrados na análise visual das amostras, as
mesmas tiveram a transmitância e absorbância medidas por espectrofotometria. Os
resultados encontrados são apresentados nas Tabelas 4 e 5 e, confirmaram os
resultados da análise visual. Os valores de absorbância para as misturas com miristato
de isopropila em ordem decrescente foi Capryol® 90 > Tween® 80 > Alkest® CSO 400
> Labrafil® M 1944 CS > Tween® 20 > Labrasol® > Span® 80.
98
Tabela 4 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de solubilidade do extrato
mole de R. ferruginea em miristato de isopropila e diferentes tensoativos.
Amostra
Comprimento de
Absorbância
Transmitância (T%)
350
2,039
0,9
350
1,665
2,2
MI Sol (3)
350
0,592
25,6
MI1 Sol3 (4)
350
0,536
29,2
MI1 Alk4 (5)
350
1,699
2,4
350
2,408
0,8
MI Tw80 (7)
395,5
2,635
0,5
MI1 Tw805 (8)
395,5
2,150
0,7
MI1 Sp806 (9)
671
- 286
193,6
MI1 Sp806 (10)
671
- 324
211,4
MI Tw20 (11)
369
1,317
4,8
MI1 Tw207 (12)
369
1,521
3,1
MI1 Cap908 (13)
350
1,702
2
MI1 Cap908 (14)
350
4,000
0
MI1 Fil2 (1)
1
2
MI Fil (2)
1
1
3
4
MI Alk (6)
1
1
5
7
Onda (nm)
Nota: 1Miristato de isopropila; 2Labrafil® M 1944 CS; 3Labrasol®; 4Alkest ® CSO 400; 5Tween® 80; 6Span®
80; 7Tween® 20; 8Capryol® 90.
99
Tabela 5 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de solubilidade do extrato
mole de R. ferruginea em triglicérides de ácido cáprico e caprílico e diferentes tensoativos.
Amostra
Comprimento de
Absorbância
Transmitância (T%)
350
0,813
15,6
350
0,726
18,7
Poly Sol (3)
350
0,416
38,4
Poly1 Sol3 (4)
350
0,547
28,4
Poly1 Alk4 (5)
350
1,473
3,4
350
1,355
4,9
Poly Tw80 (7)
384,5
1,597
2,5
Poly1 Tw805 (8)
384,5
1,601
3,0
Poly1 Sp806 (9)
395,2
- 208
161,3
Poly1 Sp806 (10)
395,2
- 0,099
125,7
Poly Tw20 (11)
369
1,147
7,1
Poly1 Tw207 (12)
369
1,171
6,7
Poly1 Cap908 (13)
350
4,000
0
Poly1 Cap908 (14)
350
4,000
0
Poly1 Fil2 (1)
1
2
Poly Fil (2)
1
1
3
4
Poly Alk (6)
1
1
5
7
Onda (nm)
Nota: 1Triglicérides de ácido cáprico e caprílico; 2Labrafil® M 1944 CS; 3Labrasol®; 4Alkest ® CSO 400;
5Tween® 80; 6Span® 80; 7Tween® 20; 8Capryol® 90.
Avaliando os resultados encontrados, foi selecionado como óleo o miristato de
isopropila e os tensoativos Capryol® 90, Tween® 80 e Alkest® CSO 400 para o
desenvolvimento das nanoemulsões.
5.3.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato mole
O coeficiente de partição (log de P) de uma substância em n-octanol/água é um
parâmetro matemático que prediz o transporte desta substância através das
membranas biológicas, uma delas a sua penetração percutânea, descrevendo a
distribuição de uma substância entre a fase aquosa, o veículo, e a fase lipídica, o
estrato córneo (GOMBAR; ENSLEIN, 1996; KORINTH et al., 2012). O octanol simula
de modo simplificado a barreira lipídica do estrato córneo auxiliando na predição da
penetração de substâncias químicas na pele, sendo a permeabilidade dessas
substâncias diretamente proporcional aos seus coeficientes de partição (KORINTH et
al., 2012).
O coeficiente de partição n-octanol/água para o extrato mole de R. ferruginea
foi realizado através da adição de uma solução aquosa contendo o extrato ao octanol
100
saturado pela água. A análise dos marcadores AMA e AMB em CLAE das fases
aquosas do teste de partição não detectou a presença dos mesmos, o que indica que
a partição é de 100% dos marcadores para o octanol, ou seja, estes compostos
migram da fase aquosa para a fase lipídica simulada.
Em ensaio de determinação do coeficiente de partição para os marcadores
AMA e AMB usando o método de CLAE de fase reversa, Zermiani (2014) encontrou o
log de P de 3,30 e 3,21, respectivamente. Estes valores indicam que os marcadores
AMA e AMB do extrato das cascas de R. ferruginea possuem alta lipofilicidade,
sugerindo que quando aplicados na pele irão migrar do veículo aquoso para o estrato
córneo, aumentando a penetração percutânea dos mesmos (KORINTH et al., 2012).
5.4 Desenvolvimento das nanoemulsões
5.4.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário
Sabe-se que a mistura de tensoativos tem uma eficiência melhor na formação
de nanoemulsões, do que o uso de tensoativos puros, dispersando-se e dissolvendose mais rapidamente dentro da fase contínua (PENG et al., 2010). A otimização dos
sistemas, neste estudo, foi realizada usando o diagrama de fases pseudoternário
obtido pelos métodos de titulação e ponto a ponto e com três diferentes misturas de
tensoativos considerando o valor de EHL do miristato de isopropila (EHL 11,50), fase
oleosa: Capryol® 90 (EHL= 6) + Alkest® CSO 400 (EHL= 13); Capryol® 90 (EHL= 6)
+ Tween® 80 (EHL= 15) e Alkest® CSO 400 (EHL= 13) + Span® 80 (EHL= 4,3),
conforme apresentado no Quadro 2.
O diagrama de fase pseudoternário é um triângulo equilátero em que se
representa a mistura de 4 componentes (óleo, água e a mistura de tensoativos) onde
os vértices deste triângulo representam os componentes puros. Podem ser
construídos a partir de dados obtidos por titulação ou ponto a ponto de diferentes
composições de amostras, sendo uma ferramenta ideal para caracterizar regiões que
apresentam o aspecto desejável para a incorporação da substância ativa
(DAMASCENO et al., 2011).
Os diagramas pseudoternários formados pelo método ponto a ponto para a
combinação dos tensoativos Capryol® 90:Alkest® CSO 400 (1,5:5,5), apresentaram
visualmente a formação de maior número de diferentes sistemas, os quais não foram
observados no diagrama formado pelo método da titulação (Figura 15).
101
Figura 15 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato
de isopropila, Capryol 90 e Alkest CSO 400, usando métodos diferentes: titulação e ponto a ponto.
Nota: FT: fluido transparente; FL: fluido translúcido; FB: fluido branco; GT: gelificado transparente; GU:
gelificado turvo; GL: gelificado translúcido; GR: gelificado com ressonância; EG: emulsão gelificada;
SF: separação de fases.
No método da titulação, a adição de água nos sistemas fluidos transparentes
(FT) contendo concentrações semelhantes de óleo e tensoativo resultou na turvação
destes, ou seja, a formação de sistemas fluidos translúcidos (FL). Com a contínua
adição de água, houve a formação de sistemas fluidos brancos, quando a
concentração de tensoativo foi menor que a do óleo. Na região com concentrações
semelhantes dos três componentes, houve a formação de sistemas gelificados
viscosos. Este aspecto foi alterado para visualmente emulsionado quando a
concentração de óleo foi maior que a de tensoativos. Este resultado evidencia que no
método da titulação ocorrem alterações físicas e físico-químicas dos sistemas
promovidas pela diluição dos sistemas formados com a adição de água, enquanto no
método da ponto a ponto há a formação clara e bem distinta dos sistemas.
Comparando os dois diagramas para a combinação dos tensoativos Capryol®
90:Alkest® CSO 400, a maior diferença é encontrada na região central do diagrama
cujas condições resultaram em sistemas fluidos ou gelificados. No diagrama obtido
por titulação foi observado maior área com formulações com aspecto de fluídos
translúcidos enquanto pelo método direto, as mesmas proporções dos componentes
resultaram em sistemas gelificados. Tais resultados apontam que a diluição dos
sistemas fluidos com água pode levar a diluição da fase aquosa externa, sem
promover alteração ou reestruturação do sistema, comportamento este comum às
nanoemulsões (ANTON; VANDAMME, 2011). Sistemas com características de
102
cristais líquidos (GR) com maior grau de organização foram obtidos somente pelo
método ponto a ponto.
O tamanho da fase interna dos sistemas preparados pelo método direto usando
os tensoativos Capryol® 90 e Alkest® CSO 400, foi de 9,33 ± 0,41 nm e 16,23 ± 0,66
nm para os sistemas fluidos transparentes com concentração de tensoativo maior que
50%. O aumento de água na formulação resultou em sistemas com aspecto gelificado
e turvo, com tamanho entre 13,25 ± 0,35 nm e 20,30 ± 0,72 nm. Os sistemas
gelificados com ressonância (GR), provavelmente com formação de cristais líquidos,
foram obtidos na região do diagrama com concentração semelhante dos três
componentes e/ou proporção de água levemente inferior aos demais. Tais sistemas
apresentaram tamanho entre 24,28 ± 1,02 nm e 100,24 ± 11,38 nm. Sistemas
gelificados translúcidos com tamanho entre 17,03 ± 5,71 nm e 80,50 ± 1,42 nm foram
formados com o aumento progressivo da água, nas regiões com proporções
semelhantes de tensoativo e água. Não foi observada uma relação direta entre o
tamanho da fase interna e o aspecto físico observado.
Os sistemas contendo mais de 50% de água e cerca de 20% de tensoativo
apresentaram aspecto fluido transparente e translúcido no diagrama por ponto a
ponto, com tamanho de gotículas entre 8,01 ± 0,39 nm e 26,76 ± 20,34 nm. Com o
aumento da proporção de água, os sistemas apresentaram aspecto branco e maior
tamanho (entre 20,86 ± 5,77 nm e 62,19 ± 19,72 nm). O aumento da concentração de
água, com tensoativos inferior a 20% e óleo entre 0 e 50%, resultou em sistemas
fluidos translúcidos ou branco, sendo que o aumento da concentração de óleo levou
a formação de sistemas com maior tamanho (entre 57,21 ± 27,94 nm e 205,9 ± 61,98
nm) e branco, característicos de emulsões.
Com o uso da mistura de Alkest® CSO 400 e Span® 80 foi obtida uma maior
área do diagrama com formulações com aspecto gelificado (Figura 16) quando
comparado ao uso do Capryol® como tensoativo lipofílico. Empregando o método da
titulação, a formação de sistemas com aspecto fluido translúcido ocorreu conforme se
foi procedendo a diluição do sistema fluido transparente, reduzindo a concentração de
tensoativo e aumentando a proporção de óleo, elevando a turbidez do sistema. Nestas
mesmas proporções, pelo método ponto a ponto, foi observada a definição de uma
maior área gelificada translúcida.
No método de titulação, o sistema formado sofreu diluição pela adição da água,
transformando a emulsão gelificada (EG) em fluido branco (FB), e este em sistemas
103
de fases separadas com a continuidade da adição de água. Já, o sistema gelificado
turvo (GT), com a diluição, passou a gelificado transparente (GT) e, posteriormente
fluido transparente (FT) e fluido translúcido (FL). Esta interferência da diluição do
sistema com o acréscimo de água não se observa quando o método utilizado para o
preparo do diagrama é o do ponto a ponto, proporcionado a obtenção de sistemas
bem definidos.
Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato
de isopropila, Alkest CSO 400 e Span 80, usando métodos diferentes: titulação e ponto a
ponto.
Nota: FU: fluído turvo; FT: fluído transparente; FL: fluído translúcido; FB: fluído branco; GT: gelificado
transparente; GU: gelificado turvo; GL: gelificado translúcido; GR: gelificado com ressonância; EG:
emulsão gelificada; SF: separação de fases.
A análise de tamanho das gotículas dos sistemas obtidos com a combinação
de Alkest® CSO400 e Span® 80 revelou que os sistemas formados com a
concentração de tensoativo maior que 50% e baixa concentração de óleo e água, com
aspecto fluido transparente e translúcido, apresentaram tamanho entre 6,13 ± 0,47
nm e 14,92 ± 2,04 nm. Este tamanho de gotículas aumentou quando a concentração
de tensoativo foi reduzida, ficando entre 18,2 ± 3,53 nm e 62,97 ± 29,02 nm. A
formação de uma maior região com sistemas de aspecto gelificado, quando a
concentração de água foi aumentada, com concentrações cada vez menores de óleo
e tensoativo, resultou em tamanhos de gotículas entre 6,54 ± 0,26 nm e 100,5 ± 2,15
nm, tendendo ao aumento do tamanho com o aumento da concentração de óleo.
Novas regiões com sistemas fluidos translúcidos e transparentes e uma região
fluida com aspecto turvo foram identificadas com a concentração de tensoativos na
faixa de 25% a 40%, com concentrações elevadas de água e óleo, apresentando
tamanho das gotículas entre 4,85 ± 1,34 nm e 16 ± 5,34 nm. Os fluidos brancos
104
formaram-se com as concentrações mais altas de óleo juntamente com a mistura de
tensoativos e cerca de 50% de fase aquosa, com tamanho de gotícula entre 7,3 ± 2,14
nm e 73,49 ± 25,11 nm.
Nos diagramas de fase obtidos usando a combinação miristato de isopropila e
Capryol® 90:Tween® 80 (Figura 17), a proporção entre os tensoativos (3,5:5,5) não foi
adequada para a emulsificação do óleo. Conforme observado no diagrama, houve
formação de grandes regiões com separação de fases em ambos os métodos de
preparo empregados. Este comportamento pode estar relacionado com o baixo EHL
do Capryol® 90. Alguns trabalhos relatam o uso do Capryol® 90 como fase oleosa no
desenvolvimento de nanoemulsões, assim como a avaliação da sua eficiência com
várias combinações de tensoativos não iônicos (SHAKEEL et al., 2013). A
desestabilização dos sistemas foi observada principalmente nas regiões com maior
concentração de óleo, mas também nas regiões com maior proporção de tensoativos
e quantidades semelhantes de água e óleo.
A formação de fluidos transparentes foi observada na região diagrama em que
a concentração de tensoativo era maior que de óleo. Nestas proporções houve a
emulsificação do óleo devido à molhabilidade do mesmo pela água através da ação
tensoativa.
Comparando-se os sistemas formados entre os dois métodos usados, observase que no método da titulação houve formação de maior número de diferentes
sistemas, demonstrando menor estabilização. Já no método ponto a ponto, os
sistemas formados apresentaram regiões melhor definidas. Este comportamento está
relacionado com a constante diluição dos sistemas pela adição diária e contínua de
água no método da titulação, com consequente transformação dos sistemas ou
desestabilização dos sistemas formados.
105
Figura 17 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato
de isopropila, Capryol 90 e Tween 80, usando métodos diferentes: titulação e ponto a ponto.
Nota: FU: fluido turvo; FT: fluido transparente; FL: fluido translúcido; FB: fluido branco; GU:
gelificado turvo; EG: emulsão gelificada; SF: separação de fases.
Na avaliação da distribuição de tamanho das gotículas nos sistemas formados
pelo método ponto a ponto, observou-se que os sistemas com concentração da
mistura de tensoativo acima de 70% e água menor que 30% da composição total,
apresentaram tamanho das gotículas entre 12,42 ± 1,09 nm e 30,64 ± 2,90 nm, ou
seja, tamanhos em escala nanométrica, com aspectos fluídos transparentes ou turvos,
sem a formação de um sistema emulsionado. Provavelmente houve apenas a
formação de micelas de tensoativo. Nas composições com concentração de
tensoativos entre 55% e 70%, com a quantidade de óleo igual ou maior que a de água,
o tamanho das gotículas aumentou, ficando entre 99,29 ± 81,28 nm e 240,5 ± 77,10
nm, com aspecto fluido turvo ou transparente. Estas diferenças de tamanho
demonstram a influência da concentração de tensoativo.
Com a redução progressiva da concentração da mistura de tensoativos houve
uma redução do tamanho das gotículas dos sistemas. Os sistemas com aspecto
gelificado turvo apresentaram tamanho de 18,2 ± 0,36 nm quando a proporção de
tensoativo e água superou a de óleo, sendo este menor que 20%. Tamanhos entre
86,90 ± 1,87 nm e 219,06 ± 2,72 nm ocorreram nas formulações com concentrações
semelhantes entre os três componentes com ligeiro aumento da proporção de água.
Sistemas com concentração de óleo e tensoativo semelhantes e baixa concentração
de água, apresentaram aspecto fluido transparente com tamanho das gotículas entre
14,36 ± 2,04 nm e 21,90 ± 15,58 nm. Com o aumento da concentração de água, os
sistemas apresentaram aumento do tamanho das gotículas tendendo a formação de
sistemas com aspecto fluido turvo a branco e tamanho entre 21,25 ± 1,47 nm e 164,75
106
± 65,27 nm. Sistemas translúcidos com tamanho entre 12,73 ± 0,76 nm e 16,92 ± 0,39
nm foram obtidos com concentração de água e tensoativos semelhantes e menor
concentração de óleo. O aumento da proporção de água em relação ao óleo, com
tensoativo entre 10% e 40%, resultou em aumento de tamanho, ficando entre 77,54 ±
51,21 nm e 197,3 ± 100,7 nm, com sistemas de aspecto turvo e tendendo ao
branqueamento.
Analisando os resultados encontrados em todos os diagramas formados
independente da combinação de componentes, percebeu-se diferenças nos sistemas
formados de acordo com o método empregado para sua formação.
Segundo Anton e Vandamme (2011) o método da titulação empregado para
construção de diagrama de fases para obtenção de nanoemulsão, pode gerar erros
de interpretação. Esta diferença pode estar relacionada com a lenta alteração e/ou
organização do sistema emulsionado quando a água é titulada em pequenos volumes.
Embora o método da titulação seja o método empregado no desenvolvimento de
nanoemulsões, em que o óleo e o tensoativo são misturados previamente e a água é
adicionada posteriormente, a adição de água continuamente
em um sistema
nanoemulsionado já formado, dilui a fase externa, sem alterar o tamanho das gotículas
(ANTON; VANDAMME, 2011). Assim, percebe-se como melhor método para o
desenvolvimento do diagrama de fases pseudoternário para o desenvolvimento de
nanoemulsões, o método ponto a ponto, pois apresenta resultados mais reprodutíveis
e confiáveis dos sistemas formados.
No presente trabalho os sistemas formados foram classificados de acordo com
as características visuais observadas a olho nu, pois a classificação entre
nanoemulsões e microemulsões não é segura baseada somente na observação visual
do aspecto do sistema e aferição do tamanho das gotículas. São sistemas muito
semelhantes entre si quanto às características físicas e ao tamanho das gotículas,
apenas diferenciando-se
quanto
à estabilidade. Tanto
nanoemulsões
como
microemulsões se apresentam nas formas fluida translúcida ou transparente e com
tamanho
de
gotículas
menor
de
100
nm
(ANTON;
VANDAMME, 2011;
MCCLEMENTS; RAO, 2011; MCCLEMENTS, 2012).
Nos resultados encontrados ficou evidente que os diagramas desenvolvidos
utilizando como um dos tensoativos o Alkest® CSO 400, tiveram maior formação de
sistemas com aspecto gelificado. Isto porque o caráter não-iônico deste tensoativo,
com a parte hidrofóbica proveniente do óleo de mamona e a porção hidrofílica
107
proveniente da cadeia de óxido de eteno (óleo de mamona 40 EO), apresentando alto
grau de etoxilação elevando o seu valor de EHL, tem seu caráter hidrofílico mais
acentuado. Quanto maior for o grau de etoxilação do tensoativo maior é a cadeia polar
da molécula, o que estabiliza estericamente a gotícula de óleo no sistema, formando
sistemas com aspecto gelificado (DALTIN, 2011).
A combinação de Capryol® 90 e Tween® 80 não foi adequada para a formação
de sistemas estáveis na sua maioria e, embora a combinação de Capryol® 90 e Alkest®
CSO 400 apresentou conformidade para a formação de sistemas mais estáveis, esta
teve a continuidade dos seus testes inviabilizado pelo alto custo do tensoativo
Capryol® 90. Portanto para dar continuidade a otimização da nanoemulsão foram
selecionados 3 sistemas a partir do diagrama com a combinação dos tensoativos
Alkest® CSO400 e Span® 80. Conforme apresentado na Tabela 6, estes sistemas
apresentaram tamanho de fase interna menor que 100 nm, aspecto fluido branco e
PDI próximo a 0,2.
Tabela 6 - Formulações e características dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o estudo de
estabilidade preliminar.
1–
4-
Tensoativos2
Fórmula
Óleo1 (%)
4:6:20
13,3
20,0
66,7
5:5:70
6,3
6,3
87,5
6:4:20
20,0
13,3
66,7
(%)
Água (%)
Aspecto
Fluído
Branco
Fluído
Branco
Fluído
Branco
Tamanho
d (nm)3
PDI 4
66,98
0,283
23,09
0,216
73,49
0,153
Miristato de isorpropila. 2- *Alkest® CSO 400 e Span ® 80 (7,2:1,5). 3- Tamanho expresso como média em número.
PDI: índice de polidispersibilidade.
As formulações selecionadas foram submetidas aos estudos de estabilidade
preliminar e estabilidade termodinâmica, a fim de proceder a escolha da formulação.
5.4.2 Estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica das
nanoemulsões
O teste de estabilidade preliminar foi realizado com o objetivo de escolher a
formulação mais estável para posterior incorporação do extrato da R. ferruginea. Para
esta análise foram preparados lotes de 30 g em duplicata.
108
Das três formulações analisadas, a 4:6:20 durante o processo de resfriamento ,
após a emulsificação, formou um sobrenadante com aspecto gelificado diferente do
sistema formado na porção inferior do frasco, com aspecto fluido. Foi então verificado
a influência de alteração no processo de emulsificação, elevando-se o período de
agitação sem aquecimento de 3 minutos para 5 minutos. Esta alteração não provocou
mudanças no sistema formado, permanecendo heterogêneo. Assim, esta formulação
não foi submetida ao teste de estabilidade preliminar e excluída do estudo.
Os resultados da estabilidade preliminar para as formulações 5:5:70 e 6:4:20
estão expostos na Tabela 7.
Tabela 7 - Resultados das análises no tempo inicial (ti) e final (tf) das nanoemulsões sem extrato
submetidas aoestudo de estabilidade preliminar.
Amostra
(réplica)
5:5:70
(1)
5:5:70
Aspecto1
Tamanho
Centrifugação2
pH
(nm)
ti
tf
ti
tf
ti
tf
ti
FL
FL
6,65
7,08
+
+
7,90 ± 6,4
FL
FL
6,49
6,94
+
+
10,84 ± 6,1
FLL
FLL
6,60
6,72
+
+
62,14 ± 3,5
FLL
FLL
6,61
6,70
+
+
56,17 ± 1,4
(2)
6:4:20
(1)
6:4:20
(2)
PDI4
3
tf
11,89 ±
7,2
13,76 ±
6,3
58,99 ±
0,6
57,26 ±
1,4
ti
tf
0,291
0,264
0,290
0,266
0,087
0,095
0,068
0,065
Nota: 1FL: fluido translúcido; FLL: fluido leitoso levemente translúcido. 2(+) em conformidade; (-) em
não conformidade. 3Tamanho expresso como média do número ± SD. 4PDI: índice de
polidispersibilidade.
Comparando o aspecto físico das amostras escolhidas pelo diagrama de fases
(Tabela 6) e o aspecto destas mesmas formulações preparadas para o estudo da
estabilidade preliminar (tinicial – Tabela 7), percebe-se a alteração do aspecto, de fluido
branco para fluido translúcido. Isto se deve, provavelmente
à influência da
temperatura sobre o tensoativo polietoxilado Alkest® CSO 400.
Para o desenvolvimento do diagrama de fases foi utilizada a temperatura de 45
°C, no entanto esta temperatura não foi adequada para reproduzir o mesmo sistema
para o teste de estabilidade preliminar. A temperatura de 45 °C gerou sistemas
gelificados e não fluidos, quando houve o aumento na quantidade do lote, para 30 g.
109
Então, foi necessário o aumento da temperatura para 80 °C obtendo-se assim
sistemas fluidos porém não mais de cor branca, e sim sistemas translúcidos.
Esta alteração se deve ao tensoativo Alkest® CSO 400, um tensoativo não
iônico etoxilado, que não apresenta em sua molécula cargas verdadeiras de sais
dissociados e, que seriam responsáveis pela sua alta solubilidade em água. Neste
tensoativo as cargas que atraem moléculas de água, estão distribuídas por todos os
átomos de oxigênio na cadeia polimérica da molécula. Assim a força de atração para
as moléculas de água é fraca. Porém a agitação molecular provocada pelo
aquecimento de uma solução com tensoativo não iônico etoxilado rompe esta força
de atração, consequentemente, menos moléculas de água se estabilizam ao longo da
cadeia do tensoativo, fazendo com que o tensoativo sofra precipitação e resulte em
uma solução com aspecto de névoa ou turvo (DALTIN, 2011). Mudanças na
temperatura levam às modificações na hidratação das cadeias polietoxiladas deste
tensoativo (SOLANS; SOLÈ, 2012). Por isso a temperatura de 45 °C para a formação
da nanoemulsão e a agitação através do agitador mecânico não foram suficientes para
romper a força de atração entre as moléculas de água e o tensoativo etoxilado Alkest®
CSO 400, sendo necessário o aumento da temperatura de aquecimento.
Comparando os resultados encontrados no estudo de estabilidade preliminar
(Tabela 7) com os resultados obtidos na etapa de otimização (Tabela 6), o tamanho
das gotículas diminuiu significativamente na formulação 5:5:70, e na formulação
6:4:20 houve grande redução no índice de polidispersibilidade.
Devido à alta concentração de tensoativo na formulação 5:5:70 e a temperatura
maior durante o processo de emulsificação, a quebra das gotículas provocada pela
agitação foi mais efetiva, gerando tamanhos mais reduzidos. Segundo Amani e
colaboradores (2008), a energia total empregada durante a formação do sistema é um
fator dominante no controle do tamanho das gotículas finais em uma nanoemulsão. A
agitação somada a maior concentração da mistura de tensoativos e a alta temperatura
durante a emulsificação aumentaram a energia interfacial das gotículas, reduzindo
seus tamanhos (FERNANDEZ et al., 2004; IZQUIERDO et al., 2005).
Na proporção 6:4:20, com concentração de tensoativo menor que a de óleo, as
condições de preparo não alteraram significativamente o tamanho das gotículas,
porém tornou o sistema mais homogêneo, percebido pela redução do índice de
polidispersibilidade. Este resultado demonstra a influência da temperatura e da
concentração de tensoativos na formação de nanogotículas,
provocada pela
110
capacidade dos tensoativos não iônicos com cadeia polietoxiladas realizar a transição
de fases com variações de temperatura, modificando a sua solubilidade nas diferentes
fases do sistema com consequente formação de nanoemulsões (SOLANS et al.,
2005).
Analisando os resultados no tempo inicial e final da estabilidade preliminar
(Tabela 7), percebe-se que o aspecto físico das formulações permaneceu inalterado,
sem evidência de qualquer instabilidade, assim como o teste de centrifugação não
revelou qualquer separação de fases nos sistemas. Como principal alteração observase o aumento do pH na formulação 5:5:70, porém não representativa para degradação
química.
Prosseguindo nos testes de estabilidade preliminar, foi realizado ciclo
gelo/degelo, com adaptação da temperatura para -4 ± 2°C e 25 ± 2°C, para verificação
da estabilidade termodinâmica.
Todas as formulações apresentaram alteração de aspecto, com separação de
fases, aumento da fluidez e cremeação demonstrando instabilidade frente a variações
críticas de temperatura, o que é esperado para uma nanoemulsão. As nanoemulsões
têm por definição serem um sistema não estável termodinamicamente, ou seja, o ciclo
gelo/degelo apenas acelerou a desestabilização. Uma nanoemulsão sempre terá
quebra do sistema em determinado tempo, sendo a proporção desta separação
dependente da barreira de energia livre entre a nanoemulsão (sistema disperso) e a
energia livre das fases separadas deste mesmo sistema, e do processo de transporte
de moléculas envolvido. Nas nanoemulsões, a energia livre do sistema disperso é
maior do que a energia livre das fases separadas, sendo que esta barreira de energia
formada entre o sistema disperso e o sistema separado, deve ser suficientemente
grande para assegurar a estabilidade do sistema por um período de tempo
(MCCLEMENTS, 2012). Neste estudo, o emprego de alterações críticas das
temperaturas
acelerou a redução desta barreira de energia, provocando a
desestabilização dos sistemas.
A partir dos resultados de estabilidade preliminar, as duas formulações 5:5:70
e 6:4:20 foram mantidas no estudo para a etapa posterior de incorporação do extrato
de R. ferruginea.
111
5.5 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo
extrato de R. ferruginea
A concentração de extrato mole incorporada nas nanoemulsões selecionadas
(5:5:70 e 6:4:20) baseou-se no resultado encontrado em ensaio farmacológico
empregando modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton para cremes
convencionais contendo 0,25%, 0,5% e 1,0% de extrato mole de R. ferruginea,
juntamente com creme convencional contendo 0,5% e 0,1% do marcador AMB,
representado na figura 30 no item 5.11. Embora a inibição do edema proporcionada
pelas diferentes concentrações não tenha diferenças significativas entre si, a
concentração de 0,5% do extrato mole de R. ferruginea foi escolhida para
incorporação nas nanoemulsões por ser esta concentração intermediária.
O extrato mole foi primeiramente incorporado na fase aquosa da nanoemulsão ,
após prévia dissolução em propilenoglicol devido à dificuldade de dissolução deste na
fase oleosa, conforme procedimento descrito no item 4.5.3. Nesta etapa do estudo foi
adicionado o agente de consistência Sepigel® com o objetivo de aumentar a
consistência da fase externa das nanoemulsões, adequando-as para aplicação tópica,
conforme realizado em alguns trabalhos que também empregaram modificadores
reológicos com este objetivo (MOU et al., 2008; SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET;
L’ALLORET, 2004; YILMAZ; BORCHERT, 2006).
Os resultados do estudo de estabilidade preliminar para as formulações
contendo extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, estão expressos
na Tabela 8.
Na amostra 5:5:70 S a adição do agente de consistência promoveu leve
aumento do tamanho das gotículas e diminuição do PDI, indicando maior estabilização
do sistema com a homogeneização do tamanho das gotículas. No caso da amostra
6:4:20 S, ocorreu o contrário, a adição do Sepigel® levou a diminuição do tamanho
das gotas com elevação do valor de PDI. Isso ocorreu provavelmente em função da
proporção de água na amostra 5:5:70 ser maior (87,5%) que na amostra 6:4:20
(66,7%), o que pode ter levado ao maior intumescimento do polímero, levando a
formação de uma rede polimérica com maior estabilidade para o sistema.
A adição do extrato
mole da R. ferruginea provocou claramente
a
desestabilização dos sistemas, evidenciada pela separação de fases na amostra
6:4:20 RF no teste de centrifugação no tempo zero e na amostra 5:5:70 RF no teste
112
de centrifugação no tempo final. Esta desestabilização provocada pelo extrato é
percebida nos valores do índice de polidispersibilidade, os quais se elevaram,
principalmente na amostra 6:4:20 RF. Isso se deve, provavelmente, a característica
complexa do extrato com componentes solúveis e insolúveis, formando diversos
tamanhos de gotículas. O acréscimo do Sepigel® na amostra 6:4:20 RFS contendo o
extrato provocou uma melhor estabilização, com redução do PDI, embora tenha
apresentado valor elevado, com redução do tamanho. Já na amostra 5:5:70 RFS
contendo o extrato, o Sepigel® elevou o valor de PDI. A adição do extrato também
provocou redução do pH, por este possuir característica levemente ácida (pH do
extrato = 4,21).
O aumento dos valores de PDI nas amostras contendo extrato e Sepigel ®,
observado nas análises após o estudo de estabilidade preliminar, indica a
desestabilização do sistema ao término do ensaio. Foi possível observar que a adição
do extrato foi a causa da desestabilização das amostras, e que a adição do Sepigel ®
como agente de consistência, formou uma rede polimérica estabilizando os sistemas,
sem alteração significativa no tamanho das gotas.
Em uma nanoemulsão
a sua elevada estabilidade intrínseca leva em
consideração a estabilização estérica causada pelo o uso de tensoativos não-iônicos
e polímeros (TADROS et al., 2004), o que foi percebido nas formulações
desenvolvidas. As formulações sem extrato apresentaram uma maior estabilidade
considerando o aspecto físico após o teste de estabilidade, sem qualquer alteração
visual, e os seus baixos índices de polidispersibilidade.
Uma vez que os resultados do estudo preliminar de estabilidade das
nanoemulsões com extrato incorporado na fase aquosa mostraram instabilidades
físico-químicas, foi testada a incorporação de 0,5% de extrato na fase oleosa da
formulação, com prévia dissolução em propilenoglicol nas concentrações de 2% e 5%.
Este novo método de preparo demonstrou melhor estabilização quanto ao pH
e ao tamanho de fase interna e valores de PDI, conforme observado na Tabela 9. No
entanto,
demonstrou
resultados
não adequados para uma
nanoemulsão
e
desestabilização dos sistemas no término do estudo, com separação de fases. Na
formulação 6:4:20 RFS, como possível consequência da menor proporção de água, o
extrato não se dispersou totalmente na fase oleosa, mesmo com a dissolução prévia
em propilenoglicol, apresentando separação de fases no término do estudo.
113
Tabela 8 - Resultados do estudo de estabilidade preliminar para as amostras com e sem extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, com e
sem Sepigel®.
Teste de
Tamanho
Aspecto1
pH
PDI 4
Amostra
2
Centrifugação
(nm)3
(réplica)
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
5:5:70 (1)
FL
FL
ND
ND
+
+
23,99 ± 11,03
17,50 ± 8,28
0,196
0,246
5:5:70 (2)
FL
FL
ND
ND
+
+
14,31 ± 9,59
18,43 ± 5,54
0,214
0,271
5:5:70 S(1)
CBF
CBF
6,32
6,08
+
+
34,47 ± 1,81
33,15 ± 0,26
0,173
0,186
5:5:70 S(2)
CBF
CBF
5,68
6,43
+
+
34,55 ± 1,31
34,72 ± 3,01
0,182
0,173
5:5:70 RF (1)
FOMC
SF
ND
ND
+
-
41,03 ± 4,28
37,34 ± 4,60
0,336
0,474
5:5:70 RF (2)
FOMC
SF
ND
ND
+
-
38,31 ± 5,68
34,38 ± 6,31
0,299
0,495
5:5:70 RFS (1)
CMCF
CMCF
4,81
4,96
+
+
43,18 ± 9,23
79,54 ± 37,94
0,554
0,842
5:5:70 RFS (2)
CMCF
CMCF
4,71
5,04
+
+
34,71 ± 21,48
88,85 ± 50,73
0,546
0,874
6:4:20 (1)
FLL
FLL
ND
ND
+
+
66,08 ± 0,23
61,23 ± 1,24
0,065
0,097
6:4:20 (2)
FLL
FLL
ND
ND
+
+
56,44 ± 2,80
57,02 ± 1,33
0,074
0,075
6:4:20 S (1)
GCBC
GCBC
7,35
6,71
+
+
53,19 ± 1,22
52,18 ± 0,98
0,144
0,178
6:4:20 S(2)
GCBC
GCBC
7,17
6,59
+
+
45,64 ± 1,41
34,57 ± 14,94
0,163
0,196
6:4:20 RF (1)
FOM
SF
ND
ND
-
-
49,97 ± 2,74
ND
0,633
ND
6:4:20 RF (2)
FOM
SF
ND
ND
-
-
46,90 ± 3,66
ND
0,763
ND
6:4:20 RFS (1)
CCME
CME
4,99
4,06
+
+
47,16 ± 3,61
30,92 ± 20,82
0,591
0,997
6:4:20 RFS (2)
CCME
CME
4,93
4,04
+
+
40,80 ± 14,36
36,20 ± 6,90
0,657
0,986
Nota: ND: não determinado; 1 CBF: creme branco levemente fluido; CCME: creme consistente marrom escuro; CME: creme marrom escuro; CMCF: creme
marrom claro levemente fluido; FLL: fluido leitoso levemente translúcido; FOMC: fluido opaco marrom claro; FOME: fluido opaco marrom; FL: fluido translúcido;
GCBC:gel-creme branco consistente; SF: separação de fases. 2(+): em conformidade; (-): em não conformidade. 3tamanho expresso como média em número
± SD. 4índice de polidispersibilidade.
114
Tabela 9 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as formulações com o
extrato de R. ferruginea incorporado na fase aquosa (linhas em cinza) e na fase oleosa com diferentes
concentrações de propilenoglicol (linhas em branco).
Teste de
Tamanho
Amostra
Aspecto1
pH
PDI 4
2
Centrifugação
(nm)3
(réplica)
t inicial
tf inal tinicial t f inal tinicial
tf inal
t inicial
tf inal
tinicial tf inal
5:5:70 RFS (1)
CMCF
CMCF
4,81
4,96
+
+
5:5:70 RFS (2)
CMCF
CMCF
4,71
5,04
+
+
CFBE
CFBE
5,00
4,53
+
-
CFBE
CFBE
5,11
4,68
+
-
CFBE
CFBE
5,25
4,60
+
-
CFBE
CFBE
5,11
4,61
+
-
6:4:20 RFS (1)
CCME
CME
4,99
4,06
+
+
6:4:20 RFS (2)
CCME
CME
4,93
4,04
+
+
CCBE
SF
5,00
ND
+
-
CCBE
SF
5,00
ND
+
-
CCBE
SF
5,14
ND
+
-
CCBE
SF
5,18
ND
+
-
5:5:70 (1)
43,18 ±
79,54 ±
9,23
37,94
34,71 ±
88,85 ±
21,48
50,73
26,27 ±
32,64 ±
15,98
20,05
27,78 ±
48,03 ±
15,22
11,29
34,32 ±
32,14 ±
18,57
25,86
19,76 ±
42,57 ±
18,43
26,33
47,16 ±
30,92 ±
3,61
20,82
40,80 ±
36,20 ±
14,36
6,90
RFS 2%
5:5:70 (2)
RFS 2%
5:5:70 (1)
RFS 5%
5:5:70 (2)
RFS 5%
6:4:20 (1)
RFS 2%
6:4:20 (2)
RFS 2%
6:4:20 (1)
35,52 ±
17,28
27,60 ±
7,64
52,53 ±
3,34
RFS 5%
6:4:20 (2)
RFS 5%
60,58 ±
54,75
0,554
0,842
0,546
0,874
0,698
0,677
0,533
0,929
0,613
0,576
0,668
0,835
0,591
0,997
0,657
0,986
ND
0,428
ND
ND
0,441
ND
ND
0,519
ND
ND
0,503
ND
Nota: ND: não determinado; 1CCBE: creme consistente bege escuro; CCME: creme consistente
marrom escuro; CFBE: creme fluído bege escuro; CME: creme marrom escuro; CMCF: creme marrom
claro levemente fluido; SF: separação de fases. 2(+): em conformidade; (-): em não conformidade.
3Tamanho expresso como média em número ± SD. 4Índice de polidispersibilidade.
Com base nestes resultados, um novo teste foi realizado, com redução da
concentração do extrato para 0,25% e 0,13% com incorporação na fase oleosa e
aquosa com prévia dissolução em 2% de propilenoglicol.
Nestes resultados, apresentados na Tabela 10, foi verificado que a redução da
concentração do extrato de 0,5% para 0,25% e 0,13% propiciou a incorporação do
mesmo nas formulações selecionadas, as quais permaneceram homogêneas durante
o estudo sem evidências de separação de fases, mesmo após o teste de
centrifugação. Exceto para uma réplica da formulação 6:4:20 com 0,13% de extrato
incorporado na fase oleosa do sistema (6:4:20 FO 0,13% (2)), que apresentou leve
115
separação de fases após a centrifugação, apresentando aumento do tamanho das
gotículas e confirmando a desestabilização.
As formulações 5:5:70 apresentaram-se mais instáveis com aumento relevante
no tamanho das gotículas e na distribuição do tamanho. O pH apresentou leve
redução. As formulações 6:4:20 apresentaram acentuada redução do pH e redução
do tamanho das gotículas com pouca elevação na distribuição de tamanho, no tempo
final do estudo. Esta formulação apresenta maior concentração de óleo e o dobro da
concentração de tensoativo em relação a formulação 5:5:70, o que possivelmente
favoreceu a dissolução dos ácidos mirsinoicos na formulação com as alterações
bruscas de temperatura, ocasionando a redução no valor de pH.
A partir dos resultados encontrados, a formulação 6:4:20 contendo 0,25% e
0,13% do extrato incorporado na fase oleosa do sistema, foi selecionada para
continuidade dos estudos.
116
Tabela 10 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as nanoemulsões com 0,25% e 0,13% de extrato de R. ferruginea, incorporados
na fase oleosa (linhas cinzas) e na fase aquosa (linhas brancas).
Aspecto1
Amostra
pH
Teste de
Tamanho
Centrifugação2
d (nm)3
PDI4
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
tinicial
tfinal
5:5:70 FO 0,25% (1)
CFB
CFB
5,0
4,81
+
+
24,93 ± 7,77
2660 ± 2402
0,461
0,201
5:5:70 FO 0,25% (2)
CFB
CFB
5,19
4,90
+
+
42,54 ± 1,96
1532 ± 2622
0,702
0,527
5:5:70 FA 0,25% (1)
CFB
CFB
5,39
5,10
+
+
39,77 ± 1,94
1618 ± 2766
0,376
0,567
5:5:70 FA 0,25% (2)
CFB
CFB
5,40
5,29
+
+
29,84 ± 8,95
20,28 ± 8,84
0,388
0,231
5:5:70 FO 0,13% (1)
CFBC
CFBC
5,18
5,02
+
+
30,28 ± 10,62
24,61 ± 11,64
0,325
1,0
5:5:70 FO 0,13% (2)
CFBC
CFBC
5,25
5,28
+
+
33,01 ± 7,76
33,08 ± 13,33
0,262
1,0
5:5:70 FA 0,13% (1)
CFBC
CFBC
5,63
5,32
+
+
45,72 ± 19,10
23,26 ± 11,92
0,204
0,899
5:5:70 FA 0,13% (2)
CFBC
CFBC
5,42
5,40
+
+
33,80 ± 0,78
22,29 ± 1,08
0,255
1,0
6:4:20 FO 0,25% (1)
CCBE
CCBE
5,13
3,50
+
+
65,39 ± 33,28
16,76 ± 1,49
0,171
0,414
6:4:20 FO 0,25% (2)
CCBE
CCBE
5,07
3,54
+
+
80,92 ± 9,44
46,04 ± 28,14
0,166
0,459
6:4:20 FA 0,25% (1)
CCBE
CCBE
5,82
3,80
+
+
70,56 ± 6,96
25,58 ± 15,02
0,151
0,481
6:4:20 FA 0,25% (2)
CCBE
CCBE
5,61
3,94
+
+
69,20 ± 5,76
26,35 ± 7,35
0,171
0,275
6:4:20 FO 0,13% (1)
CCBC
CCBC
5,31
3,57
+
+
70,72 ± 7,2
39,03 ± 35,09
0,127
0,250
6:4:20 FO 0,13% (2)
CCBC
CCBC
5,42
3,56
+
-
72,85 ± 1,80
90,02 ± 0,31
0,149
0,175
6:4:20 FA 0,13% (1)
CCBC
CFBC
5,70
3,64
+
+
63,04 ± 5,68
49,36 ± 21,81
0,146
0,214
6:4:20 FA 0,13% (2)
CCBC
CFBC
6,20
3,74
+
+
56,84 ± 23,44
35,33 ± 24,63
0,209
1CCBE:
Nota:
creme consistente bege escuro; CCBC: creme consistente bege claro; CFB: creme fluído bege; CFBC: creme fluido bege claro.
conformidade; (-): em não conformidade. 3Tamanho expresso como média em número ± SD. 4Índice de polidispersibilidade.
0,282
2(+)
em
117
5.6 Caracterização das nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea
Partindo dos resultados obtidos no estudo de estabilidade preliminar, a
formulação escolhida para continuidade dos estudos foi a 6:4:20 contendo 0,13% e
0,25% de extrato das cascas de R. ferruginea.
A fim de selecionar uma única concentração do extrato nas nanoemulsões,
antes da caracterização completa do sistema, foi realizado estudo in vivo da atividade
anti-inflamatória em modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton, conforme
metodologia descrita no item 4.11.2, com o objetivo de avaliar qual a concentração
mais efetiva do extrato incorporado na nanoemulsão e em uma base de creme
convencional. O teste foi realizado com a nanoemulsão sem extrato, nanoemulsão
com extrato a 0,13% e 0,25%, creme sem extrato, creme com extrato a 0,13%, 0,25%
e 0,5%. A nanoemulsão com 0,13% de extrato apresentou atividade anti-inflamatória
mais efetiva com significativa diferença em relação a nanoemulsão com 0,25% de
extrato, conforme figura 31 do item 5.11. Em relação ao creme, não houve diferença
estatística na inibição do edema de orelha entre as diferentes concentrações. Como
um dos objetivos deste estudo é averiguar a diferença de ação entre os veículos creme
e nanoemulsão, optou-se pelo emprego da mesma concentração de extrato em
ambos veículos, 0,13% de extrato em nanoemulsão e creme. O extrato foi incorporado
nas formulações após prévia dispersão em propilenoglicol.
A caracterização das nanoemulsões desenvolvidas requer o emprego de
diferentes técnicas de análise para garantir que o sistema desenvolvido apresente as
características desejadas para uma nanoemulsão.
Após 24 h de preparo, a nanoemulsão sem adição de extrato apresentou
aspecto semissólido consistente, homogêneo, na cor branca, com toque aveludado.
A adição do extrato desenvolveu cor caramelo na nanoemulsão, que apresentou
aspecto semissólido com menor consistência em relação ao veículo
branco,
homogêneo, com toque aveludado. Após o teste de centrifugação, as formulações
demonstraram adequada estabilidade física, não apresentando qualquer indício de
instabilidade como separação de fases, cremeação ou sinais de precipitação.
Para a análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta, as
formulações foram diluídas em água ultrapura na proporção de 1:100, e analisadas
por DLS, a temperatura de 25 °C. O tamanho das gotículas foi expresso como média
de 3 aferições. Todas as formulações apresentaram-se monodispersas. Para a
118
nanoemulsão com 0,13% de extrato, a média de tamanho foi de 47,88 ± 8,20 nm com
0,228 ± 0,004 de PDI, representado na figura 18(B). Para a nanoemulsão sem extrato
a média de tamanho das gotas foi de 57,43 ± 3,37 nm com 0,114 ± 0,016 de PDI,
representado na figura 18(A).
As figuras 18A1 e 18B1 representam a taxa de correlação das nanoemulsões
sem e com extrato, respectivamente. A taxa de correlação informa sobre a correlação
entre o tempo e o movimento provocado pelo espalhamento de luz das gotículas
(SCHÄTZEL, 1987), representando a taxa de decaimento das gotas em suspensão,
influenciada pelo tamanho das mesmas, durante o tempo de incidência da luz. A taxa
de correlação de ambas formulações analisadas representa a homogeneidade dos
sistemas quanto ao tamanho.
A incorporação do extrato no sistema provocou redução do tamanho das gotas,
o que também foi encontrado em outros trabalhos incorporando substâncias ativas
(OKUR et al., 2011; SANDIG et al., 2013), havendo a hipótese de que as moléculas
de um ativo incorporado no sistema participam da sua microestrutura podendo causar
influências devido a interações moleculares (SANDIG et al., 2013). Possivelmente
devido a estas interações moleculares houve elevação do PDI quando da
incorporação do extrato, indicativo da diminuição da homogeneidade do tamanho das
gotas do sistema, pois o PDI é um índice que indica o desvio da média de tamanho
das gotas (KELMANN et al., 2007).
A caracterização de nanoemulsões por DLS possui algumas limitações como,
não reconhecimento de pequenas populações de gotículas grandes dentro do
sistema, além da técnica reconhecer somente formas esféricas perfeitas e necessitar,
algumas vezes, da amostra diluída para promover maior transparência para a análise.
O emprego da microscopia eletrônica de transmissão (MET) como técnica
complementar a técnica por DLS, é uma ferramenta confiável e informativa para
caracterizar as nanoemulsões (KLANG et al., 2012).
119
Figura 18 - Gráficos representativos da distribuição do tamanho da fase interna da nanoemulsão sem
extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B), com seus respectivos gráficos de taxa de correlação
correspondentes (A1 e B1).
Sendo assim, para verificar a morfologia da fase interna, as nanoemulsões com
e sem extrato de R. ferruginea foram analisadas por MET.
Na MET a amostra é iluminada por um feixe de elétrons que interage com o
material provocando um espalhamento de elétrons, obtendo-se uma imagem
contrastada. A resolução na MET é proporcional a aceleração na voltagem dos
elétrons, que para sistemas coloidais, pode ser entre 80 e 200 kV (KLANG et al.,
2012). No presente estudo foi utilizada a voltagem de 80 kV para visualizar as
nanoemulsões diluídas. A diluição foi necessária devido ao aspecto semissólido dos
sistemas.
As imagens obtidas pela MET das nanoemulsões com e sem extrato, figura 19,
demonstram as gotículas da fase interna esféricas envolvidas por um sistema
estruturado formado pelo polímero Sepigel® e pelo tensoativo polietoxilado Alkest®
CSO 400, sem a formação de agregados. Em função da “rede” formada pelo polímero
e pelo tensoativo, a imagem das gotículas aparece com as bordas com pouca nitidez.
Na imagem da nanoemulsão com extrato algumas gotículas apresentam menor
120
intensidade de cor, comportamento este que
pode estar relacionado com a
evaporação da amostra provocada pelo feixe de elétrons (KLANG et al., 2012).
Figura 19 - Micrografias eletrônicas obtidas após coloração negativa da nanoemulsão sem extrato (A)
e da nanoemulsão com extrato (B). Aumento de 15.000x.
O potencial zeta representa a força de repulsão entre as gotículas e possui
relação com a estabilidade da dispersão (BALI; ALI; ALI, 2010), sendo o valor maior
que +/- 30 mV indicativo de máxima estabilidade (ARAÚJO et al., 2011). O valor
encontrado para a nanoemulsão com extrato foi de -34,7 ± 1,15 mV e para a
nanoemulsão sem extrato foi de -19,95 ± 0,21 mV. Os resultados indicam que a
característica ácida do extrato (pKa de 4,5 para o AMA e de 4,8 para o AMB, de acordo
com Zermiani (2015)) aumentou o potencial zeta da nanoemulsão, o que pode levar a
maior estabilidade do sistema em relação a ausência do extrato devido ao aumento
da força de repulsão entre as gotículas.
121
O pH da nanoemulsão com extrato foi de 5,25 ± 0,02 e para o sistema sem
extrato foi de 5,19 ± 0,01, indicando que para aplicação tópica, os nanossistemas
possuem valor de pH próximo ao pH fisiológico da pele, mostrando-se adequados.
Para a avaliação reológica das nanoemulsões foi utilizado o viscosímetro
rotacional Haake® VT 550, em que o fluido é cisalhado entre duas superfícies, uma
estática e outra em movimento, e as tensões de cisalhamento geradas são
determinadas através de medições de torque.
O comportamento reológico demonstrado pelas nanoemulsões com e sem
extrato, representado na Figura 20, foi do tipo pseudoplástico com índice de
comportamento de fluxo inferior a 1, calculado pelo modelo de Ostwald-de-Waele
(Tabela 11), e tixotrópico. A viscosidade aparente média da nanoemulsão com extrato
foi de 5773,28 ± 950,85 mPa.s, inferior ao valor encontrado para a nanoemulsão sem
extrato que foi de 7356,34 ± 303,59 mPa.s, indicando que a incorporação do extrato
no sistema provocou redução da viscosidade. A adição do extrato também reduziu o
valor de tixotropia de 2,99.107 Pa-1 para 1,90.107 Pa-1.
Figura 20 - Perfil de viscosidade da nanoemulsão veículo (imagem à esquerda) e da nanoemuls ão
contendo 0,13% de extrato mole das cascas de R. ferruginea (imagem à direita).
Tabela 11 - Análise da constante de Ostwald-de-Waele (K) e do índice de comportamento de fluxo (n)
para a nanoemulsão veículo e para a nanoemulsão com extrato de R. ferruginea.
Formulação
Nanoemulsão veículo
Nanoemulsão 0,13% extrato
R. ferruginea
K (mPa.sn )
n
R
5,20.105
0,0230
0,8122
4,51.105
0,0061
0,8739
Conforme apresentado na Figura 21, a nanoemulsão com 0,13% de extrato
mole de R. ferruginea apresentou perfil cromatográfico semelhante ao do extrato mole
122
e os componentes da formulação não interferem na integração dos picos dos
marcadores AMA e AMB. O teor dos marcadores AMA e AMB foi 54,10 ± 0,08 µg/g e
53,03 ± 0,03 µg/g, respectivamente, representando 103,87% e 109,25% em relação a
concentração teórica de marcadores na formulação (52,08 µg/g e 48,54 µg/g de
formulação para AMA e AMB, respectivamente).
Figura 21 - Perfis cromatográficos por CLAE do extrato mole de R. ferruginea, da nanoemuls ão
contendo 0,13% de extrato mole de R. ferruginea e da nanoemulsão veículo, em 270 nm.
5.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão
O estudo de estabilidade de um produto prevê o seu comportamento em
determinado intervalo de tempo, sob certas condições ambientais, com o objetivo de
avaliar o seu desempenho, segurança e eficácia (ANVISA, 2004).
As nanoemulsões com extrato, em triplicata, e sem extrato, em duplicata, foram
submetidas ao estudo de estabilidade acelerada, por um período de 180 dias em
temperatura ambiente (23 ± 2 °C) e à 40 °C. As avaliações foram realizadas nos
123
tempos zero (24 h), 30, 90 e 180 dias. Os resultados das análises estão expostos na
Tabela 12.
Observando os resultados das análises da nanoemulsão branco (veículo), não
houve alterações importantes em suas características físico-químicas ao longo do
estudo, demonstrando a sua provável estabilidade.
A presença do extrato provocou a desestabilização do sistema ao longo do
estudo realizado, tendo as amostras expostas a 40 °C alterações aceleradas em
relação a temperatura ambiente. Possivelmente, esta alteração tenha sido provocada
pelas interações moleculares entre o veículo com o extrato mole de R. ferruginea.
A nanoemulsão com extrato apresentou perda da homogeneidade, com a
presença de duas fases distintas, uma mais translúcida e outra mais opaca, a partir
do 30° dia exposta a 40 °C e a partir do 90º dia exposta a temperatura ambiente. Até
o período de 90 dias, estas amostras recuperaram o aspecto homogêneo inicial após
o teste de centrifugação realizado ao término de cada período de tempo, somente
após 180 dias de estudos, as amostras não recuperaram a homogeneidade (Figura
22).
As amostras de nanoemulsões com extrato expostas a temperatura ambiente,
tiveram redução gradual do tamanho médio da fase interna com aumento gradual no
valor de PDI e do potencial zeta, com pouca redução na concentração dos marcadores
AMA e AMB e poucas alterações nos valores de pH, em comparação a nanoemulsão
exposta a temperatura de 40 °C.
As amostras de nanoemulsão com extrato expostas a temperatura de 40 °C,
apresentaram aumento no tamanho médio da fase interna ao longo do tempo do
estudo, com poucas modificações no valor de PDI, grande redução do potencial zeta
e pH, com maior redução da concentração de AMA em relação ao AMB.
124
Tabela 12 – Resultado do estudo de estabilidade acelerada das nanoemulsões nas temperaturas ambiente e 40 ºC.
Formulações
Parâmetros
(média ± desvio
padrão)
Nanoemulsão 0,13% Extrato Mole
R. ferruginea
t0
t30d
t30d
t90d
t90d
amb
40 ºC
amb
40 ºC
Nanoemulsão Branco
t180d amb
t180d 40ºC
t0
t30d
t 30d
t90d
t 90d
amb
40 ºC
amb
40 ºC
t180 d amb
t180 d 40
ºC
Cor
C
C
C
C
CE
C
CE
B
B
B
B
B
B
B
Homogeneidade
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Odor
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
SC
SF
LF
LF
LF
LF
LF
SC
SC
SC
SC
SC
SC
SC
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
5,24 ±
0,02
5,7 ±
0,09
5,13 ±
0,14
5,25 ±
0,07
4,87 ±
0,10
5,46 ±
0,43
4,64 ±
0,26
5,19 ±
0,01
6,2 ±
0,10
5,9 ±
0,24
5,7 ±
0,14
5,65 ±
0,05
6,22 ±
0,03
6,14 ±
0,17
Viscosidade média
(mPa.s)
5,77.103 ±
9,51.102
2,42.103 ±
7,59.102
1,35.102 ±
3,02.101
2,54.102 ±
4,48.101
1,15.102 ±
2,45.101
9,92.101 ±
1,88.101
8,64.101 ±
5,71.101
Tixotropia (Pa -1)
1,90.107
±2,25.106
-5,49.105
±1,83.105
5,28.104
±3,92.104
-2,52.105
±1,15.105
-1,35.105
±9,03.104
-1,72.105
±5,46.104
-6,85.104
±1,18.105
61,30 ±
1,32
57,6 ±
0,23
47,88 ±
8,20
0,228 ±
0,004
-34,7 ±
1,15
59,33 ±
0,80
56,07 ±
0,50
31,09 ±
13,26
0,277 ±
0,02
-31,3 ±
5,03
51,4 ±
0,54
53,77 ±
0,72
36,63 ±
19,63
0,447 ±
0,02
-38,56 ±
1,85
45,9 ±
6,99
55,28 ±
3,77
18,68 ±
7,28
0,331 ±
0,03
-36,73 ±
2,44
41,34 ±
4,65
57,51 ±
2,86
65,91 ±
5,13
0,224 ±
0,02
-25,83 ±
1,46
53,38 ±
2,09
51,91 ±
1,15
12,41 ±
1,70
0,363 ±
0,03
-37,63 ±
1,45
29,96 ±
2,97
48,48 ±
2,03
74,13 ±
2,50
0,204 ±
0,01
-17,46 ±
3,03
Consistência
Centrifugação
pH
Teor AMA (µg/g)
Teor AMB (µg/g)
Tamanho médio
fase interna (nm)
Polidispersibilidade
(PDI)
Potencial Zeta (mV)
7,36.103
±
3,03.102
2,99.107
±
9,12.105
8,26.103
±
1,23.103
3,06.107
±
4,58.106
5,85.103
±
2,06.103
2,58.107
±
5,30.106
NA
NA
NA
7,16.103 ±
1,07.102
2,93.107
±2,43.106
NA
7,84.103
±
7,64.102
1,44.107
±
2,12.106
NA
7,10.103 ±
8,34.102
2,85.107±
5,59.106
NA
6,15.103
±
1,60.103
2,09.107
±
5,66.106
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
57,43 ±
3,37
0,114 ±
0,01
-19,95 ±
0,21
55,63 ±
0,28
0,144 ±
0,009
-17,7 ±
2,96
58,06 ±
1,81
0,114 ±
0,01
-16,25 ±
0,07
51,75 ±
9,79
0,131 ±
0,01
-16,7 ±
3,67
60,52 ±
0,84
0,123 ±
0,004
-15,7 ±
0,56
53,91 ±
2,96
0,142 ±
0,009
-15,65 ±
3,74
55,66 ±
4,38
0,132 ±
0,02
-13,15 ±
0,91
Nota: B: branco; C: caramelo; CE: caramelo escuro; LF: líquido fluido; S: semi-sólido; SC: semi-sólido consistente; SF: semi-sólido fluido; t: tempo; d: dias; amb: temperatura
ambiente; +: em conformidade; -: não conformidade; NA: não se aplica.
125
Figura 22 - Fotografia demonstrando o aspecto visual das nanoemulsões branco e com extrato após o
término do estudo de estabilidade acelerada, expostas a temperatura ambiente e a 40 °C.
Os resultados encontrados indicam também alterações no comportamento
reológico das nanoemulsões com a adição do extrato de R. ferruginea. As oscilações
observadas no perfil da tensão de cisalhamento indicam alterações de força para
alcançar o gradiente ou a velocidade de cisalhamento previsto, representando a
heterogeneidade das amostras (Figuras 23 e 24). A exposição das amostras a 40 °C
agravou e acelerou as alterações reológicas. O índice de comportamento de fluxo
inicial da nanoemulsão com extrato, calculado pelo modelo matemático de Ostwaldde-Waelle, foi menor que a unidade indicando um comportamento pseudoplástico,
sem limiar de tensão de cisalhamento. Este comportamento permaneceu ao longo do
estudo em temperatura ambiente, ocorrendo redução gradual da viscosidade aparente
e antitixotropia. A 40 °C estes comportamentos foram acelerados porém de modo
diferenciado. Em 30 dias o comportamento reológico demonstra alteração, com índice
de comportamento de fluxo pouco superior a unidade, com a viscosidade aparente
muito reduzida e elevação da tixotropia. A partir do período de 90 dias em estufa, a
nanoemulsão teve o valor de n próximo de 1, com presença de antitixotropia e maior
redução da viscosidade aparente.
126
Figura 23 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato (NE branco)
durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero, e após exposição a temperatura ambient e
nos tempos 30, 90 e 180 dias.
Nota: As cores diferentes representam a réplica de cada análise da amostra.
127
Figura 24 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato (NE branco)
durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero e após exposição a temperatura de 40 °C
nos tempos 30, 90 e 180 dias.
Nota: As cores diferentes representam a réplica de cada análise da amostra.
128
Conceitualmente
as nanoemulsões
são
sistemas termodinamicamente
instáveis, ou seja, a energia livre da dispersão coloidal formada é maior que a energia
livre da sua fase separada (óleo e água), sendo possível proporcionar estabilidade
cinética, garantindo uma grande barreira energética entre os dois estados e
controlando a transferência de massa entre os componentes. Portanto, uma
nanoemulsão tende a se desestabilizar em um dado tempo, dependendo da energia
de barreira formada entre a nanoemulsão e as suas fases separadas e o transporte
de massas envolvido. A força da energia de barreira é determinada principalmente
pela prevenção da aproximação entre as gotas da fase interna como interações
repulsivas
hidrodinâmicas e coloidais (estérica e eletrostática).
A taxa de
desestabilização das nanoemulsões depende da sua composição e das condições
ambientais (MCCLEMENTS, 2012).
Neste estudo foi verificado que a presença do extrato mole das cascas de R.
ferruginea acelerou a desestabilização do sistema, quando comparado com o veículo,
sendo que a exposição a temperatura de 40 °C colaborou para este processo.
Um sistema tende sempre a se reverter a um estado de baixa energia livre, que
para as nanoemulsões implica na separação de fases, sob a influência da temperatura
(MCCLEMENTS, 2012). Durante a exposição a temperatura ambiente foi observado
que as gotículas da fase interna sofreram redução de tamanho com potencial zeta
elevado. O tamanho da fase interna depende da energia livre interfacial, a qual é
grande para a formação de tamanhos reduzidos de fase interna, que se reduz a um
valor mínimo quando o tamanho diminuiu até um certo valor e depois se eleva
novamente para uma redução ainda maior da fase interna (MCCLEMENTS, 2012). As
amostras quando expostas a temperatura de 40 °C apresentaram desestabilização
mais rápida, ao 30° dia, com aumento do tamanho da fase interna ao longo do estudo
e potencial zeta sendo gradualmente reduzido. Ou seja, a temperatura elevada
favoreceu a aproximação das gotículas, diminuindo o potencial zeta em 49,68%,
levando a fusão entre as gotículas, com aumento de tamanho médio em 54,91%. Já
quando exposta a temperatura ambiente, o tamanho médio da fase interna das
nanoemulsões teve um decréscimo de 74,08%, e o potencial zeta aumentou em
8,44%.
A estabilidade eletrostática de sistemas coloidais tem sido indicada pelo valor
de potencial zeta, que quando se apresenta com valor negativo, representa uma alta
energia de barreira entre as gotículas (HATANAKA et al., 2010). O aumento do
129
potencial zeta durante o estudo em temperatura ambiente, revela grande repulsão
entre as gotículas, e quando a interação entre as gotas é predominantemente de
repulsão, fenômenos de instabilidade como cremeação, coalescência e floculação não
são geralmente importantes em função da predominância do movimento Browniano
das gotículas (FRYD; MASON, 2010). Provavelmente
por isto, os testes de
centrifugação ao término de até 90 dias de estudo, reverteu a cremeação do sistema,
provocada pela instabilidade do sistema contendo extrato, no estudo a temperatura
ambiente. A taxa de reversão entre o sistema coloidal e as fases separadas, em uma
nanoemulsão, é determinada pela frequência em que as gotículas de óleo entram em
contato uma com a outra, fenômeno este que depende do movimento Browniano,
agitação aplicada e forças da gravidade, ou seja a centrifugação (MCCLEMENTS,
2012). A reversão da separação de fases também foi verificada nas amostras
expostas a 40 °C. No entanto, após o período de 180 dias de exposição a temperatura
ambiente e a 40 °C, a não reversão do sistema, representou a desestabilização física
irreversível do sistema.
A desestabilização do sistema durante o estudo a 40 °C ficou evidente também
analisando a redução da concentração dos marcadores AMA e AMB, 51,12% e
15,83%, respectivamente, especialmente para o AMA. Enquanto que, quando
expostas a temperatura ambiente, os marcadores do extrato nas nanoemulsões
apresentaram pouca redução em suas concentrações, 12,92% para o AMA e 9,87%
para o AMB. Zermiani (2014) verificou que em ensaios de degradação forçada do
extrato mole das cascas de R. ferruginea, o AMA demonstra menor estabilidade,
sofrendo hidrólise ácida e oxidação, enquanto o AMB sofre degradação menos
significativa em meio ácido. Quanto à degradação térmica, nenhum dos dois
marcadores apresentaram degradação quando expostos a temperatura de 40 °C por
60 dias, diferente dos dados encontrados neste estudo. Esta diferença demonstra a
possibilidade de interação entre os componentes do extrato e da nanoemulsão o que
levou a degradação dos marcadores.
Nas nanoemulsões, a adição de um agente doador de consistência contribuiu
para a formação da energia de barreira estérica, favorecendo a estabilidade do
sistema, conforme percebe-se quando se verificada a estabilidade estudada com o
veículo.
Estas alterações observadas na nanoemulsão contendo extrato e exposta a
temperatura elevada (40 °C) podem ser explicada por possível interação molecular
130
entre o extrato e os componentes que formam a barreira eletrostática e estérica da
formulação, reduzindo-a, pois se percebe grande redução da viscosidade do sistema
na presença do extrato e do potencial zeta. A viscosidade aparente apresentou
redução semelhante entre a nanoemulsão com extrato exposta a temperatura
ambiente e a 40 °C, queda de cerca de 98,28 e 98,50% até o término do estudo,
respectivamente. A mistura de tensoativos e polímeros possuem propriedades
reológicas e a habilidade em estabilizar sistemas coloidas. O tensoativo não iônico
polietoxilado, usado na composição da nanoemulsão, possui grande sensibilidade a
temperatura, podendo também sofrer interações eletrostáticas em sistemas aquosos
envolvendo componentes iônicos, embora menos importante que a temperatura
(GALINDO-ALVAREZ et al., 2011). A instabilidade desta classe de tensoativo frente a
temperaturas elevadas, se deve a desidratação da porção polar da sua molécula,
provocando mudanças em sua solubilidade levando à redução da tensão interfacial e
aumento da flexibilidade interfacial, provocando a coalescência das gotas de óleo da
fase interna de uma nanoemulsão submetida a altas temperaturas (GUTTOFF;
SABERI; MCCLEMENTS, 2015).
Em estudo
realizado
por Guttoff,
Saberi e Mcclements
(2015) no
desenvolvimento de uma nanoemulsão contendo vitamina D pelo método da
emulsificação espontânea, foi verificada a estabilidade do sistema em temperatura
ambiente e a 80 °C. O sistema se manteve estável em temperatura ambiente porém
instável com elevação no tamanho da fase interna quando armazenado a 80 °C. Os
autores relacionaram este comportamento à presença do tensoativo não iônico, que
possui estabilidade dependente da temperatura. Foi avaliado então, a influência da
adição de um co-tensoativo, o dodecil sulfato de sódio, na formulação. O co-tensoativo
melhorou a estabilidade térmica da nanoemulsão, provavelmente, por ter aumentando
as forças de repulsão entre as gotas da fase interna, reduzindo a tendência à
coalescência.
Considerando que a nanoemulsão veículo apresentou-se estável durante o
estudo, o tensoativo Alkest® CSO 400, possivelmente sofreu interação molecular com
o extrato e a temperatura intensificou esta interação, provocando a desestabilização
do sistema. Este achado nos indica a necessidade de testes com novos tensoativos
para estudo de interações com o extrato.
Sandig e colaboradores (2013) relataram o estudo de estabilidade para
nanoemulsões com imipramina e doxepina, preparadas usando banho ultrassônico,
131
somente a temperatura ambiente e por período de 3 meses. As nanoemulsões com e
sem substâncias ativas não apresentaram alterações significativas em suas
características físico-químicas que evidenciasse perda de estabilidade. Alam e
colaboradores (2012) avaliaram a estabilidade acelerada de uma nanoemulsão com
betametasona, preparada por emulsificação espontânea,
por 3 meses nas
temperaturas de 4 °C e 25 °C, em que foram avaliados mensalmente aspectos como
tamanho da fase interna, viscosidade e índice de refração, já o teor do fármaco foi
avaliado mensalmente por 3 meses na nanoemulsão armazenada nas temperaturas
de 30, 40, 50 e 60 °C. A nanoemulsão não apresentou mudanças significativas nos
aspectos físicos e químicos. Atrux-Tallau e colaboradores (2014) verificaram a
estabilidade de uma nanoemulsão contendo licorice (extrato da raiz de Glycyrrhiza
glabra) preparada por processo de ultrassonificação. Neste estudo, a estabilidade foi
verificada através da análise do tamanho das gotas e observações macroscópicas,
para verificar sinais de desestabilização, em diferentes nanoemulsões armazenadas
a 4 °C, temperatura ambiente (22 °C) e 40 °C, por 3 meses. Não foi verificado qualquer
sinal de desestabilização (floculação, cremeação ou sedimentação) e o tamanho da
fase interna não apresentou aumento de valor, demostrando estabilidade física ,
segundo os autores.
Baseado nos resultados encontrados no estudo de estabilidade acelerada, a
nanoemulsão contendo extrato não permaneceu estável com alterações no seu
aspecto, redução do teor de AMA e perda da viscosidade inicial. Este estudo revelou
que, para a incorporação do extrato mole das cascas de R. ferruginea são necessárias
adequações farmacotécnicas, como construção do diagrama de fases utilizando o
extrato na composição para verificar a formulação mais adequada e estável à
incorporação do mesmo, além de mais testes com diferentes tensoativos.
5.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R. ferruginea
O ensaio in vitro para avaliação do potencial irritante das nanoemulsões neste
estudo foi baseado na citotoxicidade pela difusão em gel de agarose, que é
recomendado para emulsões com a fase externa aquosa. Neste teste a citotoxicidade
em cultura de fibroblastos é baseada na medida no diâmetro do halo formado pela lise
celular revelado pelo corante vermelho neutro (ANVISA, 2003).
132
O potencial irritante encontrado neste estudo para as nanoemulsões com e sem
extrato da R. ferruginea, foi moderado de acordo com a classificação descrita pela
Farmacopéia Americana (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007). A média do
halo de lise de uma duplicata foi de 6,5 ± 0,70 mm para a nanoemulsão com extrato e
7,25 ± 0,35 mm para a nanoemulsão sem extrato, conforme figura 25. Os cremes com
e sem extrato de R. ferruginea (Figura 25) e o extrato mole, figura 26, não
apresentaram formação de halo, indicando nenhuma ação irritante na metodologia
empregada.
Figura 25 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro para as
nanoemulsões e cremes contendo extrato de R. ferruginea.
Figura 26 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro para o extrato
mole da casca de R. ferruginea a 0,25% em DMSO.
133
Baseado nos resultados encontrados, a composição da nanoemulsão é
responsável pelo grau irritativo acusado no ensaio, pois foi a única formulação com
formação de halo mesmo sem adição do extrato.
Em estudo prévio realizado por Müller (2013), o potencial de irritação do
tensoativo Alkest® CSO 400, referenciado como R400, foi de grau severo com
formação de halo com 1,1 cm de diâmetro. Este dado suporta a avaliação da possível
causa do grau de irritação da nanoemulsão, como consequência do grau irritante do
Alkest® CSO 400, empregado na formulação. A maioria dos tensoativos induz a
reações irritantes na pele, pois provoca alterações bioquímicas como dissolução das
membranas lipídicas que perdem sua capacidade de barreira aumentando a sua
permeabilidade, podendo levar a lise celular quando o tensoativo se encontra em altas
concentrações (EFFENDY; MAIBACH, 1996).
5.9 Análise de liberação in vitro da nanoemulsão contendo extrato da R.
ferruginea
O perfil de liberação in vitro de sistemas coloidais contendo fármacos é uma
caracterização físico-química muito importante, pois além de prever a performance in
vivo, pode ser correlacionada à microestrutura
do veículo,
descrevendo o
comportamento estrutural da formulação em escala microscópica e as possíveis
interações entre o fármaco e o veículo (MORAIS; BURGESS, 2014).
Para a execução do ensaio de liberação foi escolhida a membrana sintética de
acetato de celulose por ser inerte e recomendada pelo FDA (FDA, 1997) e como meio
receptor uma solução hidroalcoólica 70%, por ter sido capaz de proporcionar a
condição sink para a dissolução dos marcadores do extrato, AMA e AMB. Como
amostra foi usado 300 mg de cada formulação teste, por ser esta a capacidade do
suporte para a amostra nas células.
Conforme observado no perfil de liberação do extrato na concentração de
0,13% em propilenoglicol (Figura 27), a liberação do AMB ocorreu após 2 h de ensaio,
enquanto o AMA foi liberado a partir de 4 h de análise. Por ser a amostra uma solução,
o perfil observado pode estar relacionado com a resistência dos marcadores em
transpor a membrana, devido às características físico-químicas destas moléculas e da
própria membrana. A membrana se apresenta com característica hidrofílica sendo
uma barreira a passagem dos marcadores AMA e AMB, que são compostos fenólicos
134
e com características hidrofóbicas. Estes compostos químicos são muito reativos
podendo formar ligações de hidrogênio (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2004)
e consequente lentificação na liberação para o meio receptor. Este mesmo
comportamento foi observado por Plessis e colaboradores (2001), quando avaliou a
liberação de diversos compostos fenólicos através de membrana de silicone, que foi
saturada com octanol ou tolueno para que interagissem com os compostos fenólicos
e influenciassem nas suas absorções através da membrana. Este trabalho demonstra
o grande efeito das ligações de hidrogênio quando a membrana pode interagir com a
substância que irá permeá-la (PLESSIS et al., 2001). A diferença nos tempos de
detecção entre o AMA e o AMB, se deve, provavelmente, a maior reatividade do AMA
em formar ligações de hidrogênio em relação ao AMB, o que retardou mais a sua
liberação.
Quantidade liberada µg/cm²
Figura 27 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do extrato mole de R. ferruginea
0,13% em propilenoglicol. n= 6 células.
0,8
0,7
0,6
AMB
0,5
AMA
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
2
4
6
8
12
24
Tempo (horas)
A Figura 28 apresenta o perfil de liberação dos marcadores AMA e AMB
presentes no extrato mole de R. ferruginea incorporado na nanoemulsão. Para ambos
os marcadores, foi observado um maior lag time com início da liberação mais
retardado do que o observado no perfil de liberação da solução de extrato. Conforme
apresentado na Figura 28, o AMB e o AMA foram liberados a partir de 6 e 12 h de
análise, respectivamente.
135
Quantidade liberada µg/cm²
Figura 28 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB da nanoemulsão com 0,13% de
extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células.
0,8
0,7
AMB
0,6
AMA
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
2
4
6
8
12
24
Tempo (horas)
Um comportamento de liberação semelhante ao das nanoemulsões
é
observado no perfil de liberação dos cremes convencionais contendo o extrato (Figura
29). A liberação dos marcadores AMB e AMA ocorreu a partir de 4 e 12 horas,
respectivamente. Em relação ao marcador AMB, o início da liberação foi mais lento
do que a partir da solução, porém mais rápido do que quando o extrato foi incorporado
nas nanoemulsões. Os resultados indicam que as nanoemulsões possuem uma maior
capacidade de retenção dos ativos na fase interna oleosa, provavelmente pelo seu
grau de organização na interface, assim como, a maior afinidade dos marcadores pela
fase interna do sistema.
Figura 29 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do creme com 0,13% de extrato
mole de R. ferruginea. n= 6 células.
Quantidade lIberada ug/cm²
1
0,9
0,8
0,7
AMB
AMA
4
6
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
2
Tempo (horas)
8
12
24
136
Para análise cinética do perfil de liberação de fármacos a partir de formas
farmacêuticas são empregados diferentes modelos matemáticos. No entanto, a
seleção do melhor modelo que descreve corretamente a liberação de fármacos é
muito difícil, em função de diversas etapas envolvidas durante o transporte e liberação
dos fármacos no interior de uma forma farmacêutica. Como parâmetro para escolha
do modelo matemático em que o perfil de liberação apresenta melhor ajuste é utilizado
o valor de coeficiente de determinação (R²), não se devendo utilizar modelos em que
o coeficiente seja baixo. Para a descrição adequada de um perfil de liberação,
recomenda-se o uso de pelo menos 5 tempos de dissolução (COSTA, 2002).
Neste estudo, para analisar o mecanismo de liberação dos marcadores do
extrato a partir das formulações, os perfis de liberação foram ajustados em diferentes
modelos matemáticos (ordem zero, primeira ordem, Higuchi e Peppas). A análise
cinética foi realizada com os resultados da quantidade de marcadores dissolvidos
após período de lag time, ou seja, após o início da liberação.
O perfil de liberação do AMA em todas as formulações e do AMB na solução
do extrato em propilenoglicol e no creme, apresentou um bom ajuste ao modelo
cinético de ordem zero (Tabela 13). O perfil de liberação do AMB a partir da
nanoemulsão seguiu uma cinética de acordo com o modelo da equação geral da
liberação. Este modelo é empregado para analisar a liberação de formas
farmacêuticas poliméricas, quando o mecanismo de liberação não é bem conhecido
ou quando estão envolvidos mais que um mecanismo de liberação (COSTA, 2002). A
partir do ajuste a este modelo e a partir do expoente de liberação obtido (n = 1,995),
observou-se que o mecanismo de liberação do AMB a partir da nanoemulsão segue
super transporte caso-II, em que a liberação é controlada somente pelo relaxamento
das cadeias poliméricas (BRUSCHI et al., 2007; COSTA, 2002).
O fluxo de liberação dos marcadores em cada formulação foi obtido a partir da
constante de liberação K no modelo cinético com melhor ajuste. Os resultados obtidos
confirmam que as emulsões lentificam a liberação dos marcadores, pois o fluxo de
liberação destes quando incorporados no creme, assim como, na nanoemulsão, é
menor do que o fluxo de liberação a partir da solução do extrato em propilenoglicol.
Esta liberação retardada proporcionada pelas emulsões é baseada na lipofilicidade do
fármaco incorporado na fase dispersa (disperso ou dissolvido na fase interna da
emulsão), reduzindo a cedência destes para a membrana e o meio de liberação
(MORAIS; BURGESS, 2014).
137
Comparando o fluxo de liberação dos marcadores a partir do creme e da
nanoemulsão, independente do modelo matemático empregado para o ajuste, foi
observado que a nanoemulsão diminuiu ainda mais o fluxo de liberação, prolongando
a liberação dos marcadores.
Para um fármaco lipofílico dissolvido ou disperso na fase interna oleosa de uma
emulsão O/A, durante o processo de liberação, deve, inicialmente, se particionar para
a fase externa aquosa da emulsão. No caso das nanoemulsões, emulsões com
tamanho da fase interna muito pequeno, espera-se uma liberação mais rápida que
para macroemulsões (MORAIS; BURGESS, 2014). No entanto, o modo de preparo
da nanoemulsão, em que o extrato é incorporado na fase oleosa antes da formação
da emulsão, pode resultar na maior proteção aos marcadores lipofílicos AMA e AMB,
fazendo com que a liberação seja retardada.
Além do efeito da lipofilicidade dos marcadores, o uso do tensoativo polimérico
na composição da nanoemulsão deve ser considerado ao se avaliar o perfil de
liberação. Os tensoativos poliméricos ao formarem um filme espesso na interface da
fase interna proporcionam maior estabilidade e uma forte barreira ao transporte de
fármacos (MORAIS; BURGESS, 2014; NAM et al., 2012). O uso do tensoativo nãoiônico Alkest® CSO 400 para a formação das nanogotículas provavelmente formou um
filme interfacial polimérico nas gotículas o que pode ter retardado o transporte dos
marcadores na interface do sistema e consequentemente seu fluxo. Provavelmente,
não pode ter ocorrido influência do polímero Sepigel® adicionado a fase externa da
nanoemulsão, já que o mesmo foi adicionado à nanoemulsão já formada, no entanto,
seriam necessários testes para confirmar esta probabilidade.
A incorporação do extrato no creme convencional foi realizada após o veículo
estar pronto. Este procedimento pode não promover a total incorporação do extrato
na fase interna da emulsão, embora os marcadores possuam alto coeficiente de
particção. Isto por ter resultado também no maior fluxo dos marcadores para esta
amostra.
Comparando o perfil de liberação entre as formulações, a nanoemulsão
proporciona uma liberação mais lenta para os marcadores do que o creme
convencional, devido a provável incorporação adequada do marcador na fase interna
e a formação das estruturas poliméricas interfaciais das gotículas.
138
Tabela 13 - Análise dos dados obtidos com o ensaio de liberação in vitro do AMB e AMA a partir do extrato mole em propilenoglicol, do creme e da nanoemuls ão
contendo extrato.
Modelos matemáticos
Formulação
Solução
Creme
Nanoemulsão
Marcador
Ordem zero
Primeira ordem
Higuchi
Equação Geral de Liberação
R2
K
R2
K
R2
K
R2
K
n
AMB
0,9593
0,0264
0,9548
2,49.10-4
0,7313
0,0916
0,9547
0,0250
0,9993
AMA
0,9751
0,0255
0,8767
1,88.10-4
0,5463
0,0665
0,9496
0,0049
1,4582
AMB
0,9984
0,0404
0,8836
0,0003
0,5357
0,1018
0,9910
0,0048
1,6124
AMA
1,0000
0,0142
0,5997
5,67.10-5
0,3333
0,0231
0,9951
1,72.10-7
4,342
AMB
0,9897
0,0367
0,8085
0,0002
0,4664
0,0830
0,9913
0,0018
1,995
AMA
1,0000
0,0042
0,5999
1,67.10-5
0,3333
0,0068
0,9951
5,06.10-8
4,342
139
5.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo extrato
de R. ferruginea
A metodologia empregada para estudar a permeação cutânea in vitro das
nanoemulsões, usando as células de Franz, é um experimento clássico que se baseia
na avaliação da difusão passiva dentro e através da pele não viável. Neste modelo o
transporte do fármaco é controlado pelo seu coeficiente de difusão dentro dos lipídeos
do estrato córneo, pela retenção através da adsorção pela queratina dos corneócitos
e o coeficiente de partição entre a formulação que contém o fármaco e os lipídeos do
estrato córneo (BOLZINGER et al., 2012).
Parâmetros físico-químicos do fármaco como massa molar, número de ligações
de hidrogênio doadoras e receptoras, e o coeficiente de partição octanol-água (Log
de P), têm relação com o coeficiente de permeabilidade cutânea (BOLZINGER et al.,
2012).
O estudo de permeação cutânea com a nanoemulsão e o creme contendo
extrato e a solução do extrato em propilenoglicol, que é um promotor de permeação
cutânea, revelou a ausência dos marcadores AMA e AMB no meio receptor, no estrato
córneo e na pele. A presença dos marcadores foi encontrada na formulação
remanescente e nas duas primeiras fitas adesivas que foram aderidas à pele para
extração dos resquícios da formulação, após o término do estudo, conforme
apresentado na Tabela 14.
Tabela 14 - Resultados do estudo de permeação cutânea para a nanoemulsão e creme contendo
extrato de R. ferruginea e para o extrato de R. ferruginea em propilenoglicol, em modelo de célula de
Franz, usando pele de porco.
Formulações
Extrato Mole de
R. ferruginea 0,13%
em propilenoglicol
Creme 0,13% de R.
ferruginea
Nanoemulsão
0,13% de R.
ferruginea
AMA
(µg/cm²)
Formulação Remanescente 1
Porcentagem
AMB
Porcentagem
Retida AMA (%)
(µg/cm²)
Retida AMB (%)
8,07 ± 1,72
13,14 ± 2,80
13,09 ± 2,60
11,69 ± 2,33
1,75 ± 0,49
12,37 ± 3,75
2,21 ± 0,53
16,09 ± 4,30
2,86 ± 0,80
15,97 ± 4,34
3,01 ± 0,73
18,52 ± 4,19
Nota: 1A formulação remanescente corresponde ao excesso de formulação sobre a pele no término do
estudo juntamente com as duas primeiras fitas adesivas que foram aderidas a pele de porco.
140
Observando os resultados das porcentagens retidas dos marcadores nas
formulações foi verificado que houve a cedência dos marcadores a partir das
formulações. Os marcadores AMA e AMB são derivados de ácidos benzoicos
prenilados (GAZONI, 2009), ou seja, compostos fenólicos (NOVAES, 2011), os quais
são muito suscetíveis
a formação de ligações de hidrogênio (CARVALHO;
GOSMANN; SCHENKEL, 2004) e apresentam alta lipofilicidade (ZERMIANI, 2014).
Estas características dos marcadores originam diversas hipóteses quanto ao
resultado encontrado para o estudo de permeação cutânea.
A presença de grupos ligantes de hidrogênio nas substâncias, retardam a sua
penetração dérmica, possivelmente devido a interação destes grupos com os grupos
–COOH dos ácidos graxos e –OH dos grupos amidas das ceramidas presentes nos
lipídeos do espaço intercelular do estrato córneo (PLESSIS et al., 2001). Segundo
resultados encontrados para um estudo sobre a influência do número e a substituição
do grupo –OH, em uma seleção de fenóis sobre a permeação in vitro em epiderme
humana, estas ligações de hidrogênio afetam negativamente o coeficiente de difusão
das substâncias, sendo dependente da simetria das substituições do grupo –OH
(PLESSIS et al., 2002). Os marcadores AMA e AMB por pertencerem aos compostos
fenólicos, podem sofrer estas interações moleculares com os lipídeos do estrato
córneo, no entanto, não foi detectado a presença dos mesmos na análise do estrato
córneo. Isto sugere que esta interação ocorreu, provavelmente, nas camadas bem
superficiais do estrato córneo, a qual foi extraída nas primeiras duas fitas adesivas e
quantificadas juntamente com a formulação remanescente.
Quanto à característica lipofílica dos marcadores AMA e AMB, possivelmente,
não afetou a permeação dos marcadores, já que no estudo de liberação in vitro
ocorreu a partição dos ácidos a partir das formulações.
Para a nanoemulsão, deve-se também levar em conta a influência gerada pelo
tensoativo polimérico presente em sua composição, o que pode ser observado na
maior porcentagem retida dos marcadores nesta formulação. O filme polimérico
interfacial formado pelo Alkest® CSO 400 pode ter dificultado a eficiência do transporte
dos marcadores para a pele. Na literatura sugere-se o uso de um sistema híbrido
lipídeo-polímero para otimizar a nanoemulsão como veículo tópico, além de melhorar
a estabilidade da dispersão (NAM et al., 2012).
Estes resultados encontrados, porém, não comprometeram a atividade
farmacológica anti-inflamatória tópica, conforme descrito no item 5.11. O que pode
141
indicar a possibilidade de limitações no método analítico empregado para a
quantificação dos marcadores para este ensaio, já que houve a cedência dos
marcadores a partir da formulação. Sugere-se, então, estudos aprofundados a
respeito da permeação dos marcadores AMA e AMB, com o objetivo de confirmar as
possíveis variáveis que podem influenciar a permeação cutânea dos mesmos.
5.11 Ensaios farmacológicos
O método do edema de orelha é frequentemente empregado para o estudo do
potencial efeito anti-edematogênico de possíveis agentes anti-inflamatórios tópicos.
Neste método há a indução de reações inflamatórias dérmicas, evidenciada pelo
aumento da espessura da orelha, onde um sensibilizante químico é aplicado,
refletindo a dermatite alérgica de contato (KIMBER et al., 1999; LEITE et al., 2011). O
óleo de cróton, agente sensibilizante escolhido para este estudo, contém 12-Otetradecanoilforbol acetato (TPA) como principal agente irritante na sua composição
(LEITE et al., 2011; OLIVEIRA, 2009). É necessária uma única aplicação do óleo de
cróton para a obtenção de resultados de atividade antiedematogênica de compostos
em processos inflamatórios agudos, tendo como primeiro sinal de irritação cutânea e
inflamação local o edema (LEITE et al., 2011; OTUKI et al., 2011). A exposição da
pele ao TPA induz respostas que englobam uma forte reação inflamatória similar
aquelas observada em várias doenças cutâneas severas (PASSOS et al., 2013), com
ativação da proteína kinase C que leva a ativação de outras cascatas enzimáticas que
por sua vez liberam o fator de ativação plaquetária (PAF), o ácido araquidônico (AA)
e seus metabólitos como as prostaglandinas e leucotrienos (HORINOUCHI et al.,
2013; LEITE et al., 2011). Estes eventos, juntamente com as citocinas geradas pela
indução com TPA, que inclui TNF, IL-1β, KC, MIP-2 (PASSOS et al., 2013), levam aos
sinais microscópicos da inflamação aguda como aumento da permeabilidade vascular,
vasodilatação e migração celular (HORINOUCHI et al., 2013; LEITE et al., 2011).
Para definição da concentração de extrato a ser incorporada na nanoemulsão
na fase da sua otimização, item 5.5, inicialmente foi realizado teste de edema de
orelha incorporando o extrato mole de R. ferruginea em um veículo de creme
convencional, formulação descrita no item 4.5.3, Quadro 4. O resultado encontrado,
representado na Figura 30, indica redução do edema induzido pelo óleo de cróton, e
com base neste resultado a concentração de extrato escolhida para incorporação na
142
nanoemulsão foi de 0,5%, pois foi a concentração intermediária que apresentou efeito
antiedematogênico, não apresentando diferença significativas entre as concentrações
empregadas no ensaio.
Figura 30 - Efeito dos cremes contendo extrato mole de R. ferruginea (RF 0,25%, 0,5% e 1,0%) e AMB
(0,5% e 0,1%) administrados topicamente sobre edema de orelha induzido pelo óleo de cróton.
Nota: Cada barra representa a média S.E.M. para 8 animais. Os símbolos gráficos indicam os níveis
de significância quando comparado com o grupo controle. Significativamente diferente do controle, ***
para P < 0,0001, ** para P < 0,01 e * para P < 0,05.
Posteriormente, novo teste de avaliação anti-inflamatória foi realizado para
definição da concentração de extrato de R. ferruginea a ser incorporado na
nanoemulsão com formulação definida no item 4.6 Quadro 6 e no creme convencional,
formulação descrita no item 4.5.3 Quadro 4, com o objetivo de avaliar a ação antiinflamatória confrontando
as mesmas concentrações de extrato em veículos
diferentes. O resultado encontrado, representado na Figura 31, indica que a
concentração de 0,13% de extrato apresentou atividade anti-inflamatória mais efetiva
quando incorporado no veículo nanoemulsão. Quando se compara a inibição do
edema provocada pela ação do extrato incorporado no creme convencional, não
houve diferença estatística entre as concentrações testadas. Para averiguar a
influência na ação anti-inflamatória do extrato mole das cascas de R. ferruginea
incorporado em diferentes veículos, a concentração de extrato incorporada na
nanoemulsão e creme convencional foi de 0,13%.
Conforme observado na Figura 31, a aplicação tópica do óleo de cróton
promoveu a formação do edema nas orelhas do grupo controle, apresentando uma
143
espessura média de 455,5 ± 36,65 µm. De acordo com Patrick e colaboradores (1987),
a aplicação do óleo de cróton desenvolve um edema auricular após 1h da aplicação,
no entanto, seu efeito máximo se dá após 6 horas.
Figura 31 - Efeito das nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R. ferruginea e dexametasona
administrados topicamente sobre edema de orelha induzido por óleo de cróton. O edema de orelha foi
mensurado após 6 h da indução com óleo de cróton.
Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de
significância quando comparado com o grupo controle e (#) indica o nível de significância quando
comparado entre os grupos. Significativamente diferentes do controle, *** para P < 0,0001 e diferentes
entre os grupos, # para P < 0,05.
A presença do extrato da R. ferruginea proporcionou a redução do edema em
todas as orelhas tratadas com a nanoemulsão e o creme, conforme observa-se na
Tabela 15 que indica a porcentagem de inibição do edema nos grupos tratados,
demonstrando a atividade anti-inflamatória tópica das formulações contendo o extrato.
Esse resultado também demonstra que os veículos, nanoemulsão branco e creme
branco, não causaram interferência na ação.
144
Tabela 15 - Porcentagem de inibição e média da espessura do edema de orelha induzido pelo óleo de
cróton 2,5% nos grupos tratados com as nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R.
ferruginea.
Inibição do edema
Espessura ± s
(% )
(µm)
Nanoemulsão 0,13%
90,50%
43,25 ± 1,6
Nanoemulsão 0,25%
64,98%
159,5 ± 41,02
Creme 0,13%
56,53%
198,0 ± 28,8
Creme 0,25%
58,64%
188,4 ± 38,86
Creme 0,5%
64,65%
161,0 ± 22,2
Dexametasona 0,1%
97,80%
10,0 ± 10,0
Tratamento
A inibição do edema no grupo tratado com a nanoemulsão com 0,13% de
extrato, foi superior a todas as outras formulações contendo extrato da R. ferruginea.
Comparando os resultados entre as nanoemulsões, a menor concentração de 0,13%
de extrato, foi mais efetiva em relação à concentração de 0,25% de extrato, ou seja,
a atividade anti-inflamatória tópica do extrato de R. ferruginea veiculado na
nanoemulsão foi potencializada. Esta diferença de ação entre as nanoemulsões é,
possivelmente, devido a melhor incorporação e/ou dissolução na fase oleosa durante
o seu preparo, pois nesta concentração, 0,13%, o extrato demonstrou melhor
homogeneização em relação as concentrações maiores.
Comparando os resultados entre os diferentes veículos, nanoemulsão e creme,
ficou evidente que a nanoemulsão se apresenta como melhor veículo em comparação
ao creme, 1,6% mais eficaz, com significativa diferença estatística quanto ao efeito
inibitório do edema. Confirmando mais uma vez a potencialização do efeito antiinflamatório do extrato quando incorporado em nanoemulsão.
A resposta antiedematogênica dos cremes contendo o extrato da R. ferruginea,
não apresentou diferença estatística entre as diferentes concentrações, conforme
verificado na Figura 31.
Estes resultados demonstram a ação anti-inflamatória tópica do extrato de R.
ferruginea em modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton. Esta atividade
farmacológica deve-se possivelmente a presença do AMA e AMB no extrato mole da
planta, pois estudos anteriores, com estes compostos isolados, confirmaram a
atividade anti-inflamatória de ambos em modelo de edema de orelha induzido por TPA
(DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; MIZUSHINA et al., 2000). No entanto, deve-
145
se levar em conta que nesse estudo foi utilizado o extrato da planta, o qual contém
inúmeros componentes desconhecidos, ainda, e podem atuar sinergicamente com os
marcadores conhecidos proporcionando esta atividade farmacológica. A ação
sinérgica entre os componentes do extrato de R. ferruginea ficou claro no estudo
realizado por Baccarin (2010), em que a avaliação da atividade farmacológica quanto
à antinocicepção, demonstrou que o resultado foi superior no extrato seco que não
continha maior concentração do marcador AMB.
Para a realização dos demais testes farmacológicos foi selecionado como
grupo de tratamento, a nanoemulsão com 0,13% de extrato da R. ferruginea, pois esta
forma farmacêutica demonstrou melhor ação farmacológica em relação a todos os
demais grupos. Para verificar a influência do veículo na ação anti-inflamatória tópica
do extrato, optou-se por confrontar a nanoemulsão com o creme incorporando a
mesma concentração do extrato de R. ferruginea, ou seja, 0,13%.
Histologicamente, a análise do tecido das orelhas no grupo controle, tratado
somente com óleo de cróton 2,5%, quando comparado ao naive, evidencia a derme
mais espessa, com elevada concentração de infiltrado celular e maior extravasamento
plasmático, caracterizando o edema visualizado macroscopicamente (figuras 32 A e
B). Estes achados ganham suporte com estudo realizado por Patrick e colaboradores
(1987), que observaram, após 6 h da aplicação do óleo de cróton, um aumento do
número de vasos sanguíneos, edema moderado a severo, com um difuso infiltrado
celular.
Os grupos tratados com creme e nanoemulsão contendo 0,13% de extrato de
R. ferruginea (Figuras 32 E e G), apresentaram-se histologicamante com redução do
extravasamento plasmático e espessura dérmica, em relação ao grupo controle,
demonstrando a atividade anti-inflamatória tópica. Apresentam também semelhante
concentração de células em relação aos grupos que receberam creme e nanoemulsão
sem extrato (Figuras 32 D e F). Visualiza-se que não houve redução da espessura
dérmica e do extravasamento plasmático nos grupos tratados com os veículos creme
e nanoemulsão sem extrato, em relação ao grupo controle. Estas observações
confirmam que a presença do extrato de R. ferruginea possui efeito anti-inflamatório.
Os resultados histológicos confirmam os resultados macroscópicos encontrados na
avaliação da atividade anti-inflamatória tópica pelo método do edema de orelha
induzido por óleo de cróton.
146
Figura 32 - Fotomicrografias dos cortes histológicos das orelhas dos camundongos, corados em hematoxilina-eosina (HE), 6 horas após a indução do edema
com óleo de cróton 2,5% (4x e 10x). (A) naive, (B) controle negativo, (C) controle positivo tratado com dexametasona 0,1%, (D) tratamento com veículo-creme,
(E) tratamento com creme 0,13% extrato de R. ferruginea, (F) tratamento com veículo-nanoemulsão, (G) tratamento com nanoemulsão 0,13% extrato de R.
ferruginea. As setas indicam a presença de infiltrado celular e as barras vermelhas indicam a espessura dérmica.
147
Para elucidar os mecanismos envolvidos na inibição do edema de orelha
provocado pela nanoemulsão contendo extrato de R. ferruginea, foi realizada a
quantificação de algumas citocinas envolvidas em um processo inflamatório como a
IL-1β, o TNF e a KC, além da avaliação da atividade enzimática da MPO.
A diferença na quantidade de infiltrado celular nos grupos tratados pode ser
elucidada pela avaliação indireta da atividade da MPO, a qual faz referência somente
a infiltração de neutrófilos, pois a MPO é uma enzima sinalizadora da infiltração
(HORINOUCHI et al., 2013) e sobrevivência de neutrófilos (VEEN; WINTHER;
HEERINGA, 2009).
No resultado obtido pela medida indireta da atividade da MPO neste estudo,
Figura 33, o grupo que recebeu o óleo de cróton 2,5% apresentou elevada atividade
da MPO, indicando o estímulo promovido pela aplicação do óleo de cróton a liberação
desta enzima pelos neutrófilos. Percebe-se que houve significativa redução da
atividade enzimática no grupo tratado com a nanoemulsão com 0,13% de extrato
(concentração média= 0,355 ± 0,06 DO/mg correspondendo a 64,60% de inibição),
tanto em relação ao grupo controle como quando comparado com o grupo tratado com
o creme com 0,13% de extrato (concentração média= 0,689 ± 0,02 DO/mg
correspondendo a 31,30% de inibição). Estes resultados demonstram o efeito da
nanoemulsão
com
0,13%
de
extrato
em
reduzir
a
atividade
da
MPO,
consequentemente promovendo a redução da infiltração e migração de neutrófilos no
local da inflamação, além de evidenciar melhor resultado quando o veículo é a
nanoemulsão e não o creme.
148
Figura 33 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a
atividade da mieloperoxidase no sobrenadante de homogeneizados das orelhas tratadas com óleo de
cróton 2,5%. A atividade da MPO foi mensurada após 6 h da indução pelo óleo de cróton.
Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M. para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de
significância quando comparado com o grupo controle e (#) quando comparado entre os grupos.
Significativamente diferente do controle, *** para P < 0,0001, * para P < 0,05, significativament e
diferente entre os grupos, ## para < 0,01.
Estas observações se confirmam também analisando os resultados obtidos
através da quantificação da KC, uma quimiocina responsável pelo recrutamento de
neutrófilos (FILIPPO et al., 2008), representada na Figura 34. A quantificação da KC
realizada no grupo controle demonstra uma quantidade elevada como resposta a
aplicação do óleo de cróton. O grupo tratado com a nanoemulsão contendo 0,13% de
extrato apresentou redução na quantificação da quimiocina (concentração média=
365,96 ± 35,6 pg/mg correspondendo a 42,72% de inibição) assim como o creme com
0,13% do extrato (concentração média= 268,97 ± 72,73 pg/mg correspondendo a
57,90% de inibição), não apresentando diferença estatística significativa entre si.
149
Figura 34 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a inibição
da quimiocina derivada de queratinócitos (KC) induzida por óleo de cróton 2,5% em orelhas de
camundongos.
Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M. para 6 animais. Os símbolos gráficos indicam os níveis
de significância quando comparado com o grupo controle. Significativamente diferente do controle, **
para P < 0,01.
O tratamento com veículos tópicos contendo extrato da R. ferruginea inibe a
infiltração e migração de neutrófilos para o local da inflamação. A ação do extrato de
R. ferruginea é melhorada quando veiculado em nanoemulsão, em relação a inibição
da enzima mieloperoxidase liberada pelos neutrófilos. Não se observou diferença na
ação do extrato entre os veículos com relação ao recrutamento de neutrófilos,
representada pela inibição da quimiocina KC.
Os queratinócitos quando expostos a agentes irritantes ou sensibilizantes
respondem através da síntese e liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e
TNF, que induzem as células endoteliais a expressarem moléculas de adesão
necessárias ao acúmulo de células inflamatórias (FUCHS et al., 2001).
A análise da quantificação das citocinas IL-1β e TNF, representada pela Figura
35, evidencia diferenças na atividade inibitória entre os grupos tratados com a
nanoemulsão e o creme contendo o extrato da R. ferruginea. A nanoemulsão
contendo o extrato reduziu a quantidade de IL-1β (concentração média= 668,49 ± 39,4
pg/mg) e TNF (concentração média 251,24 ± 10,64 pg/mg) correspondendo a 40,96%
e 42,23%, respectivamente.
Comparando-se a ação do extrato nos diferentes veículos, percebe-se que a
nanoemulsão foi superior ao creme com relação a inibição da TNF, com diferença
150
estatística significativa, o creme inibiu 28,72% (concentração média= 309,95 ± 2,47
pg/mg). Para IL-1β, a inibição do creme com extrato foi de 45,89% (concentração
média= 612,72 ± 21,52 pg/mg), sem diferença estatística significativa. Como o TNF
também é produzido a partir da MPO ativa (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009),
este resultado tem estreita ligação com a maior redução da MPO observado no grupo
tratado com a nanoemulsão com 0,13% de extrato.
Figura 35 - Efeito da nanoemulsão e do creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a
produção de IL-1β e TNF, induzida por óleo de cróton 2,5% em orelhas de camundongos.
Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de
significância quando comparado com o grupo controle e (#) quando comparado entre os grupos.
Significativamente diferente do controle, *** para P < 0,0001, significativamente diferente entre os
grupos, # para P < 0,05.
Estes resultados demonstram a ação anti-inflamatória tópica do extrato mole
de R. ferruginea veiculada em nanoemulsão e creme, com redução do edema,
infiltrado celular e redução da quantificação de citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF,
redução da atividade da MPO e da quimiocina KC. Em relação a veiculação do extrato
em nanoemulsão e creme, a nanoemulsão demonstrou melhor ação anti-inflamatória
que o creme, quanto à inibição do edema de orelha induzido pelo óleo de cróton tanto
macroscopicamente como microscopicamente, além de melhor ação inibitória da
atividade da MPO e redução na produção de TNF. Estes achados demonstram que a
ação anti-inflamatória tópica do extrato mole da R. ferruginea testada em modelo de
edema de orelha induzido por óleo de cróton, é influenciada pelo veículo e sua
provável interação com o sistema fisiológico da pele.
151
6 CONCLUSÕES
A coleta das cascas de R. ferruginea foi padronizada para árvores com 35 cm
de diâmetro e no tronco à altura de 20 cm do chão, devido ao maior teor de
marcadores. O marcador AMA apresenta-se em maior concentração que o AMB nas
cascas de R. ferruginea. Foi obtido extrato mole das cascas de R. ferruginea com teor
de 37,34 ± 0,09 mg/g de AMB de 40,04 ± 0,02 mg/g de AMA.
Foi desenvolvida a nanoemulsão a partir da seleção da melhor e mais estável
proporção de componentes em um diagrama de fases pseudoternário. A nanoemulsão
foi desenvolvida pelo método de inversão de fases, usando como componente oleoso
o miristato de isopropila, a mistura de tensoativos Alkest® CSO400 e o Span® 80. O
extrato mole das cascas de R. ferruginea foi incorporado na fase oleosa da
nanoemulsão. Para adequação da viscosidade da nanoemulsão para aplicação
tópica, foi usado um doador de consistência.
A nanoemulsão contendo extrato apresentou textura cremosa na cor caramelo
claro, com pH de 5,24 ± 0,02, o tamanho médio da fase interna foi de 47,88 ± 8,20 nm
com índice de polidispersibilidade adequado no valor de 0,228 e potencial zeta de 34,7 ± 1,15 mV. A análise morfológica por MET, confirmou que o sistema é pouco
disperso sem a formação de agregados com as gotículas na forma esférica. O sistema
apresentou comportamento reológico pseudoplástico tixotrópico, com viscosidade
média de 5773,28 ± 950,86 mPa.s-1. O teor dos ácidos AMA e AMB foi de 54,10 ± 0,08
μg/g e 53,03 ± 0,03 μg/g de formulação, respectivamente.
O estudo de estabilidade acelerada revelou a necessidade de adequações
farmacotécnicas futuras para assegurar a estabilidade da nanoemulsão incorporando
o extrato mole de R. ferruginea, pois houve um decréscimo de 51,12% para o AMA e
de 15,83% para o AMB após 180 dias a 40 °C, com diminuição de 98,50% na
viscosidade aparente.
A nanoemulsão veículo e contendo extrato apresentaram moderado grau de
irritação cutânea in vitro. O extrato mole não desenvolveu irritação no ensaio de
difusão em ágar. Estes resultados demonstram que o grau de irritação das
nanoemulsões se deve a composição das mesmas.
152
O ensaio de liberação in vitro demonstrou liberação mais lenta dos marcadores
AMA e AMB quando incorporados na nanoemulsão.
Os marcadores AMA e AMB não permearam através da pele de porco no
estudo
de permeação cutânea,
sendo detectados somente
na
formulação
remanescente. Sugere-se novos estudos aprofundados quanto a influência de
variáveis na permeação cutânea dos marcadores do extrato em nanoemulsão.
A atividade anti-inflamatória tópica foi maior para a nanoemulsão
em
comparação ao creme convencional com a mesma concentração de extrato (0,13%),
com inibição do edema de orelha de 90,5 e 56,53%, respectivamente. O resultado da
análise histológica dos tecidos inflamados não demonstrou diferenças visuais
significativas entre o tratamento com o creme convencional e a nanoemulsão
contendo extrato. A quantificação de citocinas e da atividade da MPO, demonstrou
que a nanoemulsão contendo extrato possui melhor atividade inibitória na liberação
de TNF e MPO, não havendo diferença significativa, entre os tratamentos, quanto à
inibição da liberação de KC e IL-1β. Portanto, a incorporação do extrato em um
sistema nanoemulsionado promoveu uma maior eficácia anti-inflamatória tópica, em
modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton, em relação à emulsão
convencional
não
diferindo
estatisticamente
do creme
contendo
0,1% de
dexametasona, demonstrando o seu potencial anti-inflamatório tópico.
Sugere-se
a
continuidade
dos
estudos
buscando
o
aprimoramento
farmacotécnico da nanoemulsão para adequá-la a incorporação do extrato de R.
ferruginea e também buscar maiores evidências quanto a permeação cutânea do AMA
e AMB presentes no extrato quando incorporado em nanoemulsão.
153
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ANEXO A – Parecer Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUAUNIVALI