UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
RELATORIO DE ESTÁGIO
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
LISBOA, 2010
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO
GENTIL, ENTIDADE PÚBLICA EMPRESARIAL (IPOPFG, E.P.E.)
Serviço de Hematologia Clínica,
Serviço de Imunologia, Laboratório de Imunologia Celular
Serviço de Genética, Laboratório de Genética Molecular e Laboratório de Citogenética
HOSPITAL CURRY CABRAL
Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.
Secção de Bioquímica Clínica
Secção de Microbiologia
MATERNIDADE ALFREDO DA COSTA
Serviço de Procriação Medicamente Assistida
ORIENTAÇÃO: DR. CARLOS MENDES, SERVIÇO HEMATOLOGIA CLÍNICA, IPO PORTO
DRª GABRIELA MARTINS, SERVIÇO DE IMUNOLOGIA, IPO PORTO
DRª SUSANA BIZARRO, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO
DRª CECÍLIA CORREIA, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO
DRª MARIA DO CÉU SANTOS, SERVIÇO NEFROLOGIA, H. CURRY CABRAL
DRª MARGARIDA BAPTISTA, LAC. DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.
DRª SÓNIA CORREIA, SERVIÇO PMA, MATERNIDADE ALFREDO COSTA
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
LISBOA, 2010
Resumo
O presente trabalho consiste no relatório de estágio curricular, efectuado como
parte integrante e conclusivo do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de
Farmácia da Universidade de Lisboa. Tem em conta as normas regulamentares do ciclo
de estudos definidas pelo Decreto-lei nº 74/2006 de 24 de Março.
O relatório está estruturado em duas partes. A Parte I consiste no registo resumo
da aprendizagem teórica e prática obtida durante todo o período de estágio nas
diferentes áreas. A Parte II aborda um tema específico - Metodologias Laboratoriais
para Diagnóstico e Seguimento Terapêutico em Patologias Auto-Imunes.
A Parte I é constituída por sete capítulos nos quais se descreve o trabalho
realizado durante o estágio. O primeiro capítulo refere-se ao estágio realizado em
Colheitas de Análises Clínicas. O segundo capítulo resume o estágio da valência de
Hematologia, realizado no Serviço de Hematologia Clínica do IPO Porto, segundo a
orientação do Dr. Carlos Mendes. O terceiro capítulo resume o estágio da valência de
Imunologia, realizado no Serviço de Imunologia do IPO Porto, segundo a orientação da
Drª Gabriela Martins (estágio em Imunologia Celular – Citometria de Fluxo) e no
Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral, segundo a orientação da Drª Maria do
Céu Santos (estágio em Imunologia Humoral – Auto-Imunidade); a referência ao
estágio realizado no Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral é bastante breve,
dado ser este o tema desenvolvido na Parte II do relatório de estágio. O quarto capítulo
resume o estágio da valência de Genética Molecular Humana, realizado no Serviço de
genética di IPO Porto, Laboratório de Genética Molecular, segundo a orientação da Drª
Susana Bizarro (estágio em Biologia Molecular) e Laboratório de Citogenética, segundo
a orientação da Drª Cecília Correia (estágio em Citogenética Clássica e FISH). O quinto
capítulo resume o estágio das valências de Bioquímica Clínica e Endocrinologia,
realizados na Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel
Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª Margarida Baptista. O sexto capítulo
resume o estágio da valência de Microbilogia, realizado na Secção de Microbiologia do
Laboratório de Análises Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª
Margarida Baptista (abordagem geral da área de Microbiologia) e no Serviço de
Procriação Medicamente Assistida da Maternidade Alfredo da Costa, segundo a
iii
orientação da Drª Sónia Correia (realização de espermogramas). Por fim, o sétimo
capítulo aborda o Controlo de Qualidade Interno e Externo realizado nas diferentes
áreas de estágio.
A Parte II deste relatório desenvolve as Metodologias Laboratoriais para
Diagnóstico e Seguimento Terapêutico nas Doenças Auto-Imunes, focando com maior
relevo a técnica de Imunofluorescência Indirecta. O trabalho referente a esta segunda
parte foi desenvolvido em consequência dos conhecimentos apreendidos no estágio de
Imunologia Humoral realizado no Serviço de Imunologia do Hospital Curry Cabral,
segundo a orientação e acompanhamento permanente da Drª Maria do Céu Santos. A
escolha do tema por parte da estagiária deveu-se ao facto dos conhecimentos
apreendidos terem possibilitado a implementação de uma nova técnica de análise no
Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, onde hoje a estagiária
trabalha – a Imunofluorescência Indirecta.
Palavras-Chave:
ANA • Análises Clínicas • Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos • AutoAnticorpos Anti-Nucleares • Auto-Imunidade • Bioquímica Clínica • Citometria de
Fluxo • Doenças Auto-Imunes • ELISA • Endocrinologia • Ensaio Imunoenzimático
• FISH • Genética Molecular • Hematologia • Imunologia • Imunoflourescência
Indirecta • Microbiologia.
iv
Abstract
The present work represents a curriculum internship report, made conclusive as
well has an integrant part of Master in Clinical Analysis, School of Pharmacy,
University of Lisbon (Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade
de Lisboa), according to decree of law...
This report is structured in two main parts. The first part (Part I) contains the
resumed registry of the practical and theoretic learning obtain in different areas of
study during the occurring internship. The second part (Part II) goes to a specific
theme of study - Laboratory Methods for Diagnosis and Therapeutic Action in
Autoimmune Pathology.
In Part I there are seven different chapters where it is described the work done
during the internship in seven different areas of scope. Chapter one references the
work done in Clinical Analysis crops. Chapter two is a résumé of work developed in
Hematology, work that was performed, according to Dr. Carlos Mendes orientation,
at the Clinical Service of Hematology IPO OPorto (Serviço de Hematologia Clínica
do IPO Porto). Chapter three summarizes the work performed in Immunology field,
with the orientation of Dr. Gabriela Martins (internship in Cellular Immunology –
Flow Citometry), at the Clinical Service of Immunologyy IPO OPorto (Serviço de
Hematologia Clínica do IPO Porto) and with the orientation of Dr. Maria do Céu
Santos (internship in Humoral Immunology – Autoimmunity) at the Nephrology
Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral); as
a note, in this first part (Part I) of the work, the citation of the developed work in
Nephrology Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital
Curry Cabral ) is very brief, since this is the subject that is vastly reported in Part II.
Chapter four is dedicated to Human Molecular Genetics, and the internship was
performed in Genetics Service IPO Oporto (Serviço de genética do IPO Porto) under
the supervising of Dr. Susana Bizarro (internship in Molecular Biology) and in
Cytogenetics Laboratory (Laboratório de Citogenética) under guidance of Dr. Cecília
Correia (internship in Classic Cytogenetics and FISH). This chapter five is dedicated
to the analysis of Clinical Biochemistry and Endocrinology, performed in Clinical
v
Biochemistry Department of Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão
Pinto, S.A. (Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel
Reymão Pinto, S.A) under guidance of Dr. Margarida Baptista. Chapter six is
accredit to studies in Microbiology, conducted in Microbiology Department of
Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. under guidance of Dr.
Margarida Baptista and also in Service of Medical Assisted Procreation of the
Alfredo da Costa Maternity (Serviço de Procriação Medicamente Assistida da
Maternidade Alfredo da Costa), which was guided by Dr. Sónia Correia (breading
spermiograms). Lastly, chapter seven addresses the internal and external quality
control achieved in different areas of the internship.
In Part II of this report there’s a development on the laboratory methodologies
for diagnose and therapeutic follow-up in autoimmune diseases, with bigger strength on
a specific technique, Indirect Immunofluorescence. The work carried out in this second
part (Part II) of the report is an accumulation of experience and knowledge gathered in
the internship of internship in Humoral Immunology – Autoimmunity at the Nephrology
Service, Hospital Curry Cabral and with the orientation and permanent follow-up by Dr.
Maria do Céu Santos. This choice fell down to the fact that this learning’s enabled an
implementation of a new technique at the laboratory workplace of the intern, Laboratory
of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. - Indirect Immunofluorescence.
Keywords:
ANA • Anti-Citoplasmatic Auto-Antibodys • Anti-Nuclear Auto-Antibodys •
Autoimmune Diseases • Autoimmunity • Clinical Analysis • Clinical Biochemistry •
ELISA
•
Endocrinology
Immunoenzymatic
Essay
•
FISH
•
Flow
•
Immunology
•
Citometry
Indirect
•
Hematology
•
Immunofluorescence
Microbiology • Molecular Genetics.
vi
Índice de Páginas
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1
1.
Colheitas ................................................................................................................................ 2
2.
Hematologia .......................................................................................................................... 6
2.1.
3.
Imunologia........................................................................................................................... 18
3.1.
Imunologia Celular ...................................................................................................... 20
3.1.1.
Princípios da Citometria de Fluxo........................................................................ 20
3.1.2.
Preparação das Amostras.................................................................................... 23
3.1.3.
Marcadores Celulares.......................................................................................... 24
3.2.
4.
Equipamento – Sysmex XE 2100 ................................................................................... 9
Imunologia Humoral.................................................................................................... 26
Genética Molecular Humana .............................................................................................. 29
4.1.
Biologia Molecular....................................................................................................... 30
4.1.1.
4.1.1.1.
Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction) .... 30
4.1.1.2.
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) ........................................................... 32
4.1.1.3.
RT-PCR Nested ............................................................................................. 32
4.1.1.4.
PCR Específico de Alelo (ASO-PCR) .............................................................. 33
4.1.1.5.
PCR de Longa Distância (PCR-LD) ................................................................ 33
4.1.1.6.
PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo .......................... 34
4.1.2.
Restrição Enzimática ........................................................................................... 37
4.1.3.
Electroforese ....................................................................................................... 37
4.2.
5.
PCR ...................................................................................................................... 30
4.1.3.1.
Electroforese em Gel de Agarose ................................................................ 37
4.1.3.2.
Electroforese Capilar ................................................................................... 38
Citogenética ................................................................................................................ 42
4.2.1.
Citogenética Clássica ........................................................................................... 42
4.2.2.
FISH (Fluorescente in situ Hibridization) ............................................................. 44
4.2.3.
Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias ......................................... 50
Bioquímica Clínica e Endocrinologia ................................................................................... 55
5.1.
Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados .............................................. 55
5.1.1.
Modular Hitachi SWA, Roche .............................................................................. 55
5.1.2.
Hydrasys Sebia, Phadia ........................................................................................ 58
5.1.3.
Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................................................................ 58
vii
5.1.4.
Urisys 2004, Roche .............................................................................................. 59
5.1.5.
Immulite 2000, Amerlab...................................................................................... 59
5.1.6.
Vidas, bioMérieux................................................................................................ 60
5.1.7.
Vidia, bioMérieux ................................................................................................ 61
5.1.8.
Serologia Manual................................................................................................. 62
5.2.
6.
Métodos Analíticos...................................................................................................... 62
5.2.1.
Potenciometria .................................................................................................... 62
5.2.2.
Fotometria ........................................................................................................... 63
5.2.3.
Electroforese ....................................................................................................... 63
5.2.4.
Imunoturbidimetria ............................................................................................. 64
5.2.5.
Aglutinação.......................................................................................................... 64
5.2.6.
Fluorescência Polarizada ..................................................................................... 64
5.2.7.
ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) ............................................... 65
5.2.7.1.
ELISA para a detecção de Ag ....................................................................... 66
5.2.7.2.
ELISA para a detecção de Ac ....................................................................... 66
Microbiologia ...................................................................................................................... 68
6.1.
Meios de Cultura ......................................................................................................... 69
6.2.
Condições de Incubação das Sementeiras .................................................................. 70
6.3.
Equipamentos ............................................................................................................. 70
6.3.1.
6.4.
Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux ................................................................ 70
Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos .......................................... 71
6.4.1.
Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux ................................................ 71
6.4.2.
Coloração de Gram .............................................................................................. 71
6.4.3.
Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de Kinyoun modif. ou de
Tan - Thiam - Hok) ............................................................................................................... 71
6.4.4.
Teste da Catalase................................................................................................. 72
6.4.5.
Prova da Coagulase ............................................................................................. 72
6.4.6.
SLIDEX Strepto Plus ............................................................................................. 72
6.4.7.
Teste do Tubo Germinal ...................................................................................... 72
6.4.8.
Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China............................................ 72
6.5.
Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos Biológicos: ............................ 72
6.5.1.
Urina Asséptica.................................................................................................... 72
6.5.2.
Exsudado Uretral e Vaginal ................................................................................. 73
6.5.3.
Exsudado Nasofaríngeo ....................................................................................... 73
viii
6.5.4.
Expectoração ....................................................................................................... 73
6.5.5.
Fezes .................................................................................................................... 73
6.5.6.
Hemoculturas ...................................................................................................... 73
6.6.
Espermogramas........................................................................................................... 74
6.6.1.
6.6.1.1.
Liquefacção e Viscosidade ........................................................................... 74
6.6.1.2.
Aparência..................................................................................................... 75
6.6.1.3.
Volume ........................................................................................................ 75
6.6.1.4.
pH ................................................................................................................ 75
6.6.2.
Avaliação Microscópica Essencial ....................................................................... 75
6.6.2.1.
Estimativa da Concentração Espermática ................................................... 75
6.6.2.2.
Motilidade ................................................................................................... 76
6.6.2.3.
Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides ........... 77
6.6.2.4.
Agregação e Aglutinação ............................................................................. 77
6.6.2.5.
Concentração Espermática.......................................................................... 77
6.6.2.6.
Morfologia ................................................................................................... 78
6.6.3.
Avaliação Microscópica Complementar .............................................................. 80
6.6.3.1.
Teste da Vitalidade ...................................................................................... 80
6.6.3.2.
Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides ................................ 81
6.6.3.3.
Testes Opcionais – Testes Bioquímicos ....................................................... 81
6.6.4.
7.
Avaliação Macroscópica Inicial ............................................................................ 74
Nomenclatura...................................................................................................... 82
Controlo de Qualidade ........................................................................................................ 84
7.1.
Controlo de Qualidade Interno ................................................................................... 84
7.2.
Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) ....................................................................... 85
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento
Terapêutico ................................................................................................................................. 87
1.
Sistema Imunológico e Auto-Imunidade ............................................................................. 88
2.
Doenças Auto-Imunes (DAI) ................................................................................................ 94
3.
2.1.
DAI Multi-Sistémicas ................................................................................................... 94
2.2.
DAI Específicas de Orgão ............................................................................................. 99
Metodologias Laboratoriais .............................................................................................. 103
3.1.
Imunofluorescência Indirecta (IFA) ........................................................................... 104
3.1.1.
Fundamento ...................................................................................................... 104
ix
3.1.2.
Aplicação ........................................................................................................... 106
3.1.3.
Células e Tecidos Utilizados .............................................................................. 107
3.1.3.1.
Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2.............. 107
PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO .................................. 112
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO ..................... 135
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO ...................... 140
3.2.
3.1.3.2.
Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae ............. 148
3.1.3.3.
Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos ..................................... 150
3.1.3.4.
Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos ............................... 162
Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio em “Sanduíche” .................... 167
3.2.1.
Fundamento ...................................................................................................... 167
3.2.2.
Aplicação ........................................................................................................... 168
3.2.3.
Ensaios Executados ........................................................................................... 169
3.2.3.1.
3.3.
ANA Screen ................................................................................................ 169
Immunoblotting - Imunodot’s ................................................................................... 170
3.3.1.
Fundamento ...................................................................................................... 170
3.3.2.
Aplicação ........................................................................................................... 172
3.3.3.
Perfis Executados .............................................................................................. 173
3.4.
3.3.3.1.
Perfil ANA (“ANA Profile 3”) ...................................................................... 173
3.3.3.2.
Perfil Hepático “Liver Profile” ................................................................... 174
3.3.3.3.
Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”).......................................................... 175
3.3.3.4.
Perfil Gástrico ............................................................................................ 176
Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio em “Sanduíche” .................. 177
3.4.1.
Fundamento ...................................................................................................... 177
3.4.2.
Aplicação ........................................................................................................... 178
3.4.2.1.
Ac. anti-DNAds .......................................................................................... 178
3.4.2.2.
Ac. anti-Nucleossoma ................................................................................ 178
3.4.2.3.
Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM .................... 178
3.4.2.4.
Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA ........................................................ 178
3.4.2.5.
Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA ............................................... 179
3.4.2.6.
Ac. anti-CCP ............................................................................................... 179
3.4.3.
Outros Ensaios Executados ............................................................................... 179
3.4.3.1.
Ac. anti-ICC e anti-C1q ............................................................................... 179
3.4.3.2.
Ac. anti-GBM ............................................................................................. 180
x
3.4.3.3.
Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA) ................ 180
3.4.3.4.
Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180 .......................................................... 181
4.
O Futuro….......................................................................................................................... 182
5.
Observações e Sugestões .................................................................................................. 183
Bibliografia ................................................................................................................................ 186
Agradecimentos ........................................................................................................................ 188
Anexo 1...................................................................................................................................... 189
Anexo 2...................................................................................................................................... 192
Anexo 3...................................................................................................................................... 193
xi
Índice de Figuras
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1
Figura 1 –Câmara DIFF do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................................. 11
Figura 2 - Câmara WBC/BASO do aparelho Sysmex XE 2100 ...................................................... 12
Figura 3 – Câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 .............................................................. 13
Figura 4 – Histogramas RBC e PLT do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................ 14
Figura 5 – Canal RET do aparelho Sysmex XE 2100. .................................................................... 16
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100 ..................................................................... 17
Figura 7 –Gráfico com FSC versus SSC nos contadores hematológicos ...................................... 21
Figura 8 – Imagens obtidas num Citómetro de Fluxo ................................................................. 21
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto ...................... 23
Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR ................................................................. 34
Figura 11 – Actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-PCR. ............. 35
Figura 12 – Leitura do produto de PCR na fase exponencial ...................................................... 36
Figura 13 – Electroforese em gel de agarose .............................................................................. 38
Figura 14 – Sequenciação Automática ........................................................................................ 40
Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) ........................................................ 42
Figura 16 - Cariótipo com anomalia numérica constitucional e anomalia estrutural adquirida. 43
Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas. ...................................... 43
Figura 18 – FISH, Sondas de Painting .......................................................................................... 45
Figura 19 – FISH , Sondas Alfa-Satélite ........................................................................................ 46
Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. ............................................................................ 46
Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion....................................................................... 47
Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal .......................................................................................... 48
Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color, Dual Fusion ....................................................................... 49
Figura 24 – FISH, Sondas Dual Color, Break Apart ...................................................................... 49
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento
Terapêutico ................................................................................................................................. 87
Figura 25 – Estrutura dos Anticorpos .......................................................................................... 89
Figura 26 – “Buttelfly rash”, LES, DAI Multi-Sistémica ................................................................ 94
Figura 27 – Sinovite das mãos, AR, DAI Multi-Sistémica ............................................................ 95
Figura 28 – Aumento das parótidas, SS, DAI Multi-Sistémica ..................................................... 95
xii
Figura 29 – Depósito de cálcio nas mãos, Esclerodermia, DAI Multi-Sistémica ......................... 96
Figura 30 – Necrose do dedo, F. de Raynaud, DAI Multi-Sistémica ............................................ 96
Figura 31 – Músculo Estriado destruído, Miosite, DAI Multi-Sistémica...................................... 97
Figura 32 – Glossite, Anemia Perniciosa, DAI Específica de Orgão ........................................... 101
Figura 33 – Intestino sem vilosidades, Doença Celíaca, DAI Específica de Orgão .................... 101
Figura 34 – Separação da epiderme, Pênfigo, DAI Específica de Orgão ................................... 102
Figura 35 – Pênfigo foliáceo, vulgaris e bulhoso. ...................................................................... 102
Figura 36 – Reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina............................................ 105
Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular ............................................................................. 110
Figura 38 – A célula durante a Interfase ................................................................................... 110
Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. .............................................................................. 111
Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2 ................................................................... 112
Figura 41 – Padrão homogéneo em células HEp-2. Cromossomas positivos em profase,
metafase, anafase e telofase .................................................................................................... 113
Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco.............................................. 113
Figura 43 – DNA, Histonas e Nucleossoma ............................................................................... 114
Figura 44 – Padrão de Scl-70 em células HEp-2 ........................................................................ 115
Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2 .................................................................. 116
Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B .......................................................................... 117
Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. ........................................................................ 118
Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP ........................................................................................ 118
Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2 ........................................................ 119
Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2. ............................................................................. 120
Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2................................................................ 121
Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear em células HEp-2. ...................................................... 122
Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco. ................................ 123
Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear em células HEp-2. ....................................... 124
Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear. .... 124
Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2. ................................................. 125
Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2.. ........................................................ 127
Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2. ....................................................... 127
Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2. ....................... 128
Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2. ........................................................ 129
Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2. .................................................. 130
xiii
Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2 ............................................... 131
Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2 .................................................................. 132
Figura 64 – Localização das proteínas centroméricas. .............................................................. 133
Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2. ...................................................................... 134
Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial em células HEp-2. ......................................... 135
Figura 67 – Padrão Actina em células HEp-2............................................................................. 136
Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2 ................................................................................ 137
Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2. ................................................................................ 138
Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2. .................................................................... 139
Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2. ....................................................... 140
Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2. ................................................................ 141
Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2....................................................................... 142
Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2. ..................................................................... 142
Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2. ................................................................ 143
Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2. ........................................................................ 144
Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2..................... 144
Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2. .................................................................... 145
Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2. ................................................................ 146
Figura 80 – Protozoário Crithidia luciliae. ................................................................................. 149
Figura 81 – Fluorescência em células de Crithidia luciliae ........................................................ 150
Figura 82 – Tecidos utilizados para pesquisa de auto-anticorpos citoplasmáticos .................. 152
Figura 83 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-mitocôndriais
(AMA) ........................................................................................................................................ 155
Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-actina (ASMA)
................................................................................................................................................... 152
Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-LKM1 ........... 152
Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-células parietais
(APCA) ....................................................................................................................................... 152
Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares
................................................................................................................................................... 162
Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de
Langerhans em pâncreas de macaco. ....................................................................................... 163
Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em
córtex adrenal de macaco. ........................................................................................................ 164
Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-endomísio (EMA)
em esófago de macaco.............................................................................................................. 165
xiv
Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado
em músculo esquelético de macaco. ........................................................................................ 166
Figura 92 – Reacção de ELISA. ................................................................................................... 167
Figura 93 – Immunoblotting...................................................................................................... 172
Figura 94 – ELISA Quantitativa, Curva de calibração absorvância vs concentração. ................ 177
Figura 95 – ANCAs. .................................................................................................................... 184
Todas as figuras da Parte II têm como fonte os pontos 3 e 4 da Bibliografia:
3. Bradwell A. R., Hughes R. G., Atlas of HEp-2 Patterns, third edition, The Binding Site, 2007
4. Bradwell A. R., Stokes R. P., Johnson G. D., Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues, second
edition, The Binding Site, 2004
xv
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche .............................. 58
Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................ 58
Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia ........................................ 59
Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche............................................... 59
Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab ...................................... 60
Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux ................................................ 61
Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux ................................................. 61
Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual .............................................................. 62
Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática. ................... 76
Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas. ................................................................. 98
Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão. ........................................................ 102
Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos.. ..................................................... 147
Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. . 148
Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais
(AMAs). .............................................................................................................................. 154
Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira
do ANA Profile 3. ............................................................................................................... 173
Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas................ 175
Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas .................... 176
Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no
Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............................................................ 191
Tabela 19 – Estudos moleculares, Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............. 192
Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae.......................... 193
Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.
........................................................................................................................................... 194
Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp. ............................ 194
Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae. .................................. 194
Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp. ......................... 195
Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes. .................. 195
Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp. ........................... 196
Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp. ...................... 196
Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares. ........................ 197
xvi
ParteI
Apreciação Global dos Estágios
Realizados
1
1. Colheitas
O estágio decorreu no Posto de Colheitas Eça de Queiroz do Laboratório
Lababa, integrado no grupo ReymãoLabs, durante o mês de Janeiro de 2009, sob a
orientação da técnica Manuela.O estágio perfez um total de 80 horas.
Para a colheita de sangue periférico total, deverão encher-se os tubos
necessários às análises requeridas pela seguinte ordem:
1. Tubo de citrato;
2. Tubo de EDTA;
3. Tubo seco.
Regra geral, o tubo de citrato utiliza-se para provas de coagulação, o tubo de
EDTA para hemograma e VS e o tubo seco para a maioria das análises bioquímicas. O
tubo de citrato e de EDTA exigem agitação suave após o seu enchimento, a fim de que o
sangue se misture com o anticoagulante.
No que respeita as provas de tolerância aos hidratos de carbono:
- Pós-Prandial (PP): tirar sangue em jejum, dar 50g de glucose oral ao utente e
voltar a tirar sangue ao fim de 60 minutos; caso o clínico der indicações específicas,
seguir à risca as mesmas;
- Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTOG): fazer a colheita de sangue em
jejum ao utente e executar o teste rápido da glicémia em equipamento próprio. Caso o
resultado obtido seja inferior a 150 mg/dL, dar 75g de glucose oral e tirar sangue aos
30, 60, 90 e 120 minutos; se o utente for uma mulher grávida, dar 100g de glucose oral
e tirar sangue aos 60, 120 e 180 minutos. Caso o resultado obtido esteja entre 150 e 200
mg/dL, o utente prossegue a prova com 50g de glucose oral. Caso o resultado obtido
seja superior a 200 mg/dL, o utente prossegue a prova com o pequeno-almoço. Colher
sempre sangue e urina em paralelo.
A optimização das condições de colheita de produtos para exame
microbiológico visa manter a viabilidade dos microrganismos mais sensíveis e a não
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
2|
Colheitas
contaminação da amostra a estudar com anti-sépticos, com flora saprófita do doente ou
com microrganismos do meio ambiente. Assim, exigem-se algumas regras para a sua
colheita:
- Colheita feita em rigorosas condições de assepsia e antes de se iniciar
terapêutica anti-microbiana e sob rigorosas condições de assepsia;
- Enviar rapidamente ao Laboratório, os produtos para exame Microbiológico; o
intervalo de tempo entre a colheita e a sementeira não deve ultrapassar duas horas;
- Urina Asséptica: amostras da 1ª urina da manhã ou, se não for possível, de
urina que tenha estado pelo menos durante 3 horas na bexiga; obtenção do jacto médio,
mantendo o prepúcio retraído ou os pequenos lábios da vagina afastados; para pesquisa
de BK fazer 3 colheitas de toda a urina da manhã. Conservar no frio;
- Exsudados Uretrais e Vaginais: não efectuar a higiene íntima de manhã; para
o exsudado uretral introduzir uma zaragatoa fina até 2 a 4 cm no interior da uretra,
rodando-a lentamente; para o exsudado vaginal utilizar espéculo ao nível do fundo da
vagina, do colo e do endocolo uterino. Colher com duas zaragatoas, uma colocada em
meio de transporte de carvão previamente aquecido a 37ºC e outra que se utiliza para
efectuar o esfregaço em lâmina. As colheitas para pesquisa de Chlamydia trachomatis
devem ser feitas por raspagem vigorosa;
- Quando para o mesmo utente for pedido urina asséptica e exsudado
uretral/vaginal, estes últimos devem ser colhidos em primeiro lugar;
- Exsudados Nasofaríngeos: Evitar tocarem com a zaragatoa do exsudado
faríngeo nos lábios, na língua ou na úvula, pressionando a língua para baixo, com uma
espátula; efectuar a colheita ao nível das amígdalas e em zonas que se encontrem
inflamadas. Inserir uma zaragatoa nas fossas nasais até encontrar resistência e rodá-la.
Colocar as zaragatoas de imediato num meio de transporte. Conservar à temperatura
ambiente;
- Exsudados Purulentos (Feridas, Auriculares e Oculares): os produtos de
feridas abertas são colhidos com zaragatoas e os das colecções purulentas fechadas e/ou
para pesquisa de microrganismos anaeróbios, com seringa. As zaragatoas devem ser
mergulhadas no meio de transporte adequado, previamente aquecido a 37C;
- Derrames das Serosas (Líquido Ascítico, Pleural, Pericárdico e Sinovial):
enviar um volume mínimo de 10 mL e de 50-100 mL se se suspeitar de um derrame de
etiologia tuberculosa;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
3|
Colheitas
- Expectoração: em jejum, depois de o utente fazer a sua higiene oral e se
assoar; não cuspir; para a pesquisa de BK 3 a 5 amostras em dias sucessivos. Conservar
à temperatura ambiente;
- Fezes: para pesquisa de ovos, quistos e parasitas as amostras devem ser
colhidas de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias, até um total de 3, abrangendo um período de
tempo no mínimo de 8 dias. Fazer o teste da Fita Adesiva para pesquisa de Enterobius
vermicularis ou de Taenia sp., sem que o utente faça previamente a sua higiene matinal.
Conservar no frio, excepto para pesquisa de Entamoeba histolytica;
- Hemoculturas: colher no início da subida da temperatura; efectuar 3 colheitas
com intervalo de duas horas. Desinfectar a região a puncionar com éter, betadine e
etanol a 70%¸“injectar” o sangue no frasco do meio de cultura com uma seringa
diferente da utilizada para a punção. Conservar a 37ºC.
Segue-se a descrição para as condições de colheita de espermogramas:
1. Avaliação inicial:

Mínimo duas amostras, com intervalo entre 1 a 3 semanas;

Se a motilidade da primeira avaliação for baixa (< 25% com motilidade
progressiva) a segunda avaliação deverá ser feita o quanto antes, dado que a
motilidade diminui com o tempo;

Se os resultados entre a primeira e a segunda avaliação forem muito
diferentes, deve fazer-se uma terceira avaliação;

Os dias de abstinência para as várias avaliações deverão ser os mesmos.
2. Condições de Colheita:

Abstinência sexual mínima de 2 dias e máxima de 7 dias; menos de 2 dias de
abstinência poderá resultar em diminuição da concentração; mais de 7 dias
de abstinência poderá resultar em diminuição da motilidade e vitalidade;

Ausência de medicação e febre; febre pode causar alterações espermáticas
observáveis 10 a 12 semanas depois.
3. Colheita:

Feita por masturbação para um recipiente estéril;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
4|
Colheitas

A colheita de esperma tem que ser completa; a perda da primeira fracção
resultará na diminuição da concentração, visto ser nesta fracção que se
encontram a maioria dos espermatozóides;

O recipiente de colheita deverá ser identificado com o nome/nº do utente,
data e hora da colheita;

Feita preferencialmente no laboratório; quando feita no domicílio terá que
ser entregue ao laboratório num período máximo de 1 hora e deverá ser
transportada à temperatura do corpo (no bolso);

Se for necessária uma análise microbiológica, o utente deverá urinar antes e
depois desinfectar-se; só em seguida será feita a colheita de esperma; a
abstinência sexual deverá ser de 5 a 7 dias;

Em caso de ejaculação retrógrada, o utente deverá ingerir bicarbonatos de
véspera, para neutralizar a urina; na colheita deverá urinar antes e depois
masturbar-se; só depois deverá urinar para o recipiente de colheita;

Se for necessário o uso de preservativo, este deverá ser livre de
espermicidas; os preservativos de látex diminuem a viabilidade dos
espermatozóides;

Coitus interruptus não é aceitável para colheita: a primeira porção de
esperma (a mais rica em espermatozóides) pode perder-se; o pH ácido
vaginal diminui a motilidade, as formas normais e a concentração dos
espermatozóides; poderá haver contaminação celular e bacteriológica do
esperma com as secreções vaginais.
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2. Hematologia
O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco
Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Hematologia
Clínica, durante os meses de Fevereiro e Abril de 2009 do IPO Porto, sob a orientação
do Dr. Carlos Mendes. O estágio perfez um total de 294 horas.
Trata-se de uma Entidade Pública Empresarial, de prestação de serviços de
saúde no domínio da oncologia, bem como a investigação, o ensino e o rastreio
oncológico. Pelo prestígio conquistado adquiriu hoje dimensão europeia e internacional,
sendo membro activo da European Organization of Research and Treatment of Cancer
(EORTC).
No Serviço de Hematologia Clínica procede-se à elaboração e interpretação de
hemogramas, mielogramas e outras técnicas manuais inseridas no contexto da área
(colorações citoquímicas várias), bem como à contagem de células sanguíneas em
citoesfregaços de LCR e outros líquidos biológicos. O laboratório divide-se em três
principais áreas distintas: uma área onde se efectuam as punções digitais para
monitorização do estado geral de crianças em ambulatório com patologias oncológicas
diagnosticadas, uma área onde se encontram os diferentes aparelhos e uma terceira área
destinada à validação dos resultados. O serviço recebe, em média, 400 hemogramas
diariamente.
Para o estágio realizado foi de extrema utilidade para a estagiária os
conhecimentos teóricos apreendidos na cadeira de Hematologia II do Mestrado em
Análises Clínicas. O défice de aulas práticas da referida cadeira justificou a escolha do
Instituto para a realização do estágio.
Assim, o estágio decorreu maioritariamente na área destinada à validação dos
resultados, onde o tempo foi sobretudo empregue na visualização de lâminas de sangue
periférico e medula óssea e realização da respectiva fórmula leucocitária para as
diferentes patologias oncológicas. Visualizaram-se lâminas que apareceram durante a
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
rotina laboratorial diária e também lâminas de arquivo do Instituto. Visualizaram-se
lâminas das seguintes patologias oncológicas:
Neoplasias Mieloproliferativas:

Leucemia Mielóide Crónica (LMC), BCR-ABL1 positiva;

Leucemia Neutrofílica Crónica;

Policitémia vera;

Mielofibrose Primária;

Trombocitémia Essencial;

Leucemia Eosinofílica Crónica.
Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas:

Leucemia Mielóide Crónica atípica, BCR-ABL1 negativa.
Síndromes Mielodisplásicos vários (subclassificação é impossível pelo sangue
periférico)
Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA):

LMA com t(8;21)(q22;q22), ETO-AML1;

LMA com inv(16)(p13.1q22), CBFB-MYH11;

Leucemia Aguda Promielocítica com t(15;17)(q22;q12), PML-RARA;

LMA com t(9;11)(p22;q23), AF9-MLL;

LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1;

LMA Com Diferenciação Mínima;

LMA Sem Maturação;

LMA Com Maturação;

Leucemia Mielomonocítica Aguda;

Leucemia Monocítica e Monoblástica Aguda;

Leucemia Eritróide Aguda;

Leucemia Megacarioblástica Aguda;
Leucemias Bifenotípicas
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7|
Hematologia
Neoplasias de Precursores Linfóides:

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(9;22)(q34;q11.2), BCR-ABL1;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(4;11)(q21;q23), AF4-MLL;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(12;21)(p13;q22), TEL-AML1;

Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(1;19)(q23;p13.3), E2A-PBX1;

Leucemia Linfoblástica Aguda T;
Neoplasias de Células B Maturas:

Leucemia Linfocítica Crónica (LLC);

Leucemia Prolinfocítica B;

Linfoma Esplénico da Zona Marginal;

Leucemia a Hairy-Cell (tricoleucemia);

Mieloma Múltiplo;

Linfoma da Zona Marginal;

Linfoma Folicular;

Linfoma do Manto;

Linfoma Difuso de Grandes Células B;

Linfoma de Burkitt.
Neoplasias de Células T e NK Maturas:

Leucemia Prolinfocítica T;

Leucemia Linfocítica T a Grandes Células Granulares;

Desordem Linfoproliferativa Crónica a Células NK;

Síndrome de Sézary;

Linfoma Anaplásico.
Houve também oportunidade para realizar colorações citoquímicas (Fosfatase
Alcalina dos Leucócitos, Mieloperoxidase, Naftol-Cloroacetato Esterase, α-NaftilAcetato Esterase, Ácido Periódico de Schiff e Coloração de Perl’s).
Durante o estágio, a estagiária reorganizou ainda os dossies de arquivo do
Instituto segundo a classificação da OMS 2008 (visto estarem até à data organizados
pela classificação FAB), adicionou novas lâminas ao arquivo e fotografou todas as
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Hematologia
lâminas relevantes, a fim de criar um arquivo de imagens com patologias diagnosticadas
no próprio Instituto. Por outro lado, houve ainda a possibilidade da estagiária criar a sua
própria laminoteca com as lâminas de interesse que foram surgindo no dia-a-dia.
Pela experiência adquirida durante o estágio, os parâmetros definidos para
visualização de lâminas de sangue periférico no laboratório onde a estagiária trabalha
foram afinados. Por outro lado, o laboratório alterou o seu equipamento de Hematologia
para o existente no IPO Porto – Sysmex XE 2100.
2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100
Utiliza os seguintes métodos para determinação dos vários parâmetros:
1. Citometria de fluxo:
Todas as células da amostra passam individualmente entre dois pólos, criando
assim um fluxo laminar. À medida que passam individualmente neste fluxo, faz-se
incidir sobre cada célula três tipos de radiação diferentes:
- FSC, Forward Scattered Light: radiação que incide de frente na célula, sendo
difundida através da célula; avalia o tamanho celular;
- SSC, Side Scattered Light: radiação que incide lateralmente na célula, sendo
dispersa; avalia a complexidade/granularidade celular;
- SFI, Side Fluorescent Light: radiação que incide lateralmente na célula; indica
a actividade fluorescente celular, relacionada com a quantidade de DNA e RNA que a
célula contém; faz com que as histonas directamente ligadas ao material genético
fluoresçam.
Através da informação obtida (tamanho celular, complexidade celular e
conteúdo em material genético), o aparelho faz a contagem total e diferencial dos
leucócitos, conta os eritrócitos imaturos (NRBC), os reticulócitos e as plaquetas
imatura.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
2. Método de Capacitância Eléctrica / Medição de Resistência Eléctrica (fluxo
DC):
As células da amostra são colocadas individualmente num espaço entre dois
eléctrodos com cargas opostas. A presença de uma célula irá alterar a resistência
eléctrica; a alteração da resistência eléctrica gerada pela presença de uma célula entre os
dois eléctrodos é medida, sendo esta proporcional ao volume celular.
3. Método Colorimétrico:
A formação de um composto corado é medida em solução por determinação
fotométrica da sua absorvância, sendo comparada com a absorvância da mesma solução
sem o composto corado.
4. Método de Impedância Eléctrica (método RF-DC):
A amostra de sangue (mau condutor de corrente eléctrica) é diluída numa
solução electrolítica e é exposta a uma corrente eléctrica entre dois eléctrodos. A
presença de uma célula sanguínea entre os dois eléctrodos vai aumentar a resistência na
corrente eléctrica (DC), gerando uma alteração no potencial entre os eléctrodos e,
consequentemente, gerando um impulso eléctrico; a intensidade do impulso gerado é
proporcional ao tamanho celular. Por outro lado, a densidade relativa das células
(estrutura molecular interna) poderá determinar-se por radiofrequência (RF). Este
processo melhora a precisão e reprodutibilidade das contagens de células sanguíneas em
relação ao método de capacitância eléctrica.
A análise dos diferentes parâmetros é feita em 7 câmaras de detecção distintas:
1. Câmara DIFF:
Utiliza a técnica de citometria de fluxo.
Nesta câmara é feita a contagem diferencial das diferentes populações de
leucócitos, excepto dos basófilos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
Para isso inicialmente são lisados os eritrócitos. Aos leucócitos são apontados
raios laser no bloco óptico de detecção; a luz difundida e dispersa são medidas, o que
permite tirar conclusões sobre o tamanho e complexidade celular, respectivamente.
Assim, o aparelho consegue distinguir as diferentes populações de leucócitos,
apresentando os resultados sobre a forma de um gráfico com o tamanho celular (FSC)
em ordenadas e a complexidade celular (SSC) em abcissas.
Figura 1 – Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara DIFF do aparelho
Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).
As células imaturas presentes na amostra também podem ser observadas neste
gráfico, uma vez que apresentam um tamanho muito superior à das células maturas.
Assim, irão aparecer no gráfico para cima, tipo foguetes, como prolongamentos das
respectivas células maturas. Sempre que estejam presentes estes foguetes justifica-se,
portanto, a visualização da lâmina de sangue periférico; estes poderão corresponder a
uma infecção bacteriana ou viral (mononucleose infecciosa) ou a um processo
neoplásico.
Esta tecnologia apresenta, no entanto, dois possíveis problemas. O primeiro
reside no facto de, por vezes, existirem eritrócitos resistentes à lise celular. Estes
eritrócitos são geralmente mais imaturos na sua diferenciação e aparecem muitas vezes
em amostras de sangue periférico de recém-nascidos ou em certas neoplasias
(Mielofibrose Primária, alguns SMD, LMA Eritróide). Irão aparecer no canto esquerdo
inferior do gráfico. Por outro lado, se a amostra contiver linfócitos fragilizados, como
acontece em certas patologias oncológicas linfóides, estes poderão não resistir ao
processo de lise destinado aos eritrócitos, sendo assim quantificados por defeito. Os
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Hematologia
seus restos celulares irão aparecer na mesma zona do gráfico que os eritrócitos
resistentes à lise.
Através desta distribuição não é possível, no entanto, visualizar os basófilos,
uma vez que eles se localizam na mesma zona de distribuição que os linfócitos e, sendo
geralmente poucos, são encobertos pela população linfocitária. Assim, a contagem de
basófilos é feita numa câmara diferente.
2. Câmara WBC/BASO:
Utiliza a técnica de citometria de fluxo.
Nesta câmara é feita a contagem de basófilos, bem como a contagem total de
leucócitos.
Para isso, lisam-se inicialmente os eritrócitos maturos para que a contagem total
de leucócitos possa ser feita no bloco óptico de detecção. No caso da amostra conter
eritrócitos nucleados, estes irão resistir à lise celular e ser quantificados como
leucócitos. Esta correcção é feita por recurso a outra câmara do aparelho.
Seguidamente, todos os leucócitos excepto os basófilos são lisados, o que
permite a quantificação destes últimos no bloco óptico de detecção.
Assim, sempre que a mancha correspondente aos basófilos neste gráfico estiver
aumentada, justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois pode estar-se
na presença de uma LMC.
Figura 2 - Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara WBC/BASO do
aparelho Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).
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Hematologia
3. Câmara NRBC:
Utiliza a técnica de citometria de fluxo.
Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos imaturos nucleados (NRBC), a fim de
que não seja necessário fazer a correcção do número total de leucócitos por contagem
manual dos NRBCs em amostras de sangue periférico onde precursores eritróides estão
presentes.
Para isso lisam-se as membranas dos eritrócitos maturos, ficando intactos
NRBCs e os leucócitos. Seguidamente tinge-se o material genético (mais precisamente
as histonas) dos NRBCs e dos leucócitos, de forma a que este material genético
fluoresça quando a SFI incidir sobre ele. Uma vez que os leucócitos apresentam mais
histonas do que os NRBCs e visto que o tamanho de leucócitos e NRBCs é claramente
distinto, é possível quantificá-los separadamente. A sua distribuição faz-se num gráfico
com tamanho em abcissas e nível de fluorescência emitida em ordenadas.
Sempre que este canal indicar a presença de NRBCs, caso não se trate de um
recém-nascido, a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada, pois é possível que
se esteja na presença de uma anemia regenerativa mas também de um processo
neoplásico (Policitémia vera, Mielofibrose Primária, SMD com displasia da série
eritróide ou LMA Eritróide).
Figura 3 – À esquerda, imagem correspondente à visualização de um sangue periférico sem
NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, imagem correspondente à visualização
de um sangue periférico com NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas
pela Roche).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
4. Canal RBC:
Utiliza a técnica de capacitância eléctrica / medição de resistência eléctrica
(fluxo DC).
Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos (RBC) e as plaquetas (PLT).
Discriminadores automáticos separam as duas populações celulares.
Sempre que os valores obtidos para os eritrócitos ou plaquetas forem muito
baixos justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois muitos processos
neoplásicos conduzem a uma baixa destas duas séries por invasão da medula óssea por
precursores leucocitários.
Figura 4 – À esquerda, histograma RBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, histograma
PLT do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).
5. Canal de fluxo:
Utiliza o método colorimétrico.
Neste canal quantifica-se a hemoglobina (Hb) da amostra.
Para tal, a amostra é diluída numa solução electrolítica que conduz a corrente
eléctrica, ocorrendo assim a lise dos eritrócitos e a consequente libertação da
hemoglobina (Hb). Segue-se a conversão da Hb em cianometahemoglobina (SLS-Hb),
um composto corado cuja absorvância a 540 nm é medida fotometricamente. A
absorvância da SLS-Hb é comparada com a absorvância da solução electrolítica sem
amostra diluída.
A partir dos parâmetros determinados no canal RBC e canal de fluxo, os índices
eritrocitários podem ser calculados pelo aparelho.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
6. Canal RET:
Utiliza a técnica de citometria de fluxo.
Nesta câmara quantificam-se os reticulócitos e as plaquetas muito imaturas
(PLT-fl).
Para isso tinge-se o material genético (mais precisamente as histonas) de todas
as células presentes na amostra: leucócitos, NRBCs, reticulócitos e plaquetas muito
imaturas. As plaquetas maturas não apresentam núcleo e, portanto, não têm material
genético que possa ser corado; só as muito imaturas apresentam vestígios de material
genético.
Como a intensidade de fluorescência dos leucócitos e dos NRBCs é muito
elevada em relação à dos reticulócitos e das plaquetas imaturas, estas populações
conseguem facilmente distinguir-se das populações que se desejam avaliar nesta câmara
e o cut-off no gráfico é feito de forma a que leucócitos e NRBCs nem sequer sejam
visualizados.
À medida que maturam, os reticulócitos vão perdendo material genético e,
assim, intensidade de fluorescência. Como tal, num diagrama em que se avalia o
tamanho celular em abcissas e o grau de fluorescência emitida em ordenadas, é possível
distinguir as diferentes populações de reticulócitos, desde os mais imaturos (HFR - high
fluorescence ratio), passando pelos de maturidade intermédia (MFR – middle
fluorescence ratio), até aos reticulócitos mais maturos (LFR – low fluorescence ratio),
acabando
nos
eritrócitos
maturos
(RBC-o)
já
sem
fluorescência
emitida.
Adicionalmente, a fracção da população muito precoce de reticulócitos (IRF,
reticulócitos imaturos) é analisada.
As plaquetas imaturas (PLT-fl), que ainda emitem fluorescência, são muito mais
pequenas que os reticulócitos e, para além disso, emitem menos fluorescência que estes
últimos, podendo assim distinguir-se no gráfico. Estas plaquetas imaturas não são
quantificadas no canal que mede usualmente as plaquetas (canal RBC). Assim, se as
plaquetas forem quantificadas no canal RET, o seu valor será ligeiramente superior
dado a suplementar quantificação das plaquetas imaturas. Esta quantificação é muito
importante sobretudo para doentes que apresentam níveis baixos de plaquetas, exibindo
um valor próximo do cut-off entre o fazer ou não uma transfusão, receber ou não o seu
tratamento de quimioterapia. Assim, no IPO sempre que um doente apresenta um valor
de plaquetas ligeiramente inferior a 20x10^9/L (nível de cut-off importante para muitas
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
decisões terapêuticas, quase que como os 150x10^9/L do limiar inferior que geralmente
se admite fora de um instituto de oncologia), este parâmetro é quantificado no canal
RET, podendo, assim, evitar-se transfusões em certos casos ou permitir-se a
quimioterapia noutros.
Figura 5 – Localização das diferentes fracções de reticulócitos imaturos e de plaquetas
fluorescentes no canal RET do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).
7. Canal IMI:
Utiliza a método de impedância eléctrica (método RF-DC).
Neste canal quantificam-se as células imaturas: as stem cell (HPC – Human
Progenitor Cells) e os granulócitos imaturos (IG – Immature Granulocytes).
O reagente utilizado afecta os constituintes lipídicos das membranas celulares.
Assim, eritrócitos e leucócitos maturos são lisados. Os leucócitos imaturos permanecem
intactos, dado o seu menor conteúdo em lípidos a nível das membranas celulares.
Assim, em amostras de sangue normais (isto é, sem precursores), nenhumas células
aparecem no gráfico correspondente ao canal IMI visto que todas as células são lisadas.
Este gráfico comporta em ordenadas o sinal RF (corresponde à estrutura molecular
interna das células) e em abcissas o sinal DC (correspondendo ao volume celular). Em
amostras de sangue de pacientes sujeitos a quimioterapia, a visualização dos HPC
permitirá concluir que o doente está a arrancar; o parâmetro IG permitirá detectar
precocemente uma possível infecção.
Assim, sempre que o gráfico correspondente ao canal IMI indicar a presença de
células precursoras a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Hematologia
Por outro lado, este canal também dá uma ideia da existência de agregados
plaquetários (PLT Clumps), que no caso de existirem aparecerão como prolongamentos
das plaquetas isoladas. Poderá, nesse caso, ponderar-se uma pseudo-trombocitopénia,
devendo visualizar-se a lâmina a fim de a confirmar. Para a objectiva de 100x, a
observação de 5 plaquetas por campo corresponde sensivelmente a uma contagem de
100x10^9/L plaquetas.
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100; imagem de um sangue periférico sem
percursores mielóides nem agregados plaquetários (imagem cedidas pela Roche).
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3. Imunologia
O estágio decorreu:
- No Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil, Entidade
Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), Serviço de Imunologia, Laboratório de
Imunologia Celular, durante o mês de Março de 2009, sob a orientação da Drª Gabriela
Martins (Imunologia Celular). O estágio perfez um total de 154 horas.
- No Hospital Curry Cabral, Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia,
entre 7 de Setembro e 16 de Outubro, sob a orientação da Drª Maria do Céu Santos
(Imunologia Humoral). O estágio perfez um total de 150 horas.
Antes da realização do estágio, a estagiária tinha pouco conhecimento teórico da
área, adquirido na valência de Hematologia II e Imunologia do Mestrado de Análises
Clínicas. Os estágios, contudo, permitiram o adquirir de conhecimentos teóricos mais
sólidos e a sua aplicação prática.
Os conhecimentos apreendidos e praticados no estágio de Imunologia Humoral
permitirão a implementação da Técnica de Imunofluorescência Indirecta no Laboratório
onde a estagiária trabalha.
O serviço de Imunologia do IPO Porto recebe, em média, cinco amostras
diariamente.
Durante a primeira semana de estágio, a estagiária teve a oportunidade de
aprender a preparar as amostras que foram surgindo na rotina diária; durante a segunda
semana adquiriu amostras nos dois Citómetros de Fluxo do serviço; a terceira e quarta
semanas de estágio foram dedicadas à análise de resultados no programa Infinicyt.
Durante o estágio, a estagiária teve ainda oportunidade de frequentar um curso
nocturno de Iniciação à Citometria de Fluxo leccionado pela Enzifarma.
O Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral executa semanalmente,
em média, 80 amostras para pesquisa de ANAs por Imunofluorescência Indirecta, 30
amostras para pesquisa de Auto-Anticorpos Anti-DNAds, 20 amostras para pesquisa
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Imunologia Celular
geral de Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos e 30 amostras para pesquisa de ANAs
específicos por Dot’s.
Durante o estágio, a estagiara teve oportunidade de executar lâminas
manualmente e automaticamente para as diferentes técnicas de Imunofluorescência
Indirecta e visualizá-las. Teve ainda oportunidade de executar automaticamente testes
de ELISA, verificar o funcionamento do aparelho de ELISA e executar Dot’s para as
diferentes técnicas disponíveis no hospital.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Imunologia Celular
3.1.
Imunologia Celular
3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo
A Citometria de Fluxo exibe a capacidade de medir propriedades (parâmetros
celulares) de partículas em suspensão, uma a uma.
Quando uma amostra em solução é injectada num Citómetro de Fluxo, as
partículas em suspensão são aleatoriamente distribuídas no espaço tridimensional.
Assim, é necessário que as partículas da amostra sejam alinhadas, de forma a que o
sistema de detecção do Citómetro de Fluxo as consiga avaliar individualmente. Este
processo é conseguido pelo sistema de fluidos do aparelho, que consiste num canal
central apertado através do qual a amostra é injectada com uma determinada velocidade
de fluxo. Sob condições optimizadas, obtém-se um fluxo laminar, sendo cada partícula
analisada individualmente.
Após focagem hidrodinâmica, cada partícula é atravessada por um feixe de luz
(laser). Estando cada partícula ligada a um fluorocromo, após a absorção de energia do
feixe de luz incidente, a emissão de fluorescência pelo fluorocromo fornecerá
informação acerca das propriedades da partícula a que está ligado. A radiação emitida
na direcção do feixe de luz incidente é captada por uma lente conhecida por “Forward
Scatter Channel” (FSC); fornece informação acerca do tamanho da partícula e
distingue partículas inteiras (células vivas, maiores) de partículas alteradas (restos
celulares, menores). A radiação emitida aproximadamente a 90 graus do feixe de luz
incidente é captada por uma lente conhecida por “Side Scatter Channel” (SSC); fornece
informação acerca da complexidade (conteúdo em granulação) da partícula. As duas
informações em simultâneo permitem distinguir vários tipos de células numa amostra
heterogénea.
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Imunologia Celular
Figura 7 – Imagem obtida nos contadores hematológicos. Gráfico com FSC (tamanho celular) no
eixo dos y, versus SSC (granularidade) no eixo dos x. Só estes dois parâmetros permitem distinguir a
população normal de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e restos celulares (ghost). Os poucos
basófilos são encobertos pela vasta população de linfócitos normais (imagem cedida pela Enzifarma).
Figura 8 – Imagens obtidos num Citómetro de Fluxo. Na imagem à esquerda, gráfico com SSC
(granularidade) no eixo dos y e FSC (tamanho) no eixo dos x; é possível distinguir linfócitos (vermelho),
monócitos (azul escuro), neutrófilos (verde), eosinófilos (roxo) e restos celulares (laranja); os monócitos
(azul claro) misturam-se com os linfócitos. Na imagem à direita, gráfico com CD45 (marcador
leucocitário) no eixo dos y e SSC (granularidade) no eixo dos x; é possível isolar a população
monocitóide da linfóide (imagem cedida pela Enzifarma).
A medição da fluorescência emitida a diferentes comprimentos de onda,
seleccionados com recurso a diferentes filtros, fornece informação quantitativa e
qualitativa acerca dos fluorocromos ligados tanto à superfície das partículas (receptores
celulares) como ao seu interior (moléculas intracelulares, como DNA e citocinas).
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Imunologia Celular
Quando a luz emitida atinge um fotodetector gera-se uma pequena corrente
eléctrica, cuja voltagem é proporcional ao número de fotões recebidos pelo detector.
Esta voltagem é convertida em sinal digital e, seguidamente, expressa graficamente.
Nem todos os fluorocromos podem ser utilizados em Citometria de Fluxo. É
necessário que a diferença entre a Energia de Absorção e a Energia de Emissão do
fluorocromo seja suficientemente elevada para que apresentem diferentes cores no
espectro de luz visível. Por exemplo, o fluorocromo FITC (“Fluorecein Isothiocyanate”)
absorve luz entre os 400-550 nm (luz azul) e emite o seu máximo de radiação a 525 nm
(luz verde).
Como escolher o melhor laser e o melhor filtro para cada fluorocromo? O pico
de absorção para o FITC ocorre para 490 nm. Assim, o laser escolhido para a sua
excitação deve excitar próximo deste valor (escolhe-se o laser Azul de Argon, que
excita a 488 nm), pois quanto mais o fluorocromo se excitar, maior intensidade de
fluorescência irá emitir. Por outro lado, embora emita o seu máximo de radiação a 525
nm (luz verde), o FITC emite radiação num espectro mais alargado que vai de 475 a 700
nm (abrange a zona do azul-verde-amarelo-laranja). Consoante o filtro escolhido, assim
a zona do espectro onde irá emitir radiação, assim a cor que evidenciará. O filtro
escolhido deverá seleccionar o máximo de radiação emitida para o fluorocromo, para
que este apresente a maior intensidade possível. Para o FITC deve escolher-se um filtro
que seleccione a radiação emitida a 525 nm (luz verde); daí dizer-se que o FITC é um
fluorocromo verde.
Utilizando-se vários fluorocromos é possível analisar vários parâmetros
celulares ao mesmo tempo numa determinada amostra. Assim, é possível que, por
exemplo, o fluorocromo FITC se ligue a todos os CD45 (marcador leucocitário) da
superfície celular, enquanto que o fluorocromo PerCP se liga a todos os CD19
(marcador de linfócitos B). Conjugando vários fluorocromos é possível obter-se
informação acerca de múltiplas propriedades celulares numa só análise.
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Imunologia Celular
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto nos dois
citómetros existentes no serviço (imagem cedida pelo Serviço de Imunologia do IPO, Porto).
Uma consideração a ter em conta quando se utilizam múltiplos fluorocromos é a
possível sobreposição espectral. Isto é, há possibilidade do espectro de emissão de dois
(ou mais) fluorocromos coincidir, tornando a medição da fluorecência do fluorocromo
que de facto emitiu a radiação difícil. Esta interferência é evitável porque actualmente o
próprio Citómetro faz automaticamente a chamada compensação de fluorescência; isto
é, selecciona diferentes comprimentos de onda para a leitura da emissão de radiação
para fluorocromos cujo espectro de emissão seja em parte sobreponível.
3.1.2. Preparação das Amostras
Utilizam-se amostras de sangue periférico total, aspirado medular, biopsia
aspirativa de gânglios, fragmentos de biopsia excisionais de gânglios, lavado broncoalveolar, líquido cefalo-raquidiano e líquido ascítico. O EDTA é o anticoagulante de
eleição.
As amostras deverão ser analisadas pouco tempo após a colheita, para que se
evite a morte celular.
A amostra deverá apresentar uma densidade celular que ronde os 10^6
células/mL para evitar entupir o Citómetro. Assim, a densidade celular da amostra é
medida previamente, sendo a amostra diluída numa solução isotónica.
À
amostra
adicionam-se
os
anticorpos-monoclonais
(marcados
com
fluorocromos) cuja presença se pretende analisar. Sempre que se utilizam anticorposmonoclonais que marcam as imunoglobulinas leves de superfície (κ e λ), adiciona-se
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Imunologia Celular
uma solução de albumina à amostra antes de se adicionaram os anticorposmonoclonais; esta solução irá eliminar as imunoglobulinas serológicas que, de outra
forma, interfeririam com a determinação pretendida. Sempre que se utilizam anticorposmonoclonais que marcam antigénios citoplasmáticos, adiciona-se uma solução fixadora
e uma permeabilizadora antes de se adicionar o monoclonal à amostra, a fim de que
este consiga atingir o conteúdo intracelular, sem contudo destruir a célula.
Adiciona-se depois uma solução de lise dos eritrócitos para que estes não
interfiram na análise das populações leucocitárias.
Lava-se depois o preparado com a solução isotónica para que os eritrócitos
lisados e os monoclonais que não se ligaram aos antigénios celulares sejam removidos.
Entre as diferentes adições é necessário incubar o preparado no escuro (evitar a
perda de fluorescência do fluorocromo).
Procede-se, por fim, à aquisição do preparado no Citómetro de Fluxo.
3.1.3. Marcadores Celulares
Todas as células normais expressam uma variedade de marcadores de superfície
(receptores
celulares)
e
marcadores
intracitoplasmáticos
(marcadores
intracitoplasmáticos, DNA, citocinas), dependendo do seu tipo celular e do seu grau de
maturação. Contudo, um crescimento celular anormal (neoplasia) pode interferir com a
expressão normal dos marcadores. Assim, qualquer alteração seguidamente descrita,
obriga a confirmar e caracterizar essa alteração, na tentativa de sugerir uma hipótese de
diagnóstico.
- Intensidade e/ou modo de expressão dos marcadores característicos de um
determinado tipo celular;
- Cronologia de expressão dos diferentes marcadores durante o processo de
maturação celular;
- Características de tamanho e complexidade celulares;
- Percentagens relativas de expressão de uma determinada população celular em
relação às restantes populações;
- Tipo de receptores que uma determinada linhagem celular costuma expressar
(expressões anormais).
Como tal, a técnica de Citometria de Fluxo é de extrema utilidade não só no
diagnóstico, como também na classificação, no prognóstico, na monitorização
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Imunologia Celular
terapêutica e na avaliação de recaída de leucemias, Síndromes Mieloproliferativos,
Síndromes Mielodisplásicos, linfomas e mielomas.
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Imunologia Humoral
3.2. Imunologia Humoral
As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imune onde
os linfócitos T e B respondem contra antigénios do próprio, com consequente produção
exagerada de auto-anticorpos, sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou
a presença de antigénios tumorais. Podem ser inespecíficas ou específicas de órgão,
sendo a sua prevalência felizmente baixa entre nós.
Assim, os testes laboratoriais imunológicos que detectam a presença de autoanticorpos fornecem informação relevante no que respeita o diagnóstico, prognóstico e
monitorização das DAI. Contudo, a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a
presença de doença, uma vez que em indivíduos saudáveis verifica-se por vezes a
existência destes auto-anticorpos, embora geralmente em títulos baixos. Por outro lado,
a utilização inadequada destes testes poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a
um aumento dos custos no tratamento destas patologias. Exige-se, portanto, uma
marcha analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.
No Hospital Curry Cabral (HCC), sempre que é feito um pedido de um
anticorpo-antinuclear
(ANA)
começam
por
se
realizar
duas
técnicas
de
imunofluorescência indirecta (IFA) em células HEp-2 (identificação de todos os ANAs,
com elevada sensibilidade e baixa especificidade) e células de Crithidia luciliae
(identificação específica de DNAds).
Nas células HEp-2, caso as células exibam um padrão de fluorescência nuclear
identifica-se o tipo de padrão (homogéneo, fino granular, granular, matriz nuclear,
perinuclear, poros da membrana nuclear, etc) e titula-se a fluorescência (1:160, 1:320,
1:640 ou > 640). Para estas amostras positivas por IFA realiza-se depois o teste de
ELISA ANA Screen que permite confirmar a existência de alguns auto-anticorpos
(DNAds, histonas, Sm e hnRNP para LES, Scl-70 para Escleroderma Difusa, SS-A e
SS-B para Síndrome de Sjögren, U1-snRNP para DMTC, centrómero para CREST e Jo1 para Miosites). Para as amostras positivas para o teste ANA Screen ou negativas para
ANA Screen mas com títulos altos por IFA (possível existência de um auto-anticorpo
não identificável por ANA Screen) segue-se a marcha analítica por execução de
Imunodot’s – reacções de ELISA que permitem a identificação do(s) auto-anticorpo(s)
presente(s) no soro do doente. O(s) Imunodot(‘s) escolhido(s) depende(m) do(s) autoVera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Imunologia Humoral
anticorpo(s) que se desconfia que o doente possa ter ou da informação clínica
disponível:
- Perfil ANA (DNAds, Histonas, Nucleossoma, Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1snRNP, PCNA, hn-RNP, PM-Scl, CENP-B, AMA-M2, Jo-1, estando sublinhados os
anticorpos não pesquisados no ANA Screen);
- Perfil Hepático (M2, M2-3E, gp210, sp100 e PML sobretudo associados a
Cirrose Biliar Primária; Ro-52 associado a Cirrose Biliar Primária e Hepatite
Autoimune I; LKM-1 e LC-1 sobretudo associados a Hepatite Autoimune II; SLA e LP
sobretudo associados a Hepatite Autominue III);
- Perfil Miosites (Mi-2, PM-Scl 75, PM-SCl 100, Ku, Jo-1, SRP, PL-7, PL-12 e
EJ). Os testes de ELISA caracterizam-se por apresentar menor sensibilidade mas maior
especificidade que as células HEp-2 para os ANAs.
No caso da amostra conter um auto-anticorpo anti-DNAds ou anti-nucleossoma,
identificável no Perfil ANA, segue-se a sua quantificação por um ELISA Quantitativo.
Para as amostras positivas nas células de Crithidia luciliae segue-se
directamente a quantificação do DNAds por um ELISA Quantitativo.
Se nas células HEp-2 se suspeitar da existência de um padrão citoplasmático
mitocondrial ou de actina procede-se de imediato à pesquisa destes auto-anticorpos em
substratos mais adequados do que as células HEp-2 à sua identificação: lâminas
compostas por seis tipos de tecidos (células HEp-2, tecido hepático de rato e macaco,
tecido renal, tecido gástrico e células VSM-47).
Sempre que é feito um pedido de um anticorpo anti-citoplasmático são as
lâminas compostas pelos seis tecidos já mencionados que se utilizam para a pesquisa
inicial por IFA. As lâminas permitem a identificação/suspeita de auto-anticorpos antiactina (característicos de Hepatite Autoimune tipo 1), anti-mitocôndrias (por vezes
característicos de Cirrose Biliar Primária), anti-LKM1 (característicos de Hepatite
Autoimune 2) e anti-Células Parietais (característicos de Gastrite Atrófica Crónica e
Anemia Perniciosa). A presença dos auto-anticorpos anti-actina é confirmada nas
próprias células VSM-47 das referidas lâminas. A suspeita de auto-anticorpos antimitocôndrias e anti-LKM1 é confirmada por Imunodot’s realizando-se o Perfil
Hepático. A suspeita de auto-anticorpos anti-células parietais é confirmada por
Imunodot’s realizando-se o Perfil Gástrico.
Por outro lado, sempre que o pedido médico é específico para um determinado
tipo de auto-anticorpos utilizam-se lâminas com tecidos indicados para a sua pesquisa
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Imunologia Humoral
por IFA: auto-anticorpos anti-ductos-salivares (característico de Síndrome de Sjögren),
anti-Ilhéus de Langerhans (característicos de Diabetes Mellitus tipo I), anti-SupraRenais (característicos de Doença de Addison Primária), anti-Endomísio (característicos
de Doença Celíaca) e anti-Músculo Estriado Esquelético (característicos de Myasthenia
gravis).
Para além da quantificação dos auto-anticorpos anti-DNAds e anti-nucleossoma
já referida é essencial ao diagnóstico / à monitorização clínica a quantificação dos
ANCAs (pANCA MPO e cANCA PR3) para as vasculites e auto-anticorpos antiCardiolipina e anti-β2-Glicoproteína 1 IgM e IgG para o Síndrome Antifosfolipídico.
Para além destes, também se quantificam no HCC os auto-anticorpos anti-ICC e C1q, os
anti-CCP (específicos para Artrite Reumatóide), os anti-GBM (característicos de
Síndrome de Goodpasture) os anti-Gliadina e anti-Transglutaminase IgA e IgG
(característicos da Doença Celíaca) e os anti-Desmogleinas 1 e 3 e BP180
(característicos dos vários tipos de Pênfigo). Sempre que um destes pedidos médicos é
feito, realiza-se directamente a quantificação destes auto-anticorpos por um ELISA
Quantitativo, sem que nenhum teste de rastreio se realize previamente.
Por uma questão de organização do serviço, à 2ª feira realizam-se as lâminas das
células HEp-2, das células de Crithidia luciliae e as lâminas compostas por seis tecidos
para pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-nucleares e anti-citoplasmáticos. À 3ª feira
lêem-se estas lâminas por IFA e realizam-se os testes ANA Screen necessários. À 4ª
feira executam-se os Imunodot’s adequados. À 5ª realizam-se os ELISAs Quantitativos.
A 6ª é o dia das repetições e confirmações necessárias. Os tecidos para pesquisa de
auto-anticorpos específicos por IFA executam-se sempre que o número de amostras a
executar o justifica.
Desta forma garante-se no HCC organização no serviço e identificação de todos
os tipos de auto-anticorpos disponíveis até ao momento no mercado, sendo o auxílio
dado à clínica médica o melhor possível.
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4. Genética Molecular Humana
O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco
Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Genética, nos
seguintes laboratórios:
- Laboratório de Genética Molecular, durante o mês de Maio de 2009, sob a
orientação da Drª Susana Bizarro (Biologia Molecular). O estágio perfez um total de
140 horas.
- Laboratório de Citogenética, durante o mês de Junho, sob a orientação da Drª
Cecília Correia (Citogenética Clássica e FISH). O estágio perfez um total de 126
horas.
O Serviço de Genética recebe, em média, cinco amostras diariamente para cada
um dos dois laboratórios.
Antes da realização do estágio de Biologia Molecular, a estagiária já tinha algum
conhecimento teórico da área, adquirido na valência de Biologia Molecular do Mestrado
de Análises Clínicas. O estágio, contudo, permitiu a consolidação e a aplicação prática
dos conhecimentos teóricos previamente adquiridos, tendo-se revelado muito útil. A
estagiária teve a oportunidade de observar e executar todas as técnicas moleculares que
seguidamente se descrevem.
Assim, foi possível propor ao Laboratório de Análises Clínicas onde a estagiária
trabalha a implementação de Técnicas Moleculares, actualmente já em curso.
Antes da realização do estágio de Citogenética, a estagiária não tinha
praticamente nenhum conhecimento da área, dado que só uma aula da cadeira de
Hematologia II abordou o assunto de forma genérica durante todo o Mestrado de
Análises Clínicas. Durante o estágio, a estagiária teve oportunidade de apreender
conhecimentos teóricos relacionados com a Citogenética Clássica e FISH, executar
lâminas para Citogenética Clássica e FISH, aprender a nomenclatura dos cromossomas
para a realização de cariótipos, realizar cariogramas e observar lâminas de FISH ao
microscópio de fluorescência.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
4.1. Biologia Molecular
Nas últimas décadas, numerosas alterações genéticas foram detectadas em
neoplasias hematológicas. Hoje sabe-se que uma determinada alteração genética
específica está na génese de um tumor hematológico em particular, por causar uma
alteração no equilíbrio proliferação celular / apoptose. Esta alteração genética é sempre
clonal e adquirida, sendo limitada às células malignas do organismo. As alterações que
conduzem ao processo neoplásico podem ocorrer em quatro diferentes grupos de genes:
genes de reparação do DNA, genes que interferem com a apoptose, genes que
interferem com o Ciclo Celular, genes que controlam a proliferação celular (ProtoOncogenes – genes que estimulam a proliferação celular – ou Genes Supressores
Tumorais – genes que inibem a proliferação celular). Os estudos moleculares são
imprescindíveis nas alterações neoplásicas hematológicas. Revelam-se excelentes
marcadores de diagnóstico, prognóstico, orientação terapêutica, avaliação de doença
residual mínima e avaliação de resposta/resistência à terapêutica instituída.
As amostras de sangue e medula óssea processadas no Laboratório de Genética
Molecular do IPO Porto são colhidas em EDTA (a heparina inibe a reacção de PCR). O
processo de extracção do material genético (DNA e RNA) é feito por salting-out, sem
recurso a kits de colunas hidrofílicas. O material genético extraído é analisado com
recurso às técnicas que seguidamente se descrevem.
4.1.1. PCR
4.1.1.1.Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction)
Uma reacção de PCR Simples é um processo automatizado que envolve a
amplificação de “genes” in vitro. A reacção necessita essencialmente do seguinte:
- Sequência de DNA que se pretende amplificar (DNA molde);
- Um par de primers (RNA primases) sintéticos de cadeia simples e
complementares às extremidades 3’ dos fragmentos de DNA molde;
- Nucleótidos livres (dNTPs);
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
- Enzima para a síntese do DNA (DNA Polimerase), resistente a altas
temperaturas;
- MgCl2 – cofactor da DNA Polimerase;
- Tampão de reacção ideal ao funcionamento da DNA Polimerase utilizada.
Consiste numa série de ciclos, cada um dos quais envolvendo reacções
efectuadas a temperaturas diferentes. Cada ciclo de PCR envolve os seguintes passos:
- Desnaturação da dupla cadeia de DNA (94 a 96ºC, 2 a 5 minutos);
- Emparelhamento (annealing) dos primers foward e reverse (55 a 70ºC
consoante os primers utilizados, 30 segundos a 1 minuto); os primers vão emparelhar
com as cadeias simples de DNA porque estão presentes em concentração muito elevada
em relação à concentração de DNA existente no meio reaccional;
- Síntese de DNA por acção da DNA Polimerase (polimerização), que usa como
molde a cadeia simples de DNA a que cada primer está emparelhado (1 a 2 minutos, 72
a 74ºC - temperatura mais elevada que para o emparelhamento mas variável consoante a
enzima utilizada - 72ºC para a Taq Polimerase).
O ciclo é repetido várias vezes no aparelho de PCR, demorando cada ciclo
apenas alguns minutos e, por isso, todo o processo é muito rápido. O resultado é a
grande amplificação das sequências de DNA delimitadas pelos dois primers usados na
reacção. Cada n ciclos leva à produção de 2^n moléculas de DNA. No final da reacção o
termociclador mantém-se a 4ºC a fim de conservar o produto de reacção. A quantidade
de DNA que se obtém é suficiente para que este seja directamente visualizado num gel
de agarose, sem recurso a técnicas mais sensíveis.
Se a reacção de PCR for contaminada com DNA estranho, este pode emparelhar
com os primers, mesmo que só parcialmente, e ser amplificado. Para que se evitem
contaminações devem respeitar-se as seguintes condições:
- A área de trabalho deve ser arejada (ar condicionado ou janela) e não ter
ligação com áreas de contaminação;
- A sala de pipetagem dos reagentes, a sala de PCR e a sala de electroforeses
(que está sempre ultra-contaminada) deverão ser isoladas umas das outras;
- As bancadas de trabalho deverão ser descontaminadas com álcool a 100%;
- Todo o material utilizado terá de ser esterilizado, podendo para isso utilizar-se
uma câmara de UV; trabalhar numa câmara de UV é sobretudo importante quando se
manipula produtos de PCR, cujos aerossóis podem contaminar o meio; o operador
deverá mudar de luvas regularmente;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
31 |
Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
- Todo o material utilizado para PCR (exº: micropipetas) não deverá ser utilizado
para outros fins;
- As micropipetas deverão ser resistentes à formação de aerossóis quando se
trabalha com produtos de PCR;
- Os reagentes devem ser congelados em alíquotas individualizadas para evitar
perdas de actividade e contaminações que iriam fazer perder todo o material;
- Os reagentes deverão estar em gelo durante todo o processo de pipetagem,
sobretudo se se trabalhar com RNA porque trata-se de uma molécula mais facilmente
degradável que o DNA e porque no frio as RNAses (existentes em todo o ambiente e
sem necessidade de co-factor para actuarem) não têm actividade;
- A DNA Polimerase deverá ser o último reagente pipetado;
- Para mix’s que serão distribuídas por 10 amostras, será conveniente pipetar
reagentes para 11 amostras; para 20 amostras, pipetar reagentes para 22 amostras; etc;
- Evitar vortexar os tubos de PCR, agitando os reagentes da reacção com o
auxílio do dedo indicador;
- Para controlo de cada reacção de amplificação deverá sempre utilizar-se um
controlo negativo (feito com tudo excepto com o DNA a amplificar cujo volume é
substituído por água) e um controlo positivo (fornecido pela casa comercial ou com um
resultado fortemente positivo anterior).
4.1.1.2.RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
A reacção de RT-PCR é utilizada sempre que se pretende trabalhar com RNA
em vez de DNA. Tal poderá ser vantajoso porque o RNA não contém os intrões que o
DNA possui, amplificando-se uma zona menor do material genético. Para tal, apenas
tem que se utilizar uma outra enzima, a Transcriptase Reversa (e os respectivos
primers), que converte o RNAm em DNA complementar (cDNA). A partir daí, o cDNA
é amplificado da mesma forma que o DNA por PCR.
4.1.1.3.RT-PCR Nested
O RT-PCR Nested envolve uma primeira reacção de RT-PCR normal em que se
utilizam os chamados primers externos. Segue-se uma segunda reacção de RT-PCR realizada com o produto da primeira reacção mas num tubo diferente - em que se
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
32 |
Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
utilizam primers mais internos em relação aos utilizados na primeira reacção; esta
segunda reacção designa-se por Nested.
Este segundo conjunto de primers utilizado na segunda reacção funciona como
um controlo extra ou uma confirmação do primeiro RT-PCR, aumentando a
sensibilidade da reacção aproximadamente de 1:1000 para 1:1x10^6. Ou seja, poderá
acontecer que os primers na primeira reacção se liguem a uma zona diferente
(inespecífica) da que se pretende amplificar, mas nesse caso o segundo conjunto de
primers (mais internos) não se irá ligar ao produto da primeira reacção não havendo
amplificação do sinal; se se fizesse correr num gel de agarose, o produto da primeira
reacção visualizar-se-ia como uma banda (que até poderia apresentar o mesmo peso
molecular que a banda esperada), mas ao se fazer correr noutro gel o produto da
segunda reacção não se obteria qualquer banda.
Também a especificidade do processo aumenta, passando a visualizar-se muito
menos bandas inespecíficas no gel de agarose realizado para o produto da segunda
reacção.
4.1.1.4.PCR Específico de Alelo (ASO-PCR)
Trata-se de uma variação à reacção de PCR utilizada para pesquisar mutações
pontuais. Utiliza um conjunto de primers em que um deles se liga especificamente à
zona de uma mutação pontual no caso de esta estar presente; assim, só nesse caso
haverá amplificação do sinal. Utiliza-se como controlo um terceiro primer (que faz
“pare” com o primer que se liga fora do local da mutação) que se liga a uma zona fora
do local da mutação e que, portanto, deverá amplificar um sinal independentemente de
existir ou não mutação. Como tal, caso haja mutação obter-se-ão duas bandas no gel de
agarose, enquanto que se não houver mutação apenas se obterá uma banda
correspondente ao controlo.
4.1.1.5.PCR de Longa Distância (PCR-LD)
Trata-se de uma variação à reacção de PCR que utiliza uma DNA Polimerase
(com actividade de proofreading) que tem a capacidade de amplificar um fragmento
muito maior de DNA, de 5 kb a 40 kb.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
33 |
Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
4.1.1.6.PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo
O PCR/RT-PCR determina se o DNA/cDNA em pesquisa está ou não presente
na amostra (avaliação qualitativa). O PCR em Tempo Real determina a quantidade de
DNA/cDNA presente na amostra (avaliação quantitativa).
Teoricamente, a quantidade de produto de PCR obtida duplica no final de cada
ciclo de amplificação (relação exponencial), o que pressupõe que a reacção ocorra com
100% de eficácia em todos os ciclos de amplificação. Contudo, a existência de
inibidores de reacção altera este pressuposto. Para além disso, amplificações tardias são
realizadas com menos eficácia que as primeiras amplificações. Assim, a reacção não é
eternamente exponencial, exibindo uma fase linear e, no final, uma fase de plateau.
Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética,
IPO Porto).
Na fase exponencial de reacção o produto de PCR obtido duplica ao fim de cada
ciclo (100% eficácia); a reacção é muito específica e precisa. Na fase linear os
componentes da reacção começam a esgotar e a reacção começa a abrandar; o produto
de PCR já não duplica no final de cada ciclo. Na fase de plateau os componentes
esgotam-se, não se forma mais produto de PCR, a reacção pára e os produtos de PCR
começam a degradar-se.
Numa reacção de PCR/RT-PCR qualitativo avalia-se o DNA/cDNA obtido no
final da reacção (fase de plateau). Essa avaliação é feita por observação de uma banda
num gel de agarose; contudo, a espessura da banda não permite quantificar o
DNA/cDNA obtido (baixa sensibilidade), apenas permitindo dizer se houve ou não
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
amplificação, isto é, se o DNA/cDNA está ou não presente na amostra. O PCR
quantitativo avalia a quantidade de DNA/cDNA formada, não na fase de plateau, mas
antes na fase exponencial (específica e precisa), através do uso de um sistema
informático, por análise da cinética da reacção de PCR.
Para quantificação do material genético da amostra pode utilizar-se a técnica de
FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer). Esta técnica baseia-se no princípio de
que quando uma fonte de energia elevada está próxima de uma fonte de energia mais
baixa, haverá transferência de energia da primeira para a segunda.
Segundo esta técnica, um oligonucleótido (sonda TaqMan) é adicionado à mix
de reagentes de PCR/RT-PCR. A sonda é desenhada de forma a ligar-se
especificamente a uma sequência do DNA/cDNA molde entre o primer foward e o
reverse. Assim, a sonda encontrar-se-à no caminho da DNA Polimerase quando esta
começar a copiar o DNA/cDNA. A sonda é desenhada com uma extremidade 5’ de alta
energia (Reporter) e uma extremidade 3’ de menor energia (Quencher). Quando a sonda
está intacta e é excitada por uma fonte luminosa, o Reporter fornece parte da sua energia
ao Quencher, dada a proximidade existente entre ambos, e assim o Reporter não emite
quase nenhuma fluorescência (abaixo do limiar de detecção do instrumento). Quando a
sonda é clivada pela DNA Polimerase a distância entre o Reporter e o Quencher
aumenta, o Reporter deixa de conseguir transferir a sua energia ao Quencher e passa a
emitir toda a sua energia sob a forma de fluorescência. O aumento de fluorescência
emitida pelo Reporter atinge um nível que consegue ser detectado pelo instrumento,
dando origem a uma curva de amplificação.
forward
5primer
3
'5
'
1.'
polymerisatio
n
R
pr
ob
e
Q
5'
3'
reverse
primer
Q
5
3
'5 5'
'
' 2. strand displacement
R
3'
5'
5'
3'
5'
3. cleavage
3'
5'
3'
5'
R
Q
5'
3'
R
3
'
Q
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
4. polymerisation completed
Figura 11 – Esquema de actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RTPCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
A curva de amplificação contém informação essencial para a quantificação de
DNA/cDNA da amostra. A linha “threshold” correponde ao ponto em que a reacção
atinge uma intensidade de fluorescência detectada pelo aparelho. Esta linha atinge-se na
fase exponencial da reacção de PCR/RT-PCR. O ciclo ao qual a amostra atinge este
nível designa-se por “Cycle Threshold” (CT). Teoricamente, existe uma relação
quantitativa entre a altura em que a amplificação entra em fase exponencial e a
quantidade de DNA/cDNA da amostra; isto é, quanto maior a quantidade de
DNA/cDNA que a amostra contiver, mais rapidamente a sua amplificação entra em fase
exponencial, maior o aumento da fluorescência emitida pelo Reporter e menor o CT da
amostra.
fluorescent signal
End point
not quantitative
quantiquantitative
) threshold of
detection
detection
PCR
cycles (
CT
High CT
Low C
(low
copy no.)
(high copy
T no.)
T
T
Figura 12 – Leitura do produto Tde PCR na fase exponencial (threshold of detection); quanto mais
cedo o produto entrar na fase exponencial, maior o número de cópias, maior a quantidade inicial de
material genético da amostra (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
A quantidade de DNA/cDNA na amostra a analisar é calculada com base numa
curva de calibração, construída a partir de padrões de concentração rigorosamente
conhecida, que correm na reacção de PCR em Tempo Real ao mesmo tempo e nas
mesmas condições que a amostra.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
4.1.2. Restrição Enzimática
A ocorrência de uma mutação pontual pode originar a criação ou a abolição de
um local de restrição (local de corte do DNA por uma enzima de restrição) e essa
característica pode ser usada para diagnóstico da mutação.
O método consiste na amplificação por PCR Single da região do DNA a
analisar, utilizando-se para isso primers que flanqueiam a região de interesse. O produto
da amplificação é então digerido com a enzima de restrição e os diferentes fragmentos
resultantes da digestão (RFLPs) são separados por electroforese de acordo com o seu
tamanho. Por exemplo, se a mutação não estiver presente a enzima não corta e obtém-se
apenas um fragmento correspondente ao DNA amplificado não digerido; se a mutação
estiver presente a enzima corta e obtêm-se dois fragmentos. Para indivíduos
heterozigóticos obter-se-ão 3 fragmentos, um correspondente ao produto de PCR não
digerido (cromossoma/gene normal) e os outros dois correspondentes ao produto da
digestão enzimática (cromossoma/gene alterado).
4.1.3. Electroforese
4.1.3.1.Electroforese em Gel de Agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa
solução tampão e deixando polimerizar numa “forma” apropriada. Colocando
previamente um pente, obtém-se um gel contendo uma fileira de poços numa das
extremidades, onde posteriormente serão colocadas as amostras a analisar.
O gel é colocado num tanque de electroforese, imerso em tampão, ficando entre
dois eléctrodos posicionados paralelamente à fileira de poços do gel. Cada amostra é
colocada num poço do gel e, com a aplicação de um campo eléctrico, vão migrar para o
pólo positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm carga negativa em pH
neutro.
A agarose funciona como uma peneira, deixando passar mais facilmente as
moléculas mais pequenas que, assim, vão migrar mais do que as moléculas maiores; a
migração é inversamente proporcional ao tamanho. A relação entre o peso molecular do
DNA e a distância percorrida no gel é aproximadamente linear, sendo possível estimar o
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
tamanho de fragmentos de DNA obtidos quando parando a sua migração em gel com a
migração de fragmentos cujo tamanho é conhecido (marcador de peso molecular, que se
faz correr como uma amostra).
As moléculas do mesmo tamanho migram conjuntamente e formam bandas que
podem depois ser visualizadas com o auxílio de luz ultravioleta num transiluminador.
Para tal, é necessário incluir no gel brometo de etídio, uma substância mutagénica que
se intercala nas cadeias de DNA e que, após exposição a raios UV, emite fluorescência
alaranjada.
Figura 13 – Electroforese em gel de agarose. Marcador de peso molecular à esquerda (imagem
cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
4.1.3.2.Electroforese Capilar

Sequenciação Automática
Trata-se de um método automático que permite determinar a sequência de
nucleótidos que compõem um fragmento de DNA.
O primeiro passo da reacção de PCR de Sequenciação (feita numa aparelho de
PCR normal, com recurso ao kit próprio para sequenciação) é a desnaturação da dupla
cadeia de DNA. Em seguida, um primer é emparelhado numa zona do DNA cuja
sequência é conhecida. Uma DNA Polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir
da zona de ligação do primer. Contudo, em vez de se adicionar ao meio reaccional
apenas dNTPs normais, adicionam-se também e em excesso derivados didesoxi dos
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
nucleótidos normais (ddNTPs) que, não possuindo o grupo OH na posição 3’ da
desoxirribose, impedem as ligações fosfodiestéricas do DNA e, assim, que a cadeia de
DNA continue a ser sintetizada.
Cada ddN está marcado com um fluorocromo de cor diferente; isto é, por
exemplo, os ddA estão marcados com um fluorocromo amarelo, os ddC com um
fluorocromo azul, os ddG com um verde e os ddT com um vermelho. Cada ddN está
presente numa proporção que permite que, de quando em quando, seja incorporado no
DNA em vês do dNTP normal correspondente e termine a síntese da cadeia de DNA.
Assim, vão ser sintetizadas uma série de cadeias de DNA com, sucessivamente um
nucleótido de diferença. A relação entre a quantidade de dNTPs e ddNTPs presentes no
meio reaccional é muito importante, sendo essencial que os ddNs estejam em excesso
em relação aos dNTPs para que se obtenham produtos de PCR mais curtos, com apenas
um nucleótido de diferença entre as diferentes cadeias formadas.
Fazendo também uma reacção de sequenciação com um primer que emparelha
com a outra cadeia de DNA, é possível ler a sequência de ambas as cadeias, o que é
sempre aconselhável para evitar erros resultantes de ligações inespecíficas. Assim, para
o PCR de Sequenciação prepara-se uma mix com o tampão, a DNA Polimerase, os
dNTPs, os ddNTPs e a água e essa mix é distribuída por dois tubos – um que leva o
primer foward e outro que leva o primer reverse.
Uma posterior reacção de electroforese irá separar as diferentes cadeias de DNA
formadas de acordo com o seu tamanho. A electroforese capilar apresenta sensibilidade
suficiente para separar cadeias de DNA que apenas diferem em peso 1 bp. As cadeias de
DNA formadas, com carga negativa devido aos grupos fosfato, irão passar através de
um capilar migrando do cátodo para o ânodo devido a uma diferença de potencial que é
gerada pelo aparelho. Os produtos mais leves serão os primeiros a serem transferidos,
conseguindo-se, assim, a separação pretendida. O capilar funciona aqui como o gel de
agarose – polímero que permite a separação.
Por outro lado, o aparelho emite um laser que é feito incidir sobre as cadeias de
DNA à medida que estas passam ao longo do capilar. O laser vai excitar o fluorocromo
a que está ligado o ddNTP terminal de cada cadeia, havendo uma emissão de
fluorescência cujo comprimento de onda (cor) depende do ddNTP em causa. Os sinais
de fluorescência emitidos são detectados, processados e interpretados pelo sistema
informático acoplado ao instrumento. A sequência é automaticamente lida e o resultado
final é um gráfico de “picos” (cromatograma) cada um correspondente a um nucleótido
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
do DNA sequenciado. Quanto mais altos e agudos forem os picos mais qualidade
apresentam.
Figura 14 – Esquema que representa o processo de Sequenciação Automática (imagem cedida
pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
Contudo, quando o DNA que se pretende sequenciar provém de uma prévia
reacção de PCR, antes de se realizar a sequenciação, é necessário remover todos os
“resíduos” da reacção de PCR que iriam interferir com o processo de sequenciação,
como os primers utilizados (para evitar múltiplas sequenciações), os dNTPs (para
manter uma ideal relação dNTPs/ddNTPs), os sais (interferem com a acção da DNA
Polimerase) e produtos de PCR inespecíficos que eventualmente se tenham formado
(para evitar artefactos na sequenciação). Para purificar o produto de PCR inicialmente
feito basta utilizar uma coluna hidrofílica que irá agarrar as moléculas de DNA pela sua
carga negativa e deixar passar todos os “resíduos”; depois basta eluir as moléculas de
DNA. Só no fim desta purificação é que se realiza, então, o PCR de Sequenciação.
Por outro lado, depois de se realizar o PCR de Sequenciação e antes de se
realizar a electroforese capilar, também é necessário executar uma segunda purificação
a fim de se eliminarem os ddNTPs soltos (que iriam interferir com a leitura no aparelho
de sequenciação) e os sais (que iriam interferir com a injecção electrocinética do
aparelho).

Análise de Fragmentos
O processo de separação é idêntico ao utilizado para a sequenciação automática.
Cada pico obtido no cromatograma também corresponde a um fragmento de DNA, seja
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
40 |
Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
ele resultante de digestão enzimática ou o produto inteiro de PCR. Contudo, neste caso
os fluorocromos estão agarrados aos primers que se utilizam na reacção de PCR prévia.
No Anexo 1 encontram-se descritas as alterações genéticas associadas a
determinados processos neoplásicos hematológicos que são pesquisadas no Laboratório
de Genética Molecular do IPO Porto.
No Anexo 2 encontram-se descritos os estudos moleculares realizados no
Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
41 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
4.2. Citogenética
4.2.1. Citogenética Clássica
A Citogenética Clássica é a ciência que estuda o DNA da célula através da
observação individualizada dos cromossomas.
Durante a interfase do Ciclo Celular o material genético da célula está relaxado
e os cromossomas não se conseguem observar individualizados. É só durante a mitose
que o material genético se condensa e conseguem observar-se os cromossomas
individualizados. Das diferentes fases que constituem a mitose, é na metafase que os
cromossomas atingem o máximo de condensação e o centrómero e os dois cromatídeos
de cada um são perfeitamente visíveis ao microscópio óptico. Assim, é apenas neste
período que a análise por Citogenética Clássica detalhada pode ser efectuada, sendo
para isso necessário que as células entrem em divisão celular.
O posterior tratamento e coloração (obtenção de padrões de bandeamento,
definindo-se uma banda como uma parte do cromossoma que é claramente distinta dos
segmentos adjacentes por aparecer mais clara os mais escura) dos cromossomas,
permitem a construção do cariograma - desenho esquemático dos cromossomas
metafásicos da célula do indivíduo, agrupados aos pares e dispostos de acordo com o
seu tamanho, posição do centrómero e padrão de bandas - e a elaboração do cariótipo nomenclatura utilizada para descrever a constituição cromossómica, normal ou anormal,
constitucional ou adquirida, do indivíduo.
Tanto o cariograma como o cariótipo fornecem informação acerca do número de
cromossomas por célula, da composição dos cromossomas sexuais (XX para mulher e
XY para homem) e identificam anomalias cromossómicas numéricas ou estruturais,
constitucionais (congénitas) ou adquiridas (alteração neoplásica).
Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) (imagem cedida pelo Laboratório de
Citogenética do IPO Porto).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
42 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Figura 16 - Cariótipo com S. Down (47,XY,+21) à esquerda - anomalia numérica constitucional.
Cariótipo com cromossoma Ph - t(9;22)(q34;q11.2) à direita - anomalia estrutural adquirida (imagem
cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas (imagem cedida pelo
Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
43 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Os estudos citogenéticos clássicos envolvem a análise dos cromossomas
encontrados no sangue periférico (cariótipos constitucionais), na medula óssea
(leucemias), em gânglios linfáticos (linfomas), em biopsias de tumor (tumores sólidos)
ou em líquido amniótico (suspeita de invasão o LCR por células neoplásicas). A
colheita é feita em heparina de lítio.
4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization)
A Citogenética Clássica permite visualizar todo o cariótipo de um indivíduo,
detectando quer as alterações genéticas de que o clínico à partida desconfia, quer outras
imprevistas. Contudo, esta técnica não consegue, por si só, identificar todo o tipo de
alterações genéticas até hoje já descritas. As alterações não visualizadas por esta técnica
designam-se por alterações “crípticas” para Citogenética Clássica. Para estas só uma
técnica de Citogenética mais sensível, como o FISH, as consegue detectar.
O FISH (Fluorescente in situ Hibridization – Hibridação Fluorescente in
situ) pode definir-se como a localização morfológica de sequências genéticas, com
recurso a técnicas de fluorescência.
O seu objectivo consiste na determinação da presença ou ausência de fragmentos
específicos de DNA ou RNA e na localização desses fragmentos particulares no
material genético. A identificação de sequências específicas de genes ao longo do
material genético consegue-se explorando as propriedades fundamentais do material
genético, isto é, a sua capacidade de emparelhar de uma maneira específica formando
híbridos entre uma cadeia natural e uma cadeia artificial de ácidos nucleicos, em que a
cadeia artificial constitui a chamada sonda.
Assim, os requisitos básicos para a realização da técnica são a utilização de uma
sonda complementar para a sequência de material genético de interesse e o uso de um
fluorocromo ligado a essa sonda, a fim de que se permita a sua detecção.
Para que a técnica se realize é necessário, antes de mais, ligar o DNA alvo à
superfície de uma lâmina de vidro a fim de manter a estrutura morfológica do material
genético. Segue-se a desnaturação do DNA, por forma a que uma cadeia simples do
DNA alvo e a cadeia simples da sonda complementar à sequência de genes de DNA que
se pretende pesquisar hibridizem (“annealing” da sonda). Segue-se a lavagem do
excesso de sonda, não ligada ao material genético, podendo-se, por fim, detectar o sinal
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Genética Molecular Humana – Citogenética
de fluorescência (emitida pelo fluorocromo ligado à sonda) num microscópio de
fluorescência.
O FISH pode ser utilizado para analisar uma grande variedade de material
biológico, como sangue, medula óssea, gânglios linfáticos, biopsias e até a partir de uma
lâmina de esfregaço de sangue periférico ou medula óssea. Não necessita que o material
genético esteja em metafase, podendo interfases ser analisadas.
Segue-se uma breve explicação de cada um dos tipos de sonda existentes.
Sondas de “Painting” (WCP)
Trata-se de muitas sondas específicas que se unem ao longo de um cromossoma,
parecendo pintar todo o cromossoma.
Figura 18 – FISH, Sondas de Painting para os cromossomas 19, a verde, permitindo confirmar a
presença de material deste cromossoma num cromossoma marcador (imagem cedida pelo Laboratório de
Citogenética do IPO Porto).
Sondas Alfa-Satélite
O DNA alfa-satélite é composto por elementos de sequência repetitiva,
localizado junto aos centrómeros. Na maioria das vezes, trata-se de sequências
repetitivas específicas de cada cromossoma.
As sondas alfa-satélite vão-se ligar a estes locais, perto dos centrómeros.
Consoante a sua sequência, vão-se ligar especificamente a um determinado
cromossoma. São utilizadas para determinar a ploidia.
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Genética Molecular Humana – Citogenética
Figura 19 – FISH, Sondas Alfa-Satélite para os cromossomas 4, 6, 17, 10, 18 e 21; observa-se
trissomia dos cromossomas 4, 6, 17, 18 e 21 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO
Porto).
Sondas de Sequência Única
São sondas que se ligam a sequências específicas dos cromossomas, sendo úteis
no estudo de micro-delecções.
D5S721/D5S722
EGR1
Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. Uma sonda verde ligada a 5p15.2 (região génica
D5S721 e D5S722) e outra vermelha ligada a 5q31 (região génica EGR1) do cromossoma 5. No exemplo
dado existe delecção do braço longo (q) de um cromossoma 5 - SMD com del(5q) - de onde resulta a
ausência de um sinal vermelho para 5q31 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO
Porto).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
46 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Dual Color, Single Fusion
Neste caso os alvos das sondas utilizadas flanqueiam os pontos de quebra de
uma translocação. São úteis na detecção de translocações específicas quando elevadas
percentagens de células apresentam essa translocação.
Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion. Uma sonda flanqueia a região 9q34 do
cromossoma 9 (sinal a vermelho) e outra flanqueia a região 22q11.2 do cromossoma 22 (sinal a verde).
Sempre que existe LMC com t(9;22)(q34;q11.2) com genes de fusão BCR-ABL, em 22q11.2 e em 9q34
respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a sonda verde, originando um sinal de fusão amarelo.
“Dual color” (vermelho e verde) corresponde aos cromossomas 9 e 22 não translocados; cor “single”
(amarelo, junto com o sinal vermelho e verde) corresponde a “fusion” dos outros dois cromossomas 9 e
22 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
ES (Extra Signal)
Com recurso às sondas dual color, single fusion muitas vezes obtêm-se falsos
resultados positivos porque pode acontecer que haja sobreposição casual do sinal
vermelho e verde, originando um sinal amarelo, se os cromossomas estiverem
sobrepostos sem que, no entanto, exista translocação.
Para que se reduza a frequência de falsos positivos devido a co-localização
acidental dos sinais, recorre-se a sondas extra signal; isto é, utiliza-se uma sonda
idêntica à utilizada nas sondas dual color, single fusion (que flanqueia o ponto de
quebra de um gene) e outra sonda grande que, em vez de flanquear o ponto de quebra do
outro gene, cobre / ultrapassa o ponto de quebra. Assim, sempre que ocorrer
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
47 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
translocação, para além do sinal de fusão terá de se observar também um sinal extra que
corresponde ao bocado da sonda grande que partiu como resultado da translocação.
TEL
AML1
Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal. Uma sonda flanqueia a região 12p13 do cromossoma 12
(sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra 21q22 do cromossoma 21 (sinal vermelho). Sempre que
existe LMA com t(12;21)(p13;q22), com genes de fusão TEL-AML1 nas regiões 12p13 e 21q22
respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a verde dando origem a um sinal de fusão amarelo no
cromossoma translocado e a um sinal extra vermelho que resulta da quebra da sonda que cobre a região
21q22. Serão ainda visíveis outro sinal verde e vermelho que correspondem aos cromossomas 12 e 21 não
translocados, respectivamente. Na imagem não se consegue visualizar o sinal verde individualizado do
cromossoma 12 não translocado (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Dual Color, Dual Fusion
Trata-se de duas sondas grandes que cobrem os dois pontos de quebra
envolvidos numa translocação em particular. São sondas com elevada especificidade,
reduzindo muito falsos resultados positivos, tal como as sondas extra sinal. Para além
disso, apresentam elevada sensibilidade, uma vez que detectam percentagens baixas de
núcleos com translocação envolvida.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
48 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color Dual Fusion. Uma sonda cobre o ponto de quebra na
região 14q32 do cromossoma 14 (sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra na região 18q21 do
cromossoma 18 (sinal a vermelho). Sempre que existe LNH Folicular com t(14;18)(q32;q21), com genes
de fusão IgH-Bcl2 nas regiões 14q32 e 18q21 respectivamente, metade da sonda verde funde-se com a
sonda vermelha e a outra metade da sonda verde funde-se com a outra metade da sonda vermelha,
originando dois sinais de fusão. O outro cromossoma 14 não translocado dará origem a um sinal verde,
enquanto que o outro cromossoma 18 não translocado originará um sinal vermelho (imagem cedida pelo
Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Dual Color, Break Apart
Este tipo de sonda é útil nos casos em que há vários parceiros possíveis
associados com um ponto de quebra conhecido. É o caso do gene MLL em 11q23 que
pode fundir-se com inúmeros parceiros. Utilizam-se duas sondas de cores diferentes que
flanqueiam o ponto de quebra conhecido, havendo sobreposição do sinal entre elas.
Figura 24 – FISH, Sonda Dual Color, Break Apart para o gene MLL em 11q23, com ligeira
sobreposição das cores verde e vermelha da sonda. O cromossoma 11 não translocado apresenta um sinal
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
49 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
de fusão amarelo. O cromossoma 11 translocado origina a quebra do gene MLL e, assim, das duas
sondas, levando à separação da sonda, com consequente observação de um sinal verde e outro vermelho
separados. Não se sabe com que gene o MLL está translocado (imagem cedida pelo Laboratório de
Citogenética do IPO Porto).
4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias
Nas últimas décadas numerosas alterações cromossómicas específicas foram
detectadas em neoplasias. Hoje sabe-se que certas alterações citogenéticas estão na
própria origem do próprio processo tumoral. A análise citogenética nas alterações
neoplásicas revela-se importante para o diagnóstico, prognóstico, orientação e
monitorização terapêutica, identificação precoce de recaída e evidência de progressão
tumoral.
Em seguida descrevem-se as alterações citogenéticas mais características de
neoplasias em particular, detectadas por técnicas de citogenética.
Leucemia Mielóide Crónica (LMC)
Translocação entre a banda q34 do cromossoma 9 e a sub-banda q11.2 do
cromossoma 22, envolvendo a fusão dos genes BCR do cromossoma 22 e ABL1 do
cromossoma 9. A presença desta translocação confere bom prognóstico na LMC. A
translocação é identificável por Citogenética Clássica e por FISH com recurso a uma
sonda dual color, single fusion.
LMA com t(8;21)(q22;q22); ETO-AML1
Translocação que envolve a fusão dos genes ETO do cromossoma 8 e AML1 do
cromossoma 21. Encontra-se em cerca de 5% das LMAs e em cerca de 10% das LMAM2 da antiga classificação FAB e tem bom prognóstico nas LMAs.É observada por
Citogenética Clássica.
LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11
Inversão que envolve a fusão dos genes CBFB e MYH11 ambos no cromossoma
16. Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M4eos da
antiga classificação FAB. Confere bom prognóstico. É necessário que as metafases
estejam muito boas (cromossomas bem separados) para que esta alteração seja visível
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
50 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
por citogenética clássica, sendo por isso sempre necessária a avaliação por FISH no
diagnóstico.
Leucemia Promielocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12); PML-RARA
Translocação com fusão dos genes PML em 15q22 e RARA em 17q12.
Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M3 (clássica e
variante hipogranular) da antiga classificação FAB. Actualmente todas as antigas LMAM3 estão associadas a esta alteração citogenética. Confere bom prognóstico. Alguns
casos são crípticos por citogenética clássica. Nos casos em que há suspeita da
translocação mas ela não é detectada por citogenética clássica a pesquisa é feita por
FISH.
LMA com t(9;11)(p22;q23); AF9-MLL
Translocação com fusão dos genes AF9 em 9p22 e MLL em 11q23. Está
presente em 9-12% das LMAs de crianças e 2% das LMAs de adultos. Está, sobretudo,
relacionada com as antigas LMA-M4 e LMA-M5 da classificação FAB, mas também
por vezes associada às antigas LMA-M1 e LMA-M2. Confere prognóstico intermédio.
O gene MLL pode fundir-se com inúmeros parceiros. As translocações que
envolvem o MLL mais frequentes dão-se com o gene AF9 já descrito (resultando
predominantemente em LMA) e com o gene AF4 (resultando sobretudo em LLA),
embora existam muitas outras. Um terço das translocações que envolvem o gene MLL
não são detectadas por Citogenética Clássica, tendo que ser identificadas por FISH.
Assim, sempre que se suspeita de uma LMA e a Citogenética Clássica não identifica
nenhuma alteração característica, recorre-se ao FISH, utilizando-se para isso uma sonda
dual color, break apart que flanqueia a região 11q23, onde se encontra o gene MLL.
LLA/Linfoma com t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1
Esta translocação é semelhante à que ocorre na LMC, não sendo as duas
situações distintas por citogenética clássica. Só a análise por RT-PCR confere a sua
distinção, por síntese de diferentes transcriptos. Neste caso, a presença da translocação
confere mau prognóstico.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
51 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
LLA/Linfoma com t(v;11q23); rearranjos do MLL
Tal como já referido, é possível que o gene MLL localizado em 11q23 se
recombine
com
inúmeros.
A
fusão
que
mais
frequentemente
conduz
ao
desenvolvimento de uma LLA dá-se entre o gene MLL e o gene AF4 em 4q21,
originando a t(4;11)(q21;q23). Confere mau prognóstico. Sempre que se suspeita desta
alteração, faz-se por FISH uma sonda dual color, break apart para o gene MLL em
11q23.
LLA/Linfoma com t(12;21)(p13;q22); TEL-AML1
Esta alteração é críptica por Citogenética Clássica, sendo necessário recorrer a
FISH para detectá-la, com uma sonda extra signal para esta translocação. Com esta
sonda é também possível observar a ploidia do cromossoma 21; assim, caso se verifique
hiperploidia deste cromossoma, realiza-se o painel hiperdiplóide para LLA’s
recorrendo a sondas alfa satélite para os cromossomas 4, 6, 10, 17, 18 e 21. É frequente
este tipo de translocação estar associado a triploidias dos cromossomas referidos.
LLA/Linfoma com t(1;19)(q23;p13.3); E2A-PBX1
Translocação que envolve os genes de fusão E2A em 1q23 e PBX1 em 19p13.3,
constituindo 6% dos casos de LLA-B em crianças. Associada a prognóstico
intermédio. Observável por Citogenética Clássica, não sendo pesquisada por FISH.
Leucemia Linfocítica Crónica B (LLC-B)
As alterações citogenéticas mais características são trissomia 12, del(11q2223), del(17p13), del(6q21) e del(13)(q14.3). Todas estas alterações são visíveis por
Citogenética Clássica, excepto a del(13)(q14.3). Contudo, sempre que se suspeita de
LLC faz-se o seguinte painel por FISH: trissomia 12, del(11)(q23), del(17)(p13) e
del(13)(q14.3). Para avaliar a trissomia 12 recorre-se a uma sonda alfa satélite. Para
avaliar a del(11)(q23), a del(17)(p13) e a del(13)(q14.3) utilizam-se sondas de
sequência única dirigidas a essas regiões.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
52 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Mieloma Múltiplo (MM)
A alteração mais frequentemente detectada envolve uma translocação em 14q32
(gene IgH) conferindo mau prognóstico – t(11;14)(q13;q32),
t(4;14)(p16.3;q32),
t(14;16)(q32;q23), t(6;14)(p21;q32) e t(14;20)(q32;q11).
Os MM que apresentam uma destas translocações geralmente são não
hiperdiplóides, estando associados a pior prognóstico. Os restantes geralmente são
hiperdiplóides, com ganhos frequentes nos cromossomas 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 ou 21, e
sobrevidas mais longas. Monossomia do cromossoma 13 é detectada em muitos casos,
conferindo mau prognóstico, bem como del(13)(q14) e a del(17)(p13), esta última
associada a progressão da doença.
A t(4;14)(p16.3;q32), a del(13)(q14) e a del(17)(p13) são crípticas por
Citogenética Clássica; a t(14;16)(q32;q23) é muito difícil de visualizar por esta técnica.
Assim, sempre que se desconfia desta patologia faz-se o seguinte painel por FISH:
del(13)(q14) e del(17)(p13) com sondas de sequência única para estas regiões. Recorrese também a uma sonda dual color, break apart para a região 14q32 e no caso desta
última dar como resultado a existência de uma translocação envolvendo o cromossoma
14,
pesquisam-se
as
translocações
t(11;14)(q13;q32),
t(4;14)(p16.3;q32)
e
t(14;16)(q32;q23) por sondas dual color, dual fusion. Para além disso, sempre que a
Citogenética Clássica revela um cariótipo hiperdiplóide, utiliza-se um kit para a
pesquisa de hiperploidia nos cromossomas 5, 9 e 15.
Linfoma Folicular
Este linfoma caracteriza-se por rearranjos no gene Bcl2 em 18q21, sobretudo
pela t(14;18)(q32;q21) (gene IgH), observável por Citogenética Clássica. Contudo,
sempre que há suspeita de um LNH Folicular, utiliza-se também por FISH uma sonda
dual color, dual fusion para a t(14;18)(q32;q21).
Linfoma do Manto
A alteração citogenética mais característica é a t(11;14)(q13;q32), estando
presente na maioria dos casos e sendo considerada a anomalia primária. Contudo, esta
alteração não é patognomónica da patologia, podendo aparecer noutras alterações
neoplásicas. Esta alteração é observável por Citogenética Clássica. No entanto, sempre
que há suspeita de um LNH do Manto, utiliza-se também por FISH uma sonda dual
color dual fusion para esta translocação.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
53 |
Genética Molecular Humana – Citogenética
Linfoma Difuso de Grandes Células B
Cerca de 30% dos casos apresentam anomalias em 3q27, envolvendo o gene
Bcl6, como a t(3;14)(q27;q32) (gene IgH em 14q32). Translocações envolvendo o gene
Bcl2 em 18q21, como a t(14;18)(q32;q21) característica também de linfoma folicular,
estão presentes em 20 a 30% dos casos. Estas duas translocações são observáveis por
Citogenética Clássica. Contudo, sempre que há suspeita deste LNH pesquisam-se
alterações envolvendo o gene Bcl6 em 3q27 com recurso a uma sonda dual color, break
apart, e pesquisa-se a t(14;18)(q32;q21) com recurso a uma sonda dual color, dual
fusion por FISH.
Linfoma de Burkitt
A maioria dos casos apresenta rearranjos do gene MYC em 8q24, originando a
t(8;14)(q24;q32) (gene IgH em 14q32) ou, mais raramente, a t(8;22)(q24;q11) (gene
IgL κ) ou a t(2;8)(p12;q24) (gene IgL loci), todas elas visíveis por Citogenética
Clássica. Sempre que se suspeita deste tipo de linfoma faz-se também por FISH a
pesquisa de alterações envolvendo o gene MYC em 8q24, utilizando-se uma sonda dual
color, break apart.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
54 |
5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia
Os estágios decorreram no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão
Pinto, SA, em Lisboa, na secção de Bioquímica Clínica, durante os meses de Julho e
Agosto, sob a orientação da Drª Margarida Baptista. Os estágios perfizeram um total de
344 horas (264 horas de Bioquímica Clínica e 80 horas de Endocrinologia).
No Laboratório Reymão Pinto a secção de Bioquímica Clínica compreende as
áreas de Bioquímica, Endocrinologia, Serologia, Imunologia e Alergologia. O
laboratório recebe, em média, 500 amostras por dia.
Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,
tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Bioquímica
Clínica I e II, Fisiopatologia, Imunologia, Virologia e Métodos Instrumentais de Análise
do Mestrado de Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de
2008 a trabalhar nesta secção do Laboratório.
A estagiária percorreu todas as fases do processo laboratorial - pré-analítica,
analítica e pós-analítica -, debruçou-se sobre os fundamentos de funcionamento e a
manutenção de todos os equipamentos, sobre os métodos bioquímicos que apoiam as
determinações analíticas e sobre a validação dos diferentes parâmetros analíticos.
Participou, ainda, nos programas de controlo de qualidade interno e externo.
5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados
5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche
Analisador especificamente adaptado para a quantificação de parâmetros
imunológicos (Módulos E) e bioquímicos (Módulos P e ISE) e. Aplica métodos de
medição
por
Potenciometria,
Espectrofotometria,
Imunoturbidimetria
e
Quimioluminescência.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
55 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
 Módulos E:
Parâmetro
Método
Amostra
Ac Anti-HAV Totais
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ac Anti-HAV IgM
Electroquimioluminescência (Captura)
Soro/Plasma
Ac Anti-HBe
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ac Anti-HBc
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ac Anti-HBs
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Ac Anti-HCV
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Ac Anti-Tiroglobulina (Anti-Tg)
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ac Anti-Peroxidase (Anti-TPO)
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ag HBe
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
AgHBs
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
CA 19-9
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
CA 125
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
CA 15-3
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
CEA
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Estradiol (E2)
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Ferritina
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Folato
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro
FSH
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
FT3
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
FT4
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
LH
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Prolactina (PRL)
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Progesterona
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
PSA Livre
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
PSA Total
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
T3
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
T4
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
Tiroglobulina (Tg)
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Electroquimioluminescência (Sandwich)
Soro/Plasma
Electroquimioluminescência (Competição)
Soro/Plasma
TSH
(hormona estimuladora da tiróide)
Vitamina B12
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
56 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
 Módulos P:
Parâmetros
Método
Amostra
Ácido Úrico
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma/Urina
Albumina
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma
Aldolase
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma
Amilase
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma
Aminotransferase Alanina (ALT)
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma
Aminotransferase Aspartato (AST)
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma
Ac. Anti-estreptolisina O (ASLO)
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
Bilirrubina Directa
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma
Bilirrubina Total
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma
Cálcio
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma Hep/Urina
Colesterol HDL
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma Hep.
Colesterol LDL
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma Hep.
Colesterol Total
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma
Creatina Cinase (CK)
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma
Creatinina
Espectrofotometria (M. Cinético)
Soro/Plasma/Urina
Desidrogenase Láctica (LDH)
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma
Factor Reumatóide
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
Ferro
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma Hep
Fosfatase Alcalina (ALP)
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma Hep.
Fósforo
Espectrofotometria (UV)
Soro/Plasma/Urina
Frutosamina
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma
Gama Glutamil Tranferase (GGT)
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma
Glucose
Espectrofotometria (M. Enzimático UV)
Soro/Plasma /Urina/LCR
IgA
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
IgG
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
IgM
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
Magnésio
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma /Urina
Microalbuminúria (MAU)
Imunoturbidimetria
Urina
Proteína C Reactiva (PCR)
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma
Proteínas Totais
Espectrofotometria (M. Colorimétrico)
Soro/Plasma
Proteínas Totais na urina e LCR
Imunoturbidimetria
Urina/LCR
Transferrina
Imunoturbidimetria
Soro/Plasma Hep.
Treponema Pallidum (TPLA)
Imunoturbidimetria
Soro
Trigliceridos (TG)
Espectrofotometria (M. Enzimático)
Soro/Plasma
Ureia
Espectrofotometria (M. Cinético UV)
Soro/Plasma /Urina
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57 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
 Módulo ISE:
Parâmetros
Método
Amostra
Ionograma (Sódio, Potássio e Cloro)
Pontenciometria Indirecta com Eléctrodos Selectivos
Soro
Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche
5.1.2. Cobas Integra 400 Plus, Roche
Sistema que permite consolidar todos os testes de bioquímica clínica – enzimas,
substractos, iões, drogas de abuso e terapêuticas e proteínas específicas – com rapidez e
facilidade. Integra quatro métodos diferentes: absorvância fotométrica para enzimas e
substractos; imunoturbidimetria para proteínas específicas; fluorescência polarizada
para drogas terapêuticas; potenciometria, com eléctrodo selectivo para iões.
Parâmetro
Método
Amostra
Ácido Valpróico
Fluorescência Polarizada
Soro
Alfa1-Antitripsina
Espectrofotometria
Soro
Apoliporoteína A
Imunoturbidimetria
Soro
Apoliporoteína B
Imunoturbidimetria
Soro
C3
Imunoturbidimetria
Soro
C4
Imunoturbidimetria
Soro
Carbamazepina
Fluorescência Polarizada
Soro
Digoxina
Fluorescência Polarizada
Soro
Enzima Conversão Angiotensina (ECA)
Espectrofotometria
Soro
Fenitoína
Fluorescência Polarizada
Soro
Hemoglobina A1C
Imunoturbidimetria
Sangue Total EDTA
Lipase
Espectofotometria
Soro
Lítio
Potenciometria
Soro
Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche
5.1.3. Hydrasys Sebia, Phadia
Permite processar de um modo semi-automático análises electroforéticas de
proteínas humanas no soro e urina.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
58 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
Técnica
Método
Amostra
Electroforese de zona em gel de agarose 8 g/L,
Electroforese das Proteínas
Soro
com tampão tris-barbital pH 9.2
Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia
5.1.4. Urisys 2004, Roche
É um fotómetro de reflectância totalmente automatizado, para medições semiquantitativas in vitro de tiras teste de urina.
Parâmetro
Método
Amostra
Densidade Específica
Refracção Fotométrica
Turvação
Transmitância Fotométrica
Cor
pH
Nitritos
Tiras
Proteínas
Urina
Glicose
Reflectância Fotométrica
Cetonas
Urobilinogénios
Bilirrubinas
Leucócitos
Eritrócitos
Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche
5.1.5. Immulite 2000, Amerlab
Equipamento
que
efectua
imunoensaios
por
quimioluminescência,
automatizando todo o procedimento.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
59 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
Parâmetro
Método
Amostra
ACTH
Plasma EDTA
Fetoproteína (AF)
Soro/Liquido Amniótico
Calcitonina
Soro/Plasma Hep.
Cortisol
Soro
Creatina Quinase-MB (CK-MB)
Soro/Plasma Hep.
Delta–4–Androstenediona
Soro
Estriol Livre
Soro
Fosfatase Ácida Prostática (PAP)
Soro
Globulina de transporte das hormonas sexuais (SHBG)
Soro
Gonadotropina Coriónica Humana (β – HCG)
Gonadotrofina Coriónica Humana Livre
Fotoquimioluminescência
(Sandwich)
(β – HCG livre)
Soro/Urina
Soro
Homocisteina
Plasma/Soro
Insulina
Soro/Plasma Hep.
Péptido C
Soro/Plasma Hep.
Proteína A do plasma associada à gravidez (PAPP–A)
Soro
PTH
Plasma EDTA /Soro
Somatomedina (IGF-1, Factor de Crescimento I da Insulina)
Soro/Plasma Hep.
Somatotrofina (hGH, Hormona do Crescimento Humano)
Soro
Sulfato de De-hidroepiandrosterona (DHEA-SO4)
Soro
Testosterona Total
Soro
Testosterona Livre
(Testosterona Total/SHBG)
x100
Soro
Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab
5.1.6. Vidas, bioMérieux
É um sistema multiparamétrico de imunoensaio cujo princípio de doseamento
associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com uma detecção final
em fluorescência (ELFA- Enzyme Linked Fluorescent Assay).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
60 |
Bioquímica Clínica e Endocrinologia
 Testes de Diagnóstico:
Parâmetro
Método
Amostra
β2–Microglobulina
Citomegalovirus IgG
Citomegalovirus IgM
Citomegalovirus IgG Avidez
Fotoquimioluminescência
Helicobacter pylori IgG
(Sandwich)
HIV Duo (I e II)
ELFA
Soro/Plasma
Mioglobina
NT-ProBNP
Toxoplasmose IgG Avidez
Troponina I
 Testes Confirmatórios:
Parâmetro
Método
Amostra
Ac Anti-HBc
Ag HBs
Fotoquimioluminescência
Rubéola IgG
(Sandwich)
Rubéola IgM
Soro/Plasma
ELFA
Toxoplasmose IgG
Toxoplasmose IgM
Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux
5.1.7. Vidia, bioMérieux
Equipamento
de
imunoensaio
que
utiliza
a
tecnologia
de
fotoquimioluminescência, recorrendo a diferentes métodos, todos baseados na
tecnologia ELISA. Para os parâmetros realizados no laboratório Reymão Pinto utiliza o
método da ELISA Indirecta na detecção de IgG’s e o método de Imuno-Captura na
detecção de IgM’s.
Parâmetro
Método
Amostra
Rubéola IgG
Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto)
Soro/Plasma
Rubéola IgM
Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura)
Soro/Plasma
Toxoplasmose IgG
Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto)
Soro
Toxoplasmose IgM
Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura)
Soro
Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
5.1.8. Serologia Manual
Parâmetro
Agente/Patologia
Reacção de Wuddleson / Reacção de
Método
Amostra
Aglutinação
Soro
Brucella abortus
Wright, BioSystems
Reacção de Rosa de Bengala, Weybridge
Brucella abortus
Células LE / LE Teste, Omega Diagnostics
Lúpus Eritematosos Sistémico (LES)
MonoTeste / Paul Bunnell, Innovacon
Mononucleosa Infecciosa
Reacção de Weil Félix, BioSystems
Proteus
Reacção de Widal, BioSystems
RPR / VDRL / Reacção de Wassermann,
Bio Rad
Cromatografia
Sangue total
Soro
Salmonella typhi e Salmonella
paratyphi
Soro/ Plasma/
Aglutinação
Treponema pallidum
Soro/Plasma
Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual
Todas as reacções serológicas, à excepção do teste para diagnóstico da
mononucleose infecciosa, têm como princípio reacções de aglutinação entre o antigénio
do reagente e os anticorpos da amostra.
5.2. Métodos Analíticos
5.2.1. Potenciometria
Potenciometria é a medida da diferença de potencial eléctrico entre dois
eléctrodos, numa célula electroquímica. Baseia-se na medição do potencial de um
eléctrodo indicador (eléctrodo constituído pelo elemento que se deseja determinar) em
relação a um eléctrodo de referência (eléctrodo para o qual o potencial eléctrico é, por
definição, igual a zero), quando não passa corrente através da solução em que estão
mergulhados. Este potencial depende das actividades das espécies que entram nas
reacções redox correspondentes, através da equação de Nernst.
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
5.2.2. Fotometria
A fotometria é um método de medição que consiste na determinação da
intensidade da luz absorvida pela amostra a um determinado comprimento de onda da
radiação incidente.
A absorvância varia linearmente com a concentração da amostra. A
determinação da concentração da amostra é feita por extrapolação gráfica, a partir da
absorvância lida pelo aparelho, com base na Lei de Lambert Beer.
Abs= K.[ ]. l
sendo, Abs, a absorvância calculada pelo aparelho
K, a constante de absortividade molar (valor tabelado)
l, a espessura do percurso óptico
[ ], a concentração que se pretende calcular
O Método Colorimétrico é o método que quantifica a intensidade da cor
formada por um composto. Trabalha-se, para isso na zona do visível, entre os 400 e os
800 nm.
Os métodos de determinação que envolvem enzimas incluem a determinação da
actividade enzimática a um tempo fixo (Método Enzimático) e a monitorização
contínua da actividade enzimático (Método Cinético). O Método Enzimático mede a
actividade de uma enzima baseado apenas nos pontos inicial e final da reacção. O
Método Cinético monitoriza a velocidade de aparecimento ou de desaparecimento de
um determinado composto, sendo mais preciso e sensível que o Método Enzimático.
5.2.3. Electroforese
Refere-se à migração de solutos ou partículas com carga, num meio líquido, sob
a influência de um campo eléctrico (mobilidade electroforética). Na electroforese de
zona a migração faz-se sobre um suporte sólido poroso, que poderá ser um gel de
agarose. As moléculas que possuam uma carga eléctrica em virtude da ionização
movem-se para o cátodo ou para o ânodo no sistema de electroforese, dependendo do
tipo de carga que apresentem; a migração dar-se-á para o pólo de sinal contrário à sua
carga. O tampão tem não só a função de conferir carga às partículas, como também a de
conduzir a corrente eléctrica. A mobilidade electroforética é inversamente proporcional
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
ao tamanho da molécula. O electroretrograma gerado é identificado por corantes
específicos e susceptível de ser quantificado.
5.2.4. Imunoturbidimetria
A turvação causa diminuição da intensidade de um feixe de luz quando este
passa através de uma solução de partículas. A turbidimetria é uma medida da
diminuição da intensidade da luz incidente causada pela dispersão, reflecção e absorção
do feixe de luz incidente de uma dada intensidade. A turvação é medida a 180º em
relação ao feixe incidente, o que significa que o detector está na mesma direcção que o
feixe de luz incidente (diferença em relação à nefelometria).
A Imunoturbidimetria é um método de medição da taxa de formação de
imunocomplexos Ag/Ac in vitro, com misturas mais concentradas de reagentes, de
forma a que os imunocomplexos tornem a solução suficientemente turva. Utiliza-se uma
quantidade constante e em excesso de anti-soro específico e, ao se adicionar a amostra
com Ag, vai-se medindo a formação progressiva de imuncomplexos numa célula
fotoeléctrica, na forma de densidade óptica.
5.2.5. Aglutinação
Os ensaios de aglutinação que pesquisam a presença de Ac dependem da
disponibilidade de uma partícula recoberta com o Ag apropriado (reagente). A partícula
pode consistir num eritrócito, exibindo os seus Ag naturais, ou numa partícula sintética
(por exemplo, uma partícula de látex) que é artificialmente recoberta com Ag. Na
presença do Ac específico no soro do doente, as partículas sofrem agregação. A
formação de agregados pode ser visualizada numa simples lâmina de vidro.
O processo pode ser invertido e utilizado para a detecção de Ag. Neste caso, a
partícula é coberta com Ac específicos.
5.2.6. Fluorescência Polarizada
O fenómeno de fluorescência corresponde à emissão de radiação sob a forma de
luz de um dado composto. Pressupõe, portanto, a prévia absorsão de radiação. Assim,
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
ao ser excitado, o composto fluorescente absorve radiação de uma determinada energia
e a um determinado c.d.o; ao passar ao estado fundamental liberta energia sob a forma
de radiação/luz/cor (fluorescência), sendo essa libertação menos energética que a
absorção de radiação prévia e, portanto, a radiação será emitida a um c.d.o. superior ao
c.d.o. da absorção.
Na fluorescência polarizada mede-se a mudança na despolarização de
fluorescência após reacções imunológicas. Se o relaxamento de um composto for mais
lento que o seu tempo de declínio de fluorescência (como é o caso de moléculas grandes
marcadas com fluoróforos), a fluorescência emitida será polarizada. As pequenas
moléculas têm tempos de relaxamento mais curtos que os seus tempos de declínio de
fluorescência. Como tal, a fluorescência emitida é despolarizada. Contudo, se essa
molécula for ligada a uma grande molécula ou se for colocada numa solução viscosa,
emitirá luz polarizada.
5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay)
Trata-se de ensaios imunoenzimáticos que funcionam por fixação de Ag ou Ac a
uma superfície sólida, como, por exemplo, um orifício de uma placa de microtitulação
ou uma partícula de plástico (esfera, cone, etc). A amostra é aplicada e os Ac ou os Ag
em pesquisa, vão-se ligar especificamente aos Ag ou Ac da superfície sólida,
respectivamente, durante um período de incubação. Segue-se uma lavagem da superfície
sólida para que o material não ligado seja retido do meio reaccional. O material ligado é
depois detectado por um segundo Ac marcado com uma enzima. O conjugado que não
estiver ligado é removido com uma segunda lavagem. A revelação final é feita por
acção posterior da enzima sobre um substrato, em que o produto da reacção origina cor
ou quimioluminescência. Os resultados são interpretados após leitura utilizando um
espectrofotómetro de absorvância (quando o produto da reacção é corado) ou de
emissão
(quando
o
produto
da
reacção
emite
radiação/fluorescência).
A
absorvância/fluorescência será proporcional à quantidade de Ag ou de Ac específico
presente na amostra testada.
Os testes de ELISA possuem muitas variações. Descrevem-se seguidamente as
mais utilizadas e aplicadas no laboratório Reymão Pinto.
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
5.2.7.1.ELISA para a detecção de Ag
ELISA Sandwich
Trata-se da versão mais comum de ELISA. Um Ac monoclonal é fixado à
superfície sólida. Adiciona-se posteriormente a amostra com os Ag em pesquisa,
incuba-se e lava-se. Junta-se depois ao meio reaccional um Ac secundário específico
para o Ag em pesquisa (que pode ser o mesmo que o Ac ligado à superfície sólida)
conjugado com a enzima. Finalmente, após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o
substrato sobre o qual a enzima ligada vai actuar, originando um produto corado ou
quimioluminescente.
ELISA de Competição
A amostra é incubada inicialmente com uma solução que contém Ac específicos
para o Ag em pesquisa. Seguidamente esta mistura é incubada com a superfície sólida
revestida com Ac. Os Ag da amostra que previamente se tiverem ligado ao Ac da
solução já não se irão ligar aos Ac da superfície sólida. Segue-se uma lavagem que irá
remover os complexos Ag/Ac em solução, não removendo, no entanto, os complexos
formados na superfície sólida. Um Ac secundário marcado enzimaticamente é depois
adicionado, indo ligar-se aos Ag da amostra fixados à superfície sólida. Finalmente,
após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o substrato sobre o qual a enzima ligada
vai actuar, originando um produto corado ou quimioluminescente. Assim, no ensaio
competitivo quanto maior a concentração de Ag na amostra inicial, menor será a
absorvância ou fluorescência lida.
5.2.7.2.ELISA para a detecção de Ac
ELISA Indirecta
É o método mais utilizado para a detecção de Ac. Consiste na sensibilização da
superfície sólida com um Ag específico para o Ac em pesquisa. Posteriormente
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Bioquímica Clínica e Endocrinologia
adiciona-se a amostra, indo os Ac presentes ligar-se especificamente aos Ag
imobilizados na superfície sólida e não serão removidos na lavagem. Seguidamente
adiciona-se o Ac secundário marcado enzimaticamente que apresenta especificidade de
ligação para o Ac em pesquisa (trata-se de um anti-Ac). Incuba-se, lava-se novamente e
adiciona-se por último o substrato sobre o qual a enzima vai actuar.
ELISA de Competição
Funciona como a Elisa de Competição para pesquisa de Ag, mas neste caso a
amostra é previamente incubada com uma solução com Ag específicos para os Ac em
pesquisa, sendo superfície sólida revestida com Ag.
ELISA de Captura de Ac
A superfície sólida é recoberta com anti-IgM ou anti-IgG, resultando na
captação de toda a IgM ou IgG do paciente, respectivamente. Seguidamente adiciona-se
ao meio reaccional uma solução com Ag específico na ligação aos Ac IgM ou IgG do
paciente. Segue-se a incubação, a lavagem e a adição de um Ac monoclonal secundário
enzimaticamente marcado específico para o Ag da solução.
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6. Microbiologia
O estágio decorreu:
- Na Maternidade Alfredo da Costa, no Serviço de Procriação Medicamente
Assistida, durante a segunda quinzena do mês de Outubro, sob a orientação da Drª Sónia
Correia. O estágio perfez um total de 80 horas.
- No Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, SA, em
Lisboa, na Secção de Microbiologia, durante os meses de Novembro e Dezembro de
2009 sob a orientação da Drª Margarida Baptista. O estágio perfez um total de 320
horas.
Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,
tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Microbiologia,
Parasitologia, Micologia e Anatomofisiologia (espermogramas) do Mestrado de
Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de 2007 a trabalhar
na secção de Microbiologia do Laboratório Dr. Manuel Reymão Pinto, SA.
A necessidade sentida por parte da estagiária em aperfeiçoar a técnica de
realização de espermogramas, feita, regra geral, com muito mais pormenor e com outros
critérios, sobretudo morfológicos, na área da Fertilização in Vitro, fê-la recorrer à
Maternidade Alfredo da Costa, especificamente com esse fim. Assim, os aspectos
descritos relacionados com a realização de espermogramas são os aplicados na
Maternidade.
O Laboratório Reymão Pinto, SA, recebe em média 150 amostras
microbiológicas diariamente.
Na Maternidade Alfredo da Costa analisam-se 8 espermogramas por dia.
Na área da Microbiologia o principal objectivo é fornecer informação relevante e
válida, que dê ao clínico ferramentas para o processo de diagnóstico de uma doença
infecciosa, o que significa detectar e identificar o agente causal, para que seja possível
estabelecer o diagnóstico e o tratamento adequado à infecção
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Microbiologia
6.1. Meios de Cultura
C.P.S. ID3: Meio cromogénico usado para o isolamento, identificação e contagem das
colónias das bactérias presentes na urina; E. coli (produtoras de ß-glucuronidase):
coloração vermelho escuro; Enterococcus (produtor de glucosidase): coloração
turquesa; Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) (exprimem ßGlucosidase): coloração verde a castanha esverdeada; Proteae (exprime desaminase):
coloração castanha.
COLUMBIA ANC + 5% DE SANGUE (CNA): Meio selectivo que permite o
desenvolvimento das bactérias Gram (+); a presença de sangue permite a expressão da
hemólise.
CHOCOLATE POLYVITEX (PVX): Meio selectivo para o isolamento do género
Neisseria, Haemophilus e Streptococcus pneumoniae.
CHOCOLATE POLYVITEX + VCAT: Meio selectivo para o isolamento da
Neisseria gonorrhoeae.
CHOCOLATE HAEMOPHILUS: Meio selectivo para o isolamento do género
Haemophilus.
MacCONKEY: Meio selectivo para o isolamento das bactérias Gram negativas; tendo
cristal de violeta, permite evidenciar a fermentação de lactose pela viragem do vermelho
neutro; os microorganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas ou
vermelhas; os outros originam colónias incolores ou ligeiramente beges.
CHAPMAN (Manitol Salgado): Meio selectivo para o isolamento do Staphilococcus
aureus.
GELOSE SS: Meio selectivo para o isolamento do género Salmonella e Shigella;
SM ID 2 (SM2): Meio selectivo cromogéneo para identificação de Salmonelas que
aparecem com coloração rosa pálido a roxo.
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Microbiologia
CALDO de TODD – HEWITT: Meio de enriquecimento para Streptococcus spp. Os
antibióticos presentes inibem a maioria dos microorganismos Gram (-).
LOWENSTEIN – JENSEN: Meio selectivo em tubo, para o isolamento do género
Mycobacterium;
ALBICANS ID 2 (CAN2): Meio selectivo, cromogéneo, para isolamento dos fungos e
identificação imediata da Candida albicans (colónias azuis); as restantes colónias do
género Candida são pigmentadas de rosa.
6.2. Condições de Incubação das Sementeiras
Estão disponíveis comercialmente geradores que permitem obter as diferentes
atmosferas necessárias para a cultura de microrganismos patogénicos em laboratório:
CO2, microaerofília e anaerobiose.
A temperatura óptima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos
ronda os 35-37ºC; alguns, contudo, podem desenvolver-se a temperaturas mais baixas,
como a Listeria spp. (4ºC), e outros a temperaturas mais elevadas, como o
Campylobacter spp. (42ºC).
A maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma
humidade igual ou superior a 70%. Para manter a humidade numa estufa pode colocarse um recipiente com água no seu interior.
6.3. Equipamentos
6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux
Utilizam-se as seguintes cartas de identificação:

Cartas de Identificação de Gram-Negativos (GN);

Cartas de antibiograma Gram-Negativos (AST-N020);

Cartas de identificação Gram-Positivos (GP);
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Microbiologia

Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P534), para analisar a
sensibilidade aos antibióticos dos estreptococos dos grupos B e
enterococos;

Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P536), para analisar a
sensibilidade aos antibióticos dos estafilococos;

Cartas de identificação bioquímica das Leveduras (YST).
6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos
6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux
Utilizada para a identificação de Neisseria, Haemophylus e Moraxella
catarralis. Permite fazer a fenotipagem do Haemophylus influenza e do Haemophylus
parainfluenza, bem como detectar a presença da penicillinase.
6.4.2. Coloração de Gram
De acordo com as diferenças estruturais da parede celular, existem bactérias que
retêm o complexo cristal de violeta - Iodo, após descoloração com uma mistura de
Álcool - Éter, ficando com uma cor púrpura (Gram-Positivas), enquanto que outras
não o retêm ficando com a coloração dada pelo corante de contraste utilizado, vermelho
(Gram-Negativas).
6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de
Kinyoun modif. ou de Tan - Thiam - Hok)
O método baseia-se na capacidade de alguns microrganismos, designadamente o
género Mycobacterium e algumas espécies do género Nocardia (N. asteroides, N.
brasiliensis e N. caviae), em virtude das composição da sua parede celular em ácidos
micólicos, em reterem a Fucsina básica fenicada. Esta não é removida pela acção de
uma mistura descorante, constituída por Etanol e um Ácido mineral forte. Assim, os
bacilos álcool-ácido-resistentes coram de vermelho sobre um fundo azul, dado pelo
corante de contraste (solução aquosa de azul de metileno).
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Microbiologia
6.4.4. Teste da Catalase
A catalase desdobra o peróxido de hidrogénio (3%) em água e oxigénio. O teste
é positivo se se observar a formação de bolhas oxigénio.
6.4.5. Prova da Coagulase
A coagulase é uma enzima termoestável produzida principalmente pelas estirpes
de S. aureus, servindo a prova para identificar esta espécie. A prova é positiva no caso
de se observar a existência de coagulação.
6.4.6. SLIDEX Strepto Plus
Este teste identifica o grupo a que a estirpe de Streptococcus pertence.
6.4.7. Teste do Tubo Germinal
Prova da filamentação para identificação de Candida albicans.
6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China
Permite a visualização de espiroquetas e das cápsulas de Cryptococcus
neoformans.
6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos
Biológicos:
6.5.1. Urina Asséptica
Enterobacteriaceae; Enterococcus; Pseudomonas sp.; Acinetobacter sp.;
Staphylococcus aureus, S. saprophyticus, Mycobacterium sp. e Candida albicans.
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72 |
Microbiologia
6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal
Trichomonas vaginalis; Gardnerella vaginalis (só vaginal); Candida albicans;
Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus do Grupo-B de Lancefield (só vaginal em
grávidas). Outros microorganismos patogénicos são Treponema pallidum sp.,
Haemophilus ducrey e Calymatobacterium granulomatis.
6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo
Streptococcus - hemolíticos. Quando solicitado ou em cultura abundante
valorizar também
Streptococcus
pneumoniae;
Haemophilus
influenzae
e
H.
parainfluenzae; Staphylococcus aureus; Corynebacterium diphtheriae; Neisseria
meningitidis; Bordetella pertussis.
6.5.4. Expectoração
Streptococcus pneumoniae; H. influenzae e H. parainfluenzae; Mycobacterium
sp.; apenas nos bronquíticos crónicos e/ou quando é isolada em cultura predominante ou
pura Nocardia sp. e Branhamella catarrhalis.
6.5.5. Fezes
Salmonella sp. (S. typhi; S. cholerasuis; S. enteritidis); Shigella sp.;
Campylobacter fetus spp. jejuni; Yersinia enterocolitica.
6.5.6. Hemoculturas
Streptococcus - hemolítico (se for S. pneumoniae, houver endocardite ou se
voltar a ser isolado numa segunda hemocultura); Staphylococcus epidermidis (se houver
material de prótese implantado no doente).
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73 |
Microbiologia
No Anexo 3 encontra-se um resumo da selecção de agentes anti-microbianos
feita para os diferentes microorganismos na secção de Microbiologia do Laboratório
Reymão Pinto, SA.
6.6. Espermogramas
6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial
- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora
após a colheita;
- Entre a colheita e a análise o esperma poderá ficar à temperatura ambiente
(preferencialmente) ou na estufa a 37º (diminui mais a motilidade);
- Homogeneizar gentilmente o esperma no recipiente original; não vortexar e,
em caso de se utilizar uma pipeta, optar pelas de grande calibre;
6.6.1.1.Liquefacção e Viscosidade
- Uma amostra normal liquefaz no máximo em 60 minutos; caso o esperma
forme um fio com mais de 2 cm considerar “liquefacção incompleta” e “aumento da
viscosidade”;
- O aumento da viscosidade poderá estar associado a diminuição da motilidade
ou da concentração de espermatozóides e poderá dever-se a:
 Presença de auto-Ac;
 Infecção do tracto reprodutor masculino;
 Disfunção prostática (o líquido prostático é responsável pela liquefacção
espermática);
- Em caso de liquefacção incompleta/aumento da viscosidade deverá proceder-se
gentilmente a liquefacção mecânica (com uma seringa e agulha) ou adicionar-se ao
esperma uma enzima digestiva.
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74 |
Microbiologia
6.6.1.2.Aparência
- Aparência normal: opalescente;
- Aparência anormal:
 Transparente: baixa concentração espermática;
 Esbranquiçado: presença de leucócitos;
 Avermelhado: presença de eritrócitos;
 Amarelado: icterícia ou toma de vitaminas.
6.6.1.3.Volume
- Medido por pipeta de vidro elevado calibre (o plástico interfere com a
motilidade espermática);
- 2 mL < Valores de Referência < 5,0 mL.
6.6.1.4.pH
- Medido com papel indicador, ao fim de 30 segundos;
- 7.2 < pH Valores de Referência < 8.3;
- pH baixo é sugestivo défice de liquido das vesículas seminais (confere pH
alcalino); pH elevado é sugestivo de défice de líquido prostático (confere pH ácido).
6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial
- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora
após a colheita;
- Realizada preferencialmente num microscópio de contraste de fase;
6.6.2.1.Estimativa da Concentração Espermática
- Preparação a fresco;
- Serve para decidir a diluição que será feita, a fim de determinar posteriormente
a concentração espermática;
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75 |
Microbiologia
Nº de spz por campo de 40x
Diluição
1-2
-
3 - 15
1:5
15 – 40
1:10
40 – 200
1:20
> 200
1:50
Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática.
Amostras com 1 – 2 spz / campo deverão ser centrifugadas (600 RPM; 15
minutos), rejeitando-se o sobrenadante, a fim de se avaliar posteriormente a motilidade
e morfologia; a concentração será dada como < 2x10^6;
- Amostras sem espermatozóides deverão ser centrifugadas (3000 RPM; 15
minutos), rejeitando-se o sobrenadante; só se considera que a amostra é azoospérmica se
em todo o sedimento obtido não se visualizar nenhum espermatozóide; se se
visualizarem espermatozóides a concentração será dada como < 1x10^6;
- Para ejaculados sem espermatozóides deverão fazer-se os seguintes testes
subsequentes:
 Teste da Frutose (fornece energia aos espermatozóides, entrando no
conteúdo das vesículas seminais);
 Exame de esperma numa urina após masturbação (possível ejaculação
retrógrada).
6.6.2.2.Motilidade
- Preparação a fresco de duas lâminas;
- Avaliar, no mínimo, 5 campos por lâmina;
- Classificação dos espermatozóides (dar valor percentual):
 (a) Motilidade progressiva rápida (≥ 4 cabeças/segundo);
 (b) Motilidade progressiva lenta;
 (c) In situ;
 (d) Imóveis (se >50% deve fazer-se o teste da vitalidade).
- Valores de Referência:
 a + b > 50% ou
 a > 25%
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Microbiologia
6.6.2.3.Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides
- Poderão estar presentes:
 Células Epiteliais;
 Eritrócitos (hematospermia);
 Leucócitos (leucocitospermia para > 5 leucócitos/campo);
 Células Germinativas Imaturas;
 Cristais;
 Microorganismos:
o Gardnerella vaginalis;
o Leptotrix vaginalis;
o Trichomonas vaginalis;
o Candida albicans;
o Sarcoptes scabiei;
o Pthirus púbis.
6.6.2.4.Agregação e Aglutinação
- Agregação: aderência de espermatozóides imóveis entre si ou de
espermatozóides móveis a outras células que não espermatozóides;
- Aglutinação:
 Aderência de espermatozóides móveis entre si, agarrados cabeça a
cabeça, cauda a cauda ou uma mistura das duas aparências;
 Poderá indicar a presença de:
- Infecção, geralmente associada a leucocitospermia;
- Auto-Ac anti-espermatozóides, devendo fazer-se o teste da
sua presença.
6.6.2.5.Concentração Espermática
- Efectuar a diluição pré-determinada numa solução feita com:
 Formol 5 mL;
 Azul de Metileno 2,25 mL;
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Microbiologia
 NaCl 0,9% 42,75 mL.
- Agitar mediante vórtex a mistura durante pelo menos 15 segundos;
- Encher a Câmara de Neubauer (em cima e em baixo) com a diluição preparada
e aguardar 5 minutos para que a amostra sedimente;
- Contar os espermatozóides inteiros e as cabeças em:
 Todos os quadrados, se existirem menos de 10 espermatozóides por
quadrado;
 Dez quadrados, se existirem 10 a 40 espermatozóides por quadrado;
 Cinco quadrados, se existirem mais de 40 espermatozóides por quadrado.
- No mínimo deverão contar-se 200 espermatozóides em cada uma das duas
contagens; se as duas contagens derem valores muito diferentes, deverá fazer-se uma
nova diluição e contagem;
- Por cada quadrado, contar os espermatozóides que apenas se encontrem em
cima de duas linhas;
- Cálculo da Concentração Espermática (nº de spz/mL):
Nº espermatozóides contados x Nº de quadrados contados x Factor de Diluição x 1000
Nº de quadrados totais da Câmara de Neubauer
NOTA: 1000 tem em conta a espessura da Câmara de Neubauer.
- Valores de Referência:
 Concentração Espermática: ≥ 20x10^6 spz/mL;
 Número total de Espermatozóides: ≥ 40x10^6 por ejaculado
(concentração x volume ejaculado).
6.6.2.6.Morfologia
- Poderá ser feita directamente a partir da Câmara de Neubauer, embora se
prefira o recurso a uma técnica de coloração, como o Papanicolaou;
- Valor de referência: >15% de espermatozóides normais.
- Contar 200 espermatozóides com a objectiva de imersão de 100x, anotando os
espermatozóides:
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78 |
Microbiologia
 Normais:
- Cabeça com comprimento 4-5 μm e largura 2,5-3,5 μm
(usar micrómetro), com relação comprimento/largura de 1,5 a
1,75;
- O acrossoma (contém enzimas que ajudam os spz a
penetrar na zona pelúcida dos óvulos) compreende 40 a 70% da
cabeça; a região pós-acrossómica contém o núcleo dos spz;
- Vacúolos ocupam menos de 20% do tamanho da cabeça;
-
Gotas
citoplasmáticas
(resíduos
da
maturação
espermática; alteração da maturação final no epidídimo) ocupam
menos de 1/2 do tamanho da cabeça;
- Cauda 1,5 vezes maior que a cabeça, não enroladas e
mais fina que a peça intermédia.
 Com anomalia da cabeça:
- Alteração do tamanho (macrocéfalos, microcéfalos);
- Alteração da forma (piriforme, redonda, amorfo/forma
anormal);
- Com vacuolização que ocupe mais de 20% da cabeça;
- Acrossoma que ocupa menos de 40% da cabeça;
- Cabeças duplas;
- Pinhead (caudas sem cabeça; não contar; só referir se
forem muitos).
 Com anomalia da peça intermédia:
- Peça intermédia forma um ângulo de 90º com a cauda;
- Inserção assimétrica na cabeça;
- Partida (a cabeça descai);
- Estreita, grossa ou Irregular.
 Com a anomalia da cauda:
- Curta;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
79 |
Microbiologia
- Múltipla;
- Partida,
- Enrolada;
- Gota citoplasmática que ocupa mais de 1/2 da cabeça.
 Com anomalia mista (associação de 2 ou mais defeitos em zonas
diferentes);
6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar
6.6.3.1.Teste da Vitalidade
- Deve executar-se se a percentagem de espermatozóides imóveis exceder os
50%;
- Reflecte a percentagem de espermatozóides vivos;
- Devem contar-se 200 espermatozóides;
- Valor de Referência: ≥ 50% espermatozóides vivos.
- Técnicas existentes utilizadas:

Teste da Eosina-Nigrosina:
- Misturar eosina, nigrosina e sémen; observar uma gota do preparado
ao microscópio;
- Os espermatozóides mortos (membrana rota) irão incorporar a eosina,
aparecendo vermelhos;
os
espermatozóides vivos
manter-se-ão
incolores; a nigrosina origina um fundo escuro que facilita a
visualização da lâmina;

Teste da Hipo-Osmolaridade (HOS):
- Mistura uma solução hipo-osmótica e sémen; observar uma gota do
preparado ao microscópio;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
80 |
Microbiologia
- Os espermatozóides mortos não irão sofrer transformação; os
espermatozóides vivos, por estarem numa solução hipo-osmótica irão
entumescer e, consequentemente, enrolar a cauda;
6.6.3.2.Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides
- Deverá ser feito sempre que se observe aglutinação entre espermatozóides
(móveis);
- Avalia a produção de IgA e IgG contra os espermatozóides do próprio;
- Os espermatozóides são antigénicos; geralmente existe uma barreira que evita
o seu contacto com o sangue; quando esta barreira se rompe (traumatismo,
infecção ou vasectomia) os linfócitos B entram em contacto com o sémen, o que
leva à produção de Auto-Ac. anti-espermatozóides;
- Contagem de 200 espermatozóides;
- Técnica efectuada:

MAR Teste (Mixed Antiglobulin Reaction test):
- Misturar sémen e partículas de látex com Ig (IgA ou IgG); depois
adicionar o anti-soro anti-Ig (A ou G); ver ao microscópio 3 a 10
minutos depois;
- A presença de aglutinados entre espermatozóides e as partículas de
látex indica a presença de auto-Ac anti-Ig (A ou G);
- Valor de Referência: < 50% dos spz sem partículas de látex aderidas.
6.6.3.3.Testes Opcionais – Testes Bioquímicos
- Devem ser executados no líquido seminal desprovido de espermatozóides;

Para a próstata:
o Zinco:
- Valor de Referência ≥ 2,4 μmol/ejaculado;

Para as vesículas seminais:
o Fructose:
- Valor de Referência ≥ 13 μmol/ejaculado;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
81 |
Microbiologia

Para o epidídimo:
o α-glucosidase neutra;
- Valor de Referência ≥ 20 um/ejaculado;
6.6.4. Nomenclatura
NORMOZOOSPERMIA
Ejaculado normal definido pelos vários Valores de Referência.
ASPERMIA
Ausência de ejaculado.
HIPOSPERMIA
Volume de esperma abaixo dos Valores de Referência.
HIPERESPERMIA
Volume de esperma acima dos Valores de Referência.
AZOOSPERMIA
Ausência de espermatozóides no ejaculado.
POLIZOOSPERMIA
Concentração espermática > 250x10^6 spz/mL.
OLIGOZOOSPERMIA
Concentração espermática < 20x10^6 spz/mL.
OLIGOZOOSPERMIA GRAVE
Concentração espermática < 5x10^6 spz/mL.
ASTENOZOOSPERMIA
Motilidade abaixo dos Valores de Referência.
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82 |
Microbiologia
TERATOZOOSPERMIA
Morfologia abaixo do Valor de Referência.
OLIGOASTENOTERATOZOOSPERMIA (OTA)
Combinação das 3 definições anteriores.
NECROZOOSPERMIA
Vitalidade abaixo do Valor de Referência.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
83 |
7. Controlo de Qualidade
O processo de controlo da qualidade tem por objectivo prever os problemas que
possam alterar a estabilidade das amostras e dos reagentes e verificar o estado de bom
funcionamento dos sistemas analíticos, de forma a assegurar que os resultados obtidos
cumprem os requisitos de qualidade exigidos, para que tenham utilidade clínica.
O controlo da qualidade dos resultados inicia-se na fase pré-analítica com a
correcta preparação do doente, colheita das amostras biológicas, seu transporte e
conservação. Passa pela fase analítica através dos procedimentos de manutenção dos
equipamentos, controlo e calibração dos sistemas analíticos, avaliação dos métodos
utilizados, correlação entre dados clínicos e laboratoriais e ensaios inter-laboratoriais.
Engloba também a fase pós-analítica com uma adequada validação dos resultados.
7.1. Controlo de Qualidade Interno
O objectivo do controlo de qualidade interno é garantir a fiabilidade e
reprodutibilidade dos resultados diários do laboratório e indicar a possível necessidade
de efectuar acções correctivas em situações de não conformidade, de forma a permitir
que os resultados obtidos cumpram os requisitos de qualidade exigidos.
Para além do treino prévio do pessoal envolvido, compreende essencialmente
duas fases operacionais: o controlo interno e a calibração.
Para controlo interno recorre-se a um material de controlo, que é um produto
biológico com valores conhecidos usado na verificação do desempenho das técnicas,
reagentes e equipamentos usados para o diagnóstico analítico. O controlo interno é
efectuado diariamente de forma a garantir a qualidade dos resultados. É executado e
avaliado antes de se processarem as amostras e, periodicamente, no decorrer da fase
analítica. Os resultados são registados num gráfico e comparados com os Limites
Aceitáveis de Erro (média ± 2 desvios padrões), apenas sendo validado se os resultados
se encontrarem dentro do intervalo de confiança.
Quando um determinado parâmetro analítico está fora do controlo realiza-se
uma calibração e os resultados do controlo de qualidade desse analito são novamente
processados e analisados.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
84 |
Controlo de Qualidade
A calibração dos parâmetros analíticos consiste num conjunto de operações que
estabelecem, em condições especificadas, a relação entre valores de grandeza indicados
por um instrumento de medição ou um material de referência e os correspondentes
valores obtidos através de padrões. Para tal recorre-se a um calibrador - um material de
referência de composição qualitativa ou quantitativa bem definidas, adequado para o
analito a analisar, adaptado ao método utilizado e aferido por padrões de referência.
A partir desta fase, o equipamento encontra-se pronto para processar as
amostras.
Para todos os aparelhos bioquímicos e hematológicos das instituições onde a
estagiária passou efectou-se no mínimo um nível de controlo interno diariamente antes
do início do trabalho e outro a meio do trabalho.
Para cada reacção de PCR realizada no Laboratório de Genética Molecular do
IPO Porto, utiliza-se um controlo negativo (água de PCR) e um controlo positivo.
Para cada série de lâminas de imunofluorescência utiliza-se um controlo interno
positivo e outro negativo no Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral.
Na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto, SA, utiliza-se um
controlo interno sempre que se executam os testes da catalase e coagulase.
Semanalmente utiliza-se um controlo interno para testar as colorações utilizadas. Para
verificar a validade do procedimento de determinação de Urinas Assépticas utilizam-se
semanalmente cartas de estirpe padrão para Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Escherichia coli (ATCC25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853).
7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ)
A Avaliação Externa de Qualidade é efectuada mediante a realização de ensaios
inter-laboratoriais, permitindo a cada laboratório avaliar a exactidão dos seus resultados.
O Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil participa em
ensaios inter-laboratorias a nível nacional com o INSA (Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge)1 e a nível internacional com o UK-NEQAS3 (United Kingdom National
External Quality Assessment Service).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
85 |
Controlo de Qualidade
O Laboratório Reymão Pinto participa em ensaios inter-laboratorias a nível
nacional com o INSA e a nível internacional com o RIQAS (Randox International
Quality Assessment Sample), com o UK-NEQAS e com o Quality Club da Phadia.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
86 |
ParteII
Auto-Imunidade
Metodologias Laboratoriais para
Diagnóstico e Seguimento
Terapêutico
Hospital Curry Cabral,
Serviço de Nefrologia
Laboratório de Imunologia
Orientadora Drª Maria do Céu Santos
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
87 |
Auto-Imunidade
1.
Sistema Imunológico e Auto-Imunidade
A resposta imunológica é uma sequência complexa e regulada de eventos,
envolvendo vários tipos de células, que permite a eliminação de agentes invasores
estranhos ao organismo. Inicia-se quando um antigénio penetra no organismo e entra
em contacto com células apresentadoras de antigénio (APC); estas células possuem na
sua superfície antigénios leucocitários humanos (HLA II) e exibem a capacidade de se
ligar (através dos HLA II superficiais) e processar o antigénio exógeno de forma a que
este possa ser depois reconhecido por linfócitos T Auxiliares CD4 antigénioespecíficos. Estes linfócitos tornam-se activos e, por sua vez, promovem a activação de
outras classes de linfócitos, como os linfócitos T Citotóxicos CD8 e os linfócitos B.
Seguidamente, estes linfócitos activados executam as suas funções efectoras específicas
que, na maioria dos casos, eliminam com sucesso o antigénio. Os linfócitos T
Citotóxicos produzem enzimas (perforina e granzimas) que conduzem à morte por lise
de células do hospedeiro infectadas intracelularmente com o antigénio. Os linfócitos B,
por seu turno, produzem anticorpos, conduzindo à formação de imunocomplexos
(conjunto antigénio-anticorpo); os imunocomplexos formados neutralizam o antigénio
ou conduzem à activação do sistema do complemento ou à fagocitose do antigénio
(ADCC – Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos); em qualquer um dos três
casos, o resultado é sempre a inactivação/destruição do agente invasor. Em cada etapa
deste processo as células imunológicas comunicam entre si por contacto directo ou
através da produção de citocinas reguladoras. Todas as respostas são fisiologicamente
controladas com precisão e normalmente terminam após a eliminação do antigénio
estimulador.
Os HLA II exibidos na superfície das células APC de diferentes indivíduos são
ligeiramente diferentes, variando em alguns aminoácidos da sua estrutura. Estas
pequenas variações determinam que diferentes indivíduos respondam de forma desigual
quando expostos ao mesmo antigénio. Justificam, assim, a maior propensão que certos
indivíduos apresentam para resistir a determinados antigénios ou, pelo contrário, para
desenvolver certo tipo de patologias.
Cada anticorpo (imunoglobulina) produzido pelos linfócitos B é constituído por
duas cadeias leves iguais entre si (κ ou λ) e duas cadeias pesadas iguais entre si (γ, μ, ε,
α ou δ). Consoante o tipo de cadeias pesadas que constitui o anticorpo, assim a sua
classe: γ para IgG (os anticorpos mais abundantes), μ para IgM (os primeiros anticorpos
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
88 |
Auto-Imunidade
a serem produzidos durante a resposta imunológica), ε para IgE (os anticorpos
especialmente produzidos durante reacções alérgicas), α para IgA (os principais
anticorpos produzidos nas mucosas do organismo) e δ para IgD (sem grande função
reconhecida). A porção Fc do anticorpo determina as suas propriedades físicas e
biológicas, sendo igual para anticorpos da mesma classe; a porção Fab é aquela que se
liga, de forma específica, ao antigénio invasor. Designa-se por epítopo o grupo de
resíduos de aminoácidos do antigénio que se liga ao anticorpo e contra o qual a resposta
imunológica é dirigida.
Figura 25 – Estrutura dos anticorpos (imunoglobulinas). A verde representa-se as duas cadeias
pesadas e a azul as duas cadeias leves, unidas por pontes dissulfureto. A fracção Fab é a zona de ligação
ao antigénio. As regiões hipervariáveis da região Fab são as responsáveis pela maior especificidade na
ligação antigénio-anticorpo.
Toda a referida resposta imunológica é específica. Isto é, o sistema imunológico
tem a capacidade de detectar diferenças subtis entre inúmeros antigénios, respondendo a
cada um deles de forma individualizada e única; consoante o antigénio invasor, será
diferente a sua ligação ao HLA II das células APC, a sua ligação (depois de processado)
ao receptor TCR dos linfócitos T e a sua ligação ao anticorpo (tem de existir
complementaridade antigénio-anticorpo para que haja ligação). Por este motivo, o
sistema imunológico tem a capacidade de discriminar entre o próprio (“self”) e o não
próprio, de modo que em condições normais responde de forma vigoroso a antigénios
que lhe são estranhos, mas coexiste pacificamente com proteínas que compõem o
hospedeiro.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
89 |
Auto-Imunidade
As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imunológica
exagerada contra os antigénios do próprio indivíduo (perda do “self”), com consequente
formação excessiva de auto-anticorpos (anticorpos dirigidos contra antigénios
próprios), sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou antigénio tumoral.
Felizmente a prevalência destas doenças é baixa, sendo apenas de cerca de 5%.
O reconhecimento de auto-antigénios dentro de certos limites é fisiológico e até
essencial para o desenvolvimento de respostas imunes efectivas. Naturalmente
reconhece-se a presença de anticorpos circulantes que reconhecem auto-antigénios;
estes anticorpos designam-se por “auto-anticorpos naturais” e são geralmente IgG,
embora também possam ser IgA ou IgM.. Parecem ser essenciais para a manutenção da
vida (papel fisiológico da Autoimunidade controlada), uma vez que:
- Efectuam a clearance dos corpos apoptóticos que resultam da apoptose e dos
imunocomplexos formados;
- São importantes na vigilância imunológica de células cancerígenas;
- Desencadeiam uma resposta imune rápida, por reagirem rapidamente com
agentes patogénicos que exprimem epítopos semelhantes aos auto-antigénios (reacção
cruzada);
- Criam circuitos reguladores que evitam a Autoimunidade patogénica/excessiva
(como se explica, mais a diante).
Mas como é que surgem estes auto-anticorpos naturais?
Em circunstâncias normais, logo a nível dos órgãos linfóides primários, de entre
todos os linfócitos produzidos pelo organismo, são apenas seleccionados os que
apresentam receptores (BCR no caso dos linfócitos B e TCR no caso dos linfócitos T)
com afinidade média para os auto-antigénios. Assim, no timo, os linfócitos T com TCR
que confere:
- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, não
existe transmissão de sinal; este linfóctito T sem nenhuma reactividade ao “self” sofre
morte intra-tímica;
- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é
induzida uma força de sinalização excessivamente forte que conduz a um sinal
apoptótico; o linfócito T também sofre morte intra-tímica (Selecção Negativa);
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
90 |
Auto-Imunidade
- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é
induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); são estes linfócitos T com alguma
afinidade para auto-antigénios que sofrem uma consequente maturação intra-tímica,
saindo depois para o sangue periférico.
Os linfócitos B, na medula óssea, com BCR que confere:
- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, não
existe transmissão de sinal; estes linfócitos B sem nenhuma reactividade ao “self”
sofrem morte intra-medular;
- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, sofrem
edição do receptor BCR (rearranjo genético do BCR que conduz à substituição de uma
fracção da porção Fab). Se a edição do receptor falhar, os linfócitos B também sofrem
morte intra-medular (Selecção Negativa). Se o rearranjo for bem sucedido, é induzido
um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma afinidade para
auto-antigénios sofrem consequente maturação intra-medular, saindo depois para o
sangue periférico;
- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, é
induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma
afinidade para auto-antigénios também sofrem uma consequente maturação intramedualr, saindo depois para o sangue periférico.
Como nem todos os auto-antigénios são apresentados aos linfócitos no timo e
medula óssea, verifica-se a presença de linfócitos auto-reactivos no sangue periférico
que são depois sujeitos a uma Selecção Negativa nos órgãos linfóides secundários, a
nível dos quais os linfócitos que apresentam reactividade aos auto-antigénios aí
existentes também são eliminados (Tolerância Periférica).
Isto é, em circunstâncias normais, dentro dos precursores dos linfócitos T e B,
sobrevivem apenas os que reconhecem, dentro de certos limites, auto-antigénios.
Contudo, dois processos podem contribuir para a alteração dos fenómenos
imunológicos, conduzindo a um super-reconhecimento de auto-antigénios, surgindo
assim as DAI:
1- Disfunção do Sistema Imunitário (deficiência nos mecanismos de regulação
dos processos imunitários):
Normalmente os linfócitos B e T auto-reactivos existem mas estão inactivos em
circulação por estarem directamente ligados a certas citocinas ou ligados a linfócitos T
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
91 |
Auto-Imunidade
Reguladores; estas ligações directas conduzem à tradução de sinais inibitórios que
impedem a activação dos linfócitos auto-reactivos. Assim, distúrbios nas citocinas ou
falência na supressão podem conduzir à activação dos linfócitos auto-reactivos,
induzindo a uma Autoimunidade excessiva e patológica.
2- Reacções cruzadas por semelhança nos epítopos dos auto-antigénios e dos
antigénios estranhos:
As reacções cruzadas podem ocorrer por dois motivos:
- O antigénio estranho induz alterações celulares nos auto-antigénios que fazem
com que os linfócitos deixam de os reconhecer como próprios;
- O antigénio estranho mimetiza os auto-antigénios, estimulando directamente os
linfócitos auto-reactivos por ser molecularmente semelhante aos auto-antigénios.
A etiologia das DAI é geralmente multi-factorial, onde factores extrínsecos e
intrínsecos contribuem para a patogénese e progressão da patologia:
1. Factores Extrínsecos:
- Infecções (promovem alterações celulares);
- Tabaco;
- Drogas;
- Radiação UV;
- Metais pesados;
- Produtos químicos.
2. Factores Intrínsecos:
- Idade;
- Factores hormonais (embora a progesterona seja imunossupressora, os
estrogénios e a prolactina potenciam a resposta imunológica; daí que as DAI sejam,
regra geral, mais frequentes nas mulheres);
- Deficiências na via do Complemento (défice no C1q e C4 impedem a remoção
eficiente dos corpos apoptóticos) e nas células reguladoras (Imunodeficiência);
- Factores Genéticos (Predisposição Genética):
o Sistema HLA (a expressão de haplotipos particulares do Sistema HLA
aumenta a susceptibilidade para as DAI; praticamente todas as DAI
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
92 |
Auto-Imunidade
revelam uma associação com este Sistema; o mesmo é dizer que existem
genes de susceptibilidade à doença; por exemplo, quem expressa HLA
DR2 ou 3, apresenta uma maior proporção para o desenvolvimento de
Lúpus Eritematoso Sistémico);
o Activação e regulação celular (genes não HLA também regulam a
resposta imunitária, pelo que podem contribuir para uma predisposição
genética para certas DAI; por exemplo, genes localizados no
cromossoma
X
parecem
desempenhar
papel
importante
no
desenvolvimento das DAI);
o Apoptose (deficiência no gene Fas leva a que a apoptose não ocorra,
perpetuando-se o estado de proliferação);
Geralmente, nas DAI verifica-se a presença de “antigen speading” que se
define como a exposição de autoantigénios crípticos como consequência do
processoauto-imune, o que leva à presença de novos auto-anticorpos ao longo da
doença, com consequente aparecimento de novas DAI.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
93 |
Auto-Imunidade
2. Doenças Auto-Imunes (DAI)
2.1.
DAI
Multi-sistémica
DAI Multi-Sistémicas
Fisiopatologia
Epidemiologia e
Associação HLA
Manifestações Clínicas e
Laboratório
Geral envolvimento de
todos os orgãos:
Lúpus Eirtematoso
Sitémico
(LES)
Figura 26 – “Butterfly
rash”, LES, DAI MultiSistémicas.
Os queratócitos que sofrem
apoptose geralmente concentram-se
em vesículas (corpos apoptóticos),
evitando a sua exposição ao meio
envolvente.
Nos doentes com LES, por factores
genéticos, existe comprometimento
da remoção destes corpos
apoptóticos (deficiente depuração),
o que conduz à exposição de
antigénios à superfície celular e à
sua acumulação em circulação. Com
o tempo estes antigénios sofrem
alterações estruturais tornando-se
imunogénicos. Verifica-se, então,
desenvolvimento de uma resposta
imunológica inespecífica de órgão,
sendo activados linfócitos B, T e
células APC. Os linfócitos B
produzem auto-anticorpos contra os
antigénios, formando-se
imunocomplexos (Ag-Ac). Os
imunocomplexos formados activam
a via comum do complemeto,
havendo deposição destes
complexos a nível dos tecidos
(glomerulonefrite).
Os defeitos imunológicos combinamse com factores ambientais, como
infecções virais e radiações UV (daí
a fotossensibilidade). Estes agentes
aumentam o processo de apoptose
e favorecem alterações estruturais
nos antigénios deficientemente
depurados, exacerbando todo o
processo pré-existente.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Afecta 40 em 100 000
pessoas.
Proporção
mulheres:homens 9:1 (os
estrogénios aumentam a
formação de auto-ac antiDNA).
Afecta todas as idades.
Afecta sobretudo negros.
HLA DR2 e DR3.
-Poliartrite (artralgias
simétricas) 90%;
- Rubor e lesões cutâneas,
fotossensibilidade,
“butterfly rash” 85%;
- Glomerulonefrite 70%;
- Atingimento do SNC
(AVC, intelecto, memória,
aprendizagem) 70%;
- Miopatias 30 a 50%;
- Alterações do
parênquima pulmonar
18%;
- Alterações do TGI (dor
abdominal) 20%;
- Alterações cardíacas;
- Manifestações
hematológicas (anemia
hemolítica, linfopénia,
trombocitopénia);
- Manifestações
inespecíficas (fadiga,
febre, anorexia, dor de
cabeça, queda de cabelo,
úlceras orais);
- (…)
Laboratório:
- Hemograma: anemia
hemolítica, neutropénia,
linfopénia,
trombocitopénia;
- Diminuição do Fe sérico
e transferrina;
- Urina: possível
proteinúria e hematúria (se
glomerulonefrite
associada)
Auto-anticorpos Presentes
Auto Ac. Principais:
- DNAds (elevada
especificidade, sendo critério de
diagnóstico; importante também
na monitorização porque se
relaciona com a actividade da
doença; pode surgir até 10
anos antes do diagnóstico);
- Sm (elevada especificidade,
sendo critério de diagnóstico;
aparece em 30% dos casos
mas só se manifesta nesta
patologia; aparece pouco antes
do diagnóstico; não serve para
monitorização porque não varia
com a actividade da doença);
Outros Auto Ac. Importantes:
- DNAss;
- Histonas (LES induzido por
drogas);
- Nucleossoma (importante na
monitorização porque altos
títulos relacionam-se com
elevada actividade da doença e
envolvimento renal; aparece em
indivíduos com LES sem
DNAds);
- SS-A (Ro) e SS-B (La)
(relacionam-se com Síndrome
de lúpus neonatal – bloqueio
congénito cardíaco em recémnascidos; presente em 50% dos
casos);
- PCNA (elevada especificidade
mas aparece apenas em 3%
dos casos).
- Scl-70;
- RNA Polimerase II e III;
- U1-snRNP;
- hn-RNP;
- Lâmina A, B, B2 e C;
- RNA Polimerase I;
- NOR;
- RNA helicase II;
- sp100 e PML;
- Ku.
- Ribossomal (geralmente
envolvimento do SNC e sem
DNAds);
- Mitocondrial;
- Golgi.
Outros Ac.:
- Anti-Cardiolipinas IgG e IgM;
- Anti-C1q (relaciona-se com
LES em risco de doença renal –
nefrite lúpica)
94 |
Auto-Imunidade
DAI
Multi-sistémica
Síndrome Antifosfolipídico
(SAF)
Artrite Reumatóide
(AR)
Fig 27 – Sinovite das
mãos, AR, DAI MultiSistémicas.
Fisiopatologia
Presença de auto-anticorpos
dirigidos contra a proteína β2Glicoproteina I. Esta proteína vai
depois ligar-se à maioria das
cargas negativas das cabeças dos
fosfolípidos, como a cardiolipina (é
co-factor da cardiolipina). Os
fosfolípidos atacados encontramse, sobretudo, nas camadas
endoteliais capilares e membranas
plaquetares.
Produção de auto-anticorpos antiIgM (factor reumatóide), com
consequente deposição de
imunocomplexos nas articulações.
Segue-se um chamamento de
leucócitos a este local com
produção de citocinas e
proliferação das células sinoviais
das articulações com formação do
panus (tecido granular que crece
tipo tumor benigno). Tal evento
leva à libertação de enzimas que
gradualmente vão destruindo a
cartilagem e o osso. As citocinas
libertadas entram em circulação,
sendo as responsáveis pelas
manifestações extra-articulares.
Epidemiologia e
Associação HLA
Afecta 40 em cada
100 000 pessoas.
Sobretudo
mulheres entre 15 e
30 anos ou acima
dos 60 anos.
Afecta sobretudo
indivíduos com
LES.
Afecta 40 em cada
100 000 pessoas.
Sobretudo
mulheres, na
proporção de 3:1.
Afecta todas as
idades.
HLA DRB1 e DR4
(80% dos casos).
Síndrome de Sjögren (SS)
Etiologia desconhecida. Os autoanticorpos atacam os tecidos
epiteliais glandulares (glândulas
exócrinas salivares e lacrimais) e
extra-glandulares.
Fig 28– Aumento das
parótidas, SS, DAI MultiSistémicas
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Sobretudo
mulheres na
proporção 9:1.
Aparecimento entre
os 30 e os 60 anos.
Manifestações Clínicas e
Laboratório
- Tromboses arteriais e venosas
recorrentes;
- Trombocitopénia;
- Em grávidas conduzem a abortos
repetidos, HTA, pré-eclampsia e
Diabetes gestacional.
Laboratório:
- Hemograma: trombocitopénia
moderada;
- Presença de anticoagulante
lúpico.
- Sinovite (inflamação das
articulações) simétrica , sobretudo
das mãos e pulsos, mas também
pés, tornozelos, ombros e coluna;
- Destruição das artticulações e
formação de nódulos em torno das
articulações interfalângeas, com
dor crónica associada;
- Anquilação (dificuldade de
movimento), sobretudo logo pela
manhã;
- Manifestações extra-articulares:
coração, pulmões, SNC, olho,
músculos, rins, TGI, etc;
- Manifestações inespecíficas
(febre, anorexia, fadiga, anemia).
Laboratório:
- Hemograma: anemia
normocrómica e normocítica;
possível trobocitose e eosinofilia.
- Inflamação com aumento das
glândulas salivares; redução da
salivação;
- Inflamação das glândulas
lacrimais; olhos secos, com ardor
e sensíveis à luz; conjuntivite;
- Manifestações extra-glandulares:
envolvimento do SNC (depressão),
envolvimento pulmonar,
envolvimento renal (nefrite
intersticial, glomerulonefrite),
envolvimento hepático
esplenomegália, linfoadenopatias,
úlceras nas pernas;
- Manifestações inespecíficas
(fadiga).
Auto-anticorpos Presentes
Anticorpos anti-fosfolipídicos:
- Anti-Cardiolipina IgG e IgM
(presentes em SFA mas
também em infecções);
- Anti-β2-Glicoproteina I
(diferencia os ac. cardiolipina
relacionados com infecções
dos não relacionados com
infecções, embora um nº
significativo de doentes com
infecções permaneça positivo
também com β2-Glicoproteina
I); só altos títulos
correspondem a SAF,
podendo baixos títulos
corresponder a infecções;
Auto Ac. Principais:
- Factor Reumatóide (baixa
especificidade);
- Anti-CCP “cyclic citrullinated
peptides” (especificidade de
95% para AR; a mesma
sensibilidade que FR; pode
aparecer anos antes das
manifestações clínicas).
Outros Auto Ac.:
- hnRNP;
- RNA Polimerase I;
- NOR.
Auto Ac. Principias:
- SS-A (Ro);
- SS-B (La) (mais especifico
mas menos sensível que SSA);
Outros Auto Ac.:
- RNA Polimerase II e III;
- sp100;
- Centrómero;
- Centríolo;
- Mitocôndria;
- Golgi.
Laboratório:
- Crioglobulinas (20%).
95 |
Auto-Imunidade
Limitada Cutânea (mãos e face)
(CREST)
Fisiopatologia
Epidemiologia e
Associação HLA
Desordem do tecido conjuntivo com
excesso de depósito de colagénio,
caracterizada por disfunção endotelial
(disfunção vascular, com alteração dos
vasos), fibrose e atrofia da maioria dos
órgãos.
Afecta 2 em 1000 000
pessoas.
Sobretudo mulheres na
proporção de 4:1.
Difusa Cutânea
(progressão rápida dos dedos para o tronco)
Esclerose Progressiva
Sistémica ou Esclerodermia
(sub-divisão consoante a pele afectada)
DAI
Multi-sistémica
Fenómeno de Raynaud
Fig 30 – Necrose do dedo,
F. Raynaud, DAI
MSSistémicas
Raça negra mais
afectada.
Sobretudo 40 a 50 anos.
Muito raro em crianças.
Manifestações
Clínicas e
Laboratório
- Fenómeno de Raynaud
(vasoespasmos dos
dedos com inchaço mãos
e face de manhã (1º
sintoma);
- Espessamento
esclerótido da pele;
- Ulceração das
impressões digitais;
- Decréscimo na
transpiração;
- Telangiectasia
(dilatação dos vasos
superficiais, causando
marcas vermelhas na
pele);
- Rugas periorais
(“tobacco bag mouth”;
- Depósitos de cálcio na
pele;
- Envolvimento vascular
de outros órgãos
(músculos, ossos, TGI,
pulmão, rim, coração),
sobretudo na forma
difusa.
CREST:
- Calcinose cutânea
- Raynaud’s fenómeno
- Esofágica, disfunção
(diminuição peristaltismo
esófago e refluxo
gastroesofágico)
- eSclerodactilia
(espessamento dedeos e
mãos, dobrando os
dedos)
- Telangiectasia
Fig 29 – Depósitos de cálcio nas
mãos, Esclerodermia, DAI MultiSistémicas.
Laboratório:
- Níveis do C diminuídos;
-Aumento da actividade do SN
Simpático;
- Elevada reactividade vascular dos
dedos a estímulos que conduzem à
vasoconstrição (exº: frio e stress);
- Aumento de substâncias vasoactivas
em circulação;
- Diminuição da pressão intravascular;
↓
Vasoespasmos das artérias e
arteríolas. Consequente destruição dos
vasos sanguíneos com alteração do
fluxo sanguíneo, activação plaquetar,
aumento da fibrinólise, aumento da
viscosidade e do stress oxidativo.
O Fenómeno de Raynaud Secundário
advém de outras patologias.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Sobretudo mulheres na
proporção de 5:1.
Sintomas geralmente
antes dos 40 anos.
Sobretudo em países
frios.
Fenómeno de Raynaud
Primário (Doença de R):
- Ataques com 1º palidez;
2º cianose periférica, 3º
rubor das mãos e pés;
- Dor ao fim de alguns
ataques;
- Parestesias simétricas;
Fenómeno de Raynaud
secundário (Síndrome
de R): associação com
outras patologias como
LES, AR, SS,
escleroderma e
polimiosite
- Parestesias
assimétricas mais
intensas e dolorosas;
- Ulceração e gangrena
dos dedos das mãos e
pés
Auto-anticorpos
Presentes
Auto Ac. Principais:
- centrómero (CENP)
(elevada especificidade);
Outros Auto Ac.:
- AMA-M2 (maior
susceptibilidade para
CBP);
- Scl70 (raro);
- RNA Polimerase II e III
(raro);
- U1-snRNP;
- Histonas;
- SS-A e SS-B;
- hnRNP;
- RNA helicase II;
- centríolos;
- Ku (polimiosite com
escleroderma);
- MSA-2.
Auto Ac. Principias:
- Scl-70 (elevada
especificidade);
- RNA Polimerase II e III
(relação com crise renal e
hipertensão pulmonar);
- U1-snRNP;
- PM-Scl;
-Fibrilharina (U3-nRNP)
(elevada especificidade,
embora presente em
menos de 12% dos
casos);
- RNA Polimerase I
Outros Auto Ac:
- AMA-M2 (maior
susceptibilidade para
CBP);
- NOR;
- centrómero (raro);
- Histonas;
- SS-A e SS-B;
- hnRNP;
- RNA helicase II;
- centríolos;
-ku;
-MSA-2.
O diagnóstico não é feito
por auto-anticorpos.
Contudo, os seguintes
podem estar presentes:
- Scl-70;
- NOR;
- Centrómero;
- Centríolo;
- MSA-2;
- Mitocôndria.
96 |
Auto-Imunidade
DAI
Multi-sistémica
Polimiosites
Miosites
(miopatias)
Fisiopatologia
As fibras musculares expressam um
MHC-I anormal, o que leva à invasão e
activação local de linfócitos T CD8, com
consequente destruição das fibras
musculares. Uma vez activados, os
linfócitos T produzem citocinas que
perpetuam a resposta auto-imune.
Epidemiologia e
Associação HLA
2 a 8 casos por 1
000 000 pessoas.
Sobretudo
mulheres de meia
idade.
Rara em crianças.
Manifestações Clínicas e
Laboratório
- Fraqueza e dor aguda muscular
durante semanas ou meses; por
vezes, fraqueza dos músculos
respiratórios;
- Manifestações extra-musculares
mais raras que nas
dermatomiosites mas podem
ocorrer manifestações cardíacas,
artralgias, doença intersticial
pulmonar;
- (Rara) associação com neoplasia
maligna da mama, pulmão ou TGI
Fig 31 – Músculo
Estriado destruído,
Miosites, DAI
Multi-Sistémicas
Dermatomiosites
Laboratório:
- CK aumento mais de 50x;
- Possível aumento de AST, ALT,
LDH e aldolase.
Activação do complemento e depósito
do complexo C5b-C9 a nível dos
capilares, causando um infiltrado
inflamatório local, com consequente lise
dos capilares e isquémia muscular. As
lesões
cutâneas
demonstram
inflamação perivascular com células
CD4 na derme.
.
2 a 8 casos por 1
000 000 pessoas.
Sobretudo
mulheres com uma
proporção de 2:1.
Afecta
adultos,
crianças.
tanto
quanto
- 1º Rubor e lesões da pele
(junções interfalângeas, joelhos e
outros ossos proeminentes,
pálpebras, cara, pescoço, peito e
parte dos braços); úlceras digitais,
calcificação do tecido submucoso
- 2º Fraqueza e dor muscular
aguda (dias) ou insidiosa (meses);
por vezes, fraqueza dos músculos
do pescoço, deixando cair a
cabeça, fraqueza dos músculos do
esófago e respiratórios
- Manifestações articulares,
pulmonares, cardíacas e renais
(glomerulonefrite) como resultado
da mioglobinúria mantida
- Maior risco de desenvolver
neoplasia (30% de incidência)
Laboratório:
- CK aumento mais de 50x;
- Possível aumento de AST, ALT,
LDH e aldolase.
Doença Mista do Tecido
Conjuntivo (DMTC)
ou Síndrome de Sharp
Síndrome de sobreposição de sintomas
característicos de LES, escleroderma e
polidermatomiosite, com quadro clínico
indiferenciado.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Muito variadas, mas mais
frequentemente:
- Fenómeno de Raynaud;
- Inchaço dos dedos;
- Artrites;
- Miosites;
- Disfunção esofágica;
- Hipertensão pulmonar;
- Rash cutâneo;
- Envolvimento cardíaco;
- Geralmente, sem manifestações
renais e neurológicas.
Auto-anticorpos
Presentes
Auto Ac.
Principais:
- SRP (elevada
especificidade; pior
prognóstico);
- Jo-1 (elevada
especificidade);
- PL-7, PL-12, EJ e
OJ (específicos).
Outros Auto Ac.:
- SS-A (Ro);
- gp210;
- PM-Scl (“Overlap
Syndrome”);
- Ku (polimiosite
com escleroderma).
Auto Ac.
Principais:
- Mi-2 (específico;
presente em 25%
dos casos; associase à fase aguda, a
um bom prognóstico
e a uma boa
resposta
terapêutica);
- Jo-1 (elevada
especificidade;
presente em 10 a
25% dos casos;
associado a fibrose
pulmonar e doença
severa);
-SRP (elevada
especificidade;
raramente
associado);
- PL-7, PL-12, EJ e
OJ.
Auto Auto Ac.:
- SS-A (Ro);
- PM-Scl (“Overlap
Syndrome”).
Principais Auto
Ac.:
- U1-snRNP (altos
títulos; não são
específicos).
Outros Auto Ac.:
- SS-A (Ro);
- SS-B (La);
- RNA Polimerase II
e III;
- hnRNP;
- RNA Polimerase I:
- RNA Helicase II;
- Actina.
97 |
Auto-Imunidade
Poliartrite Nodosa (PAN)
Afecta sobretudo as artérias de tamanho
médio, mas também algumas de grande
tamanho.
Essa destruição deve-se em parte à
presença de linfócitos CD4 e células
dendríticas nas zonas vasculares.
Muitas vezes associada a infecções
virais (HBV, HCV, HIV, CMV, PVB19).
Poliangite Microscópica
(MPA)
Afecta os pequenos vasos.
Os ANCAs (MPO e PR3) activam os
neutrófilos para a produção de ROS e
para a libertação de enzimas líticas, o
que conduz à lise do endotélio dos
pequenos vasos.
Granulomatose de Weneger (WG)
Lesões granulomatosas inflamatórias
com destruição tecidular local e
procedem depois para uma fase
sistémica, afectando os pequenos e
médios vasos.
Deve-se aos auto-ac anti-PR3 que fazem
as células dendríticas apresentarem
MHC 1 aos linfócitos T, que se
transformam em Th1. Os Th1 produzem
citocinas necessárias à formação do
granuloma.
Síndrome de ChurgStauss (CSS)
Fisiopatologia
Afecta os pequenos e médios vasos.
Os eosinófilos libertam as suas enzimas
citotóxicas levando à lesão tecidular.
Nos doentes com auto-anticorpos antiMPO, os auto-ac levam à libertação da
mieloperoxidase dos neutrófilos, o que
acentua a vasculite.
Doença de Goodpasture
(Doença anti-GBM)
VASCULITES SISTÉMICAS (inflamação dos vasos)
DAI
Multi-sistémica
Presença de auto-anticorpos anti-GBM
dirigidos contra as cadeias α3 do
colagénio tipo IV da membrana
glomerular basal dos nefrónios, o que
causa glomerulonefrite.
Epidemiologia e
Associação HLA
Doença muito rara.
Atinge os dois sexos e
todas as idades de
igual forma.
Afecta 20 em cada 1
000 000 de pessoas.
Sobretudo homens na
proporção 2:1..
Pico de incidência aos
60-65 anos.
Afecta 12 em cada 1
000 000 de pessoas.
Sobretudo homens na
proporção 2:1.
Idade máxima 40 anos.
Afecta 4 em cada 1 000
000 pessoas.
Idade máxima 50 anos.
Afecta os dois sexos de
igual modo.
Atinge 1 em cada 1 000
000 de pessoas.
Pico de incidência aos
30 e 70 anos.
Atinge tanto homens,
como mulheres.
Manifestações Clínicas e Laboratório
A ocorrência de hemorragia e isquémia em
qualquer tecido conduz a múltiplas
manifestações clínicas possíveis:
-Envolvimento dos nervos periféricos;
- Envolvimento da pele (púrpura, nódulos
sub-cutâneos, Fenómeno de Raynaud,
isquémia digital)
- Possível atingimento de TGI, rins
(hematomas sem glomerulonefrite), coração e
SNC
- Manifestações inespecíficas (náuseas,
anorexia, febre, mialgia, artralgia)
- Envolvimento primário dos pequenos vasos
dos rins (desenvolvimento de glomerulonefrite
de progressão rápida / crescêntica com
proteinúria e hematúria) e pulmões (dispneia,
tosse, hemoptises)
- Possível envolvimento de outros órgãos:
pele (púrpura), nervos periféricos, fígado,
coração;
- Manifestações inespecíficas (anorexia,
febre, artralgia, mialgia)
Laboratório:
- Urina: oligúria, proteinúria, hematúria
microscópica, cilindros celulares.
- Necrose dos pequenos e médios vasos;
- Formação de granuloma nos seguintes
tecidos:
. Nariz (crosta, obstrução e hemorragia nasal,
sinusite, destruição da cartilagem com
deformação do nariz);
. Rim (glomerulonefrite com proteinúria);
. Pulmão (nódulos difusos, hemorragia
alveolar, tosse seca);
- Possível envolvimento do SNC, dos olhos
(conjuntivite) e pele (úlceras, pápulas);
- Manifestações inespecíficas (febre,
anorexia, artralgias, miopatias).
Laboratório:
- Urina: proteinúria.
1ª fase: asma e manifestações alérgicas;
2ª fase: hipereosinofilia; os eosinófilos
infiltram os tecidos, conduzindo a:
- Infiltrados pulmonares;
- Granulomas necrotizantes extravasculares
(pele, músculos, TGI, rins, coração)
- Necrose vascular dos pequenos vasos
Auto-anticorpos
Presentes
- pANCA (MPO)
(raramente);
- cANCA (PR3)
(raramente).
NOTA: Geralmente
os doentes não
manifestam ANCAs.
- pANCA (MPO) em
70% dos casos;
- cANCA (PR3) em
25% dos casos.
- cANCA (PR3) em
95% dos casos com
doença generalizada
e 50% dos casos
com doença
localizada;
(- Raramente
pANCA - MPO).
- pANCA (MPO) em
cerca de 40% dos
casos
Laboratório:
- Hemograma: anemia, eosinofilia;
- IgE aumentada (75%);
- Factor reumatóide positivo (60%).
- Glomerulonefrite com micro-hematúria e
falência renal progressiva rápida;
- Possível presença de hemorragia pulmonar.
- Anti-GBM
Laboratório:
- Urina: micro-hematúria.
Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
98 |
Auto-Imunidade
2.2.
DAI Endócrinas
Específicas de Órgão
Diabetes Mellitus
tipo 1
Doença de Addison
Autoimune
(Addison Primário)
DAI Específicas de Orgão
Fisiopatologia
A presença de genes de susceptibilidade
ligados ao HLA conduzem à expressão de
baixos níveis de CD28 nos linfócitos T – uma
molécula superficial de regulação negativa
dos linfócitos T. Assim, surgem em circulação
mais linfócitos T auto-reactivos que atacam as
células β dos ilhéus de Langerhans do
pâncreas. A destruição destas células expõe
moléculas anteriormente “escondidas” no seu
interior, o que conduz, por sua vez, à
formação de auto-anticorpos anti-células β
(ICAs) pelos linfócitos B. Estes autoanticorpos vão destruindo ainda mais células
β, com consequente diminuição progressiva
da síntese de insulina. Quando mais de 80%
das células β estão destruídas, instala-se a
Diabetes Mellitus tipo 1. Estes doentes são,
portanto, todos insulino-dependentes.
Presença de auto-anticorpos (ACAs), por
diminuição de linfócitos T supressores, que
destroem todos as zonas do cortéx adrenal
(supra-renais): zona externa glomerulosa com
diminuição da produção de
mineralocorticóides (exº aldosterona), zona
média fasciculada com diminuição da
produção de glucocorticóides (exº cortisol) e
zona interna reticulada com diminuição da
produção de androgénios (exº DHEA,
androstenediona). Consequentemente, por
feedback, verifica-se aumento da produção de
CRH (hipotálamo) e ACTH (hipófise).
Por vezes a medula adrenal também é
destruída deixando de haver produção de
catecolaminas (noradrenalina e adrenalina).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Epidemiologia e
Associação HLA
Manifestações Clínicas e Laboratório
Manifestações agudas:
- Aumento do glicogenólise:
hiperglicémia, glicosúria, desidratação,
poliúria, hipotensão, hipoperfusão,
extremidades frias, aumento da
pulsação, possível coma hiperosmolar;
- Aumento da proteólise: amoniémia,
vómito;
- Aumento da lipólise: cetonémia,
acidose metabólica, disrritmias ou
enfarto, possível coma cetogénico;
- Polidipsia, polifagia, perda de peso;
Manifesta-se na
idade jovem.
Associação a HLA
DR3 e DR4, DQ2 e
DQ8.
Afecta 1 em cada
8000 pessoas.
Sobretudo homens
durantes as
primeiras duas
décadas de vida.
Mulheres após os 40
anos.
Associa-se a HLA
B8, DR3 e DR4.
Manifestações crónicas:
- Dermopatia diabética (infecções
cutâneas frequentes, ulceração, pé
diabético);
- Retinopatia diabética (glaucoma,
cataratas, cegueira);
- Nefropatia diabética (síndrome
nefrótico, insuficiência renal crónica,
aterosclerose renal, pielonefrites
frequentes)
- Macroangiopatia diabética (HTA,
aterosclerose, claudicação)
- Neuropatia diabética (parestesias,
obstipação)
Laboratório:
- Sangue: hiperglicémia, HbA1c
aumentada, amoniémia, cetonémia,
acidose metabólica;
- Urina: glicosúria, poliúria, cetonúria.
- Por diminuição da aldosterona:
hipotensão arterial, hiponatrémia com
avidez por sal, hipercaliémia,
desidratação com possível choque
hipovolémico e coma;
- Por diminuição de cortisol:
hipoglicémia, anorexia, perda de
apetite, náuseas, vómitos, dor
abdominal, febre, apatia, depressão;
- Por diminuição dos androgénios nas
mulheres: diminuição da libido e da
pilosidade;
- Por aumento do ACTH:
hiperpigmentação da pele.
Auto-anticorpos
Presentes
- ICAs (ac anticélulas dos
ilhéus);
- IAAs (ac antiinsulina);
- GAD (ac antidescarboxilase
do ácido
glutâmico).
- ACAs (ac. anticórtex adrenal)
(altos títulos)
Laboratório:
- Diminuição da aldosterona,
hiponatrémia, hipercaliémia;
- Diminuição do cortisol, hipoglicémia;
- Diminuição da DHEA e
androstenediona;
- Aumento de ACTH
99 |
Auto-Imunidade
DAI Hepatobiliares
Específicas de Órgão
Fisiopatologia
Epidemiologia e
Associação HLA
50 a 200 casos por 1
000 000 de pessoas.
Hepatite Crónica
Autoimune
1, 2 e 3
Cirrose Biliar
Primária
(CBP)
Inflamação hepática perpetuada no tempo (mais
de seis meses) de origem desconhecida, com
presença de auto-anticorpos hepáticos e
destruição da arquitectura hepática com fibrose.
A doença progride para cirrose.
Agentes ambientais, infecciosos e genéticos
podem estar envolvidos na sua génese.
A exposição a factores ambientais (bactérias,
químicos) e factores genéticos diminuem a
tolerância ao self. Verifica-se infiltração de
linfócitos B e T em torno dos canalículos biliares
do fígado, com consequente colestase e
destruição dos hepatócitos com fibrose. A
doença progride para cirrose.
Sobretudo em
mulheres.
HAI 1 sobretudo
entre os 15 e 30
anos e depois dos
50 anos. HAI tipo 2
sobretudo em
crianças (50 a 75%).
HAI tipo 3 em todas
as idades.
Sobretudo mulheres
(mais de 90%).
Sobretudo entre os
40 e 60 anos.
Manifestações Clínicas e
Laboratório
- Icterícia;
- Hepatomegália;
- Dor no quadrante direito acima
do abdómen;
- Anorexia;
- Fadiga;
- Possíveis complicações: ascite,
hemorragia gastrointestinal,
cirrose;
- Hepatite tipo 2 apresenta
sintomas extra-hepáticos
(artralgias, glomerulonefrite,
vitiligo, doença inflamatória
crónica óssea).
Laboratório:
- Elevados níveis de bilirrubina
livre, trasaminases e γ-GT;
- PAL ligeiramente aumentada;
- Assintomáticos (60%);
- Icterícia (por aumento da
bilirrubina não conjugada);
- Prurido (por regurgitação dos
sais biliares para o sangue);
- Hipercolestolémia (por
regurgitação do colesterol para o
sangue);
- Dor na zona superior direita do
abdómen;
- Hepatoesplenomegália;
- Fadiga;
- Esteatorreia;
- Osteopénia ou osteoporose;
- Hipertensão portal;
- Carcinoma hepatocelular;
- Cirrose;
Laboratório:
- Elevados níveis de bilirrubina
livre e PAL;
- Ligeiro aumento de
transaminases e γ-GT;
- Aumento dos sais biliares e do
colesterol;
- Aumento do TP;
- Fezes esteatorreicas e claras;
- Urina escura.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Auto-anticorpos
Presentes
Hepatite tipo1 (80% das
HCA):
Principais Auto Ac..:
- Actina (elevados
títulos).
Outros Auto Ac.:
- ANAs (DNAss,
nucleossoma, histonas,
SS-A, SS-B, lâminas A,
B, B2 e C, p80 coilina)
Hepatite tipo 2 (10-15%
das HAI):
- LKM-1;
- LC-1.
Hepatite tipo 3:
- SLA;
- LP.
Principais Auto Ac.:
- AMA-M2 (também M4,
M8 e M9)
Outros Auto Ac.:
- gp 210;
- p80 coilina;
- sp100;
- PML;
- Actina (elevados
títulos)
100 |
Auto-Imunidade
DAI Gastrointestinais
Específicas de Órgão
Fisiopatologia
Epidemiologia e
Associação HLA
Manifestações Clínicas e
Laboratório
Auto-anticorpos Presentes
Gastrite Atrófica Crónica;
- Assintomática por muito
tempo;
Gastrite Autoimune do
tipo A (Gastrite Atrófica
Crónica)
e Anemia Perniciosa
Fig 32 – Glossite, Anemia
perniciosa, DAI Específica
de Orgâo
Doença Celíaca
(DC)
Fig 33 – Intestino
sem vilosidades,
Doença Celíaca,
DAI Específica de
Orgâo
A Gastrite Atrófica Crónica
caracteriza-se por uma infiltração
celular
inflamatória
(linfócitos,
granulócitos e plasmócitos) da
mucosa gástrica devido à presença
de auto-anticorpos anti-células
parietais. Esta reacção inflamatória
crónica vai aos poucos substituindo
as células pépticas e parietais
gástricas por células mucóides
(metaplasia gástrica).
Com o tempo, as células parietais
deixam de produzir vitamina B12;
por outro lado, surgem ac. anti-factor
intrínseco (FI) que impedem a
síntese gástrica de FI e a
consequente absorção intestinal da
vitamina B12 exógena; desenvolvese, assim, Anemia Perniciosa.
A presença de certos HLA conduz a
incapacidade geneticamente
determinada de induzir tolerância
oral à gliadina – uma das fracções
do glúten, presente no trigo, cevada,
centeio, aveia. Assim, no intestino
delgado – zona de maior contacto
com a gliadina ingerida – após a sua
absorção na mucosa intestinal, a
gliadina é desaminada pela enzima
transglutaminase tecidular do
endomísio (Tg), o que substitui
resíduos de glutamina por resíduos
de ácido glutâmico. Esta
transformação conduz à formação
de um infiltrado de macrófagos,
células dendríticas e linfócitos B e T.
As células APC processam e
apresentam os péptidos da gliadina
aos linfócitos T; por seu lado, os
linfócitos B produzem auto-ac. antigliadina (sobretudo IgA) e ac. antiendomísio (incluem ac específicos
contra complexos de gliadina e ac
anti-transglutaminase). Com o
tempo esta reacção inflamatória
conduz à destruição das vilosidades
intestinais, com consequente
malabsorção dos alimentos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
Anemia Perniciosa
sobretudo
mulheres idosas
do norte da
Europa.
Anemia Perniciosa:
- Anemia megaloblástica, com
consequente palidez e fadiga;
- Glossite atrófica, com
consequente perda de apetite
e língua vermelha;
- Alterações intestinais
(diarreia) por falta de absorção
da vitB12, com risco
aumentado para
adenocarcinoma gástrico;
- Desmielinização dos
neurónios por défice de vitB12,
com consequente neuropatia
periférica (tremores,
diminuição dos reflexos, etc).
Laboratório:
- Diminuição do HCl e do
pepsinogénio; aumento da
gastrina;
- Hemograma: anemia
megaloblástica,
hipersegmentação neutrófilos,
leucopénia, trombocitopénia
(A. Perniciosa);
- Diminuição da vitB12 (A.
Perniciosa);
- Ac. anti-FI (A. Perniciosa)
Afecta 1 em cada
100 pessoas.
Actualmente
afecta todas as
idades.
Associação HLA
DQ2 e DQ8, B8 e
DR3.
-Sintomas gastrointestinais
(diarreia, flatulência, enjoo,
vómitos, dor de estômago);
- Distúrbios na reprodução
(distúrbios menstruais,
adolescência atrasada,
fertilidade diminuída, perda
fetal);
- Distúrbios do sistema
esquelético e muscular (dor
óssea, artrites, nanismo,
destruição dentes,
osteoporose);
- Alterações metabólicas
(anemia, edema, hemorragias,
espasmos);
- Alterações neuropsíquicas
(neuropatia periférica,
ansiedade, depressão,
epilepsia);
- Erupção da pele;
- Manifestações inespecíficas
(mal estar, fraqueza, perda de
peso, fadiga, mau
temperamento).
Gastrite Atrófica Crónica:
- Ac. anti-células parietais
(APCA) (presentes em 90%
dos casos).
Anemia Perniciosa:
- Ac. anti-células parietais
(APCA) (presentes em 90%
dos casos; não presentes
em doença avançada);
- Ac anti-factor intrínseco
(FI) (presentes em 70% dos
casos).
- Ac anti-Endomísio EMA
IgA (trata-se dos ac mais
sensíveis 99% e específicos
99% para a DC; contudo
têm que se analisar por
IFA);
- Ac. anti-Transglutaminase
tTg IgA e IgG
(funcionalmente
semelhantes aos EMA mas
feitos por ELISA – técnica
menos sensíveis 95% e
menos específica 90%,
embora não exija
visualização subjectiva por
IFA);
- Ac anti-Gliadina AGA IgA e
IgG (menos sensíveis 90% e
menos específicos 85% que
os ac Tg, com falsos
positivos de 20% para IgG e
3% para IgA; contudo, são
úteis no diagnóstico para
pessoas que não têm ac. Tg
e na avaliação da
progressão da patologia)
101 |
Auto-Imunidade
DAI Neurológicas
Específicas de Órgão
Fisiopatologia
Myasthenia gravis
Activação de linfócitos T
CD4, o que conduz à
activação de linfócitos B
com produção de autoanticorpos contra os
receptores da
acetilcolina, impedindo a
ligação deste
neurotransmissor ao seu
receptor. Por outro lado,
a resposta imunitária
conduz também à
degradação da
acetilcolina e à
destruição da fenda póssináptico. Todos estes
factores resultam em
deficiente transmissão
neuromuscular.
Fig 34 – Separação
da epiderme,
Pênfigo, DAI
Específica de Orgâo
Bulhoso
Vulgaris
Pênfigo
Foliáceo
DAI Cutâneas
Específicas de Órgão
Fisiopatologia
Epidemiologia e
Associação HLA
Manifestações Clínicas e
Laboratório
Auto-anticorpos
Presentes
Atinge 20 em cada
100 000 pessoas.
Atinge 40% de
pessoas com
timoma, com maior
incidência em
mulheres.
Sobretudo na
terceira década de
vida nas mulheres e
na terceira e sexta
década de vida nos
homens.
- Fraqueza muscular (músculo
esquelético), sobretudo durante o
exercício físico, dos seguintes
músculos:
. Olho;
. Face;
. Pescoço;
. Respiratórios (pode dificultar a
respiração e levar à morte);
. Cintura escapular e pélvica.
- Anti-músculo estriado
esquelético (presente
em 80 a 90% dos
doentes com timoma;
mau prognóstico);
Laboratório:
- Ac. anti-receptores da acetilcolina
HLA B8 e DR3.
Epidemiologia
e Associação
HLA
Manifestações Clínicas
Auto-anticorpos
Presentes
- Desmogleina 1
Produção de autoanticorpos (antidesmogleinas ou anti-BP)
contra proteínas da
epiderme, o que resulta
na perda de adesão
célula a célula.
As desmogleinas são
caderinas – proteínas
importantes na adesão
celular.
Os antigénios BP são
estruturas de adesão que
ancoram as células
basais da epiderme à
derme.
Sobretudo idades
entre os 50 e 60
anos.
Distribuição igual
entre sexos.
Atinge uma em
cada 1 000 000
pessoas.
O pênfigo vulgaris é
o mais comum.
- Lesão inicial na mucosa orofaríngea;
- Lesão secundária na pele (bolhas
flácidas que rebentam formando uma
erosão larga e dolorosa), sobretudo
no couro-cabeludo, na cara e tronco;
- Genitálias e conjuntivas
possivelmente afectadas.
- Apresentação inicial tipo pápulas ou
placas, sobretudo nas extremidades e
dobras, que causam comichão;
- Aparecimento seguinte de bolhas
sub-epidérmicas, com depósito de
autoanticorpos, complemento e
polimorfonucleares na base da
epiderme; consequente separação da
epiderme da derme.
(- Melhor prognóstico)
Auto ac principal:
- Desmogleina 3.
Outros auto ac também
possivelmente
presentes:
- Desmogleina 1.
- BP180 (colagénio tipo
XVII);
- BP230.
Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão.
Figura 35 – Da esquerda para a direita, pênfigo foliáceo, vulgaris (duas imagens) e bulhoso.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
102 |
Auto-Imunidade
3. Metodologias Laboratoriais
Em Imunologia a detecção de anticorpos e de antigénios depende sempre da
formação de imunocomplexos (ligação antigénio-anticorpo). Assim, no caso de se
pretender detectar um anticorpo utiliza-se como sonda para investigar a sua presença um
antigénio ao qual o anticorpo se ligue, e vice-versa. Com frequência, o anticorpo ou o
antigénio sonda é fixado a um suporte sólido, permitindo a separação do
imunocomplexo formado dos outros componentes da mistura de ligação. Seguidamente,
determina-se a presença/quantidade do complexo através de uma segunda reacção de
ligação com um reagente marcado.
As técnicas que a seguir se descrevem são utilizadas no Laboratório de
Imunologia do HCC para detectar a presença de auto-anticorpos reactivos no soro do
paciente. A sua pesquisa compreende uma série de procedimentos que diferem em
termos de métodos, sensibilidade, especificidade e correlação com a clínica. Trata-se de
testes úteis em DAI nas seguintes situações:
- Prognóstico das DAI: podem existir auto-anticorpos muito antes de se
manifestar a patologia; assim, sempre que auto-anticorpos são detectados com patologia
ausente deve-se fazer uma avaliação do título do auto-anticorpo em causa de seis em
seis meses e o paciente deverá adoptar medidas que previnam o aparecimento da
patologia;
- Diagnóstico / auxílio no diagnóstico das DAI: só alguns auto-anticorpos
servem de critério de diagnóstico para DAI; contudo, muitos outros podem auxiliar no
diagnóstico clínico;
- Monitorização das DAI: a repetição periódica de alguns auto-anticorpos é um
meio de monitorizar a actividade da doença, o envolvimento de órgãos / a falência
orgânica e a resposta à terapêutica instituída.
Estes métodos permitem actualmente a identificação simultânea de muitos autoanticorpos ao mesmo tempo num mesmo ensaio. Assim, por vezes os auto-anticorpos
detectados não são solicitados pelo clínico. Nesse caso, o achado só deverá ser
referenciado se o auto-anticorpo detectado tiver relevância clínica; isto é, se o título for
elevado ou se a presença do auto-anticorpo for critério de diagnóstico de uma DAI. Tal
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
103 |
Auto-Imunidade
é exigido porque a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a presença de
patologia auto-imune; baixos títulos são frequentes em indivíduos saudáveis, sobretudo
idosos, ou em processos não auto-imunes, como infecções crónicas ou doenças
malignas. Mesmo tendo relevância clínica, o resultado deverá ser sempre confirmado
por um segundo método antes de se dar a informação ao médico. Muitas vezes, possuir
histórico do doente ou alguma informação clínica poderá ajudar na tomada de decisões
acertadas.
Assim, a utilização adequada destes testes é de extrema importância clínica;
contudo, a sua utilização inadequada poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a
um aumento dos custos no tratamento das DAI. Exige-se, portanto, uma marcha
analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.
3.1.
Imunofluorescência Indirecta (IFA)
3.1.1. Fundamento
A técnica utiliza lâminas onde estão fixados os antigénios complementares aos
auto-anticorpos que se pretendem detectar. Assim, ao se adicionar à lâmina o soro do
doente (com diluição que varia segundo os auto-anticorpos em pesquisa), no caso dos
anticorpos em pesquisa estarem presentes na amostra, estes ir-se-ão ligar aos antigénios
da lâmina formando um imunocomplexo durante o período de incubação que se segue
em câmara húmida e à temperatura ambiente. Depois, a lâmina é abundantemente
lavada para que os componentes da amostra que não se ligaram à lâmina sejam
removidos. Seguidamente, adiciona-se um segundo anticorpo IgG* dirigido contra um
epítopo da região Fc do anticorpo em pesquisa no soro do doente; este segundo
anticorpo está marcado com um fluorocromo (Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) e o
conjunto “anticorpo-fluorocromo” designa-se por conjugado. Após uma segunda
incubação em câmara húmida à temperatura ambiente que permitirá que o conjugado se
ligue ao imunocomplexo, segue-se uma segunda lavagem para remoção de todos os
componentes que não estão ligados no meio reaccional. Monta-se depois uma lamela
com o auxílio de glicerina. As lâminas podem ser executadas manualmente ou
automaticamente.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
104 |
Auto-Imunidade
Até serem observadas ao microscópio as amostras deverão ficar no frio numa
câmara húmida, a fim de se conservarem frescas.
Quando excitado com luz aproximadamente a 480-490 nm, o FITC emite
radiação sob a forma de luz por volta dos 530 nm (cor verde). Com o recurso a um
microscópio de fluorescência com um filtro que permita a visualização nesse
comprimento de onda é possível avaliar a presença do auto-anticorpo em pesquisa na
amostra do paciente.
Figura 36 – Esquema ilustrativo de uma reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina.
O padrão de ligação dos auto-anticorpos do paciente aos antigénios fixados à
lâmina observado no microscópio de fluorescência (ampliação de 400x) correlaciona-se
com a especificidade particular do auto-anticorpo e com a presença de distúrbios autoimunológicos específicos.
Para se evitar falsos resultados, devem-se ter alguns cuidados durante a
execução da técnica:
- As lâminas devem estar congeladas ou refrigeradas conforme as indicações do
kit e devem estar à temperatura ambiente a quando da execução da técnica;
- Não tocar com as pontas das pipetas na lâmina, pois pode danificar o substrato
conduzindo a falsos resultados negativos;
- Os soros devem ser congelados, caso não se efectue a técnica no dia da
colheita;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
105 |
Auto-Imunidade
- Antes de se iniciar a técnica os soros devem estar à temperatura ambiente e
homogeneizados;
- Verificar o pH da solução tampão;
- Proteger o conjugado e as lâminas após adição do conjugado da luz directa;
- As lavagens devem ser executadas correctamente e o número de vezes
requeridas; uma lavagem não cuidada pode provocar ruptura do substrato ou o
descoloramento do mesmo; lavagens insuficientes podem provocar falsos resultados
positivos, uma vez que o anticorpo do conjugado não é específico para o anticorpo em
pesquisa, podendo ligar-se a qualquer anticorpo presente no meio reaccional;
- Devem respeitar-se os tempos de incubação;
- Entre os diferentes passos da técnica nunca deixar que o substrato seque.
Por outro lado, antigénios mal fixados à lâmina logo durante o fabrico também
poderão conduzir a falsos negativos. A contaminação bacteriana das lâminas é outro
factor que poderá conduzir à visualização de padrões alterados; por exemplo, as células
HEp-2 contaminadas apresentam-se sem conteúdo nuclear, com um forte rebordo
citoplasmático e com algumas membranas que parecem rompidas; é de desconfiar desta
contaminação se no mesmo poçeto se apresentarem dois padrões distintos, sendo um
deles semelhante ao descrito.
A fim de se evitarem falsos resultados, além dos cuidados já descritos, para
cada sessão utiliza-se um controlo positivo e um controlo negativo. Uma amostra é
considerada positiva se o padrão de fluorescência observado for mais intenso que o
controlo negativo da série elaborada. É também importante visualizar-se o resultado no
centro do poçeto da lâmina, uma vez que os bordos podem conter anticorpos
inespecíficos não eliminados por lavagem insuficiente.
3.1.2. Aplicação
As técnicas de imunofluorescência indirecta são geralmente utilizadas como
técnicas de rastreio inicial das DAI, uma vez que são técnicas baratas e geralmente de
elevada sensibilidade, evitando falsos resultados negativos (a excepção são as células de
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
106 |
Auto-Imunidade
Crithidia luciliae, com elevada especificidade e baixa sensibilidade). Para além disso,
apresentam a vantagem de detectar qualquer tipo de auto-anticorpo presente no soro do
paciente (desde que
o substrato
escolhido seja o adequado)
sendo este
identificável/conhecido ou não, tendo sido pedido pelo clínico ou não.
Contudo, exigem pessoal altamente qualificado para a sua interpretação e
exibem baixa especificidade, sendo necessário uma posterior confirmação dos
resultados positivos por outro método mais específico, que evite, portanto, falsos
resultados positivos.
Assim, no Laboratório de Imunologia do HCC quase todos os pedidos de
detecção/quantificação de auto-anticorpos são iniciados com uma técnica de
imunofluorescência indirecta, adequada ao auto-anticorpo em pesquisa. Só no caso
desta inicial técnica de rastreio dar positiva é que o estudo segue com outro tipo de
técnicas mais específicas.
3.1.3. Células e Tecidos Utilizados
3.1.3.1.Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2
O diagnóstico laboratorial das DAI geralmente inicia-se pela pesquisa de autoanticorpos dirigidos contra constituintes nucleares das células (ANA). Para esta
pesquisa recorre-se no Laboratório de Imunologia do HCC a células HEp-2.
Trata-se de células tratadas de carcinoma humano da laringe. As células crescem
em monocamada na lâmina de IFA, fornecendo um substrato altamente sensível para a
detecção dos ANA. São células vantajosas para a observação destes auto-anticorpos
uma vez que são de origem humana (maior especificidade do que as células de rato
previamente utilizadas), o seu núcleo é largo (possível observação de detalhes
nucleares) e apresentam uma actividade mitótica elevada, o que permite a observação de
células em todas as fases do ciclo celular. Esta última característica revela-se pertinente
uma vez que, embora quase todos os auto-anticorpos anti-nucleares se visualizem em
interfase, determinados ANA apenas se observam / são mais facilmente observáveis em
mitose – PCNA, centrómero, centríolo, tubulina, NuMa e Midbody.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
107 |
Auto-Imunidade
A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:160 – título a partir do qual se
poderá considerar clinicamente significativa a presença de ANA por estudos feitos em
pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra
efectuada é necessário realizarem-se sucessivas diluições até que deixe de se observar
fluorescência, a fim de que se dê o título adequado: 1:160, 1:320, 1:640 ou > 1:640. A
titulação dos auto-anticorpos é dada pela maior diluição que ainda apresenta um
resultado positivo. O título é sempre dado comparando a fluorescência da amostra ao
padrão negativo e positivo da série de ensaios realizada.
Consoante o ANA envolvido na DAI, assim o padrão que se observa nestas
células ao microscópio de fluorescência. Estão descritos mais de 35 padrão de IFA
observados com células HEp-2, o que corresponde a mais de 100 auto-anticorpos
diferentes. Alguns padrões são específicos de determinados auto-anticorpos, mas muitos
auto-anticorpos diferentes originam o mesmo tipo de padrão. Por outro lado, o soro do
paciente frequentemente contém diferentes auto-anticorpos que resultam em padrões
mistos. Também é possível que a presença de um determinado padrão não permita a
visualização de outro padrão, que fica como que coberto pelo primeiro.
Para cada amostra dever-se-á também observar se os auto-anticorpos são
positivos em células em divisão celular, identificando-se o padrão como exibindo
cromossomas positivos (se os cromossomas apresentarem fluorescência) ou mitoses
positivas (se os restantes componentes celulares que não os cromossomas apresentarem
fluorescência quando em divisão celular). Esta indicação permite por vezes chegar a
algumas conclusões. Por exemplo, na presença conjunta de um padrão homogéneo e
granular, o primeiro poderá encobrir o segundo; contudo, a presença de mitoses
positivas em metafase é característica do padrão granular, enquanto que a presença de
cromossomas positivos em metafase é característico do padrão homogéneo; assim, se se
observar um padrão homogéneo com cromossomas e mitoses positivas, é provável que
o doente expresse também algum auto-anticorpo que exiba padrão granular. A
confirmação poderá ser feita por diluições sucessivas da amostra, o que permitirá
visualizar o padrão encoberto.
Para certas DAI a presença de determinados ANA é quase certo ou mesmo certo
da existência de patologia; contudo, para outras DAI a relação não é directa. É
importante reter que:
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
108 |
Auto-Imunidade
- Um teste positivo para um ANA raramente é diagnosticante, sendo o
diagnóstico quase sempre feito por critérios clínicos;
- Indivíduos com DAI podem ser ANA negativos;
- Os ANA podem ser positivos em indivíduos sem DAI, sendo que geralmente
estes ANAs não apresentam especificidade antigénica e são de títulos baixos;
- Os resultados dos ANA variam grandemente com o método utilizado na sua
detecção.
A grande vantagem na utilização deste substrato inespecífico para testes tão
importantes como os relacionados com as DAI é o seu valor de rastreio para os ANA.
As células HEp-2 são substratos altamente sensíveis que fornecem informação
qualitativa /semi-quantitativa (título determinado) que deverá ser utilizada como o passo
inicial para uma identificação mais específica e quantitativa dos ANA. Assim, sempre
que um resultado é positivo, o resultado deverá ser confirmado com um segundo teste
mais específico. A escolha do teste a realizar posteriormente é feita consoante o padrão
de fluorescência encontrado.
A visualização de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos também é possível neste
tipo de substrato. Contudo, muitos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos diferentes
podem parecer semelhantes e confundir-se por visualização das células HEp-2. Para a
sua identificação é sempre preferível o recurso a outros substratos mais adequados.
Assim, sempre que na pesquisa de um ANA se visualizam nas células HEp-2 aquilo que
parecer ser um auto-anticorpo anti-citoplasmático com significado clínico, a sua
pesquisa deverá ser feita com recurso a um substrato indicado.
A fim de se contornar um pouco esta limitação da técnica, no HCC recorre-se a
lâminas que incorporam dois tipos de células para cada doente: células HEp-2 para
melhor visualização dos ANA, e tecido de fígado de macaco para melhor visualização
de determinado tipo de auto-anticorpos que deixam algumas dúvidas quando
visualizados nas células HEp-2, tanto anti-nucleares, como anti-citoplasmáticos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
109 |
Auto-Imunidade
Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular. Durante a interfase a membrana nuclear está
delimitada, observam-se melhor os nucléolos e os organelos e fibras citoplasmáticos. A mitose inclui:
profase (a condensação do DNA permite a visualização individualizada dos cromossomas; formação do
fuso mitótico com visualização dos centríolos), metafase (rotura da membrana nuclear; cromossomas com
os seus centrómeros no plano equatorial), anafase (cada pare de cromatídeos separa-se pelo centrómero e
inicia a sua migração para pólos equatoriais opostos) e telofase (reconstrução da membrana nuclear em
torno de cada núcleo filho, reaparecimento dos nucléolos, descondensação dos cromossomas). À mitose
segue-se a citocinese, que ocorre na região “midbody”; enquanto a membrana citoplasmática invagina o
“midbody” vai progressivamente sendo constrito, até que desaparece quando se formam as duas células
filhas.
Figura 38 – A célula durante a Interfase. Boa visualização dos nucléolos e das proteínas do
citosqueletos: actina, tubulina, citoqueratina e vimentina; proteínas motoras, como a miosina e proteínas
de ancoragem, como a desmina; organelos e proteínas estruturais, como a clatrina e o Golgi.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
110 |
Auto-Imunidade
Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. O envelope nuclear mantém a integridade do núcleo
durante a interfase. É constituído, de dentro para fora, por lâmina nuclear, membrana nuclear interna e
membrana nuclear externa. A heterocromatina (condensada) encontra-se perto da lâmina nuclear,
enquanto que a eucromatina (laxa) se encontra no centro do núcleo. Atravessando o envelope nuclear
estão os poros nucleares. O retículo endoplasmático liso é uma extensão do envelope nuclear. Os
ribossomas ligados ao retículo endoplasmático liso constituem o retículo endoplasmático rugoso.
Segue-se a descrição dos padrões observados nas células HEp-2 e no tecido
hepático (sempre que útil) e os auto-anticorpos que lhes poderão estar associados. As
patologias a negrito são as mais significativas para os auto-anticorpos mencionados.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
111 |
Auto-Imunidade
PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO
1.
Padrão Nuclear Homogéneo
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células em interfase.
Cromossomas positivos em células em mitose (profase, metafase, anafase ou telofase).
Mitoses negativas; isto é, restantes constituintes nucleares que não os cromossomas,
positivos nas células em mitose.
Títulos muito elevados ou amostras envelhecidas podem apresentar mais
fluorescência à periferia do núcleo do que no centro (aquilo a que se chama padrão
Periférico Nuclear).
Este padrão pode encobrir outros padrões não permitindo a sua visualização.
Sempre que se desconfiar disso (por exemplo, se as mitoses estiverem positivas) deverse-á diluir a amostra, o que permitirá visualizar o outro padrão no caso deste estar
presente.
Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2. À esquerda, cromossomas positivos numa
célula em metafase e noutra em anafase. À direita, cromossomas positivos numa célula em anafase quase
terminada.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
112 |
Auto-Imunidade
Figura 41 – Da esquerda para a direita, cromossomas positivos em profase, metafase, anafase e
telofase em células HEp-2. A positividade dos cromossomas de células em mitose é característica do
padrão homogéneo.
Tecido hepático de macaco:
Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células.
Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco.
Auto-Anticorpos Associados:
 DNAds (cadeia dupla de DNA);
 DNAss (cadeia simples de DNA);
 DNP (“DNA histone complexes” – histonas, sobretudo H2A e H2B;
 Nucleossoma.
Associação Clínica:
 LES;
 LES induzido por drogas;
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
113 |
Auto-Imunidade
 AR;
 Escleroderma;
 Hepatite Autoimune tipo 1.
Figura 43 – São as histonas que permitem o super-enrolamento do DNA. Quando o material
genético é semi-desenrolado verifica-se que só a histona H1 se localiza na zona linear do DNA. As
restantes histonas (H2A, H2B, H3 e H4) mantêm parte do DNA enrolado. O conjunto dessas histonas
(todas excepto a H1) com o DNA designa-se por nucleossoma.
2.
Padrão Nuclear Fino Granular
2.1.
Scl-70
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Destribuição uniforme de grânulos tão finos que por vezes pode parecer padrão
homogéneo em células em interfase. Os nucléolos podem os não estar positivos em
interfase. Durante a mitose o auto-anticorpo associa-se aos cromossomas (cromossomas
positivos, mitoses negativas).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
114 |
Auto-Imunidade
Figura 44 – Padrão do auto-anticorpo Scl-70 em células HEp-2. Na imagem à esquerda os
nucléolos são negativos enquanto que na imagem à direita são positivos. Em ambas as imagens verificase que o padrão é fino granular nuclear, com cromossomas positivos em células em mitose.
Auto-Anticorpo Associado:
 Scl-70 – Produto funcional da degradação da Topoisomerase I, cuja
função é desenrolar o DNA antes da actuação da DNA Polimerase.
Associação Clínica:
 Escleroderma difusa;
 LES;
 Fenómeno de Raynaud.
2.2.
Outros Auto-anticorpos
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células em
interfase. Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses positivas.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
115 |
Auto-Imunidade
Frequentemente associado a padrão homogéneo, o que poderá encobrir o padrão
fino granular. Desconfiar da existência de padrão fino granular com homogéneo se as
mitoses forem positivas.
Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2. Mitoses positivas mas cromossomas
negativos em duas células em metafase.
Tecido hepático de macaco:
Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células ou
ausência de positividade.
A vantagem do uso deste tecido verifica-se quando pelas células HEp-2 não se
consegue perceber se se trata de um padrão homogéneo ou fino granular (a dúvida surge
sobretudo para títulos baixos de 1:160). Neste caso, se o núcleo das células hepáticas
não apresentar positividade, confirma tratar-se de um padrão fino granular, visto que o
padrão homogéneo é sempre positivo no fígado, enquanto que o padrão fino granular
pode ou não sê-lo.
Auto-Anticorpos Associados:
 SS-A (Ro52 e Ro60) – Duas ribonucleoproteínas de 52 e 60 kDa
associadas a uma das quatro Y-RNAs; está envolvida no processamento
do RNAm. Por vezes desnatura durante a fixação das células HEp-2, não
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
116 |
Auto-Imunidade
sendo possível a sua visualização; uma boa fixação é exigida para a sua
visualização;
 SS-B (La) – Proteína de 48 kDa associada a vários RNAs. Envolvida na
transcrição da RNA polimerase III;
 Mi-2;
 RNA Polimerase II e III;
Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B. Estes auto-anticorpos estão frequentemente
associados.
Associação Clínica:
 LES Neonatal (SS-A, SS-B);
 Síndrome de Sjögren (SS-A, SS-B, RNA Polimerase II e III);
 Escleroderma Difusa (RNA Polimerase II e III; SS-A; SS-B,);
 Dermatomiosite (Mi-2);
 AR;
 DMTC;
 Miosites;
 Hepatite Auto-Imune tipo 1.
3.
Padrão Nuclear Granular
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
117 |
Auto-Imunidade
Distribuição uniforme em todo o núcleo de grânulos médios ou grandes nas
células em interfase, sendo visível o contorno nuclear (o que é importante para a
distinção do padrão matriz). Em células em mitose cromossomas negativos e mitoses
positivas.
Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. Mitoses positivas e cromossomas negativos em
duas células em metafase e em uma célula em anafase.
Tecido hepático de macaco:
Distribuição uniforme de grânulos médios ou grossos em todo o núcleo nas
células ou ausência de positividade.
Auto-Anticorpos Associados:
 Sm – Constitui 8 polipéptidos do complexo Sm-U1-snRNP;
 U1-snRNP ou snRNP - “Small nuclear riboproteins”;
Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP. Este complexo facilita a produção de RNAm maduro.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
118 |
Auto-Imunidade
Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2, visto que estes dois padrões são
indistintos, uma vez que os auto-anticorpos pertencem ao mesmo complexo nucleoproteico.
Associação Clínica:
 LES (Sm – 99% de especificidade, encontrando-se em 20% dos
pacientes com LES, U1/2-snRNP);
 DMTC (U1-snRNP – 95-100%, ausência de Sm);
 Escleroderma (U1-snRNP).
4.
Padrão PCNA
Descrição do Padrão:
Células HEp-2
Padrão fino granular ou granular intensamente fluorescente em cerca de 60% das
células em interfase (fase S e G2). As restantes células em interfase (G1) não exibem
fluorescência. Nucléolos negativos. Mitose e cromossomas negativos em células em
divisão celular.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
119 |
Auto-Imunidade
Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2.
Auto-Anticorpo Associado:
 PCNA (Ciclina) – “Proliferating cell nuclear antigen”. A sua produção
aumenta logo antes da fase S do ciclo celular, daí que as células em fase
S apresentem intensa fluorescência. Envolvida na replicação e reparação
do DNA.
Associação Clínica:
 LES (PCNA só aparece em 3-6% de doentes com LES mas é muito
específico para LES) – frequentemente associado a glomerulonefrite.
5.
Padrão Matriz Nuclear
Descrição do Padrão:
Células HEp-2
Nas células em interfase grânulos grandes distribuídos pela zona central no
núcleo; a periferia do núcleo não apresenta fluorescência, não sendo visível o contorno
nuclear (ou contrário do que acontece no padrão granular). Assemelha-se a múltiplos
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
120 |
Auto-Imunidade
dots nucleares mas mais grossos ou a uma rede nuclear esponjosa. Nucléolos negativos
(mas vêem-se os contornos dos nucléolos, o que poderá distinguir este padrão do padrão
centrómeros, em que as células estão em divisão, não se visualizando por isso o
contorno dos nucléolos). Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses
positivas.
Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2. Reparar no detalhe da imagem à direita que
o contorno nuclear não é nítido, ao contrário do que se passa no padrão granular nuclear.
Auto-Anticorpos Associados:
 hnRNP (A1, A2, B1, B2, C1 e C2) – Proteínas Ribonucleares
heterogéneas. Trata-se de um conjunto de proteínas nucleares insolúveis
resistentes a DNAses, RNAses e tratamento salino.
Associação Clínica:
 LES;
 AR;
 Escleroderma;
 DMTC.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
121 |
Auto-Imunidade
6.
Padrão Membrana Nuclear
Descrição do Padrão:
Células HEp-2
Fluorescência fina e linear da membrana nuclear presente nas células em
interfase e algumas células em mitose (profase e telofase). Nucléolos negativos. Células
em mitose com cromossomas negativos (distinção do Padrão Periférico Nuclear) e
mitoses positivas.
Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear. Observa-se uma célula em telofase em que uma fina
membrana rodeia os dois núcleos jovens das futuras células filhas.
Tecido hepático de macaco:
Este padrão é mais facilmente visível no tecido hepático do que nas células HEp2, onde se pode por vezes confundir o padrão membranar nuclear com o homogéneo
nuclear. No tecido hepático apenas se visualiza um halo em torno dos núcleos das
células.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
122 |
Auto-Imunidade
Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco.
Auto-Anticorpos Associados:
 Lâmina A, B1, B2, C – Sítios de ancoragem dos cromossomas durante a
interfase.
Associação Clínica:
 LES associado a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);
 Vasculites associadas a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);
 Hepatite Autoimune tipo 1.
7.
Padrão Poros da Membrana Nuclear
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Membrana nuclear com grânulos finos ou mais grossos (tipo dots) nas células
em interfase que se observam focando e desfocando a preparação; é como se a
membrana nuclear apresentasse interrupções; padrão fino granular. Durante a mitose os
cromossomas são negativos e as mitoses são positivas, apresentando um padrão fino
granular denso. Auto-anticorpos anti-mitocondriais estão frequentemente associados
(padrão citoplasmático).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
123 |
Auto-Imunidade
Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear.
Auto-Anticorpos Associados:
 gp210 – Glicoproteína de 210 kDa que entra na constituição do
complexo proteico que forma o poro nuclear, cuja função é a de permitir
o movimento de substâncias entre o núcleo e o citoplasma da célula;
 Nucleopurina p62 – Apresenta a mesma função que a gp210;
Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear.
Associação Clínica:
 Polimiosite (é raro estar presente);
 Cirrose Biliar Primária (doença mais avançada quando a gp210 está
presente, mas é raro estar presente).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
124 |
Auto-Imunidade
8.
Padrão Nucleolar
Associação Clínica:
Qualquer sub-tipo de padrão nucleolar está geralmemte associado a esclerose
sistémica ou alguma patologia do mesmo forro clínico.
8.1.
Padrão Nucleolar Homogéneo:
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Nucléolos positivos homogeneamente fluorescentes, associado a um padrão
fraco homogéneo ou fino granular do núcleo nas células em interfase. Em mitose os
cromossomas são negativos.
Por vezes associado a padrão centrómeros.
Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 PM-Scl – Complexo polipeptídico envolvido na biossíntese ribossomal.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
125 |
Auto-Imunidade
Associação Clínica:
 DMTC (25-50% dos casos), sendo menos frequente nas manifestações
isoladas destas patologias;
 Escleroderma Difusa com envolvimento renal.
8.2.
Padrão Nucleolar Clumpy:
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Largos grânulos agrupados em cada nucléolo com aspecto homogéneo nas
células em interfase. Geralmente não existe fluorescência do restante núcleo, embora
dots nucleares possam ser visíveis. Em mitose os cromossomas são positivos.
Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2. Visualiza-se uma célula em mitose
com os cromossomas positivos.
Auto-Anticorpos Associados:
 Fibrilharina 1 (U3-nRNP) – Subunidade proteica das pequenas
ribonucleoproteinas nucleolares (snoRNP); envolvida no processamento
do RNA ribossómico.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
126 |
Auto-Imunidade
Associação Clínica:
 Escleroderma Difusa (presente em 5-10% dos casos, sendo altamente
específico), sobretudo em homens jovens.
8.3.
Padrão Nucleolar Fino Granular
Descrição do Padrão:
Células HEp-2
Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose
visualizam-se raros pontos brilhantes na zona dos cromossomas. Frequentemente
associado a padrão granular no resto do núcleo.
Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 RNA Polimerase I (RNAP I) – Enzima localizada no nucléolo.
Transcreve genes para moléculas precursoras do RNA ribossómico.
Frequente reacção cruzada com RNAP II e III (localização nuclear).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
127 |
Auto-Imunidade
Associação Clínica:
 Escleroderma Difusa (30% dos casos, sendo altamente específico para
esta patologia), sobretudo com envolvimento cutâneo, dos rins e do
coração;
 LES;
 AR;
 DMTC.
8.4.
Padrão Nucleolar Fino Granular com Dots Mitóticos
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose
visualizam-se vários pontos brilhantes na zona dos cromossomas – local que se designa
por NOR, “Nucleolar Organising Regions” (local onde os nucléolos se organizam
depois da mitose).
Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
128 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 NORs (RNA Polimerase I, NOR-90 – factor de transcrição da RNA
Polimerase I, ASE-1).
Associação Clínica:
 LES;
 AR;
 Escleroderma;
 Escleroderma com Fenómeno de Raynaud;
8.5.
Padrão Nucleolar Granular
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Nucléolos com granulação grosseira, podendo parecer homogéneo.
Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2.
Auto-Anticorpo Associado:
 RNA Helicase II – Responsável pelo enrolamento do DNA.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
129 |
Auto-Imunidade
Associação Clínica:
 LES;
 Escleroderma;
 DMTC.
Padrão Dots Nucleares (NSP1 – “Nuclear Speckled type 1”)
9.
9.1.
Poucos Dots Nucleares
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Dois a seis dots (pontos) nucleares discretos em células em interfase,
frequentemente perto dos nucléolos. Células em mitose com cromossomas negativos e
mitoses frequentemente negativas.
Geralmente associado a padrões granulares ou nucleolares nucleares ou a
padrões citoplasmáticos (mitocondrial ou actina), embora seja um padrão muito raro.
Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
130 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 p80-coilina – snRNP associado a fibrilarina; maturação do snRNP e seu
transporte do núcleo para o citoplasma.
Associação Clínica:
 Hepatite Autoimune tipo1;
 Cirrose Biliar Primária (30% dos casos) (frequentemente associado a padrão
mitocondrial).
9.2.
Múltiplos Dots Nucleares
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Mais de seis dots nucleares (geralmente até dez) por cada célula HEp-2 em
interfase, geralmente separados dos nucléolos. Células em mitose com mitoses positivas
mas com cromossomas negativos, o que permite a sua distinção do padrão centrómeros
onde os cromossomas são positivos.
Por vezes associado a padrão mitocondrial.
Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2. Nas células em mitose observamse cromossomas negativos (ao contrário do que acontece no padrão centrómeros) e mitoses positivas.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
131 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 sp100 – Proteína de função desconhecida;
 PML (“Promyelocytic Leukaemia Protein”).
Associação Clínica:
 Cirrose Biliar Primária (>30% dos casos) (frequentemente associado a
padrão mitocondrial);
 LES;
 Síndrome de Sjögren, sobretudo se associado a Cirrose Biliar Primária;
 Colangite Esclerosante Primária.
10.
Padrão Centrómeros
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Muitos dots discretos distribuídos por todo o núcleo das células em interfase.
Células em mitose com os cromossomas positivos, mas como que às riscas,
correspondendo à zona dos centrómeros dos cromossomas condensados (característica
única deste padrão).
Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2. Para além dos múltiplos dots nucleares em
células em interfase, verifica-se que os cromossomas são positivos mas tracejados (característica única
deste padrão) em células em mitose.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
132 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 Centrómeros (ACA – “anti-centromere antibody”) – Zona central dos
cromossomas. Existem quatro tipos de proteínas centroméricas: CENPA, CENP-B (mais frequentes) e CENP-C e CENP-D (mais raras). O
padrão não é visível por existência de auto-anticorpos anti-CENP-F.
Figura 64 – Diagrama ilustrativo da localização das proteínas centroméricas. A localização do
CENP-D não está definida.
Associação Clínica:
 CREST (em 55% dos casos);
 Síndrome de Sjögren (infrequente);
 Esclerose Difusa;
 Fenómeno de Raynaud.
11.
Padrão Centríolos/Centrossomas
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Em células em interfase visualiza-se um ou dois pontos no citoplasma junto ao
núcleo. Células em metafase exibem dois pontos, um em cada pólo do núcleo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
133 |
Auto-Imunidade
Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Centríolo / Centrossoma – Conjunto de proteínas (PCM-1, pericentrina,
Cep250) importantes na organização do citosqueleto em interfase; sítio a
partir do qual os microtúbulos se polimerizam para formar o fuso
acromático.
Associação Clínica:
 Síndrome de Sjögren;
 Escleroderma;
 Fenómeno de Raynaud.
NOTAR que muitas vezes este padrão surge após uma infecção viral.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
134 |
Auto-Imunidade
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO
1.
Padrão Mitocondrial
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Citoplasma rendilhado, como as contas de um rosário.
Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial.
Auto-Anticorpos Associados:
 Mitocôndrias, das quais a M2 (inclui o complexo piruvato desidrogenase – PDC
– e outras proteínas) é a mais frequentemente detectada, mas também se detecta
M3 e M6 (M1 e M5 não são detectados em células HEp-2).
Associação Clínica:
 Cirrose Biliar Primária (95% dos doentes apresentam M2);
 LES induzido por drogas (M3 e M6);
 Síndrome de Sjögren;
 Escleroderma;
 Fenómeno de Raynaud.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
135 |
Auto-Imunidade
2.
Padrão Actina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Finas fibras fluorescentes que atravessam o núcleo e o citoplasma das células.
Frequentemente associado a dots nucleares. Dificilmente visível nestas células, devendo
utilizar-se outro substrato para se confirmar um caso suspeito. Semelhante aos padrões
tropomiosina, vinculina, vimentina e citoqueratina, todos sem significado clínico.
Figura 67 – Padrão Actina nas células HEp-2. Geralmente a imagem ao vivo não é tão evidente
como a aqui ilustrada, sendo facilmente confundida com os padrões tropomiosina, vinculina, vimentina e
citoqueratina.
Auto-Anticorpos Associados:
 Actina – Subunidade dos microfilamentos do citoesqueleto, envolvidos nos
movimentos celulares, como a contracção muscular e movimentos
intracitoplasmáticos.
Associação Clínica:
 Hepatite Auto-Imune tipo 1;
 DMTC;
 Cirrose Biliar Primária.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
136 |
Auto-Imunidade
NOTAR que apenas títulos elevados são significativos, já que baixos títulos podem
relacionar-se com uma infecção viral (exº: mononucleose).
3.
Padrão Jo-1:
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Finas granulações dispersas por todo o citoplasma, sendo menos evidentes na
periferia do mesmo e mais evidentes junto ao núcleo.
Difícil de visualizar em células HEp-2. Semelhante aos padrões lisossomal e
peroxissomal, ambos sem interesse clínico.
Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2. Este padrão é por vezes confundido com os padrões
lisossomal e peroxissomal.
Auto-Anticorpos Associados:
 Jo-1 (anti-PL1) – Enzima citoplasmática responsável pela ligação da
histidina ao RNA transferência (sintetase do RNAt).
Associação Clínica:
 Polimiosites (20 a 40% dos casos);
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
137 |
Auto-Imunidade
 Dermatomiosites, mais raramente.
Sobretudo associado a doença intersticial pulmonar.
Padrão SRP (“Signal Recognition Particle”)
4.
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Citoplasma com padrão fino granular ou granular, sem fluorescência do núcleo ou
nucléolos.
Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Signal Recognition Particle (SRP) – Complexo ribonucleoproteico que
direcciona proteínas recém-formadas para o retículo endoplasmático; trata-se
de um receptor para os péptidos proteicos localizado no retículo
endoplasmático.
Associação Clínica:
 Polimiosites;
 Dermatomiosites.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
138 |
Auto-Imunidade
5.
Padrão Ribossomal
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Citoplasma com padrão fino granular, granular ou quase homogéneo, muito denso
(quase totalmente preenchido), com acentuação perinuclear. Fluorescência nucleolar
com núcleos sem fluorescência.
Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Ribossomais – Três fosfoproteínas ribossomais (P0, P1 e P2) existentes nos
nucléolos e transferidas para o citoplasma. Formam um domínio GTPase
numa subunidade dos ribossomas.
Associação Clínica:
 LES (10-20% dos casos, por vezes sem DNAds), sobretudo com
envolvimento do SNC.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
139 |
Auto-Imunidade
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO
1.
Padrão Complexo de Golgi
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Padrão composto por largos grânulos irregulares e polares na parte mais interna do
citoplasma adjacentes a uma parte do núcleo.
Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Golgi – Conjunto de proteínas com interesse na organização das membranas
do Golgi.
Associação Clínica:
 LES (raramente associado);
 Síndrome de Sjögren (raramente associado).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
140 |
Auto-Imunidade
2.
Padrão Tropomiosina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Fibras citoplasmáticas tipo Actina parecendo manter a célula sob tensão.
Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Tropomiosina – Associada à actina, sendo importante na contracção muscular.
3.
Padrão Vinculina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Fibras citoplasmáticas semelhantes à actina. Nas células em mitose o padrão é
citoplasmático granular, descartando-se, assim, a hipótese de se tratar de uma actina.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
141 |
Auto-Imunidade
Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2. Observa-se uma célula em mitose com o
citoplasma granulat, afastando-se a hipótese de se tratar de uma actina.
Auto-Anticorpos Associados:
 Vinculina – Proteína localizada nas junções aderentes, sendo importante na
ligação dos microfilamentos à membrana celular.
4.
Padrão Vimentina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Abundante quantidade de fibras citoplasmáticas, que parecem ligar-se à membrana
nuclear e citoplasmática.
Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
142 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 Vimentina – Filamento do citosqueleto de função desconhecida.
5.
Padrão Citoqueratina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Filamemtos citoplasmáticos de forma reticular nas células em interfase. Nas células
em mitose os filamentos partem-se, apresentando aspecto granular.
Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Citoqueratina.
6.
Padrão Desmina
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
143 |
Auto-Imunidade
Finos filamentos citoplasmáticos que parece formarem uma malha de suporte à
maquinaria contráctil da célula. Mitoses positivas em células em mitose.
Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Proteína filamentosa tipo III
7.
Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Extensões fibrosas curtas do citoplasma das células, ligando os filamentos do
citosqueleto à membrana plasmática da célula e à matriz extracelular de células
vizinhas.
Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
144 |
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Associados:
 Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto (Tensina, Paxilina, Zixina) – Proteínas
importantes na adesão celular, na morfogénese, na motilidade celular e na
regulação de estruturas membranares.
8.
Padrão Lisossomal
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Granulação grande e irregular distribuída por todo o citoplasma.
Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Anticorpos anti-lisossomais.
9.
Padrão Peroxissomal
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
145 |
Auto-Imunidade
Granulação fina e uniforme distribuída aleatoriamente no citoplasma.
Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2.
Auto-Anticorpos Associados:
 Desconhecidos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
146 |
Auto-Imunidade
Auto-Ac Nuclear
Padrão Nuclear
Patologia(s)
de Maior Interesse
Outras Patologias
Outras Situações
DNAds
Homogéneo
(cromossomas +)
LES
AR
Tratamento com TNFα
DNAss e
Nucleossoma
Homogéneo
(cromossomas +)
LES; Hepatite Auto-Imune
1
Tratamento com TNFα
LES induzido por
drogas
LES; Escleroderma;
Hepatite Auto-Imune 1
Tratamento com TNFα
Escleroderma
Difusa
LES; CREST; Fenómeno de
Raynaud;
DNP (histonas)
Scl-70
Homogéneo
(cromossomas +)
Fino Granular
(nucléolos +/-;
cromossomas +)
SS-A (Ro)
Fino Granular
(mitoses +)
LES Neonatal; SS
SS-B (La)
Fino Granular
(mitoses +)
LES Neonatal; SS
RNA Polimerase
II e III
Fino Granular
(mitoses +)
Escleroderma
Difusa
Mi-2
Fino Granular
(mitoses +)
Dermatomiosite
Sm
Granular
(mitoses +)
LES
U1-snRNP
PCNA
hnRNP
Granular
(mitoses +)
Fino Granular /
Granular (interfase + /-;
mitoses +)
Matriz
(mitoses +)
DMTC
gp210 e
nucleopurina
p62
Poros Membrana
Nuclear
(mitoses +)
PM-Scl
Nucleolar Homogéneo
DMTC
Fibrilharina 1
(U3-nRNP)
Nucleolar Clumpy
(cromossomas +)
Nucleolar Fino
Granular
(poucos dots nos
cromossomas)
Nucleolar Fino
Granular com Dots
(muitos dots nos
cromossomas)
Escleroderma
Difusa
NOR
Doenças Sistémicas;
Paragem Cardíaca
Hepatite Crónica B ou C;
Linfomas
LES; AR; Escleroderma;
DMTC
LES; Vasculites associadas
a outra patologia; Hepatite
Auto-Imune 1
Membranar Nuclear
(mitoses +)
Doenças Sistémicas;
Paragem Cardíaca
LES; Escleroderma
LES
Lâmina A, B,
B2, C
RNA Polimerase
I
LES; Escleroderma;
Miosites; DMTC; Hepatite
Autoimune 1
LES; Escleroderma;
DMTC; Hepatite
Autoimune 1
LES; AR; SS; CREST;
DMTC
Trombocitopénia; Anemia;
Síndrome de Cansaço
Crónico
Polimiosite; Cirrose Biliar
Primária
Escleroderma
Difusa
Escleroderma Difusa com
envolvimento renal
Carcinoma Hepatocelular
LES; AR; DMTC
LES; AR; Escleroderma
Difusa; Fenómeno de
Raynaud
Neoplasias (sobretudo
hepatocelular)
RNA Helicase II
Nucleolar Granular
LES; Escleroderma; DMTC
Ectasia Gástrica Vascular
Antral
p80-coilina
NSP1 (poucos dots
nucleares)
Hepatite Crónica
Autoimune 1; Cirrose Biliar
Primária
Doença Viral Hepática
ACA
(centrómeros)
NSP1 (muitos dots
nucleares)
(mitoses +)
Centrómeros
(cromossomas + riscas)
Centríolo
Centríolo
SS; Escleroderma;
Fenómeno de Raynaud
Ku
Ku
LES; Polimiosite com
Escleroderma
MSA-2
Midbody
Escleroderma; Fenómeno de
Raynaud;
sp100 e PML
Cirrose Biliar
Primária
LES; SS; Colangite
Esclerosante Primária
CREST
SS; Esclerose Difusa;
Fenómeno de Raynaud
Infecção viral (EBV,
CMV); Diversas Afecções
Estado Inflamatório
Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos. A azul apontam-se as patologias para as quais
os ANAs são específicos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
147 |
Auto-Imunidade
Auto-Ac
Citoplasmático
Padrão
Citoplasmático
Patologia Interesse
Mitocôndrias
(M2; M3; M6)
Mitocondrial
Cirrose Biliar
Primária
Actina
Actina
Jo-1
Jo-1
SRP
SRP
Polimiosite;
Dermatomiosite
(rara associação)
Ribossoma
Ribossomal
(nucléolos +)
LES
Golgi
Golgi
LES; SS
Hepatite Autoimune
1
(elevados títulos)
Polimiosite;
Dermatomiosite,
sobretudo com
fibrose pulmonar
Outras Patologias
LES; SS;
Escleroderma;
Fenómeno de
Raynaud;
DMTC; Cirrose
Biliar Primária
(elevados títulos)
Outras Situações
Infecção viral (baixos
títulos)
Sintomas
Neuropsiquiátricos?
Doenças Crónicas
Reumáticas;
Desgenerescência
(Esclerose Múltipla);
Ataxia Cerebral;
Neoplasias
Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. A
azul apontam-se as patologias para as quais os auto-anticorpos anti-citoplasmáticos são específicos.
3.1.3.2.Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae
Os auto-anticorpos anti-DNAds são específicos para o LES, raramente estando
presentes em doentes com outras DAI. O título destes auto-anticorpos está directamente
relacionado com a actividade da doença, tendendo a desaparecer durante os tratamentos
imunossupressores e durante a remissão clínica, daí a sua importância para o
diagnóstico e monitorização clínica. Outros auto-anticorpos presentes no LES não são
específicos da patologia podendo manifestar-se noutras doenças, ou o seu título não se
relaciona com o estado da doença.
As células HEp-2 podem ser utilizadas para a pesquisa de auto-anticorpos antiDNAds, como já referido, mas os padrões raramente são específicos. O padrão
homogéneo, característico dos auto-anticorpos anti-DNAds, também ocorre para os
auto-anticorpos anti-DNAss, anti-histonas e anti-nucleossoma – auto-anticorpos que não
só se podem manifestar no LES como em outras patologias. Assim, sempre que o
clínico faz um pedido específico de auto-anticorpos anti-DNAds, em vez de se recorrer
às células HEp-2 como substrato de imunofluorescência indirecta, no HCC recorre-se às
lâminas com Crithidia luciliae.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
148 |
Auto-Imunidade
A Crithidia luciliae é um protozoário unicelular e uniflagelado que apresenta
uma mitocôndria gigante – o cinetoplasto – que contém apenas elevadas quantidades
DNAds, e não DNAss, histonas ou nucleossoma. Assim, recorrendo-se a este organismo
como substrato antigénico da imunofluorescência indirecta, no caso do cinetoplasmo
apresentar fluorescência garante-se a presença de auto-anticorpos anti-DNAds no soro
do doente. Trata-se, portanto, de um ensaio altamente específico para a pesquisa destes
auto-anticorpos (95%), embora pouco sensível (70%).
Para além do cinetoplato, o protozoário apresenta um núcleo, onde se pode
encontrar tanto DNAds, como outro tipo de material genético. Assim, se o núcleo
apresentar fluorescência o resultado não é necessariamente positivo para DNAds. Não é
também invulgar a zona de inserção do flagelo brilhar, podendo este brilho confundir-se
com o cinetoplasto. Assim, importa, esclarecer que só se o cinetoplasto brilhar,
independentemente do núcleo ou zona de inserção do flagelo brilharem ou não, o
resultado é positivo para DNAds.
Se 2/3 dos cinetoplastos das células da lâmina apresentarem fluorescência o
resultado é dado como positivo; se apenas 1/3 brilhar o resultado é dado como negativo;
se 1/2 brilhar é conveniente repetir o ensaio.
A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:10 – título a partir do qual se
poderá considerar clinicamente significativa a presença de DNAds por estudos feitos em
pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra
efectuada poder-se-iam efectuar diluições sucessivas até que se deixasse de observar
fluorescência, a fim de se obter uma quantificação semi-quantitativa do DNAds. No
entanto, sempre que um resultado é positivo por imunofluorescência indirecta, dado a
elevada relação entre os títulos de DNAds e a actividade do LES, opta-se no HCC por
se fazer uma posterior quantificação rigorosa por métodos de ELISA.
Base de inserção do
flagelo
Núcleo
Cinetoplasto (só
DNAds)
Flagelo
Figura 80 – Esquema representativo do protozoário Crithidia luciliae. O cinetoplasto localiza-se
no terço superior da Crithidia luciliae, quase junto à zona de inserção do flagelo. O núcleo, de maiores
dimensões, localiza-se numa zona mais inferior do organismo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
149 |
Auto-Imunidade
Figura 81 – À esquerda, imagem de um resultado positivo para DNAds; verifica-se fluorescência
em todos os cinetoplastos das células de Crithidia luciliae (o núcleo e a zona de inserção do flagelo
também brilham, neste caso). À direita, resultado negativo; geralmente a zona de inserção do flagelo
brilha quando os resultados são negativos.
3.1.3.3.Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos
Para a pesquisa de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos as células HEp-2 não
constituem o substrato ideal. O ideal é recorrer a tecidos onde geralmente se encontrem
os auto-anticorpos que se pretende identificar. Isto é, por exemplo, se se pretender
averiguar a presença de auto-anticorpos anti-células parietais deve utilizar-se como
substrato tecido gástrico, onde se encontram as células parietais.
O tecido utilizado poderá ser de rato ou de macaco. O tecido de rato apresenta a
desvantagem de não ter uma homologia elevada em relação ao tecido humano, o que
significa que a ligação “antigénio do tecido de rato – IgG do soro do paciente” não é
perfeita; pode, portanto, verificar-se a ligação de anticorpos inespecíficos (heterófilos)
humanos aos antigénios do tecido do rato, o que conduzirá a falsos resultados positivos
(fluorescência inespecífica). O tecido de macaco, por apresentar elevada homologia com
o humano, garante que só as IgG do soro do paciente elevadamente complementares aos
antigénios do tecido de macaco se liguem; observa-se, assim, menos fluorescência de
fundo inespecífica.
Tecido hepático, renal e estomacal constituem os substratos tradicionais para a
pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos, onde se pode avaliar a presença
destes auto-anticorpos mais frequentes e com maior significado clínico.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
150 |
Auto-Imunidade
No HCC, sempre que é feito um pedido de pesquisa de auto-anticorpos anticitoplasmáticos, recorre-se a um kit que apresenta em cada poçeto da lâmina seis tecidos
diferentes: células Hep-2, tecido hepático de macaco, tecido hepático de rato, tecido
renal de rato, tecido gástrico de rato e células VSM47.
Cada amostra é diluída a 1:40 e, depois de se realizar a técnica de
imunofluorescência indirecta, a amostra é avaliada em cada um destes seis tipos de
tecidos. A fluorescência que o conjunto dos seis tecidos apresentarem irá permitir
identificar o auto-anticorpo anti-citoplasmático eventualmente presente. No caso de se
verificar a presença de um ANA nas células HEp-2, tal também é mencionado ao
clínico.
Para cada um dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos com interesse clínico,
segue-se a descrição do padrão de fluorescência característico para cada tecido negativo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
151 |
Auto-Imunidade
Células HEp-2
Tecido hepático
de macaco
Tecido renal
de rato
Tecido hepático de
rato
Tecido gástrico
de rato
Células VSM47
Células parietais
Trabéculas
Muscularis
mucosa
Figura 82 – Esquema que ilustra a posição dos seis tipos de tecidos em cada poçeto da lâmina.
As imagens correspondem aos tecidos sem fluorescência (negativos).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
152 |
Auto-Imunidade
1.
Auto-Anticorpos Anti-Mitocondriais (AMA)
Os auto-anticorpos anti-mitocondriais (AMA) constituem a marca de uma
Cirrose Biliar Primária. 95% dos pacientes com esta patologia apresentam elevados
títulos destes anticorpos.
De entre os nove tipos de AMA existentes (M1 a M9), os auto-anticorpos antiM2 contra o complexo enzimático da desidrogenase láctica são os mais importantes,
uma vez que estão presentes em cerca de 96% dos casos de Cirrose Biliar Primária,
estando presentes em não mais de 30% de outras patologias hepáticas crónicas. Para
além dos M2, também os auto-anticorpos anti-M4, M8 e M9 se associam à mesma
patologia, embora estejam presentes numa menor percentagem de casos.
Os títulos de AMA não se correlacionam com o estadio da doença ou com o seu
prognóstico, não tendo, por isso, significado a sua quantificação.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
153 |
Auto-Imunidade
AMA
Patologias Associadas
Prevalência
LES
50%
AR, Esclerose Sistémica, S. Sjögren, S.
Sharp
5 – 15%
Cirrose Biliar Primária
> 96%
Outras doenças crónicas hepáticas
30%
Esclerose Sistémica
7 – 25%
M3
Síndrome Pseudo-Lúpus; LES induzido
por drogas
100%
M4
Cirrose Biliar Primária
> 55%
M5
Doenças do Colagénio
raro
M6
Hepatite induzida por iproniazida; LES
induzido por drogas
100%
Miocardite aguda
60%
Cardiomiopatias
30%
Cirrose Biliar Primária
> 55%
Cirrose Biliar Primária
37 – 82%
Hepatites
3 – 10%
M1
M2
M7
M8
M9
Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais
(AMAs).
Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de
tecidos para os AMA.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
154 |
Auto-Imunidade
Células HEp-2
Tecido hepático
Padrão
citoplasmático
rendilhado
Tecido renal
de rato
Glomérulo
negativo
Túbulos com
fluorescência granular
basal
Tecido gástrico
de rato
Hepatócitos com
fluorescência
granular
Células VSM47
Células parietais
positivas
Trabéculas
negativas
Muscularis
mucosa
Padrão
citoplasmático
rendilhado
negativa
Figura 83 – Padrões de fluorescência caraterísticos para os AMA. Células HEp-2 e VSM47
com padrão citoplasmático rendilhado, fazendo lembrar um rosário; não é invulgar a associação deste
padrão citoplasmático com a presença de dots nucleares nas células HEp-2, também característico de
Cirrose Biliar Primária. Tecidos hepáticos com o citoplasma dos hepatócitos com padrão granular
(muitos pontinhos). Tecido renal com túbulos com fluorescência granular (sobretudo os distais, embora
na prática, não dê para distinguir e todos pareçam brilhar); brush border (contorno interno dos túbulos)
negativa; glomérulos com fraca ou nenhuma fluorescência. Tecido gástrico com células parietais
positivas; muscularis mucosa negativa; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares)
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
155 |
negativas.
Auto-Imunidade
2.
Auto-Anticorpos Anti-Músculo Liso (ASMA)
Existem vários tipos de fibras que constituem o músculo liso: fibras de actina,
vimentina, vinculina, desmina, citoqueratina, tubulina, entre outras. Os auto-anticorpos
dirigidos contra este tipo de células designam-se, na sua generalidade, por ASMAs.
ASMAs em elevados títulos encontram-se presentes em cerca de 90% dos
pacientes com Hepatite Autoimune tipo I. Contudo, à excepção dos auto-anticorpos
anti-actina, os restantes ASMAs são inespecíficos, podendo encontrar-se em inúmeras
diferentes patologias reumáticas e doenças inflamatórias, bem como em indivíduos
normais.
Assim, só os auto-anticorpos anti-actina apresentam interesse no diagnóstico da
Hepatite Autoimune tipo 1 e se presentes em títulos elevados (> 1:40) são suficientes
como critério de diagnóstico. Por isso, é importante semi-quantificar títulos positivos de
ac. anti-actina em 1:40 ou > 1:40, observando particularmente as células VSM47 – o
substrato ideal para visualizar estes anticorpos.
Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de
tecidos para os auto-anticorpos anti-actina.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
156 |
Auto-Imunidade
Células HEp-2
Tecido hepático
Vasos com média
intensamente
corada
Padrão
citoplasmático
fibroso
Tecido renal de rato
Glomérulos
positivos
áreas
peritubulares
positivas
Tecido gástrico de rato
Hepatócitos com
forma poligonal
por coloração
canalicular
Células VSM47
Muscularis mucosa positiva
média positiva
íntima negativa
Trabéculas positivas
Células parietais negativas
Vasos de tecido gástrico de rato
Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para os anticorpos anti-actina. Células HEp-2 com fibras no
citoplasma que atravessam o núcleo; este substrato não é específico para Ac. anti-actina, podendo confundir-se com outros
ASMAs. Tecido hepático com coloração da actina dos canalículos que rodeiam os hepatócitos, conferindo contornos
poligonais aos hepatócitos (diagrama artificial na imagem); vasos com a média intensamente corada. Tecido renal negativo;
para títulos elevados pode existir reacção cruzada com a tubulina do glomérulo (glomérulos positivos) e as áreas
peritubulares podem apresentar fluorescência às pintinhas ou mesmo tipo espículas (diagrama artificial na imagem). Tecido
gástrico com a Muscularis mucosa positiva; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares) positivas; células
parietais negativas; vasos com a íntima (dentro) negativa e a média intensamente positiva. Células VSM47 (substrato ideal
para os ac. anti-actina) com fibras citoplasmáticas marcadas que atravessam o núcleo da célula; o mesmo não se verifica para
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
157 |
os restantes ASMAS.
Auto-Imunidade
Auto-Anticorpos Anti-Microssomais (LKM – “Liver & Kidney
3.
Microssomes”)
Os auto-anticorpos anti-microssomais são invulgares, podendo encontrar-se em
vários tipos de hepatites; são úteis para a classificação da patologia hepática.
Embora também possa estar presente em caso de hepatite C, o LKM-1 é
considerado o marcador de Hepatite Autoimune tipo II; os ANA e ASMA são
geralmente negativos para este tipo de hepatite autoimune. O LKM-2 está presente em
caso de hepatite induzida por ácido tienílico (fármaco já retirado do mercado). O LKM3 manifesta-se nalguns pacientes com Hepatite Autoimune II e hepatite crónica D. Os
títulos de LKM em hepatites virais tendem a ser mais baixos que os títulos presentes em
hepatites autoimunes.
Qualquer tipo de LKM conduz à fluorescência do tecido hepático (L=liver) e
renal (K=kidney). Contudo, diferentes LKMs conduzem a diferentes tipos de padrões de
fluorescência nestes dois tecidos.
A figura que se segue evidencia o padrão característico do LKM-1 nos seis
tecidos diferentes utilizados, uma vez que este é dos três o LKM com maior interesse
clínico.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
158 |
Auto-Imunidade
Células HEp-2
Tecido hepático
Negativas
Tecido renal
de rato
Túbulos distais
negativos
Túbulos proximais
positivos
Hepatócitos com
citoplasma
positivo e núcleo
negativo
Brush border dos
túbulos proximais
positiva
Células VSM47
Tecido gástrico
de rato
Células parietais
negativas
Muscularis
trabéculas
negativas
Negativas
mucosa
negativa
Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para o LKM1. Tecido hepático com o
citoplasma dos hepatócitos completamente fluorescente (mais ainda que o padrão granular
característico das M2); núcleo negativo. Tecido renal com glomérulos negativos e apenas alguns
túbulos positivos - os túbulos proximais e, portanto, os túbulos mais largos, embora a diferenciação seja
difícil de se fazer. Brush border (contorno interno) dos túbulos proximais fortemente positiva (em
pormenor em baixo do tecido renal). Células HEp-2, células VSM47 e tecido gástrico negativos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
159 |
Auto-Imunidade
4.
Auto-Anticorpos Anti-Células Parietais (APCA)
Os auto-anticorpos anti-células parietais estão presentes em quase todos os
doentes que apresentam Gastrite Autoimune do tipo A – Gastrite Atrófica Crónica – e
em cerca de 90% dos doentes com Anemia Perniciosa, sendo úteis no diagnóstico
destas patologias. A presença de auto-anticorpos anti-células parietais vai diminuindo
com a progressão da patologia, daí poderem estar ausentes em alguns casos de doença
avançada.
Contudo, estes auto-anticorpos também estão frequentemente presentes em
várias endocrinopatias (exª Tiroidite de Hashimoto, Doença de Graves, Diabetes
Mellitus) e até em indivíduos saudáveis, apresentando, portanto baixa especificidade.
Como tal, o diagnóstico da Gastrite Atrófica Crónica e Anemia Perniciosa deverá
sempre incluir também a pesquisa da presença de auto-anticorpos anti-factor intrínseco.
A figura que se segue evidencia o padrão característico destes auto-anticorpos
nos seis tecidos diferentes utilizados.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
160 |
Auto-Imunidade
Células HEp-2
Tecido hepático
Tecido renal
Tecido gástrico
Muscularis mucosa
negativa
Células parietais
positivas
Células VSM47
Trabéculas negativas
Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para os auto-anticorpos anticélulas parietais (APCA). Só o citoplasma das células parietais do estômago apresenta
positividade (padrão granular). Todas as outras estruturas do tecido gástrico e todos os outros
tecidos são negativos. Contudo, é importante a sua observação (sobretudo das restantes
estruturas gástricas e da brush border do tecido renal) devido à possível presença de anticorpos
heterófilos. Assim, se as células parietais brilharem tanto quanto a Muscularis mucosa no
estômago ou a brush border nos túbulos renais, não se deverá considerar o resultado como
positivo. Também não se deverá considerar uma amostra como positiva se for o núcleo, e não
o citoplasma, das células parietais a apresentar fluorescência; se tal acontecer provavelmente
estra-se-à na presença de um ANA ou de um anticorpo heterófilo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
161 |
Auto-Imunidade
3.1.3.4.Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos
1.
Auto-Anticorpos Anti-Ductos Salivares
Os auto-anticorpos dirigidos contra o citoplasma das células epiteliais das
glândulas salivares estão presentes em cerca de 50% dos pacientes com Síndrome de
Sjögren e menos frequentemente em pacientes com AR (20%), LES (20%) e outros
tipos de DAI. O seu significado clínico é, contudo, incerto. Outros tipos de autoanticorpos frequentemente coexistem, como ANAs (SS-A e SS-B).
O tecido eleito para a sua pesquisa é de glândula paratiroideia de macaco, sendo
este o tecido utilizado no kit executado no HCC. A imagem que se segue ilustra o
padrão característico.
Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares.
Os auto-anticorpos ligam-se a grânulos no citoplasma das células epiteliais dos
ductos salivares, particularmente do lado do lúmen, mas não às células dos ácinos.
Como os doentes frequentemente têm ANAs associados, é possível que o núcleo das
células também apresente fluorescência.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
162 |
Auto-Imunidade
2.
Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de Langerhans (ICAs)
Os auto-anticorpos anti-ilhéus de Langerhans no pâncreas são geralmente
encontrados em doentes com Diabetes Mellitus tipo 1, estando envolvidos na
patogénese da doença. Estão presentes em 70 a 80% dos diagnósticos de novo da
Diabetes Mellitus tipo 1, sobretudo em crianças e desaparecem ao fim de algum tempo
após o diagnóstico. Alguns parentes dos doentes também apresentam estes autoanticorpos.
Para pesquisa dos ICAs utiliza-se no HCC pâncreas de macaco. A figura
seguinte ilustra um resultado positivo.
Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de
Langerhans em pâncreas de macaco.
Existem vários tipos de anticorpos que se podem utilizar. Os da figura são
anticorpos dirigidos contra todo o ilhéu (células β, α e δ). No HCC, os anticorpos
utilizados são apenas dirigidos contra as células β; assim, a fluorescência não é tão
abrangente resumindo-se a conjuntos de cerca de 3 a 4 células.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
163 |
Auto-Imunidade
3.
Auto-Anticorpos Anti-Supra-Renais (ACAs)
Os auto-anticorpos anti-glândulas supra-renais (adrenais) estão na origem de
cerca de 60 a 80% dos casos de Doença de Addison Primária, em que estes autoanticorpos destroem todo o córtex adrenal, instalando-se, assim, insuficiência corticosupra-renal global.
Os auto-anticorpos contra o córtex adrenal são detectados em cerca de 80% dos
pacientes com Doença de Addison, não se correlacionando com a evolução clínica da
doença.
Para pesquisa destes auto-anticorpos o HCC recorre a um kit com tecido de
córtex adrenal de macaco. A imagem seguinte ilustra um resultado positivo.
Cápsula de tecido
conjuntivo
Zona glomerulosa
(aldosterona)
Zona fasciculada
(cortisol)
Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em
córtex adrenal de macaco.
Verifica-se fluorescência, de fora para dentro da glândula, na zona glomerulosa e
na zona fasciculada do córtex adrenal. O corte também inclui a zona reticulada (não
visível na figura); fluorescência nessa zona obriga ao despiste da presença de AMA, que
conferem um padrão semelhante (granular a fino granular) nessa zona.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
164 |
Auto-Imunidade
4.
Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)
O endomísio é uma estrutura de suporte, que rodeia as fibras de músculo
estriado e liso de uma parte do esófago, sendo constituído por reticulina e colagénio. Os
auto-anticorpos dirigidos contra esta estrutura (EMA) encontram-se em várias partes do
corpo humano, como a nível do esófago, estômago, jejuno e fígado.
Os EMA da classe IgA (e raramente da classe IgG e IgM) são altamente
específicos (99%) para doentes com Doença Celíaca não tratada e Dermatite
Herpetiforme de Duhring (geralmente associada com enteropatia sensível ao glúten). A
sua sensibilidade também é elevada (99%), uma vez que raramente são detectados em
indivíduos saudáveis e em doentes com outras patologias intestinais. Revelam-se,
portanto, muito úteis no diagnóstico destas patologias.
Para avaliação da presença dos EMA recorre-se no HCC a um kit que utiliza
como substrato esófago de macaco – tecido onde é mais fácil de interpretar o resultado
do que no estômago. O kit detecta em simultâneo IgA, IgG e IgM.
A figura seguinte ilustra um resultado positivo.
Epitélio negativo
Endomísio positivo
(ninho de abelha)
Muscularis
mucosa negativa
Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)
em esófago de macaco.
O endomísio brilha, apresentando a forma característica de um ninho de abelha.
Localiza-se internamente ao epitélio da membrana mucosa e rodeando a camada de
fibras de músculo liso e estriado que constitui a Muscularis mucosa.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
165 |
Auto-Imunidade
5.
Auto-Anticorpos Anti-Músculo Estriado Esquelético
Os auto-anticorpos anti-músculo estriado esquelético reagem com os elementos
citoplasmáticos contrácteis do músculo. Encontram-se em cerca de 80 a 90% dos
doentes com Myasthenia gravis, sobretudo se acompanhados de timoma. No entanto, só
elevados títulos são relevantes para o diagnóstico, visto também se poderem encontrar
em várias outras formas de miopatia e na doença de Chagas.
O kit utilizado no HCC para a detecção destes auto-anticorpos utiliza músculo
esquelético de macaco. Um resultado positivo aparece como descrito na figura seguinte.
Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado em
músculo esquelético de macaco.
Visualiza-se um padrão fluorescente de estriação típica no citoplasma das fibras
do músculo esquelético. Para além disso, poderá observar-se o contorno fluorescente
das fibras, o que não é característico de positividade, visto também poder ocorrer em
caso de um resultado negativo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
166 |
Auto-Imunidade
3.2.
Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio
em “Sanduíche”
3.2.1. Fundamento
As técnicas de ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assays) são semelhantes
às técnicas de IFA. O suporte sólido é aqui uma placa de microtitulação, em vez de ser
uma lâmina, onde são fixados (em vez dos extractos das células HEp-2) os antigénios
complementares aos auto-anticorpos que se pretendem pesquisar. Os passos da reacção
também incluem a adição da amostra, seguida de incubação e lavagem. Depois
adiciona-se de igual forma o conjugado à amostra, mas desta vez, em vez da anti-IgG
estar ligada a um fluorocromo, está ligada a uma enzima; segue-se nova incubação e
lavagem. Seguidamente adiciona-se à amostra um substrato sobre o qual a enzima tem
capacidade de actuar transformando-o, durante a terceira incubação do processo, num
produto com cor. Por fim adiciona-se uma solução stop a fim de que a reacção de
conversão do substrato em produto da reacção pare simultaneamente para todas as
amostras e as posteriores leituras espectrofotométricas possam ser uniformizadas. O
processo pode ser feito manualmente ou de forma automatizada.
Figura 92 – Esquema Ilustrativo de uma reacção de ELISA. À direita, placa de ELISA.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
167 |
Auto-Imunidade
A medição espectofotométrica da intensidade da cor produzida a um
determinado comprimento de onda permite relacionar a extensão da reacção e,
consequentemente, a quantidade de auto-anticorpos presentes na amostra do doente.
Num ELISA qualitativo, juntamente com as amostras dos doentes, analisa-se no
mesmo ensaio um calibrador que funciona como “cut-off”. Assim, as amostras que
apresentarem valores iguais ou acima do calibrador são consideradas positivas (valor
amostra/valor calibrador = ou > 1), enquanto que as que apresentarem valores abaixo do
calibrador são consideradas negativas (valor amostra/valor calibrador < 1).
Falsos resultados poderão surgir por lavagem insuficiente (falsos positivos) ou
por problemas impossíveis de controlar pelo executor, como a má fixação dos
antigénios à placa de ELISA ou a aderência dos auto-anticorpos da amostra à película
utilizada para ligar os antigénios ao poçeto da placa (e não aos próprios antigénios).
3.2.2. Aplicação
Relativamente aos testes de IFA, os testes de ELISA requerem menos pessoal
especializado, sendo passíveis de automatização completa, mas são mais dispendiosos
que os testes de IFA. Por outro lado, relativamente à sua sensibilidade e especificidade:
- Em comparação aos testes de IFA para células HEp-2, os ELISA são testes
menos sensíveis mas mais específicos. Assim, sempre que um resultado é considerado
positivo por IFA em células HEp-2 justifica-se a confirmação da sua positividade por
um teste de ELISA.
- Em comparação aos testes de IFA para células de Crithidia luciliae, os testes
de ELISA são mais sensíveis e menos específicos, visto que podem ocorrer falsos
resultados positivos para DNAds por ELISA, por desnaturação espontânea do DNAds
em DNAss e consequente quantificação do DNAss como DNAds.
No HCC, sempre que um teste de IFA para células HEp-2 ou células de
Crithidia luciliae é considerado positivo, segue-se a realização de um teste de ELISA
qualitativo (ver Observações e Sugestões 1). Neste teste, cada poçeto da microplaca
está revestido com uma poll de antigénios, considerados os principais marcadores das
DAI. Se o teste for positivo significa que a amostra do doente contém pelo menos um
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
168 |
Auto-Imunidade
dos auto-anticorpos em pesquisa. Este rastreio irá detectar a maioria dos ANAs, mas
haverão sempre algumas amostras com ANAs não contidos no poll que não serão
detectados e que podem ter sido visualizados previamente por IFA.
3.2.3. Ensaios Executados
3.2.3.1.ANA Screen
O teste de ELISA qualitativo utilizado no HCC designa-se por ANA Screen.
Neste teste, para o qual as amostras são diluídas de 1:200, cada poçeto da placa de
ELISA está revestido com uma pool dos antigénios considerados os principais
marcadores das DAI:
- DNAds (LES);
- Histonas (LES Induzido por drogas);
- Scl-70 (Escleroderma Difusa);
- SS-A e SS-B (Síndrome de Sjögren);
- Sm (LES);
- nRNP ou U1snRNP (DMTC);
- Centrómero (CREST);
- Jo-1 (Polimisosites e Dermatomiosites).
Para além destes antigénios, que qualquer teste screening de ELISA contém, o
teste ANA Screen inclui também:
- Proteínas P-Ribossomais ou hnRNP (LES).
Outros testes semelhantes mas de outras casas comerciais contêm, por vezes,
para além dos antigénios principais:
- PCNA (LES);
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
169 |
Auto-Imunidade
- PM-Scl (“Overlap Syndrome: LES, Miosite e Escleroderma);
- Fibrilarina (Escleroderma Difusa);
- Ku (LES; Polimiosite com Escleroderma).
De todos os auto-anticorpos que os testes de ELISA Screen pesquisam, aqueles
para os quais os testes são mais sensíveis são os ENA – anticorpos contra antigénios
nucleares extraíveis (“Extractable Nuclear Antigens”): Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1snRNP e Jo-1. Trata-se de componentes nucleares e citoplasmáticos solúveis que,
tirando o Jo-1, aparecem em IFA com padrão fino granular.
Se a amostra for fracamente positiva por IFA (1:160 para padrões homogéneos e
1:160 ou 1:320 para padrões finos granulares) e negativa para ANA Screen, a marcha
analítica termina por aqui e o resultado é dado como negativo ao clínico. Tal verifica-se
porque, por vezes, em IFA, a observação em ambiente escuro artificial pode conduzir à
sobrevalorização de padrões de fraca intensidade de fluorescência, sendo difícil
distinguir-se um resultado negativo de um fracamente positivo. A aceitação de um
resultado de 1:320 por IFA para um padrão fino granular como negativo se der negativo
por ANA Screen deve-se à elevada sensibilidade deste teste para os ENA.
Em todas as outras situações a marcha analítica prossegue com Immunoblotting
(ver Observações e Sugestões 2).
3.3.
Immunoblotting - Imunodot’s
3.3.1. Fundamento
Trata-se de um ensaio de Western blot, em que as proteínas (antigénios)
extraídas de culturas celulares são separadas por electroforese num gel de
poliacrilamida, sob condições desnaturantes (presença de SDS). As proteínas no gel são
depois electrotransferidas para um papel de nitrocelulose que proporciona um suporte
sólido para os antigénios. O papel de nitrocelulose é seguidamente cortado em tiras de
forma a que cada tira contenha um conjunto de antigénios individualizados (para os
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
170 |
Auto-Imunidade
quais se pretendem pesquisar os respectivos anticorpos) e um controlo interno. Para
cada amostra é, assim, utilizada uma destas tiras.
Vários métodos podem depois ser utilizados a fim de se detectar a ligação
antigénio-anticorpo, nomeadamente um ELISA, como é o caso dos kits utilizado no
HCC.
Nestes kits, as tiras de nitocelulose já vêm preparadas, bastando, apenas, que
sejam hidratadas com tampão por cinco minutos, colocando-se para isso cada tira (uma
para cada amostra e outra para um controlo externo) num dos canais do aparelho.
Segue-se a pipetagem das amostras (diluídas previamente de 1:100) e do controlo
externo. Depois todo o processo é automatizado: incubação de trinta minutos, lavagem
das tiras, segunda incubação de trinta minutos com um conjugado com enzima, nova
lavagem, adição do substrato da reacção e nova incubação de 10 minutos e, por último,
adição de uma solução stop. Após a secagem das tiras, os resultados são lidos num
scanner automático que os quantifica como -, +, ++, ou +++, consoante a intensidade da
coloração negra obtida para cada antigénio. Assim, é possível identificar-se os autoanticorpos presentes na amostra do doente.
Os resultados só serão válidos se para cada tira a zona do controlo interno
apresentar coloração negra e se a tira do controlo externo apresentar coloração para os
auto-anticorpos descritos na bula como pertencentes ao controlo externo.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
171 |
Auto-Imunidade
Figura 93 – Exemplo de tiras utilizadas para vários doentes do kit de Immunoblotting “ANA
Profile”; verifica-se que para todas as tiras o controlo interno está positivo o que permite a aceitação dos
resultados; para o primeiro doente, por exemplo, verifica-se a presença do auto-anticorpo PCNA (tira
negra na zona do respectivo antigénio).
3.3.2. Aplicação
Os dot’s permitem a identificação dos auto-anticorpos presentes na amostra de
um doente. De uma maneira geral, são executados no HCC nas seguintes situações:
 Para pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células de
Crithidia luciliae por IFA:
- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a
identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA
Screen;
- Se a amostra for fortemente positiva por IFA (>1:160), mesmo que seja
negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)
presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem
identificáveis por dot’s;
- Se a amostra for negativa para ANA Screen (independentemente do título
obtido por IFA) mas se se tiver informação clínica do doente que possa indiciar
uma possível positividade por Immunoblotting (por exemplo se o doente tiver
uma miosite, o que pode ser detectado por Immunoblotting e não ser detectado
por ANA Screen, uma vez que o perfil de antigénios pesquisados para miosites
por dot’s é mais alargado que o simples Jo-1 pesquisado por ANA Screen).
 Para pesquisa prévia de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos em seis tipos
diferentes de tecidos por IFA:
- Se se visualizar a presença de algum auto-anticorpo de interesse (AMA,
LKM ou APCA).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
172 |
Auto-Imunidade
3.3.3. Perfis Executados
Existem vários tipos de tiras (dot’s) que podem ser utilizadas para pesquisa de
auto-anticorpos. Cada tipo/perfil de tira contém um determinado conjunto de antigénios.
Os perfis são escolhidos de acordo com os auto-anticorpos que se desconfia que o
doente possa ter.
3.3.3.1.Perfil ANA (“ANA Profile 3”)
É realizado no HCC sempre que se desconfia que o doente tenha um ANA. Isto
é, para a pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células Crithidia
luciliae por IFA:
- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a
identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA Screen;
- Se a amostra for fortemente positiva para um ANA por IFA (>1:160), mesmo
que seja negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)
presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem identificáveis
na ANA Profile 3.
ANA Screen
ANA Profile
Patologia
DNAds
Histonas
DNAds
Histonas
Nucleossoma
Scl-70
SS-A
SS-B
Sm
U1-snRNP
PCNA
hn-RNP
PM-Scl
CENP-B
AMA-M2
Jo-1
LES
LES induzido por drogas
LES
CREST, Escleroderma II
Síndrome de Sjögren
Síndrome de Sjögren
LES
DMTC
LES
LES
Miosite com Escleroderma
CREST; Escleroderma I
Cirrose Biliar Primária
Polimiosite
Scl-70
SS-A
SS-B
Sm
U1-snRNP
hn-RNP
Centrómeros
Jo-1
Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira
do ANA Profile 3.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
173 |
Auto-Imunidade
Uma vez que o ANA Profile 3 possui mais quatro antigénios que o ANA Screen
(nucleossoma, PCNA, PM-Scl e AMA-M2), é possível que um prévio resultado
negativo por ANA Screen dê positivo no ANA Profile para estes auto-anticorpos.
O contrário também se poderá eventualmente verificar, uma vez que a
sensibilidade do ANA Screen para os ENA (Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-snRNP e Jo-1)
é maior que a sensibilidade do ANA Profile. Tal poderá acontecer uma vez que no
processo de desnaturação proteica que os Immunobloting’s envolvem, poder-se-á
destruir a estrutura nativa dos antigénios mais sensíveis ao processo de desnaturação, o
que conduzirá a falsos resultados negativos, uma vez que o auto-anticorpo de soro do
doente poderá não se ligar convenientemente ao antigénio alterado fixado na tira de
nitrocelulose.
3.3.3.2.Perfil Hepático “Liver Profile”
É executado no HCC sempre que:
 Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes
padrões:
- Poros da Membrana Nuclear (possível gp210);
- Múltiplos dots nucleares (possível sp100 ou PML);
- Mitocondrial citoplasmático (possível AMA-M2).
 Por pesquisa anterior em tecidos de auto-antigénios citoplasmáticos se
identificam padrões nos seis tecidos característicos de:
- AMA-M2;
- LKM-1.
 O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil
identifica;
 Se sabe que o doente tem uma patologia hepática.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
174 |
Auto-Imunidade
Perfil Hepático “Liver Profile”
Antigénios
Patologia de Interesse
Outras Patologias
Hepáticas
Outras Patologias
Hepatite C
Esclerose Sistémica
AMA-M2
M2-3E
(sub-unidade da M2 que é o principal
auto-antigénio da CBP; maior
sensibilidade que M2)
Cirrose Biliar Primária
gp210
Colangite Esclerosante
sp100
Primária
PML
Ro-52 (parte do SS-A)
LKM-1
LC-1
(“cytosolic liver antigen type 1”)
LES; S. Sjögren; DMTC
Polimiosite; Colangite
Cirrose Biliar Primária
Hepatite Autoimune I
LES; AR; Esclerose
Hepatite Viral Crónica
Hepatite Autoimune II
Sistémica;S. Sjögren;
DMTC; Polimiosite
Hepatite C
(crianças, sobretudo)
SLA/LP
(”soluble liver antigen/liver-pancreas
Hepatite Autoimune III
antigen”)
Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas.
3.3.3.3.Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”)
É executado no HCC sempre que:
 Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes
padrões:
- Padrões nucleolares (possível PM-Scl) (ver Observações e Sugestões 3);
- Padrão nuclear Ku;
- Padrão citoplasmático Jo-1;
- Padrão citoplasmático SRP.
 O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil
identifica;
 Se sabe que o doente tem uma (poli)miosite.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
175 |
Auto-Imunidade
Perfil Miosites “Myositis Profile 3”
Antigénios Nucleares
Patologia de Interesse
Outras patologias
Ro-52
Miosites
Sistémica;; S. Sjögren; Cirrose Biliar
LES; AR; DMTC; Esclerose
Primária; Hepatite Autoimune
Mi-2
Dermatomiosite
PM-Scl 75
“Overlap Syndome” (polimiosite,
Escleroderma com envolvimento
PM-Scl100
dermatomiosite e esclerose sistémica)
renal
Ku
Polimiosite com Escleroderma
LES
Antigénios Citoplasmáticos
Patologia de Interesse
Outras Patologias
Jo-1
SRP
Polimiosite; Dermatomiosite, sobretudo com
doença intersticial pulmonar
Polimiosite; Dermatomiosite (raramente)
PL-7
PL-12
EJ
Miosites
OJ
Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas (ver
Observações e Sugestões 4).
Excepto o Ro-52 que pode estar presente numa grande variedade de DAI, todos
os outros antigénios apresentam elevada especificidade para miosites.
3.3.3.4.Perfil Gástrico
É executado no HCC sempre que nos seis tecidos executados para rastreio de autoanticorpos citoplasmáticos se desconfia da presença de um APCA.
O teste permite a identificação não só de auto-anticorpos anti-células parietais
(APCA), como de auto-anticorpos anti-factor intrínseco (FI).
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
176 |
Auto-Imunidade
3.4.
Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio
em “Sanduíche”
3.4.1. Fundamento
Os ensaios de ELISA quantitativos são feitos exactamente da mesma forma que
os ELISA qualitativos. A única diferença é que, em vez de se utilizar apenas um
calibrador que serve nos ELISA qualitativos como “cut-off”, utilizam-se vários
calibradores de concentração rigorosamente conhecida que são processados em
simultâneo com as amostras. Com os valores de absorvância obtidos para os diferentes
calibradores é, assim, possível traçar-se uma curva de calibração (absorvância vs
concentração). Determinando-se a absorvância de cada uma das amostras analisadas, é
possível por extrapolação gráfica (manual ou automática) determinar-se a sua
concentração rigorosa.
Absorvância
Figura 94 – Exemplo de uma curva de calibração absorvância vs concentração.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
177 |
Auto-Imunidade
3.4.2. Aplicação
Só para alguns auto-anticorpos é conhecida uma relação directa quantificação /
influência na actividade da patologia. Só para estes auto-anticorpos se justifica utilizar
um ensaio de ELISA quantitativo. Para todos os outros, os ensaios de identificação já
descritos são suficientes.
Justifica-se realizar um ELISA quantitativo só para os auto-anticorpos
seguidamente mencionados:
3.4.2.1.Ac. anti-DNAds
A sua quantificação é importante para o diagnóstico e monitorização de doentes
com LES. A sua presença é indispensável ao diagnóstico da patologia. O seu título está
directamente relacionado com a actividade da doença.
3.4.2.2.Ac. anti-Nucleossoma
A sua quantificação é importante para a monitorização de doentes com LES.
Elevados títulos relacionam-se com elevada actividade da doença e, geralmente, com
envolvimento renal. Por outro lado, 18% dos doentes com LES apresentam este autoanticorpo e não apresentam DNAds.
3.4.2.3.Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM
A sua quantificação é importante no diagnóstico do Síndrome Anti-fosfolipídico.
Só elevados títulos destes auto-anticorpos se relacionam com SAF; baixos títulos poderse-ão relacionar com infecções e outras DAI, como LES, AR, SS, escleroderma e
miosites.
3.4.2.4.Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
178 |
Auto-Imunidade
Estes auto-anticorpos manifestam-se nas vasculites, como no Granulomatose de
Wegener e, por vezes, na Poliangite Microscópica e Poliartrite Nodosa. A sua
quantificação é indispensável na Granulomatose de Wegener. Uma persistência de
cANCA positivo ou um aumento deverá influenciar a terapêutica.
3.4.2.5.Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA
Estes auto-anticorpos manifestam-se em algumas vasculites como na Poliangite
Microscópica e Síndrome Churg-Strauss; por vezes também estão presentes na
Granulomatose de Weneger e Poliartrite Nodosa (ver Observações e Sugestões 5).
3.4.2.6.Ac. anti-CCP
Os auto-anticorpos anti-CCP (“Cyclic Citrullinated Peptides”) são dirigidos contra
péptidos citrulinados cíclicos, para os quais a arginina é substituída pela citrulina. Estão
associados a doentes com AR, apresentando uma sensibilidade de cerca de 78% e uma
especificidade de 98%. Podem aparecer no soro muitos anos antes da instalação da
doença. A sua quantificação é importante para monitorização da doença.
A sua importância enquanto marcadores serológicos é muito maior que o outro
marcador de AR, o Factor Reumatóide (FR), uma vez que as suas sensibilidades para a
patologia são semelhantes, enquanto que a especificidade do anti-CCP é muito mais
elevada, uma vez que o FR está presente em muitas outras situações.
3.4.3. Outros Ensaios Executados
Para além dos auto-anticorpos cuja quantificação tem interesse clínico, o HCC
quantifica outros auto-anticorpos (ver Observações e Sugestões 6).
3.4.3.1.Ac. anti-ICC e anti-C1q
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
179 |
Auto-Imunidade
Sempre que existem ICC (Imuno-Complexos Circulantes), isto é, um antigénio
ligado ao anticorpo complementar em circulação, a fracção C1q do complemento tem a
capacidade de se ligar ao ICC, activando a via comum do complemento. Os ICC não
são específicos de nenhuma patologia, podendo estar presentes em caso de LES, mas
também em caso de doenças reumáticas e outras DAI, doenças infecciosas, alergias ou
neoplasias hematológicas, uma vez que são formados sempre que o sistema imunitário é
activado. Contudo, os auto-anticorpos anti-C1q são específicos de LES.
O presente kit utilizado pelo HCC utiliza como antigénio ligado à placa de ELISA
C1q, detectando em simultâneo ICCs e Ac. anti-C1q. Não apresenta, portanto, grande
valor clínico uma vez que não é específico de LES.
Contudo, existe já no mercado um kit que apenas detecta Ac. anti-C1q, específicos
de LES, sendo este muito mais útil do ponto de vista clínico. Um objectivo futuro do
HCC passa por substituir o kit ICC/C1q pelo kit C1q.
3.4.3.2.Ac. anti-GBM
Os auto-anticorpos anti-GBM (“Glomerular Basement Membrane”) são dirigidos
contra o colagénio tipo IV da membrana basal glomerular renal. Estão associados a
qualquer tipo de glomerulonefrite, incluindo o Síndrome de Goodpasture.
3.4.3.3.Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA)
Os anticorpos anti-endomísio (EMA) são, sem dúvida os anticorpos que apresentam
maior sensibilidade e especificidade para a Doença Celíaca, na ordem dos 99%.
Contudo, a sua análise é feita por IFA, o que implica experiência na técnica.
Os anticorpos anti-Tg são um tipo de EMA, podendo, no entanto, ser determinados
por ELISA (IgA e IgG). A sua sensibilidade (90 a 99%) e especificidade (85 a 99%)
são, contudo, um pouco mais baixas. Ainda assim, são essenciais no diagnóstico da
Doença Celíaca.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
180 |
Auto-Imunidade
Os anticorpos anti-gliadina IgA e IgG foram os primeiros (dos três referidos) a
surgir no mercado. Apresentam menor sensibilidade (90%) e especificidade (85 a 88%)
que os anti-Tg. Contudo, são ainda úteis no diagnóstico desta patologia uma vez que
crianças com menos de dois anos frequentemente não apresentam EMA nem anti-tTg.
São ainda importantes na monitorização da progressão da patologia e na sua relação
com a dieta instituída.
No HCC sempre que o pedido médico inclui EMA, anti-Tg e anti-Gliadina, caso os
anti-Tg IgA já tenham sido feitos e se derem positivo, já não se pesquisam os EMA por
IFA, dando-se o resultado como positivo ao clínico (ver Observações e Sugestões 7).
3.4.3.4.Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180
A desmogleina 1 e 3 são caderinas expressas no epitélio escamoso estratificado. A
desmogleina 1 é o antigénio contra o qual anticorpos são dirigidos no pênfigo foliáceo,
embora também se detecte em 60% dos casos de pênfigo vulgaris. A desmogleina 3 é o
antigénio contra o qual os anticorpos são dirigidos no pênfigo vulgaris, não se
encontrando em doentes com pênfigo foliáceo.
No pênfigo bulhoso verifica-se a produção de auto-anticorpos contra a base da
lesão na pele, como os auto-anticorpo BP 180.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
181 |
Auto-Imunidade
4. O Futuro…
Actualmente, uma vez iniciada a resposta autoimune, a única maneira disponível de
a atenuar/bloquear é por imunossupressão inespecífica.
O objectivo no futuro passa por realizar individualmente para cada doente estudos
proteómicos que permitam:
- Detectar um perfil de auto-anticorpos que representem a “impressão digital” do
doente autoimune, o que pode ser útil para classificar doentes em diferentes subpopulações com diferentes prognósticos;
- Monitorizar o “antigen spreading” que pode conduzir a DAI progressiva e mais
severa, a fim de se melhorar o conhecimento sobre o prognóstico do doente;
- Determinar a especificidade da resposta do auto-anticorpo, o que poderá conduzir
ao aparecimento de terapêuticas específicas para um determinado antigénio;
- Em última instância, identificar um componente celular ou sérico só por si com
potencial para conduzir ao aparecimento posterior de um auto-anticorpo importante para
o diagnóstico de uma DAI, a fim de se ser capaz de evitar (talvez por vacinação) que a
resposta autoimune para um dado antigénio ocorra.
No futuro, pertende-se que aumente o nosso conhecimento sobre a predisposição
genética, sobre biomarcadores precoces que identifiquem indivíduos e populações em
risco e sobre os mecanismos gerais que regulam a resposta imunológica. O verdadeiro
sucesso no tratamento das DAI só virá com estes conhecimentos acrescidos, pois só eles
permitirão que, com uma intervenção precoce, se possa estabelecer a homeostase
imunológica antes que ocorra a destruição tecidular irreversível.
Muito ainda há por saber e fazer…
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
182 |
Auto-Imunidade
5. Observações e Sugestões
1. Os testes de ELISA para DNAds são mais sensíveis e menos específicos que as
células de Crithidia luciliae por IFA para pesquisa do DNAds. Assim, a estagiária
considera que fazer um teste de ANA Screen após um resultado positivo para DNAds
em células Crithidia luciliae revela-se desnecessário. O posterior teste de ELISA
quantitativo é, obviamente, importante.
2. Sempre que um padrão por IFA dá 1:320 / 1:640 / > 1:640 homogéneo ou 1:640 /
> 1:640 fino granular, independentemente do teste de ANA Screen dar positivo ou
negativo, é feito sempre a seguir um Immunoblotting para a amostra. Assim, a
estagiária sugere que nos referidos casos não se realize o teste de ANA Screen e se
passe de imediato ao teste de Immunoblotting adequado à situação.
3. O único auto-anticorpo associado a miosites com padrão nucleolar (nucleolar
homogéneo) é o PM-Scl. Uma vez que este antigénio, embora não esteje incluído no
poll de antigénios do ANA Screen, está incluído no ANA Profile, a estagiária considera
que sempre que se tem um padrão nucleolar poderá optar-se por se fazer ou o ANA
Profile ou o Liver Profile, não sendo necessário realizar os dois ensaios.
4. Uma vez que o antigénio Mi-2 poderá estar associados a miosites e os testes ANA
Screen e ANA Profile não o pesquisam, sempre que o padrão obtido por IFA é fino
granular e os testes ANA Screen e ANA Profile dão ambos negativos poder-se-ia fazer
um Myosite Profile para despiste de um eventual Mi-2.
5. Os ANCAs (anticorpos dirigidos contra os grânulos citoplasmáticos dos
neutrófilos) são clinicamente importantes na assistência a doentes com desordens
vasculares. Existem lâminas no mercado para a sua pesquisa por IFA.
Em lâminas fixas com etanol, os cANCAs (anticorpos anti-citoplasmáticos dos
neutrófilos: Proteinase 3) conferem fluorescência ao citoplasma dos neutrófilos,
enquanto
que
os
pANCAs
(anticorpos
anti-perinucleares
dos
neutrófilos:
mieloperoxidase, lactoferrina, elastase, catepsina, lisozima e β-glucuronidase) conferem
fluorescência em torno do núcleo dos neutrófilos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
183 |
Auto-Imunidade
Figura 95 – ANCAs. À esquerda cANCA. À direita pANCA.
Alguns padrões de ANA (homogéneo nuclear; membranar nuclear) podem, no
entanto, também conferir o mesmo padrão perinuclear, podendo assim confundir-se um
ANA com um pANCA. Assim, sempre que os neutrófilos apresentam fluorescência
perinuclear em lâminas fixas com etanol testa-se a mesma amostra numa lâmina fixa
com formol. O formol irá fazer com que os pANCA se passem a observar-se como
cANCA, com o padrão citoplasmático dos neutrófilos; pelo contrário, o formol não irá
surtir nenhum efeito nalguns ANA (o padrão pANCA mantém-se) e irá destruir outros
ANAs (deixa de se visualizar fluorescência). Assim, só se o padrão perinuclear passar a
padrão citoplasmático na lâmina fixa com formol é que se considera que o doente tem
um pANCA.
A pesquisa de ANCAs por IFA não permite a sua quantificação nem a identificação
da MPO como sendo o pANCA eventualmente presente. Contudo, tratando-se de um
método mais sensível e barato que um teste de ELISA quantitativo, permite um rastreio
inicial, possibilitando que depois só as amostras positivas por IFA sejam quantificadas
por ELISA.
6. Os mesmos kits que são utilizados como ELISA Quantitativos podem ser
utilizados como ELISA Qualitativos, bastando para isso utilizar-se no ensaio apenas um
calibrador (o calibrador recomendado pelo fornecedor), em vez de se utilizarem todos
os calibradores necessários para se traçar a curva de calibração. No caso dos autoanticorpos cuja quantificação não tem interesse clínico (ICC, CCP, GBM, Gliadina e
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
184 |
Auto-Imunidade
Transglutaminase), a estagiária sugeriria a utilização de apenas o calibrador necessário a
um ELISA Qualitativo.
7. A especificidade dos anti-Tg IgA por ELISA (85 a 99%) é mais baixa que a
especificidade dos EMA por IFA (99%). Assim, é possível obter-se um resultado
positivo para anti-Tg IgA que não seja positivo para EMA.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
185 |
Auto-Imunidade
Bibliografia
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2. Bain Barbara J., Leukaemia Diagnosis, third edition, Blackwell, 2003
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5. Bruce Alberts, Johnson Alexander, Lewis Julian, Raff Martin, Roberts Keith, Walter
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7. Dieusaert P., Como Prescrever um Exame Laboratorial – Guia Prático de Análises
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15. Rautenstraub B., Liehr T., FISH Technology, Spinger Lab Manual, 2002
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
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Haematopoietic and Lymphoid Tissues, International Agency for Research on Cancer,
2008
19. Sverre Heim, Felix Mitelman; Wiley-Liss, Cancer Cytogenetics – Chromosomal and
Molecular Genetic Aberrations of Tumor Cells, Elsevier, 1995
20. www.ii.bham.ac.uk
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
187 |
Agradecimentos
A todos os trabalhadores do Laboratório Reymão Pinto, aos
trabalhadores dos diferentes Laboratórios do IPO Porto e aos trabalhadores
do Laboratório de Imunologia do Serviço de Nefrologia do Hospital Curry
Cabral, o meu obrigado pelo tempo dispensado e pelos conhecimentos
transmitidos.
Agradeço também a todos os professores do Mestrado de Análises
Clínicas da Faculdade de Farmácia de Lisboa, sem os quais não teria tido a
hipótese de realizar este estágio, que em muito contribuío para a minha
formação académica.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
188 |
Anexo 1
Grupo da Neoplasia
Alteração molecular e
citogenética
Função gene
PV
MFP
SMP
TE
LMC
LMAs*
LLAs
B
Mutação pontual
V617F no gene JAK2
(troca de uma Valina
por uma Fenilalanina
na posição 617) na
stem cell, estando
presente em todas as
células mielóides.
A proteína JAK2
cinase está
intracelularmente
ligada ao receptor da
EPO e TPO. Quando a
EPO ou TPO se ligam
aos seus receptores a
proteína JAK2 é
fosforilada,
conduzindo à
transcrição nuclear e
consequente
proliferação celular.
Translocação entre o
gene ABL do
cromossoma 9 em 9q34
e o gene BCR do
cromossoma 22 em
22q11.2 –
ABL-BCR;
t(9;22)(q34;q11.2).
Resulta no cromossoma
de Philadelphia 22 der(22q)
O gene BCR tem
função desconhecida.
O gene ABL conduz à
transcrição de uma
proteína cinase que:
- induz a proliferação
celular;
- exibe actividade antiapoptótica.
Translocação entre o
gene ETO do
cromossoma 8 em 8q22
e do gene AML1 do
cromossoma 21 em
21q22 –
ETO-AML1;
t(8;21)(q22;q22)
Translocação ou
inversão entre o gene
CBFβ do cromossoma
16 em 16p13.1 e do
gene MYH11 do
cromossoma 16 em
16q22 –
CBFβ-MYH11; inv(16)
(p13.1q22) ou
t(16;16)(p13.1 ;q22)
Translocação entre o
gene PML do
cromossoma 15 em
15q22 e do gene RARA
do cromossoma 17 em
17q12 –
PML-RARα ;
t(15 ;17)(q22 ;q12)
Translocação entre o
gene ABL do
cromossoma 9 em 9q34
e o gene BCR do
cromossoma 22 em
22q11.2 –
ABL-BCR;
t(9;22)(q34;q11.2).
Resulta no cromossoma
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
O gene AML1, CBFβ e
RARα conduzem cada
um deles à síntese de
uma proteína que, ao
se ligar a factores de
trancrição leva à
trancrição de genes
importantes para a
diferenciação
mielóide.
O gene BCR tem
função desconhecida.
O gene ABL do
cromossoma 9 conduz
à síntese de uma
proteína cinase que:
- induz a proliferação
celular;
- exibe actividade anti-
Efeito da Alteração
Genética
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
Na presença da
mutação V617F a
proteína JAK2 cinase é
hiper-activada
(hipersensibilidade das
células à EPO e TPO),
conduzindo à
proliferação celular
descontrolada.
O rácio
JAK2V617F/JAK2
wild-type determina o
fenótipo de SMP (PV,
MFP ou TE).
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa e
alteração da apoptose:
A fusão do gene ABL
com o gene BCR
conduz à formação de
uma proteína quimérica
p210, que aumenta a
actividade da tirosina
cinase, induzindo:
- Aumento da
proliferação celular;
- Bloqueio da apoptose.
Prognóstico
Sobrevida média > 10
anos.
Sobrevida média de 3 a
7 anos.
Sobrevida média de 10
a 15 anos (~ à da
população geral).
Bom prognóstico.
Ganho de função de
proto-oncogene;
bloqueio da
diferenciação:
A fusão ETO-AML1,
CBFβ-MYH11 ou
PML-RARα conduz à
formação de uma
proteína quimérica que
atrai co-repressores da
transcrição (Sin3A,
NCoR e HD),
impedindo assim a
transcrição de genes
importantes para a
diferenciação mielóide.
Bom prognóstico.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa e
alteração da apoptose:
A fusão do gene ABL
com o gene BCR
conduz à formação de
uma proteína quimérica
Mau prognóstico.
189 |
de Philadelphia 22 der(22q)
Translocação entre o
gene AF4 do
cromossoma 4 em 4q21
e o gene MLL do
cromossoma 11 em
11q23 –
AF4-MLL;
t(4;11)(q21;q23)
Linfoma
B
MM
T
apoptótica.
O gene AF4 conduz à
síntese de uma
proteína que activa a
transcrição genética.
O gene MLL conduz à
síntese de uma
proteína que regula a
transcrição genética.
Translocação entre o
gene TEL do
cromossoma 12 em
12p13 e o gene AML1
do cromossoma 21 em
21q22 –
TEL-AML1;
t(12;21)(p13;q22)
O gene AML1 conduz
à síntese de uma
proteína que, ao se
ligar a factores de
transcrição, leva à
transcrição de genes
importantes para a
série linfóide.
Translocação entre o
gene E2A do
cromossoma 1 em 1q23
e o gene PBX1 do
cromossoma 19 em
19p13.3 –
E2A-PBX1;
t(1;19)(q23;p13.3)
Os genes E2A e PBX1
conduzem cada um à
síntese de uma
proteína que, ao se
ligar a factores de
transcrição, leva à
transcrição de genes
importantes para a
série linfóide.
Delecção no
cromossoma 1 em
1p32, que origina o
gene de fusão SILTAL1.
O gene TAL1 conduz
à formação de factores
de transcrição
importantes na
diferenciação e
proliferação de células
da série linfóide.
Translocação entre o
gene MMSET do
cromossoma 4 em
4p16.3 e o gene IgH do
cromossoma 14 em
14q32 –
MMSET-IgH;
t(4;14)(p16.3;q32)
O gene IgH é
responsável pela
síntese constitutiva da
IgH – cadeias pesadas
das Imunoglobulinas
nos linfócitos B.
O gene MMSET é
expresso de forma
indutiva, induzindo a
proliferação e
sobrevivência
celulares.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
p190 ou p210, que
aumenta a actividade da
tirosina cinase,
induzindo:
- aumento da
proliferação celular;
- bloqueio da apoptose.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
Na presença de
translocação do gene
MLL com outro gene, a
proteína é hiperactivada, conduzindo à
transcrição nuclear e
consequente
proliferação celular
descontroladas.
Ganho de função de
proto-oncogene;
bloqueio da
diferenciação:
A fusão TEL-AML1
conduz à formação de
uma proteína quimérica
que atrai co-repressores
da transcrição (Sin3A,
NCoR e HD),
impedindo assim a
transcrição de genes
importantes para a
diferenciação linfóide.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A fusão E2A-PBX1
conduz à formação de
uma proteína quimérica
que:
- Activa o processo de
transcrição nuclear;
- Interfere no normal
funcionamento dos
factores de transcrição
codificados pelos genes
E2A e PBX1.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A fusão SIL-TAL
conduz à formação de
uma proteína quimérica
que leva à expressão
aberrante do gene
TAL1, o que se traduz
na alteração da
diferenciação e
proliferação linfóides.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A translocação faz com
que o gene MMSET
passe a ser controlado
pelo promotor da IgH,
passando a ser expresso
constitutivamente.
Mau prognóstico.
Bom prognóstico.
Prognóstico Intermédio
(antigamente associada
a mau prognóstico).
Mau prognóstico.
Sobrevida média ~ à da
população geral.
190 |
T
L. Folicular
Translocação entre o
gene IgH do
cromossoma 14 em
14q32 e o gene Bcl2 do
cromossoma 18 em
18q21 –
IgH-Bcl2;
t(14;18)(q32;q21)
L. Manto
Translocação entre o
gene Bcl1 (Ciclina D1)
do cromossoma 11 em
11q13 e o gene IgH do
cromossoma 14 em
14q32 –
Bcl1-IgH;
t(11;14)(q13;q32)
L. Burlitt
Translocação entre o
gene MYC do
cromossoma 8 em 8q24
e do gene IgH do
cromossoma 14 em
14q32 –
MYC-IgH;
t(8;14)(q24;q32)
Translocação entre o
gene ALK do
cromossoma 2 em 2p23
e do gene NPM1 do
cromossoma 5 em 5q35
– ALK-NPM1; t(2;5)
(translocação típica de
L. Anaplásico T)
O gene IgH é
responsável pela
síntese constitutiva da
IgH – cadeias pesadas
das Imunoglobulinas
nos linfócitos B.
O gene Bcl2 é
responsável pela
síntese da proteína
anti-apoptótica Bcl2.
O gene IgH é
responsável pela
síntese constitutiva da
IgH – cadeias pesadas
das Imunoglobulinas
nos linfócitos B.
O gene Bcl1 (Ciclina
D1) é responsável pela
entrada da célula em
fase S do Ciclo
Celular.
O gene IgH é
responsável pela
síntese constitutiva da
IgH – cadeias pesadas
das Imunoglobulinas
nos linfócitos B.
O gene MYC é
expresso de forma
indutiva levando à
síntese de factores de
transcrição.
O gene ALK codifica
uma proteína cinase
pertencente a um
receptor de insulina,
sendo geralmente
silenciado nos
linfócitos.
O gene NPM1 modula
supressores tumorais
no núcleo e controla a
duplicação dos
centrossomas durante
o ciclo celular .
Bloqueio da apoptose:
A translocação faz com
que o gene Bcl2 passe a
ser controlado pelo
promotor da IgH,
passando a ser expresso
constitutivamente.
Trata-se de um linfoma
de baixo grau.
Prognóstico variável.
Alteração do Ciclo
Celular:
A translocação faz com
que o gene Bcl1 passe a
ser controlado pelo
promotor da IgH,
passando a ser expresso
constitutivamente. Há
desregulação do Ciclo
Celular.
Trata-se de um linfoma
de baixo grau.
Sobrevida média de 3 a
5 anos.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A translocação faz com
que o gene MYC passe
a ser controlado pelo
promotor da IgH,
passando a ser expresso
constitutivamente.
Trata-se de um linfoma
de alto grau.
Bom prognóstico
quando detectado
precocemente.
Mau prognóstico
quando detectado em
fase avançada.
Ganho de função de
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A fusão ALK-NPM1
conduz à formação de
uma proteína
quimérica. A proteína
NPM1, uma vez
fundida com a proteína
ALK, mimetiza o
ligando da ALK,
activando-a /
sobrerregulando-a. A
ALK activada nos
linfócitos exibe
propriedades
oncogénicas.
A fusão da NPM1 com
outras proteínas resulta
também na activação
do potencial
oncogénico dos
parceiros de fusão.
Mau prognóstico.
Sobrevida média de 5
anos ou menos.
Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no Laboratório de
Genética Molecular do IPO Porto. (SMP = Síndomes Mieloproliferativos. PV = Policitémia Vera. MFP = Mielofibrose
Primária. TE = Trombocitémia Essencial. EPO = Eritropoietina. TPO = Trombopoietina. LMC = Leucemia Mielóide Crónica. LMA
= Leucemia Mielóide Aguda. LLA= Leucemia Linfoblástica Aguda.)
* Para além das translocações e inversões primárias que caracterizam as LMAs, também podem associadamente ocorrer mutações
pontuais secundárias à patologia, como mutações no gene FLT3. Estas mutações conferem mau prognóstico nas LMAs.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
191 |
Anexo 2
Neoplasia Suspeita
Pesquisa
Material Genético
Utilizado
Técnica Molecular
Revelação do
Material Genético
Síndrome
Mieloproliferativo
(PV; MFP; TE)
- mutação pontual
V617F no gene JAK2
DNA
- (só) Diagnóstico:
ASO-PCR
Electroforese em gel de
agarose 2%
RNA
- Diagnóstico: RTPCR e PCR Tempo
Real
- Follow-up: Nested
PCR e PCR Tempo
Real
- RT-PCR e Nested
PCR: Electroforese em
gel de agarose 2%
- PCR Tempo Real:
FRET com sonda
TaqMan
RNA
Sequenciação
Automática
Electroforese capilar
RNA
- Diagnóstico: RTPCR e PCR Tempo
Real
- Follow-up:
1º Nested PCR
2º (só se Nested der
positivo) PCR Tempo
Real
- RT-PCR e Nested
PCR: Electroforese em
gel de agarose 2%
- PCR Tempo Real:
FRET com sonda
TaqMan
DNA
- (só)Diagnóstico: PCR
Single / Restrição
Enzimática (RFLPs)
Electroforese capilar
RNA
- Diagnóstico: RTPCR e PCR Tempo
Real
- Follow-up:
1º Nested PCR
2º (só se Nested der
positivo) PCR Tempo
Real
NOTA: para SIL-TAL1
não se faz PCR Tempo
Real
- RT-PCR e Nested
PCR: Electroforese em
gel de agarose 2%
- PCR Tempo Real:
FRET com sonda
TaqMan
PCR Single
(MYC-IgH: PCR-LD)
- BCR-ABL1; t(9;22)
(transcrito b2a2 ou
b3a2; proteína p210)
LMC
- mutações pontuais no
gene ABL
- ETO-AML1; t(8;21)
- CBFB-MYH11;
inv(16) ou t(16;16)
- PML-RARA ;
t(15 ;17)
LMA
B
LLA
- mutações ITD e
mutação pontual D835
no gene FLT3
- BCR-ABL1; t(9;22)
(transcrito b2a2 ou
b3a2; proteína p210;
transcrito e1a2;
proteína p190)
- AF4-MLL; t(4;11)
- TEL-AML1; t(12;21)
- E2A-PBX1; t(1;19)
T
- SIL-TAL1; del1p32
B
- Suspeita MM:
MMSET-IgH; t(4;14)
- Suspeita L. Folicular:
IgH-Bcl2; t(14;18)
- Suspeita L. Manto:
Bcl1-IgH; t(11;14)
- Suspeita L. Burkitt:
MYC-IgH; t(8;14)
DNA
- NPM1-ALK; t(2;5)
RNA
Linfoma
T
Electroforese em gel de
agarose 2%
- RT-PCR
Tabela 19 – Estudos moleculares realizados no Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
192 |
Anexo 3
Selecção de agentes anti-microbianos feita para os diferentes microorganismos
na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto:
ENTEROBACTERIACEAE
Produto
1ª Linha
2ª Linha
Ampicilina
Amoxicilina+Ác.Clavulânico
Urina
Cotrimoxazol;
Nitrofurantoina
Ácido Nalidíxico
Cefoxitina ou Cefuroxime; Gentamicina
Amicacina
Norfloxacina
Cefalotina
Pus, Expectoração e Hemoculturas
Abcesso Cerebral
Ampicilina
Gentamicina;
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Amicacina;
Carbenicilina
Imipenem
Cotrimoxazol;
Ofloxacina
Cefalotina;
Aztreonam
Cefoxitina ou Cefuroxime;
Piperacilina
Ceftazidima;
Ceftriaxona
Cloranfenicol
Cefalotina;
Ampicilina
Coproculturas
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Ofloxacina;
Cotrimoxazol;
Cloranfenicol;
Ampicilina;
Salmonella typhi
Amoxicilina+Ác.Clavulânico
Cotrimoxazol;
Ofloxacina;
Ampicilina
Gentamicina;
Liquor
Amicacina;
Cloranfenicol;
Cotrimoxazol;
Ceftriaxona;
Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
193 |
PSEUDOMONAS SPP. e ACINETOBACTER SPP.:
1ª Linha
2ª Linha
Ceftazidima
Carbenicilina;
Imipenem
Gentamicina;
Piperacilina
Amicacina;
Norfloxacina
Aztreonam
Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.
HAEMOPHILUS SPP
Produto
1ª Linha
2ª Linha
Ampicilina;
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Eritromicina;
Pus, Expectoração
Cloranfenicol;
Ceftriaxona;
Tetraciclina;
Cotrimoxazol;
Ofloxacina
Hemoculturas e Liquor
Ampicilina
Ceftriaxona;
Cloranfenicol;
Ofloxacina
Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp.
NEISSERIACEAE
Microorganismo
1ª Linha
Meningococcus
Cloranfenicol;
2ª Linha
Penicilina;
Sulfadiazina
Cefalotina;
Gonococcus
Penicilina (ß-Lactamase neg.)
Eritromicina;
Tetraciclina
Cefoxitina ou Cefuroxime;
Espectinomicina
Ceftriaxona;
Ofloxacina
Moraxella catarrhalis
Antibioticos idênticos aos usados p/ Haemophilus sp
Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
194 |
STAPHYLOCOCCUS SPP
Produto
Pus, Expectoração e Hemoculturas
1ª Linha
2ª Linha
Penicilina
Gentamicina;
Cefalotina;
Amicacina;
Oxacilina
Ofloxacina;
Eritromicina;
Vancomicina;
Tetraciclina
Rifampicina
Penicilina
Abcesso Cerebral
Cefalotina;
Ácido fusídico
Oxacilina
Penicilina
Exsudado Nasal
Eritromicina;
Oxacilina
Penicilina
Nitrofurantoina;
Cotrimoxazol;
Urina
Sulfafurazol;
Norfloxacina
Amoxicilina+Ác. Clavulânico Vancomicina
Novobiocina (S. saprophyticus são resistentes)
Oxacilina
Penicilina
Cloranfenicol;
Gentamicina;
Liquor
Amicacina;
Oxacilina
Cotrimoxazol;
Rifampicina;
Vancomicina
Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp.
LISTERIA MONOCITOGENES
1ª Linha
Ampicilina
Gentamicina
Cotrimoxazol
Ofloxacina
Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
195 |
STREPTOCOCCUS SPP
Microorganismo
Produto
1ª Linha
2ª Linha
Penicilina
S. viridans
Gentamicina Vancomicina
Oxacilina
Expectoração e
Eritromicina
Exsudados
Tetraciclina
S. pneumoniae
Oxacilina
Hemoculturas e Liquor
Cloranfenicol
Ceftriaxona; Vancomicina
Ampicilina
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Pús
Cotrimoxazol; Estreptomicina
Gentamicina
Ampicilina
Enterococcus
Amoxicilina+ Ác.Clavulânico
Urina
Cotrimoxazol; Nitrofurantoina;
Norfloxacina;
Ampicilina
Hemoculturas e Liquor
Gentamicina;
Estreptomicina
Vancomicina;
Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp.
CORYNEBACTERIUM SPP
1ª Linha
Tetraciclina
Eritromicina
Cefuroxime;
Gentamicina;
Amicacina;
Ceftazidima;
Ceftriaxona;
Ofloxacina;
Vancomicina;
Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
196 |
EXSUDADOS OCULARES (conjuntivais):
Microorganismos
1ª Linha
S. pneumoniae; S. aureus; H. influenzae; H.
Cloranfenicol
aegiptius
Tetraciclina
Cloranfenicol
Enterobacteriaceae
Tetraciclina
Colistina
Gentamicina
Pseudomonas sp
Colistina
Gentamicina
Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
197 |