UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
Inativação de células planctônicas de candida albicans
empregando terapia fotodinâmica
JOÃO NILTON LOPES DE SOUSA
Orientadora: Profa Dra. Ângela Toshie Araki
Co-Orientador: Profo. Dr. Petrusk Homero Campos Marinho
Tese
apresentada
ao
Doutorado em
Odontologia, da Universidade Cruzeiro do
Sul, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Doutor em Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
S716i
Sousa, João Nilton Lopes de.
Inativação de células planctônicas de candida albicans
empregando terapia fotodinâmica / João Nilton Lopes de Sousa. -São Paulo; SP: [s.n], 2014.
99 p. : il. ; 30 cm.
Orientadora: Ângela Toshie Araki.
Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul.
1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Candida albicans 3.
Azul de metileno. I. Araki, Ângela Toshie. II. Universidade Cruzeiro
do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDU: 615.831:616.314(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Inativação de células planctônicas de candida albicans
empregando terapia fotodinâmica
JOÃO NILTON LOPES DE SOUSA
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 16/10/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Profa Dra. Ângela Toshie Araki
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr. Cacio Moura Netto
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Igor Prokopowisch
Universidade Cruzeiro do Sul
Profa. Dra. Sueli Patrícia Harumi Miyagi de Cara
Universidade de São Paulo
Prof. Dr. José Luiz Lage-Marques
Universidade de São Paulo
DEDICATÓRIA
Dedico ao maior e precioso ser, que possui o poder da vida e do conhecimento. A
força que me fez surgir e que, em nele, confio o meu existir e minha sabedoria.
Dedico este trabalho e minha vida a meu primeiro pai: DEUS.
A José Lopes e Rita Maria, meus pais, que apesar da sua insipiência no
conhecimento científico; souberam, muito bem, conduzir-me nos princípios
educativos e morais. Souberam abdicar de minha presença e entregar-me a outra
família que me deu oportunidade de ser o que vocês desejavam. Muito obrigado
papai e mainha.
Às pessoas que fizeram de um sobrinho, um filho. Vocês são tão importantes para
este momento, quanto um ser vivo precisa do oxigênio para existir. Vocês foram à
base de tudo. Dependo de vocês todo o momento de minha vida, pois necessito
disto para ser feliz. Tio Chagas e tia Kilma, muito obrigado por tudo.
A meus irmãos Janetton, José Lopes Filho, Régia e Renato. Como também, aos
meus irmãos primos, Chaguinha, Georgia, Marcília e Matheus. Vocês também
fazem parte desta história. Divido minha felicidade com todos vocês. Muito obrigado
por sempre confiar no meu crescimento. Amo vocês.
A José Lopes Filho, Rita Maria e Francisco das Chagas, meu irmão, minha mãe e
meu tio. Hoje agradeço a força que vocês deram em relação ao doutorado. No
momento que senti o sonho distante, vocês mostraram que ele poderia ser real.
À minha esposa, Lorena, e ao meu filho, João. Vocês foram as pessoas que
sempre estiveram ao meu lado. Escutaram meus devaneios e meus estresses.
Souberam suportar minha distância tanto presencial, quanto em pensamento. Sei
que fiz deste trabalho uma prioridade momentânea da minha carreira profissional.
Assim como sei que vocês serão a prioridade de toda minha vida. Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
A professora Dra. Ângela Toshie Araki, pela orientação, aprendizado, amizade e
dedicação ao desenvolvimento deste trabalho. Meu profundo agradecimento.
Ao professor Dr. Petrusk Homero Campos Marinho, pela co-orientação,
simplicidade, amizade e por seu profundo interesse de sempre ensinar. Suas
contribuições foram de suma importância para o desenvolvimento deste trabalho.
A professora Dra. Patrícia Oliveira, pela dedicação, aprendizado no laboratório de
ciências básicas do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos –
FIP.
A José Alexandre de Morais, Coordenador dos laboratórios do curso de
biomedicina das Faculdades Integradas de Patos - FIP, pelo apoio técnico no
laboratório.
A Patrícia Barbosa Pereira, Técnica do laboratório de ciências básicas do curso de
biomedicina das Faculdades Integradas de Patos – FIP, pelo apoio na preparação
dos meios de cultura.
A João Leuson Palmeira Gomes Alves, presidente das Faculdades Integradas de
Patos - FIP, por permitir a realização deste estudo em sua instituição de ensino.
Ao Prof. Dr. Michel Nicolau Youssef, coordenador do programa de pós-graduação
do doutorado em Odontologia da Universidade Cruzeiro do Sul.
Aos professores do corpo docente do Doutorado em Odontologia da Universidade
Cruzeiro do Sul: Prof. Dr. Cacio Moura Netto; Prof. Dr. Danilo Antonio Duarte;
Prof. Dr. Igor Prokopowitsch; Prof. Dr. Lúcio Frigo; Prof. Dr. Michel Nicolau
Youssef; Prof. Dr. Walter João Genovese; Profa. Dra. Adriana de Oliveira Lira
Ortega; Profa. Dra. Carina Sinclér Delfino; Profa. Dra. Eliete Rodrigues de
Almeida; Profa. Dra. Giselle Rodrigues Sant´Anna; Profa. Dra. Michele Baffi
Diniz; Profa. Dra. Maria Teresa Botti; Profa. Dra. Mariana Ferreira Leite; Profa.
Dra. Renata Oliveira Guaré e Profa. Dra. Wanessa Christine de Souza Zaroni
A turma do Doutorado em Odontologia, com a qual convivi momentos de
cumplicidade, descontração e amizade. Em especial a Rachel de Queiroz Ferreira
Rodrigues, por sua demonstração de amizade, pelo companheirismo, incentivo, e
compreensão dedicada a mim durante nosso convívio.
A Profª Dra. Sueli Cristina Marquesi, Magnífica Reitora da Universidade Cruzeiro
do Sul.
A Profa. Tania Cristina Pithon-Curi, Pró-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa da
Universidade Cruzeiro do Sul.
Aos funcionários da Universidade Cruzeiro do Sul que direto ou indiretamente
fizeram parte desta jornada.
Tua palavra é lâmpada para os meus
pés e luz para o meu caminho
Salmo119
SOUSA, J. N. L. Inativação de células planctônicas de candida albicans
empregando terapia fotodinâmica. 2014. 99 f. Tese (Doutorado em Odontologia)Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
RESUMO
Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da terapia fotodinâmica na inativação
de células planctônicas de Candida albicans (ATCC10231), empregando azul de
metileno como fotossensibilizador nas concentrações de 37,5 µg/mL; 75 µg/mL; 150
µg/Ml e 300 µg/mL. Alíquotas de 100 µg/mL da suspensão do fungo na
concentração de 106 células/mL foram semeadas em placas de microtitulação com
96 poços, nos quais foram depositados o mesmo volume de azul de metileno,
permanecendo por um período de pré-irradiação de 1, 5, 10 e 20 min. Em seguida,
aplicou-se luz laser de baixa potencia (comprimento de onda = 660 nm, potência de
100 mW e dose de 426 J/cm2) por 128s, utilizando um Laser semicondutor
portátil (Laser DUO®, GaAlAs, InGaAlP, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP –
Brasil). Experimentos controles foram realizados, sem iluminação, na ausência e na
presença de azul de metileno e, com iluminação, substituindo o fotossensibilizador
por solução salina. De cada condição experimental, diluições em série (10-1, 10-2 e
10-3) foram obtidas e alíquotas de 25 µL foram plaqueadas em duplicata em Agar
Sabouraud Dextrose. Após este período, o número de unidades formadoras de
colônias por mililitro (UFC/mL) foi determinado e os dados foram submetidos à
análise de variância e teste de Kruskal Wallis (p <0,05). A terapia fotodinâmica, com
azul de metileno na concentração de 37,5 µg/mL e tempos de incubação de 10 e 20
min, reduziu significativamente (p = 0,007) o número de UFC/mL. Nas
concentrações de 75 µg/mL, 150 µg/mL e 300 µg/mL a redução foi significativa
(p˂0,05) já a partir de 5 min de incubação, não havendo diferença entre os tempos
de 10 e 20 min de pré-irradiação. Na ausência de irradiação com laser, o azul de
metileno não produziu redução de UFC/mL. A Terapia Fotodinâmica apresentou
efeito antifúngico contra Candida albicans, podendo ser utilizada como coadjuvante
ao tratamento convencional.
Palavras-chave: Candida albicans, Terapia fotodinâmica, Azul de metileno.
SOUSA, J. N. L. Inactivation of planktonic cells of candida albicans using
photodynamic therapy. 2014. 99 f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade
Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
ABSTRACT
The aim of this study is to evaluate the effect of photodynamic therapy in the
inactivation of planktonic cells of Candida albicans (ATCC10231), using methylene
blue as a photosensitizer at concentrations 37,5 µg/mL; 75 µg/mL; 150 µg/Ml and
300 µg/mL. Aliquots of 100 mµ / mL suspension of the fungus in a concentration of
106 cells / mL were seeded in microtiter plates with 96 wells, onto which were
deposited in the same volume of methylene blue, remained for a period of preirradiation of 1, 5, 10 and 20 minutes. Thereon, it was applied laser light of low
power (wavelength = 660 nm, power 100 mW and a dose of 426 J/cm²) for 124s,
using a portable semiconductor laser (Laser DUO®, GaAlAs, InGaAlP, MM OPTICS
LTDA, São Carlos, SP - Brazil). Control experiments were developed, without
illumination, in the absence and the presence of methylene blue with light, and with
illumination, replacing the photosensitizer by saline solution. For each experimental
condition, serial dilutions (10-1, 10-2 e 10-3) were obtained and aliquots of 25 µL were
plated in duplicate on Sabouraud Dextrose Agar. After this period, the number of
colony forming per milliliter (CFU / mL) units was determined and the data were
subjected to analysis of variance and Kruskal-Wallis test (p <0.05). Photodynamic
therapy, with methylene blue at a concentration of 37.5 mg / mL and incubation time
of 10 and 20 min, reduced significantly (p = 0,007) the number of CFU/mL. In
concentrations of 75 µg/mL, 150 µg/mL and 300 µg/mL reduction was significant (p<
0,05) at 5 min of incubation, with no difference between the periods of 10:20 min of
pre -irradiation. In the absence of laser irradiation, methylene blue produced no
reduction of CFU/mL. Photodynamic therapy showed an antifungal effect against
Candida albicans, which might be used as an adjunct to conventional treatment.
Keywords: Candida albicans, Photodynamic therapy, Methylene blue.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Ilustração esquemática do mecanismo de ação da PDTErro! Indicador
não definido.
Figura 2 Cepa de Candida albicans utilizada no estudo.Erro!
definido.
Indicador
não
Figura 3 Preparo do meio de cultura nas placas de PetriErro!
definido.
Indicador
não
Figura 4 Em A, Azul de Metileno forma de apresentação em pó. Em B, o
corante manipulado nas concentrações testes.Erro! Indicador não
definido.
Figura 5 Placa de microtitulação na ausência de luz e envolvida por uma
lâmina de papel alumínio. ............................. Erro! Indicador não definido.
Figura 6 Em A, aparelho de laser e, em B, calibração da potência do aparelho
no comprimento de onda de 660 nm. .......... Erro! Indicador não definido.
Figura 7 - Placas de microtitulação estéreis com 96 poçosErro!
definido.
Indicador
não
Figura 8 Desinfecção da ponteira do aparelho .......... Erro! Indicador não definido.
Figura 9 Preparação do inóculo de Candida albicans com densidade celular
de 106 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL) .......... Erro!
Indicador não definido.
Figura 10 Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos.
Erro! Indicador não definido.
Figura 11 Ilustração esquemática do grupo terapia fotodinâmicaErro!
não definido.
Indicador
Figura 12 Em A, Transferência de alíquotas de 100µL da suspensão do fungo
para o poço da placa de microtitulação. Em B, transferência do
mesmo volume de AM para o poço. Em C, placa no escuro durante o
período de incubação e, Em D, irradiação do conteúdo do poço .. Erro!
Indicador não definido.
Figura 13 Ilustração esquemática do grupo Azul de MetilenoErro! Indicador não
definido.
Figura 14 Ilustração esquemática do grupo Laser ...... Erro! Indicador não definido.
Figura 15 Ilustração esquemática do grupo solução salinaErro!
definido.
Indicador
não
Figura 16 Ilustração esquemática das diluições seriadas pipetadas em
duplicata ......................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 17 Contagem das UFC com auxílio de um contador de colônias ....... Erro!
Indicador não definido.
Gráfico 1 Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e
300µg/mL) de azul de metileno, na ausência de luz, com tempos de
incubação de 1, 5, 10 e 20 min. .................... Erro! Indicador não definido.
Gráfico 2 Comparação da média do log10UFC/mL entre os grupos PDT AM e
grupos controles ........................................... Erro! Indicador não definido.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de
unidades formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles
nos diferentes tempos de incubação .......... Erro! Indicador não definido.
Tabela 2 Comparação da média e desvio padrão do log10UFC/mL entre os
grupos AM e PDT AM segundo as concentrações de AM e tempos de
incubação....................................................... Erro! Indicador não definido.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AM
Azul de metileno
ASD
Agar Sabouraud Dextrose
CCT
Coleção de culturas tropicais
CNV
Neovascularização coroidal
CUR
Curcumina
FS
Fotossensibilizador
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
LASER
Light Amplification by Stimulated of Radiation (amplificação da
luz por emissão estimulada de radiação)
LED
Light Emitting Diode (diodo emissor de luz)
PDT
Terapia Fotodinâmica
ROS
Espécies reativas de oxigênio
TBO
Azul de toluidina
UFC
Unidade formadora de colônia
LISTA DE SÍMBOLOS
°C
Grau Celsius
cm
centímetro
GaAlAs
Arceneto de gálio e alumínio
InGaAlP
–
Índio Gálio Alumínio Fósforo
g
grama (peso)
h
horas
J
Joule
J/cm2
Joules por centímetro quadrado
L
litro
Log
logaritmo
mW
miliwatts
min
minutos
mL
Mililitro
NaCl
Cloreto de sódio
nm
nanômetro
OH-
Íon hidroxila
s
segundos
µg
micrograma
µM
micromolar
µL
Microlitros
W
watts
≅
aproximadamente
%
por cento
1 *
Fotossensibilizador no estado singleto
S
0
Fotossensibilizador no estado fundamental
3 *
Fotossensibilizador no estado tripleto
O2
Oxigênio molecular
1
Oxigênio singleto
®
Marca registrada
S
S
O2
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................... ERRO! IND
2
REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. ERRO! IND
2.1
Efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não definido.
2.2
Papel dos agentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmicaErro! Indicador não de
2.3
Etiologia e patogenia da Candidíase......................... Erro! Indicador não definido.
2.4
Inativação de Candida albicans por terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não defin
3
OBJETIVOS ....................................................................................................... ERRO! IND
3.1
Objetivo Geral ............................................................. Erro! Indicador não definido.
3.2
Objetivos Específicos................................................. Erro! Indicador não definido.
4
MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. ERRO! IND
4.1
Tipo e Local do Estudo .............................................. Erro! Indicador não definido.
4.2
Instrumentos ............................................................... Erro! Indicador não definido.
4.2.1 Microrganismo e meio de cultura .............................. Erro! Indicador não definido.
4.2.2 Preparo do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubaçãoErro! Indicador não definido.
4.2.3 Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não definido.
4.2.4 Preparo do inóculo de Candida albicans.................. Erro! Indicador não definido.
4.3
Condições Experimentais .......................................... Erro! Indicador não definido.
4.3.1 Grupo Terapia fotodinâmica (Grupo PDT) ................ Erro! Indicador não definido.
4.3.2 Grupo Azul de Metileno (Grupo AM) ......................... Erro! Indicador não definido.
4.3.3 Grupo Laser (Grupo L) ............................................... Erro! Indicador não definido.
4.3.4 Grupo solução salina (Grupo SS) ............................. Erro! Indicador não definido.
4.3.5 Avaliação da viabilidade das células de Candida albicansErro! Indicador não definido.
4.3.6 Técnica de Contagem das UFC/mL ........................... Erro! Indicador não definido.
4.3.7 Análise estatística ...................................................... Erro! Indicador não definido.
5
RESULTADOS ................................................................................................... ERRO! IND
6
DISCUSSÃO ...................................................................................................... ERRO! IND
7
CONCLUSÕES .................................................................................................. ERRO! IND
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. ERRO! IND
ANEXOS ....................................................................................................................... 99
17
1 INTRODUÇÃO
Fungos oportunistas podem provocar infecções superficiais ou invasivas
graves, especialmente em pacientes debilitados ou imunocomprometidos. Devido a
dificuldades no diagnóstico e a disponibilidade limitada de drogas antifúngicas
eficazes, representam uma ameaça crescente para a saúde humana, podendo
resultar em alta mortalidade atribuível (DAI et al., 2012). A infecção fúngica
oportunista mais prevalente em pacientes HIV positivos é a candidíase, tanto na
forma mucocutânea, quanto na forma invasiva. Várias espécies de Candida podem
causar candidíase, embora a Candida albicans continue sendo a espécie mais
comum responsável pela doença. Por esta razão, os crescentes casos de
resistência à terapêutica antifúngica atual é um motivo de preocupação
(LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005; ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012),
pois ocorre a diminuição da eficiência das terapias convencionais, que na maioria
das vezes são tratamentos demorados, os quais exigem maiores orçamentos e
cuidados de saúde (CHIEN et al., 2013). Além disso, as drogas atuais apresentam
toxicidade, espectro de ação limitado e as interações medicamentosas são comuns
(PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012).
Infecções causadas por Candida albicans, como por outros fungos,
continuam a representar um problema significativo de saúde pública, principalmente
as espécies resistentes a drogas tradicionais, tais como os azóis e polienos
(fluconazol e anfotericina B, respectivamente) (LAM et al., 2011). Por isso, é
necessário o desenvolvimento de pesquisas científicas que busquem ampliar as
formas de tratamento das lesões de Candida albicans, possibilitando um tratamento
efetivo dos casos de insucesso e melhorando o bem estar dos pacientes acometidos
por esta doença.
Diante das limitações das terapias convencionais para o tratamento de
infecções cutâneas superficiais causadas por Candida albicans (LAMBRECHTS;
AALDERS; VAN MARLE, 2005), tratamentos alternativos devem ser estimulados
(CADASTRO et al., 2008; SILVA MARTINS et al., 2011; CHIEN et al., 2013). A
inativação antimicrobiana pela terapia fotodinâmica (PDT) pode ser uma alternativa
18
agente eficaz para eliminar estes microrganismos (PEREIRA GONZALES; MAISCH,
2012).
A PDT, também conhecida como terapia de fotoirradiação, fototerapia,
fotoquimioterapia
(KONOPKA;
GOSLINSKI,
2007)
e
terapia
fotodinâmica
antimicrobiana (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010), é um tratamento à base de
luz desenvolvido para várias aplicações na área da oncologia, dermatologia,
oftalmologia. Recentemente, seus efeitos antimicrobianos têm sido testados (KATO
et al., 2013). Consiste na administração de um fármaco não tóxico ou de um corante,
conhecido
como
agente
fotossensibilizante
(FS),
que
pode
ser
aplicado
sistemicamente, localmente ou por via tópica, seguida de iluminação da lesão, com
luz visível (geralmente com longo comprimento de onda de luz vermelha) a qual, na
presença de oxigênio, leva à formação de moléculas citotóxicas, tais como o
oxigênio singleto e de radicais livres (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004;
KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; DAI et al., 2011; HUANG et al., 2012; PEREIRA
GONZALES; MAISCH, 2012). Estes estados moleculares são muito reativos e
podem causar danos a lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e outros componentes
celulares (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007), o que desencadeia o fotoenvelhecimento
oxidativo e subsequente morte celular dentro da célula ou microrganismo
(CALZAVARA-PINTON; VENTURINI; SALA, 2005).
Apesar de ainda não existir um protocolo definido, vários estudos têm relatado
que a PDT pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de vírus e protozoários,
assim como bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e fungos (DONNELLY;
McCARRON; TUNNEY, 2008; LYON et al., 2011). A PDT antifúngica tem sido
empregado com sucesso contra Candida albicans, outras espécies de Candida e
também contra dermatófitos (LYON et al., 2011). Segundo Jackson et al. (1999), o
efeito antimicrobiano da PDT pode ser uma alternativa viável para substituir os
antifúngicos tradicionais no tratamento da candidíase bucal.
No tratamento de candidíase, a PDT utilizando azul de metileno (AM) como
FS, apresenta algumas vantagens em relação à terapia medicamentosa tradicional,
tais como: os mecanismos de ação são diferentes das drogas antifúngicas, o que
atenua os casos de desenvolvimento de resistência ao medicamento; pode ser uma
alternativa terapêutica eficaz contra cepas já resistente de Candida albicans
19
(TEICHERT et al., 2002) e o custo, pois diferentemente da terapia antifúngica
convencional, que muitas vezes é um tratamento oneroso. O AM é uma substância
simples que apresenta baixo custo, baixa toxicidade, comercialmente acessível e
que já é utilizada, com segurança, na medicina há bastante tempo (TEICHERT et al.,
2002). A PDT tem o potencial para se estabelecer como uma abordagem
antimicrobiana alternativa para infecções orais e merece uma avaliação mais
aprofundada (KOMERIK; MACROBERT, 2006). O AM, combinados com a luz de um
comprimento de onda específico, pode ser usado como um agente antifúngico
promissor (MUNIN et al., 2007).
O grande interesse em terapias alternativas para o tratamento de infecções
fúngicas vem do fato de que o número de agentes antifúngicos disponíveis no
mercado é muito restrito quando comparado com o número de drogas
antibacterianas (LYON et al., 2011). Os estudos já mostram que o AM é um
fotossensibilizador eficaz na inativação fotodinâmica de Candida albicans. No
entanto, alguns aspectos ainda precisam ser mais bem esclarecidos, antes de
recomendá-lo para terapia clínica, tais como o protocolo adequado quanto ao tempo
de pré-irradiação ou de incubação, como também a concentração de AM que
apresente o melhor custo-benefício com relação à inativação de Candida albicans,
sem apresentar efeito tóxico para as células.
Desta forma, este estudo terá como objetivo avaliar, in vitro, os efeitos da
terapia fotodinâmica em Candida albicans, variando o tempo de pré-irradiação e a
concentração de azul metileno.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (PDT)
As propriedades curativas da luz têm sido apreciadas por milhares de anos.
No entanto, segundo Allison; Mota e Sibata (2004), o aproveitamento da energia da
luz para criar uma forma rigorosa e confiável para diagnosticar e tratar as doenças
humanas é apenas um fenômeno relativamente recente. Apesar de excelentes
resultados relatados na história antiga e do refinamento deste conhecimento ao
longo dos últimos 100 anos subsequentes, o futuro do foto-diagnóstico e da terapia
fotodinâmica está entregue ao acaso.
A aplicação da luz com função antimicrobiana foi descoberta há mais de 100
anos devido à capacidade de alguns corantes eliminarem vários microrganismos
quando ativados pela luz na presença de oxigênio. No entanto, apenas no passado
relativamente recentemente, a PDT tem sido estudada com a finalidade de tratar
diversas infecções. Este interesse crescente, em parte, é motivado pelo aumento
exagerado de resistência a drogas antimicrobianas entre as bactérias e outros
patógenos (KHARKWAL et al., 2011).
A sua aplicação no campo das doenças infecciosas sofreu um grande revés
com a descoberta dos antibióticos na década de 1940. Esta descoberta revolucionou
o tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias patogênicas e, no
devido curso, surgiram e tornaram-se disponíveis os antifúngicos, antiprotozoários,
anti-helmíntico e os compostos antimalária. Assim, apesar de 100 anos de
descobrimento, o avanço da PDT antimicrobiana tem sido bastante lenta. Mas com o
recente aumento da resistência aos antibióticos em todo o mundo, tem havido um
interesse renovado por terapias antimicrobianas alternativas (KHARKWAL et al.,
2011).
O tratamento antimicrobiano por meio de luz e corante foi descrito pela
primeira vez, em 1890, por Oscar Raab quando observou a toxicidade do alaranjado
de acridina, que é dependente de luz, contra Paramecium caudatum (RYSKOVA;
BUCHTA; SLEZAK, 2010). No entanto, apenas recentemente, com o início da busca
21
por tratamentos alternativos contra agentes patogênicos resistentes aos antibióticos,
a PDT tem sido investigada mais profundamente (DONNELLY; McCARRON;
TUNNEY, 2008). Na Odontologia, o LASER (Light Amplification by Stimulated of
Radiation ou amplificação da luz por emissão estimulada de radiação) tem sido
empregado em diversas situações clínicas, como em antissepsia de feridas, em
preparos cavitários, na redução de populações bacterianas de canais radiculares e
em bolsas periodontais (CADASTRO et al., 2008).
No contexto das aplicações clínicas da PDT no combate as infecções,
Kharkwal et al. (2011) realizaram uma busca na literatura dos artigos publicados
sobre este tema, compreendendo o período entre os anos de 1960 e 2011. Ao
finalizar a leitura de todas as fontes de informação científica, Kharkwal et al.
observaram que, no campo do controle e tratamento de infeções, a PDT tem uma
vasta aplicação clínica. Entre as indicações podem ser citadas as aplicações clínicas
com do seu efeito antimicrobiano para infecções virais localizadas, tais como: as
provocadas pelo herpes simples e papiloma vírus, e infecções dermatológicas não
virais, como as causadas por acne e outras leveduras, fungos e infecções
bacterianas da pele. A PDT também tem sido utilizada para o tratamento de
infecções bacterianas em abscessos cerebrais e ulceras que não cicatrizam, para o
tratamento
da
leishmaniose
cutânea
e infecções
gástricas
causadas
por
Helicobacter pylori. Na Odontologia, tem estudada como coadjuvante no tratamento
de várias infecções dentárias, incluindo a periodontite e infecções endodônticas.
Com estes disponíveis na literatura, é possível avaliar a terapia fotodinâmica como
uma aliada promissora no tratamento infecções nas áreas odontológicas e médicas,
apesar da maioria dos estudos mostrarem resultados promissores in vitro e de ainda
existir uma carência de protocolos e estudos clínicos controlados.
Carvalho et al. (2006) avaliaram, in vitro, o efeito antibacteriano do laser
diodo com comprimento de onda de 650 nm, associado à substância fotossensível
azul de toluidina sobre as bactérias de úlceras cutâneas infectadas. Foram coletadas
amostras de material infectado de úlceras cutâneas através de um swab. Os
materiais foram inoculados em meio de cultura contendo ágar sangue para o
crescimento de bactérias gram-positivas e ágar Mac Conkey para as gramnegativas. Os autores observaram que houve uma redução significativa das
unidades formadoras de colônias quando submetidas à terapia fotodinâmica.
22
Com o objetivo de encontrar uma fonte de luz alternativa, utilizada na clínica
diária, que pudesse ser usada na terapia fotodinâmica contra a microbiota bucal,
Krespi et al. em 2005, avaliaram a fotossensibilização de Porphyromonas gingivalis
e Prevotella intermedia utilizando luz halógena, transmitida através de um guia de
luz flexível sobre placas de Petri contendo bactérias vivas. Os autores utilizaram a
idéia de que a densidade de energia produzida por uma lâmpada halógena de alta
intensidade poderia ser suficiente para ativar certos corantes e causar efeito
bactericida sem produzir danos graves a bactérias comensais ou ao revestimento
mucosa oral, diminuindo os potenciais perigos relacionados ao laser, como danos
aos olhos. O tempo de irradiação, a que os microrganismos foram expostos foram 5,
10 e 20 min. O AM nas concentrações de 0,1, 0,075, 0,05, 0,025 e 0,01% foi
utilizado como um agente de fotossensibilização. Os controles foram formados por
microrganismos apenas irradiados com luz halógena e apenas pela aplicação de
AM. A fotossensibilização letal de 50% das bactérias foi conseguida, utilizando no
protocolo de 5 min de irradiação nas concentrações superiores a 0,05% de AM. As
concentrações de 0,025% e 0,01% somente foram efetivas no tempo de irradiação
de 20 min. A exposição à luz, na ausência de AM, não foi eficaz para matar as
bactérias. Na ausência de luz, o AM, nas concentrações de 0,025, 0,001% e 0,05%
não foi eficaz. No entanto, as concentrações de 0,075 e 0,1% de AM, mesmo na
ausência de luz, apresentou poder bactericida.
A PDT também tem sido utilizada para tratar a periodontite, como uma das
alternativas para eliminar espécies bacterianas subgengivais resistentes à terapia
antimicrobiana convencional. A capacidade da PDT de reduzir o número de
bactérias no biofilme e na forma planctônica foi testada por Fontana et al. (2009).
Coletaram amostras de biofilme dental de dez indivíduos com periodontite crônica
com curetas Gracey. Em seguida, suspensões (109 células/mL) de microrganismos
do biofilme de cinco sujeitos foram sensibilizadas com azul de metileno (25 µg/mL)
durante 5 min, em seguida, expostos a luz vermelha de laser de argônio, com
densidade de potência de 100 mW/cm2 e fluência de energia de 30J/cm2. Em
seguida, cada amostra (indivíduos 1-5) foi dividida em duas partes. A primeira parte,
em suspensão, foi exposta a PDT e a segunda parte foi utilizada para o
desenvolvimento de biofilme e, em seguida, também exposta a PDT com AM na
concentração de 25 µg/ml. A PDT eliminou aproximadamente 63% das bactérias
23
presentes na suspensão. Entretanto, nos biofilmes, a PDT foi menos eficiente, com
uma de inibição de apenas 32% das bactérias no biofilme. As bactérias presentes
nos biofilmes orais foram menos susceptíveis PDT quando comparadas de bactérias
na forma planctônica.
O efeito da PDT sobre bactérias da placa dentária humana foi avaliado por
Klepac-Ceraj et al. (2011). O FS, AM-carregado poli (ácido láctico-co-glicólico)
(PLGA) foi ativado com luz visível vermelha (λ=665 nm). Amostras de placa
subgengival de 14 indivíduos com, periodontite crônica, foram coletadas dos sítios
mesiovestibulares de pré-molares ou molares com curetas de Gracey e
imediatamente colocadas em uma solução anaeróbica de Ringer (Sistemas
anaeróbios, Morgan Hill, CA, EUA). As suspensões bacterianas (109 células/mL)
foram sensibilizados com aniônico, as nanopartículas de PLGA catiônicos (50 µg/mL
de equivalentes de AM) ou AM livre (50 µg/mL) durante 20 min, seguido por
exposição à luz vermelha durante 5 minutos com uma densidade de potência de 100
mW/cm2 e fluência de energia de 30 J/cm2. Biofilmes orais polimicrobianos, que
foram desenvolvidos em ágar sangue, em placas com 96 poços, a partir de inóculo
de placa dental obtida a partir de sete pacientes. E, em seguida, também foram
expostas a PDT como citado acima. Seguindo o tratamento, a sobrevivência das
bactérias foi calculada por meio da contagem do número de unidades formadoras de
colónias (UFC/mL). O AM-carregados com nanopartículas catiônicas apresentou
maior fototoxicidade bacteriana, tanto na forma planctônica e como na forma de
biofilme, quando comparada com AM-nanopartículas carregadas aniônicos e livre
AM, embora os resultados não tenham sido significante (p> 0,05).
Como a cavidade bucal é particularmente acessível e adequada à
iluminação, a PDT também tem representado uma nova abordagem terapêutica no
controle de biofilmes orais. Nesta linha de pesquisa, os estudos estão voltados para
desenvolvimento ou descoberta de fotossensibilizantes mais seletivos (KONOPKA;
GOSLINSKI, 2007). A utilização de FS e doses de luz adequadas podem erradicar a
praticamente todos os microrganismos na região. No entanto, na cavidade oral, onde
existe um equilíbrio com microflora nativa, isto é um problema em potencial, pois
pode conduzir à proliferação de organismos oportunistas. Este inconveniente pode
ser superado utilizando um FS ligado a um anticorpo que reconhece apenas os
organismos alvo (KOMERIK; MACROBERT, 2006). Com o desenvolvimento de
24
novos FSs mais seletivos e da fibra óptica, para melhorar o acesso da entrega de
energia de excitação, o tratamento de infecções causadas por fungos, por meio da
terapia fotodinâmica, pode tornar-se uma nova abordagem terapêutica (BLISS et al.,
2004).
2.2 Papel dos agentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica
Os fotossensibilizadores (FS) são geralmente compostos macrocíclicos que
exibem nenhuma ou mínima toxicidade inerente, mas resultam na geração de
moléculas reativas de oxigénio citotóxico quando ocorre excitação com luz de
comprimento de onda adequado (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Para se
fazer uma escolha racional entre os milhares de FSs e fontes de luz disponíveis, é
necessário entender um pouco dos aspectos mecânicos de como o FS se comporta
com a iluminação e o que acontece quando é colocado em contato com células de
mamíferos em cultura de tecidos. A forma exata como a PDT influencia nas vias
celulares, é fortemente regulada pela localização do FS na célula, que depende de
sua natureza química, tais como: peso molecular, lipofilicidade, anfifilicidade, carga
iônica e características de ligação às proteínas; a concentração de FS, o tempo de
incubação, a concentração de soro e o fenótipo da célula alvo (CASTANO;
DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). Através da Microscopia confocal, Lam et al. (2011)
observou que os FSs podem localizar-se nas mitocôndrias, bem como de outras
membranas intracelulares.
Quando estes FSs são irradiados com luz ultravioleta ou visível em
determinados comprimentos de onda, absorvem energia e passam a um estado
excitado singleto (1S*). Este estado 1S* pode decair para o estado fundamental (0S)
com emissão de fluorescência, ou cruzar para um estado tripleto excitado (3S*) por
inversão espontânea do spin do elétron excitado. Uma vez formado, esta espécie
de 3S* pode participar em várias reações: pode decair ao estado 0S com emissão de
fosforescência, ou reagir por mecanismos fotoquímicos do tipo I ou II. Na reação do
tipo I, o 3S* pode reagir com um substrato orgânico ou uma segunda molécula
fotossensibilizadora, por transferência de elétrons ou hidrogênio. No tipo II, o
fotossensibilizador 3S* pode transferir energia para o oxigênio molecular, gerando 0S
e 1O2. Estes processos podem ocorrer simultaneamente e a importância de cada um
25
depende da molécula alvo, da eficiência da transferência de energia do
sensibilizador para o O2, do solvente e da concentração de O2 (RONSEIN et al.,
2006; DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; LYON et al., 2011). Este
mecanismo está ilustrado no esquema abaixo (figura 1) adaptado de Pereira
Gonzales; Maisch et al. (2012).
Figura 1 - Ilustração esquemática do mecanismo de ação da PDT
Fonte: Pereira Gonzales; Maisch et al. (2012)
Geração de moléculas reativas de oxigênio (ROS) pode seguir dois caminhos
alternativos após ativação da luz por um dado Fotossensibilizador (FS). Após a
absorção de um fóton, o FS sai do estado fundamental e um estado animado do FS
é formado. O estado animado é de curta duração e pode ser submetido a
cruzamento intersistema para o estado tripleto de vida longa, ou, alternativamente,
pode voltar ao o estado fundamental por emissão de fluorescência ou de calor, ou
ambos. Geralmente, o estado tripleto atua como um mediador das reações tipo I e
26
Tipo II no processo de fotossensibilização. Tipo I: Geração de peróxido de
hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (HO-) e ânion superóxido (O2-) pela transferência
de carga do FS no estado animado. Tipo II: O estado tripleto do FS pode sofrer
diretamente a troca de energia com o oxigénio no estado fundamental, conduzindo à
formação de oxigénio singleto, 1O2. O ROS gerado reage rapidamente com o seu
ambiente dependendo da localização do FS: paredes de microrganismos,
membranas lipídicas, peptídios, e ácidos nucléicos.
O oxigênio molecular, no estado fundamental, possui dois elétrons com
spins paralelos ocupando dois orbitais p de mesma energia, chamados de
degenerados,
caracterizando,
portanto,
um
estado
tripleto
(3∆g-).
Consequentemente, a redução direta do oxigênio por dois elétrons é proibida pela
regra de conservação do spin. Uma forma mais reativa de oxigênio, conhecida como
oxigênio singleto, pode ser gerada por um acréscimo de energia. Nela, a restrição da
regra de conservação do spin é removida. Sendo assim, o oxigênio singleto é muito
mais oxidante que o oxigênio molecular no seu estado fundamental. Existem dois
estados singleto do oxigênio: o primeiro estado excitado, 1∆g, tem dois elétrons com
spins opostos no mesmo orbital, possui uma energia de 22,5 kcal acima do estado
fundamental e tempo de meia vida em solvente aquoso de aproximadamente 10-6 s;
o segundo estado excitado, 1∆g-, tem um elétron em cada orbital degenerado, com
spins opostos, e possui uma energia de 37,5 kcal acima do estado fundamental. O
estado 1∆g- tem um tempo de vida muito curto (10-11 s) em meio aquoso, sendo
rapidamente desativado para o estado 1∆g. Portanto, apenas o primeiro estado
apresenta interesse em sistemas biológicos e será denotado por 1O2 (RONSEIN et
al., 2006).
Os FS têm estruturas moleculares que são tipificadas por ligações duplas
conjugadas que contêm um sistema deslocalizado de π-elétrons. No estado neutro
(singleto), estes elétrons são emparelhados em orbitais de spin de baixa
energia. Após a aplicação da luz correspondente ao pico de absorção do FS, o
elétron que ocupa o orbital molecular de maior energia do FS fica animado e salta
para o orbital molecular desocupado, excitando o FS a um estado singleto animado,
instável e de vida curta. O mais importante para o processo da PDT é a inversão do
spin do elétron animado, conhecido como cruzamento intersistema para originar o
estado tripleto do FS. Este estado tripleto é menos enérgico do que o estado
27
singleto animado, mas tem uma vida útil muito mais longa (microssegundos). O
elétron animado, agora com um spin paralelo, ao contrário da sua antiga forma
(elétron emparelhado), pode não reverter imediatamente para um nível mais baixo
de energia, de acordo com o Princípio de Exclusão de Pauli. Assim, o elétron
animado no estado tripleto do FS pode mudar sua orientação de spin (um processo
relativamente lento) e emitir sua energia como fosforescência, ou, alternativamente,
o FS pode interagir imediatamente com moléculas em seu ambiente, tais como o
oxigênio molecular (DAI et al., 2012).
O efeito fotodinâmico da substância fotossensível específica é atribuído à
sua capacidade de penetrar nos microrganismos susceptíveis, para absorver a luz
de determinado comprimento de onda, e para gerar produtos reativos de oxigénio
citotóxico (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). Os FS absorvem energia
diretamente de uma fonte de luz e pode, em seguida, transferir esta energia para a
molécula de oxigênio para criar uma forma ativada de oxigênio, chamado de
oxigênio singleto (1O2). O 1O2 é extremamente electrófilo e pode oxidar diretamente
ligações saturadas nas moléculas e macromoléculas biológicas, sendo o principal
agente citotóxico relacionado com a PDT (OCHSNER, 1997).
O FS, por si só, não tem ou apresenta um insignificante efeito
antimicrobiano. No entanto, após a irradiação com luz visível de comprimento de
onda apropriado, a substância em estado de repouso inicial torna-se instável.
Durante este processo, fótons (energia) são absorvidos pelo FS. Produtos
citotóxicos altamente reativos podem ser produzidos quanto houver a presença de
oxigênio. O resultado da reação do FS com o oxigênio molecular é a produção de
radicais Hidroxila (OH-) e superóxidos, radicais de oxigênio ou oxigênio singleto
(1O2). O oxigênio molecular no estado primário contém 6 elétrons na última camada
de energia, sendo dois desemparelhado. A transferência de energia pelo FS
promove a inversão do spin de um dos elétrons da molécula de oxigênio
transformando-a do estado tripleto para singleto. O oxigénio Singleto tem um
período de meia vida muito curto (nanosegundos) e sua difusão limita-se a uma
distância de até 100 nm. Por isso, sua atividade citotóxica é confinada somente ao
local onde é produzido. Em consequência disto, para que fotoativação tenha
sucesso, é necessário um período de pré-irradiação, após a aplicação, para que o
FS possa acumular-se na célula-alvo (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010).
28
Em laboratório, o
1
O2
é frequentemente gerado por reações de
fotossensibilização. Nestas reações, são utilizadas moléculas conhecidas como
Fotossensibilizadores (FSs), tais como: derivados de fenotiazinas (azul de toluidina e
azul de metileno); porfirinas (hematoporfírina, ácido delta-aminolevulínica), xantinas
(rosa bengala), clorinas (de clorina (e6)), derivados de clorina (e6) (como poli-L-lisina
e
polietilenoimina);
ftalocianinas
(disulphonated
ftalocianina
de
alumínio,
ftalocianinas catiónicas de zinco, disulphonated ftalocianina de zinco) (RYSKOVA;
BUCHTA; SLEZAK, 2010). O tetrapirrol, como porfirina, clorinas e bacterioclorinas, é
uma classe de FS que apresenta características promissoras para ser utilizado na
terapia fotodinâmica antimicrobiana (HUANG et al., 2010).
Para que a PDT seja realizada com sucesso, in vivo, é necessário assegurar
que uma quantidade suficiente de luz atinja todo o tecido doente. Isto envolve a
compreensão de como a luz se propaga dentro dos tecidos e dos efeitos relativos
absorção e dispersão da luz. O fato de a maioria dos FSs serem tanto fluorescente,
quanto fotoquimicamente ativo, permite que várias estratégias e protocolos possam
ser combinados na terapia fotodinâmica. O fator mais importante que regula os
resultados da PDT é forma como o FS interage com as células no tecido ou lesão
alvo, e o aspecto chave desta interação está relacionado à localização intracelular
do FS. Existem exemplos de FSs que se localizam nas mitocôndrias, lisossomos,
retículo endoplasmático, complexo de Golgi e membranas plasmáticas (CASTANO;
DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004).
Para a que as substâncias fotossensíveis possam ser ativadas é necessário
que sejam expostas a luz visível com um determinado comprimento de onda. A
maioria destas substâncias é ativada pela luz entre 630-700 nm. Isto corresponde ao
feixe de luz que penetra no tecido em até 0,5-1,5 cm, e, ao mesmo tempo,
representa o limite para efeito terapêutico da PDT (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK,
2010).
Um estudo, realizado por Huang et al. (2012), examinou as contribuições do
oxigênio singleto (1O2), obtido pelo mecanismo tipo II e radicais de hidroxila (HO-),
pelo mecanismo tipo I, no efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica em bactérias
Gram-positivas (Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis), e as bactérias
gram-negativas (Escherichia coli, Proteus mirabilis, e Pseudomonas aeruginosa).
29
Utilizaram como FSs duas substâncias: Tris-catiónico-buckminsterfulereno (BB6) e o
conjugado de clorina e polietilenimina (E6) (PEI-CE6). O conjugado PEI-CE6
produziu principalmente oxigênio singleto , enquanto que o BBB6 produziu
principalmente radicais de Hidroxila (OH-). Com relação a sensibilidade das
bactérias, as Gram-negativas foram mais susceptíveis aos radicais de HO-, e as
bactérias Gram-positivas foram mais susceptíveis ao oxigênio singleto (1O2).
Vários estudos mostraram a utilização de FSs e luz visível para destruir
fungos. No entanto, as propriedades físico-químicas necessárias para tornar mais
efetiva à terapia fotodinâmica têm sido pouco estudadas (DONNELLY; McCARRON;
TUNNEY, 2008). Segundo Castano; Demidova; Hamblin, (2004), as características
ideais dos FSs são:
Devem ter baixos níveis de toxicidade para os seres humanos e animais
experimentais no escuro e baixa incidência de toxicidade de funcionamento
durante a irradiação;
Devem absorver a luz em comprimentos de onda no vermelho ou entre a luz
vermelha e infra-vermelha, que tem a finalidade de penetrar nos tecidos;
Eles devem ter faixas de absorção relativamente elevadas (> 20.000-30.000
M-1 cm-1) para minimizar a dose do FS necessária para alcançar o efeito
desejado. A síntese do FS deve ser relativamente fácil e a matéria-prima
disponível para sua produção deve ser viável em larga escala.
Devem ser um composto puro com uma composição constante, prazo de
validade estável e ser solúvel em água ou em uma mistura de solventes
aquosos inofensivos.
Não devem agregar indevidamente em ambientes biológicos, pois isso reduz
sua eficiência fotoquímica.
A eliminação farmacocinética do paciente deve ser rápida, ou seja, deve ser
menor que um dia para que não seja necessária a proteção pós-tratamento à
exposição prolongada da luz com a pele.
Deve apresentar um intervalo de tempo curto entre a aplicação e a eliminação
para facilitar o tratamento ambulatorial que é mais agradável para o paciente
e de baixo custo.
Não trazer dor ao paciente, já que a terapia fotodinâmica, normalmente, não
requer anestesia ou sedação profunda.
30
Em uma revisão da literatura, que revisou os artigos publicados durante 51
anos (1960-2011), sobre as aplicações clínicas da PDT no combate as infecções,
Kharkwal et al. (2011) verificaram que vários corantes mostraram-se ser muito
eficazes in vitro e in vivo em modelos de infecção em animais, mas a maioria destes
FSs ainda está sendo testada em ensaios clínicos. Os FS que têm sido utilizados em
estudos clínicos são restritos, entre eles podem ser citados os corantes
Phenothiazinium (azul de metileno, azul de toluidina, e PP904 phenothiazinium); as
porfirinas, incluindo ALA-PPIX e derivados de hematoporfirina; vermelho neutro e
polyethylenimine clorina conjugado (e6).
Os resultados preliminares dos estudos demonstram que os dermatófitos e
leveduras podem ser eficazmente sensibilizados in vitro e in vivo através da
administração de FSs, pertencentes a quatro grupos químicos: corantes de
fenotiazina, porfirinas e ftalocianinas, bem como de ácido aminolevulínico, que,
embora não seja por si só um FS, é metabolizado de forma eficaz em protoporfirina
IX (CALZAVARA-PINTON, P. et al., 2012)
As ftalocianinas são compostos heterocíclicos de um núcleo de tetrapyrrole
ligados por pontes de nitrogênio. Alguns de seus derivados são usados como
corantes para impressoras (cor azul), tintas ou plásticos. São capazes de
permanecer no estado animado por um período mais longo em comparação com
azul de metileno ou azul de toluidina. Além disso, são mais resistentes à degradação
química ou fotoquímica. Absorvem a luz a um comprimento de onda entre 660-700
nm, que beira a extremidade do espectro infravermelho. As ftalocianinas já foram
estudadas para promover descontaminação sanguínea e para a terapia fotodinâmica
de cânceres (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010).
Para que uma molécula possa atuar como um eficiente FS, deve possuir a
capacidade de absorver a luz visível, passando para um estado excitado e
transferindo esta energia para o oxigênio molecular. Moléculas que possuem tais
características são tipicamente estruturas planares rígidas possuindo um alto grau
de conjugação. Os FSs mais empregados na PDT incluem as phenothiazinium,
porphyrin e phthalocyanine que apresentam estruturas planas, simples e tricíclicas,
tipicamente de natureza catiônica. Os compostos mais amplamente usados são o
azul de metileno (AM) e azul de toluidina (TBO). Ambos são eficientes na produção
31
de oxigênio singleto e apresentam absorção máxima de luz com comprimento de
onda de 656 nm, para AM, e 625, para TBO (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY,
2008).
Desde que foi sintetizado pela primeira vez em 1876, AM tem sido utilizado
em diferentes áreas da Medicina clínica, que vão desde a quimioterapia do cancro à
desinfecção do sangue. Além disso, o AM formou a base da quimioterapia
antimicrobiana, em particular na zona dos antimaláricos. Mais recentemente, o
potencial efeito fotossensibilizante do AM e de seus congêneres foi reconhecido,
fazendo com que fossem aplicados em associação com a luz com intuito de produzir
efeito antimicrobiano, especialmente na desinfecção do sangue. A vasta utilização
do AM, como agente FS, está relacionada à combinação da sua estrutura química
simples com facilidade de produzir reações de oxidação-redução in situ
(WAINWRIGHT; CROSSLEY, 2002).
O AM tem sido amplamente utilizado desde o final do século XIX em
investigações biomédicas. Foi o composto utilizado em várias áreas clínicas
importantes, incluindo o tratamento da malária e esquizofrenia. A PDT do cancro e,
mais
recentemente,
de
infecções
microbianas
(quimioterapia
fotodinâmica
antimicrobiana) também tem utilizado o AM e os seus congêneres, entre outros tipos
de produtos químicos, devido à baixa toxicidade humana e as propriedades
fotoativas deste grupo (WAINWRIGHT, 2005).
O AM tem uma forte absorção da luz em comprimentos de onda maiores do
que 620 nm, em que a penetração de luz no tecido é a ideal. Características como
baixa toxicidade, forte potencial antimicrobiano fotoativo e utilização e aceitação no
campo da Medicina, faz do AM um FS ideal para ser utilizado na terapia
fotodinâmica contra fungos (TEICHERT et al., 2002).
O AM é uma molécula, de baixa toxicidade e efeitos colaterais reduzidos, que
tem sido utilizada com diferentes finalidades na microbiologia e farmacologia há
bastante tempo. Entre suas indicações tradicionais, pode-se utilizar para corar
organismos vivos e para tratar a Metemoglobinemia, doença caracterizada pela
quantidade anormal no sangue de metemoglobina, que é a forma oxidada da
hemoglobina.Ultimamente, tem sido utilizada na PDT como droga fotossensibilizante
32
em associação com uma fonte de luz contínua. Suas principais indicações incluem o
tratamento de carcinoma de células basais, sarcoma de Kaposi, melanoma,
infecções virais e fúngicas. Tem características interessantes que conferem a esta
molécula um grande potencial de aplicação em PDT. Ele absorve luz intensa na
janela terapêutica e desencadeia os mecanismos tipo I e tipo II, que danifica
biomoléculas e induz a morte em vários locais nas células alvo, tecidos e
organismos. Portanto, como a irradiação, pode ser utilizado para tratar uma
variedade de doenças cancerosas e não cancerosas (TARDIVO at al., 2005).
Zeina et al. (2003) avaliaram a genotoxicidade imediata e tardia da PDT
utilizando uma combinação de luz visível (42 mW/cm2) e AM (100 µg/mL). Para
testar os efeitos tóxicos da terapia foi utilizada uma linhagem celular de
queratinócitos humano (H103) por meio do ensaio cometa. Os resultados desta
pesquisa
mostraram que
espécies microbianas associadas à
pele foram
susceptíveis a PDT, utilizando luz visível e AM, sem apresentar efeitos genotóxicos
detectáveis imediatos ou tardios sobre queratinócitos. Os autores ainda concluíram
que a PDT aplicada in vivo pode representar uma alternativa de baixo risco e ser útil
para o tratamento antimicrobiano convencional na dermatologia.
Em 2005, Lambrechts et al. avaliaram a citotoxicidade, in vitro, da PDT a
fibroblastos da derme humana utilizando porfirina, como FS. Estas células foram
submetidas a um protocolo de terapia fotodinâmica conhecido por ser efetivo para a
inativação de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, e Cândida
albicans. A viabilidade celular subsequente à exposição ao FS foi avaliada após 0 h,
6h, 18h e comparada com os valores do pré-tratamento. Os autores concluíram que
a terapia fotodinâmica, utilizando a porfirina, deve ser realizada com uma dosagem
que não cause efeitos citotóxicos nas células dérmicas.
Para que a PDT possa ser eficaz contra fungos, o FS deve ser capaz de
atravessar
através
da
parede
da
célular
e
chegar
às
organelas
citoplasmáticas. Vários fármacos FSs, incluindo o Photofrin ®, TMP-1363, porfirina
catiónico 5-fenil-10,15,20-tris (N-metil-4-piridil) porfirina cloreto (ida [4]) e clorina e6,
têm afinidade a diferentes estruturas celulares, tais como a membrana do plasma ou
mitocôndrias (LAM, M et al., 2011).
33
Fotossensibilizadores fenotiazínicos (azul de metileno e azul de toluidina) e
verde de malaquita foram utilizados por Vilela et al. (2012) para avaliar a ação da
PDT contra biofilmes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os biofilmes
foram cultivados em peças de amostra de resina acrílica e submetidos à terapia
fotodinâmica, usando um laser índio-gálio-alumínio-fosforado (InGaAlP) (660 nm,100
mW; 18,8 J; 20 J/cm2 e 105 mW/cm2) e as concentrações dos FSs variando 37,5 a
3.000 µM, que permaneceram no escuro por 5 min antes da iluminação. Após a
terapia fotodinâmica, as células dos biofilmes foram dispersos num homogeneizador
e cultivadas em caldo Brain Heart Infusion para quantificação de unidades
formadoras de colónias. Para cada microrganismo testado, existiram dois grupos
controles: exposto à radiação laser sem o FS (L+FS-) e o outro tratado com o FS,
sem exposição à luz laser vermelha (L-FS+). Os melhores resultados da PDT contra
biofilmes de S. aureus e E. coli foram obtidos com a concentrações de 300 µM do
AM, com reduções microbianas de 0,8-1,0 log10; 150 µM de azul toluidina, com
reduções microbianas de 0,9-1,0 log10, e 3000 µM de verde malaquita, com
reduções microbianas de 1,6-4,0 log10. Com os resultados, foi possível observar que
a maior redução microbiana foi alcançada com o FS verde malaquita quando
utilizados em concentrações mais elevadas do que as utilizadas para os corantes
fenotiazínicos.
A eficácia da seletividade do FS para os microrganismos, mas não para os
tecidos, também é uma preocupação importante para evitar efeitos tóxicos e danos
aos tecidos do hosédeiro na área da infecção. Com relação aos FSs, existem vários
fatores que ainda precisam ser bem definidos, incluindo as propriedades físicoquímicas do FS, a dose de aplicação, a taxa de absorção da droga, a sua
estabilidade e facilidade de aplicação e remoção após o uso. O efeito da PDT sobre
o sistema imune do hospedeiro é caminho que requer muitas investigações
científicas e pode ser um elo de ligação para o tratamento de infecções sistêmica
com esta modalidade de tratamento. Outro aspecto importante que necessita ser
estudado é a capacidade da PDT em destruir fatores de virulência segregados,
como lipopolissacáridos e outras proteínas que podem ser altamente vulneráveis a
oxidação por radicais reativos de oxigênio gerados durante a PDT (KHARKWAL et
al., 2011).
34
2.3 Etiologia e patogenia da Candidíase
A PDT antifúngica é uma área de crescente interesse. As pesquisas
avançam no sentido de identificar os mecanismos fotoquímicos e fotofísicos
envolvidos na fotoinativação; de desenvolver fotossensibilizantes potentes e
clinicamente compatíveis; de entender como fotoinativação é afetada por elementoschaves microbianos como fenotípicos resistentes, sistemas de efluxo multidroga,
formação de biofilmes, virulência e determinantes patogênicos; de explorar novas
plataformas de distribuição de FS e de identificar aplicações da fotoinativação além
do ambiente clínico, tais como desinfetantes ambientais (DAI et al., 2012; VERA et
al., 2012). Em muitos casos, os resultados são promissores, mas ainda preliminares,
necessitando de uma investigação mais aprofundada (VERA et al., 2012).
Candida albicans é o principal tipo de fungo capaz de causar infecções
superficiais da pele e mucosas, bem como infecções profundas, especialmente em
pacientes imunocomprometidos (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). A baixa
contagem
de
linfócitos
T
CD4+
(menor
que
200
células/mL)
tem
sido
tradicionalmente citada como o maior fator de risco para o desenvolvimento de
candidíase orofaríngea. O surgimento gradativo de outras espécies, além da
Candida albicans, causa preocupação, principalmente aquelas resistentes a azólicos
e outros agentes antifúngicos (ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012).
A candidíase, cuja etiologia está relacionada a Candida ssp., que colonizam
geralmente as superfícies epiteliais corpo, é muito mais prevalente em indivíduos
imunocomprometidos, como portadores de câncer, HIV/AIDS, diabetes, lactentes
prematuros e pacientes de internados em UTI, em comparação com os pacientes
saudáveis (CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2010). Embora a PDT tenha sido
desenvolvida principalmente para combater as lesões cancerosas, esta terapia pode
ser empregada para o tratamento de várias condições, incluindo doenças
infecciosas. Um grande número de microrganismos, incluindo bactérias Grampositivas e Gram-negativas, vírus, protozoários e fungos, apresenta susceptibilidade
à terapia fotodinâmica antimicrobiana, fazendo desta modalidade de tratamento uma
alternativa para o tratamento de infecções fúngicas (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK,
2010).
35
A incidência de micoses invasivas tem aumentado significativamente ao longo
das últimas 3 décadas e agora representa uma ameaça em crescimento exponencial
para a saúde humana devido a uma combinação de difícil diagnóstico e uma
escassez de drogas antifúngicas eficazes. Assim, infecções fúngicas sistêmicas
resultam em alta mortalidade. Candida albicans é a espécie de levedura patogênica
mais comum, representando cerca de 60% de todas as leveduras isoladas em
amostras clínicas (PRATES et al., 2011). Como exemplo dessa escassez de drogas
antifúngicas pode-se citar o caso da anfotericina B. Esta droga, que foi descoberta
em
1950,
ainda
tem
sido
o
medicamento
de
escolha
para
pacientes
imunocomprometidos afetados por infecções fúngicas. O fluconazol, introduzida em
1988, tem sido amplamente utilizado para o tratamento de infeções causadas por
leveduras; no entanto, a resistência a este fármaco pode limitar o seu uso no futuro
(PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012).
Em 2012, Anwar; malik; subhan realizaram estudo prospectivo durante um
período de 2 anos (2010-2011) para verificar a presença de infecção por cândida em
pacientes acometidos por
AIDS. Após os exames clínicos completos, foram
coletadas amostras para verificar a presença de Candida. As espécies foram
isoladas e testes de sensibilidade antifúngica foram realizados. As contagens de
células CD4+ de todos os pacientes foram correlacionadas com a presença (ou
ausência) de candidíase. De um total 165 pacientes com HIV positivo emaninados,
80 (48,8 %) dos pacientes tiveram diagnóstico definitivo de candidíase. Candida
albicans foi a espécie mais comum de levedura isolada. Os pacientes com
candidíase tinham contagem de CD4 inferior a 200 células/mm3 . A resistência
máxima foi observada com fluconazol, enquanto nenhuma resistência foi vista com
voriconazol.
A alta prevalência de resistência a drogas requer o desenvolvimento de novos
agentes
antifúngicos
contra
infecções
causadas
por
fungos
patogênicos
oportunistas, tais como Candida albicans (DOVIGO et al., 2011b; LAM et al., 2011).
O uso descontrolado de antifúngicos azólicos, como fluconazol, itraconazol,
cetoconazol e voriconazol, para o tratamento de infecções de mucosa e sistêmica de
Candida ssp. pode resultar na seleção e/ou aparecimento de cepas resistentes.
Apesar da natureza multifatorial da resistência à azólicos, acredita-se que pode está
relacionada alterações nos genes do fungo, que codificam a enzima alvo do azol e o
36
papel da regulação positiva de bombas de efluxo (SANGUINETTI, 2005). Várias
abordagens têm sido propostas para superar a resistência antifúngica mediada por
efluxo da droga, tais como: utilização de antifúngico alternativo que não apresente
substrato para bomba de efluxo (como equinocandinas, uma nova classe de
antifúngico); bloqueio do fornecimento de energia ao fungo e inibição farmacológica
direta das bombas de efluxo (PRATES et al., 2011).
Há uma necessidade urgente de buscar e implantar novas e eficazes contra
medidas antifúngicas alternativas. A PDT foi estabelecida como uma modalidade de
sucesso no tratamento das patologias citadas acima, mas a inativação fotodinâmica
só recentemente foi intensamente investigada como uma descoberta antimicrobiana
alternativa (DAI et al., 2012). O conceito de inativação fotodinâmica requer
exposição de células à energia da luz, normalmente com comprimentos de onda na
região do visível que faz com que a excitação de moléculas de FS, exógenas ou
endógenas, o que resulta na produção de moléculas reativas de oxigénio (ROS). Os
ROS produzem inativação e morte celular através da modificação de componentes
intracelulares. As características versáteis da PDT levaram a sua investigação como
uma descoberta para o tratamento anti-infeccioso (VERA et al., 2012).
Os fungos são importantes agentes de doenças humanas. Entre os fungos
patogênicos mais importantes são as espécies de leveduras pertencentes ao gênero
Candida (SILVA MARTINS et al., 2011). A Candidíase orofaríngea, causada
predominantemente por Candida albicans, é uma infecção frequente em pacientes
com imunodeficiência, como o HIV, deficiências nutricional, doenças metabólicas,
como diabetes, malignidades, xerostomia (secundária à terapia de radiação), efeitos
colaterais de medicamentos, envelhecimento, síndrome sjögren e próteses
dentárias. O desenvolvimento de candidíase depende do sistema de defesa do
hospedeiro e é considerado um preditor, independente de imunodeficiência, em
pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (MANG; MIKULSKI; SALA,
2010). Também pode está associada a dispositivos médicos de longa permanência
(por exemplo, implantes dentários, cateteres, válvulas cardíacas, enxertos
vasculares, lentes oculares, articulações artificiais e derivações do sistema nervoso
central), que podem atuar como substratos para o crescimento do biofilme (LAM, M
et al., 2011).
37
Candida albicans é um patógeno oportunista, capaz de produzir ambas as
infecções superficiais e sistêmicas, em hospedeiros imunocomprometidos (MUNIN et
al., 2007; MITRA et al., 2011). O controle de rotina das infecções oportunistas,
incluindo candidíase orofaríngea, é importante e deve ser realizado, pois ajuda a
monitorizar a progressão da doença e evita complicações, tais como a candidemia
(ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012).
A Candida albicans é o principal tipo de fungo capaz de formar biofilme,
causando infecções superficiais na pele e nas mucosas, bem como micoses
profundas, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Nesses pacientes,
infecções invasivas são frequentemente associadas com alta morbidade e
mortalidade. Além disso, o aumento da resistência antifúngica diminuiu a eficácia de
terapias convencionais. Os tratamentos são demorados e exigem, portanto, maiores
gastos para saúde. Além disso, as atuais drogas antifúngicas têm um espectro
limitado de ação e apresenta toxicidade. O uso da PDT, como um agente
antimicrobiano tópico, contra doenças cutâneas superficiais, representa um método
eficaz para a eliminação de microrganismos (PEREIRA GONZALES; MAISCH,
2012).
A parede celular fúngica é constituída por uma camada espessa de
betaglucano e quitina e também proporciona uma barreira à permeabilidade do
agente FS (KHARKWAL et al., 2011).
Os fungos apresentam uma estrutura celular muito mais complexa que as
bactérias. As leveduras constitui um grande grupo de microrganismos eucariontes,
que são envolvidas por uma parede celular externa composta por glucano, quitina e
lipoproteínas e é separada da membrana plasmática por um espaço periplasmático.
A absorção de substâncias exógenas por fungos é geralmente afetada pela
lipofilicidade e pela hidrofilicidade do seu revestimento celular. Após a captação, o
FS é direcionado a alvos intracelulares.
A presença do agente nestes alvos é
importante, pois o oxigênio singleto é altamente reativo e apresenta um tempo de
vida curto após a sua produção quando é irradiado. Assim que o oxigênio singleto é
formado pela excitação da luz no FS, apresenta efeito oxidante contra as enzimas
do fungo, tais como superóxidos dismutase e catalase, que são uma importante
defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigénio. Isto explica o fato
38
de não existir diferença na susceptibilidade à PDT entre organismos resistentes aos
antifúngicos
convencionais
e
os
não
resistentes
estudadas
(DONNELLY;
McCARRON; TUNNEY, 2008).
A levedura, Candida albicans, não é apenas a principal espécie associada a
micoses orais em humanos, mas a mais comum em pacientes com HIV, em quem
candidíase orofaríngea, em particular, é uma importante causa de morbidade
(PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Candidíase orofaríngea é uma das
infecções oportunistas mais comuns que acompanham os pacientes com AIDS
(LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005).
2.4 Inativação de Candida albicans por terapia fotodinâmica (PDT)
Em 1993, Wilson e Mia avaliaram a inativação fotodinâmica com laser de
baixa potência de cepas de Candida spp coletadas de lesões de candidose em a
pacientes com HIV. Suspensões de Candida albicans foram tratados com uma série
de FSs e expostos a luz de laser hélio/neon (HeNe) ou laser arseneto de gálio de
alumínio (GaAs) por 120s e, em seguida, foi avaliada a vitalidade dos
microrganismos. O azul de toluidina (TBO), tionina e cristal de violeta fotoativados
por laser HeNe (dose de energia=876 mJ e densidade de 66,36J/cm2). O éster
dihematopofirina não foi um FS eficaz sob as condições empregadas e já citadas
acima. O azul de metileno (AM) foi capaz de sensibilizar e matar Candida albicans
quando ativado por luz laser de GaAs (energia dose de 1,32 J, com uma densidade
de 2,04 J/cm2). Neste estudo os pesquisadores também observaram que a
viabilidade da levedura não foi afetada pela exposição à luz laser na ausência de
FSs.
Em 1999, Jackson et al. avaliaram o efeito antimicrobiano da terapia
fotodinâmica contra Candida albicans, utilizando o laser de baixa potência Hélio –
Neon (HeNe), com energia de 35 mW e comprimento de onda de 632,8 nm, e azul
de toluidina como FS. As variáveis estudadas foram a concentração do azul de
toluidina, a dose de luz laser e o tempo pré-irradiação. Os resultados deste estudo
demonstraram que ambas as formas de Candida albicans, levedura e hifas, bem
como cepas resistentes aos antifúngicos azólicos, podem ser sensibilizadas com
baixas doses de luz laser quando associadas a azul de toluidina em curto período de
39
tempo (2-5 min). A maior redução microbiana observada foi alcançada com a dose
de 42 J.
Teichert et al. (2002) avaliaram a eficiência da terapia fotodinâmica, utilizando
o AM nas concentrações 250, 275, 300, 350, 400, 450, ou 500 µg/ml, no tratamento
da candidíase oral induzida em ratos imunodeficientes. Setenta e cinco animais
foram incubados, por via oral, com Candida albicans coletadas de pacientes HIVpositivos três vezes ao dia por 4 semanas. Para o tratamento, foi realizada uma
administração tópica de 0,05 mL de uma solução de AM nas concentrações já
citadas. Após 10 minutos, as lesões de candidíase, do grupo experimental, foram
submetidas a terapia fotodinâmica com 664 nm de luz laser de diodo a 275 J/cm2 e
400 mW durante um tempo de 687,5 segundos. Decorrida a terapia fotodinâmica,
realizou-se uma cultura das lesões e exame histopatológico do tecido da área
afetada. Os resultados indicaram que o efeito que foi diretamente proporcional à
concentração do agente FS, quando nas concentrações ente 250 e 400 µg/ml,
reduziu o crescimento do fungo, mas não eliminou totalmente a Candida albicans. Já
nas concentrações de 450 e 500 µg/ml de AM, a C. Candida albicans foi totalmente
erradicada da cavidade bucal. Para os autores deste estudo, a terapia fotodinâmica
mediada por AM pode ser usada potencialmente para o tratamento de candidíase
oral em pacientes imunodeficientes.
A demonstração científica da susceptibilidade de Candida ssp. à PDT, usando
um corante ou FS que já está sendo utilizado na clínica médica, é um passo
importante para que esta modalidade de tratamento se torne uma nova estratégia
terapêutica com potencial para tratar a infecção fúngica. Claramente, seletividade
destes agentes é uma questão importante, pois as células humanas saudáveis
podem ser suscetíveis a danos causados por eles. A aplicação tópica do FS e da
luz, apenas nas áreas afetadas por candidíase mucocutânea, faz com que essas
infeções possam ser tratadas com PDT com o mínimo de efeitos colaterais locais
(BLISS et al., 2004).
Para avaliar a susceptibilidade de Candida ssp (Candida albicans; Candida
krusei e Candida glabrata) à terapia fotodinâmica, Bliss et al. (2004) utilizaram o
Photofrin®, como agente FS, e uma lâmpada de argônio, como luz vivível. As
células foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas no escuro durante 30
40
min a 37 ° C com Photofrin® em concentrações que va riaram 10-0,01 ug/ml. A
iluminação foi realizada durante 10 min à temperatura ambiente com uma fluência
total de 9J/cm 2. A irradiação das células fotossensibilizadas levou a uma inibição
dose-dependente da atividade metabólica das espécies de Candida albicans e
Candida krusei.
A Candida glabrata foi resistente a PDT, produzindo reduções
modestas de sua atividade, mesmo em altas concentrações do FS, provavelmente
devido a pouca absorção do Photofrin® por esta espécie de Candida.
Lambrechts; Aalders; Van Marle (2005) estudaram os mecanismos de
inativação fotodinâmica em Candida albicans utilizando uma porfirina catiônica 5fenil-10,15,20-tris (N -metil-4-piridil) porfirina cloreto TRIP ([4]) por meio das técnicas
de microscopia eletrônica e fluorescência confocal. Os autores observaram que
TRIP [4] liga-se a membrana celular das cepas de Candida albicans, e nenhum ou
muito pouco do FS entra na célula. Concluíram que a PDT pode inativar com
sucesso Candida albicans e que a membrana citoplasmática é a organela alvo da
porfirina catiônica. As imagens de microscopia eletrônica mostraram claramente que
os danos induzidos pela PDT ocorrem da camada externa da membrana
citoplasmática para o interior da célula. As imagens de fluorescência confocal
mostraram que ocorreu um efluxo maciço do FS após a morte celular.
Souza et al. (2006) estudaram os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a
viabilidade de diferentes espécies de Candida. Foram preparadas suspenções de
Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida krusei e Candida tropicalis,
contendo 106 células/mL. De cada uma das espécies, 10 amostras da suspensão de
células foram irradiadas com laser de diodo (λ = 685 nm e densidade de energia de
28 J/cm2) na presença de AM (0,1 mg/mL) por 5 minutos; 10 amostras foram apenas
tratados com AM (0,1 mg/ml por 5 min), sem exposição à luz laser; 10 amostras
foram irradiadas com o laser na ausência do corante e 10 amostras não foram
expostas luz de laser, nem ao corante AM. De cada amostra, uma série de diluições
de 10-2 e 10-3 foram obtidos e alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram plaqueadas
em duplicata em ágar dextrose Sabouraud. Após incubação a 37 º C por 48 horas, o
número de unidades formadoras de colônia (UFC/ml) foi obtido e os dados foram
submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p <0,05). Os pesquisadores
observaram que a fotoativação do AM na concentração de 0,1mg/mL reduziu o
41
número de UFC/ml em 88 Candida krusei e 82,3% para a Candida tropicalis. A
radiação laser ou AM sozinho não reduziu significativamente o número de UFC/mL
em todas as amostras de Candida, com exceção de Candida tropicalis, que foi a
única espécie apresentou susceptibilidade à luz lazer na ausência do FS. Neste
estudo a PDT apresentou efeito fungicida em todas as espécies de Candida
pesquisadas.
Munin et al. (2007) estudaram o efeito da PDT na inibição da formação de
tubo germinativo por Candida albicans, que é um estado de transição entre células e
brotamento de hifas e representa uma etapa essencial para a virulência do fungo.
As culturas de Candida albicans foram semeadas em ágar dextrose Sabouraud e
incubadas a 37 oC por 48 h. Após a incubação, amostra de colónias foi removido da
superfície do ágar e preparadas suspensões solução fisiológica estéril (0,85 %) com
densidade células viáveis de 1-5 x 107. A suspensão de Candida foi semeada em
placas de microtitulação com 96 poços, nos quais foi adicionado AM com
concentrações que variaram entre 0,027 a 13,37 mM. Após um período de
incubação de 5 min as placas foram iluminadas com laser de diodo com área do
feixe de 0,38 cm2, potência de 0,035 W, comprimento de onda de 683 nm e
densidade de energia de 28 J/cm2. Alíquotas dos poços foram diluídas 100 vezes
com solução fisiológica estéril e uniformemente espalhada em uma placa de Petri,
que formam novamente incubadas (37 oC por 48 h). Após este período, o número
de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) foi determinado. O
aumento da concentração de AM de 0,027 a 0,27 mM reduziu drasticamente o
número de UFC/mL após a irradiação. Concentrações de AM superiores a 0,27 mM
diminuíram progressivamente o efeito do laser. Na ausência de irradiação com laser,
o AM não produziu redução de UFC/mL nas concentrações variando entre 0,027 a
13,37 mM. As células tratadas com AM (0,013Mm) associada com a irradiação com
luz Laser apresentaram mínima ou nenhuma formação de tubo germinativo
Peloi et al. (2008) testaram um diodo emissor de luz (LED), como fonte de luz
alternativa, associada com o AM, na PDT contra Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Candida albicans e Artemia salina. A luz LED apresentava
comprimento de onda 663 nm e doses de 2, 4, 6 e 12 J/cm2, resultando em um
tempo de exposição de 10, 20, 30 e 60 min respectivamente. Os grupos teste foram
42
preparados adicionando-se 400µl da suspensão celular (108UFC/mL) a 100µl do AM
em diferentes concentrações variando de 7 a 140,8µM. No tempo de irradiação de
20 min e concentração de AM de 42,2 mM, a PDT resultou em uma taxa de
inativação de 93,05% para S. aureus e, na concentração de 35,2 mM de AM, houve
uma taxa de inativação de 93,7% para E.coli e 93,33% para Candida albicans.
Concluíram que o LED vermelho pode ser um dispositivo de luz promissor para PDT.
Chabrier-Roselló et al. (2008) avaliaram o efeito da terapia fotodinâmica sobre
Candida albicans e Candida glabrata, que apresentavam deficiência respiratória e,
portanto um padrão de resistência a família antifúngicos azólicos, peptídeos
antimicrobianos, histamina salivares e a outros tipos de estresse tóxico. Utilizaram o
Photofrin® como FS. Em contraste com este padrão de resistência, ambos as
espécies de Candida albicans e a Candida glabrata foram significativamente mais
sensíveis à PDT em comparação com as espécies não resistentes. Estes dados
sugerem que a função mitocondrial normal pode fornecer um nível basal de defesa
anti-oxidante contra a fototoxicidade induzida pela PDT.
Cadastro et al. (2008) tratou um paciente leucoderma, do sexo feminino, com
56 anos de idade e com diagnóstico de lesões orais recidivantes localizadas nas
comissuras labiais. Na anamnese, o paciente relatou possuir diabetes mellitus,
hipertensão controlada, que as lesões recidivavam frequentemente há mais de dois
anos e que já tinha realizado diversas manobras terapêuticas que resultaram em
insucesso, como aplicação tópica de miconazol três vezes ao dia por um longo
período, e por vezes associado de forma sistêmica. Ao exame clínico intra e extra
bucal observou-se lesões acometendo bilateralmente a região de comissura labial,
com úlceras fissurais, leito hiperêmico, hemorrágico e halo eritematoso com
presença de descamação e ruptura do epitélio, seguido de intensa dor. O
diagnóstico das alterações foi baseado nas características clínicas, confirmados por
exame citológico. Foi realizado o teste para avaliação do fluxo salivar, que resultou
em valor moderado, confirmando presença de xerostomia leve. Como conduta de
tratamento, aplicou-se com swab estéril, com leves toques, o agente azul de
metileno a 0,1 mg/ml em toda extensão da lesão seguido da aplicação única do laser
de baixa intensidade de potência (Arseneto de Gálio e Alumínio – GaAlAs) – a
790nm e 30 mW de potência, durante 2 minutos e 20 segundos, de forma pontual
43
até contemplar toda área da lesão clínica, gerando uma densidade de energia de 4
J/cm². A paciente foi avaliada no 3º e no 7º dia e após uma proservação de mais de
seis meses não houve a presença de recidivas. Concluíram que o tratamento da
queilite angular, utilizando a terapia fotodinâmica, evidenciou ausência de lesões
clínicas e citológicas, reforçando fácil aplicabilidade, sem a presença de efeitos
colaterais adversos, tornando-se um método alternativo de tratamento efetivo e
recomendado.
Donnelly; McCarron; Tunney (2008) analisaram pesquisas publicadas, até
esta data, sobre as aplicações antifúngicas da PDT. Os resultados destas pesquisas
experimentais demonstraram, de forma conclusiva, que dermatófitos e leveduras
podem ser destruídos efetivamente por meio da PDT, empregando phenothiazinium,
porphyrin e phthalocyanine como fotossensibilizadores. Estes FS apresentaram
seletividade para os fungos, não induziram resistência fúngica e não produziram
efeitos genotóxicos, nem mutagênicos para os fungos ou para as células humanas.
No entanto, os pesquisadores observaram a carência de estudos publicados do tipo
ensaios clínicos com seres humanos.
Cormick et al. (2009) estudaram o efeito da fotoativação com luz visível de
duas
porfirinas
catiônicos:
TFAP3+
(5
(4-trifluorophenyl)-10,15,20-tris(4
trimethylammoniumphenyl)porphyrin iodeto) e TMAP4+ (5,10,15,20-tetra(4-N,N,N
trimethylammonium phenyl) porphyrin p-tosylate) na viabilidade de Candida albicans.
Os resultados dessas porfirinas catiónicos foram comparados com os da
5,10,15,20-tetra (4-sulfonatofenil) porfirina (TPPS4-), que é um FS aniônico.
Diferentemente da porforina anônica (TPPS4-), as porfirinas catiônicos ligaram-se
rapidamente
a
células
de
aproximadamente 4 nmol/10
6
Candida
albicans,
alcançando
um
valor
de
células quando as suspenções celulares foram
incubadas com 5 µM dos FSs durante 30 min. Esta ligação dependeu da
concentração do FS (1-5µM) e da densidade celular (106 a 108 células por mL). A
inativação fotodinâmica das células de Candida albicans aumentou com o aumento
da concentração do FS, causando uma redução de aproximadamente 5 log10 na
viabilidade celular, quando as culturas foram
tratadas com 5 µM de porfirina
catiónica e irradiada durante 30 min. As Porfirinas catiônicos produziram uma
redução de crescimento das colónias de Candida albicans e a viabilidade das
44
células não foi observada depois de 3 horas de irradiação, indicando uma inativação
completa das células de levedura. Portanto, estes resultados indicam que estas
porfirinas catiônicos são sensibilizadores importantes para inativação fotodinâmica
de leveduras em suspensões líquidas ou localizadas em focos de infecção.
Carvalho; Felipe; Costa (2009) estudaram os efeitos das condições do meio
ambiente durante a terapia fotodinâmica antimicrobiana em Candida albicans;
Usando azul de metileno e azul de toluidina como agentes FSs. Neste estudo foi
observada a redução na inibição do crescimento de cândida em um meio
tamponado, com pH maior que 6.0 e manutenção dos efeitos fototóxicos apenas na
presença de solução salina (meio não tamponado).
Diferentes membros da mesma classe de microrganismo parecem ter
diferentes padrões de suscetibilidade à terapia fotodinâmica antimicrobiana devido a
determinantes metabólicos intrínsecos, tais como: defesa enzimática contra
moléculas reativas de oxigênio e bombas de efluxo que reconhecem as moléculas
do FS (PRATES et al., 2011).
A PDT, com AM, aumenta a permeabilidade da
membrana celular em Candida albicans, o que poderia reduzir a resistência deste
microrganismo contra outras drogas. Desta forma, a PDT pode também ser
empregada como um coadjuvante da quimioterapia antifúngica convencional (LYON
et al., 2011).
Estudando os mecanismos pelos quais a PDT produzem efeito antimicrobiano
contra Candida albicans, Giroldo et al. (2009) utilizaram suspensão Candida albicans
(ATCC 10-231), com uma densidade 1-5 x 107 células viáveis/mL, que foram
semeadas em placas de microtitulação com 96 poços. Em seguida, foi adicionado às
suspensões AM nas concentrações entre 0,01 mg/mL e 0,5 mg/mL, resultando em
um volume final de 0,2 ml por cada poço. Após um período de incubação de 5 min,
foi aplicada a luz de um laser de diodo, com potência de 35 mW de saída e
comprimento de onda de 684 nm. A área iluminada pelo feixe de laser foi de 0,38
cm2, resultando em uma dose de energia de 28 J/cm2. Alíquotas de 50 µL foram
retiradas antes e após a iluminação para determinar o número de unidades
formadoras de colônias (UFC/mL). O aumento da concentração do AM aumentou o
efeito da PDT no crescimento de Candida albicans, mas este resultado não foi
observado na ausência de irradiação. Na presença de AM a 0,05 mg/mL, houve uma
45
redução de 50% da UFC/mL. No entanto, em concentrações superiores a 0,05
mg/mL, ocorreu uma redução progressiva na inibição do crescimento do fungo. A
inativação do crescimento foi associada ao aumento da permeabilidade da
membrana plasmática, o que sugere que após a irradiação, AM pode levar à
produção de oxigénio singleto e outras moléculas reativas de oxigênio, que podem
danificar a membrana da célula e, por conseguinte, promover a morte celular.
Em 2009, Junqueira et al. testaram os efeitos da PDT, utilizando 0,1 mg/mL
de AM, como FS, e lazer de diodo (660nm, 50mw, 10J, 26J/cm2) em um modelo
experimental de candidíase bucal induzida no dorso da língua de ratos. De acordo
com as modalidades de tratamento, 72 animais, utilizados para o experimento, foram
distribuídos em quatro grupos: grupo (L+FS+), lesões tratadas com PDT, aplicação
de AM por 5 minutos e irradiação com luz laser; grupo (L-FS+), lesões tratadas
apenas com o AM, grupo (L+FS-), lesões tratadas apenas com laser e grupo (L-FS-),
lesões que não receberam tratamento algum. Em seguida, os animais foram
sacrificados imediatamente, com 1 e 5 dias após o tratamento para a análise
microscópica do dorso da língua. O grupo tratado com PDT apresentaram menor
resposta inflamatória crônica e alterações epiteliais amenas em comparação com o
grupo que não recebeu tratamento. As lesões tratadas apenas com laser ou
somente com o AM apresentaram uma resposta inflamatória e alterações epiteliais
mais severas em comparação com o grupo tratado com PDT. Os ratos tratados com
a terapia fotodinâmica (PDT) desenvolveram lesões candidíase mais discretos do
que os demais grupos.
A eficácia de diferentes FSs na terapia fotodinâmica contra Candida albicans
foi testada, em 2010, por Souza et al.. Para realizar o experimento, utilizaram laser
de baixa potência (AsGaAI), com densidade de energia de 15,8 J/cm2, 26,3 J/cm2 e
39,5 J/cm2, e azul de metileno, azul de toluidina e verde de malaquita, na
concentração de 0,1 mg/mL, como fotossensibilizantes. Com auxílio de um
espectofotômetro, suspensões de Candida albicans, com 106 células por mL, foram
padronizadas, as quais foram adicionadas o corante e aplicada a luz laser. Para
cada corante, foram realizados 120 ensaios, que foram divididos em quatro grupos
de acordo com as seguintes condições experimentais: irradiação com laser na
presença do FS, irradiação apenas com laser, o tratamento apenas com o FS e sem
exposição à luz laser e nem ao FS. Com os resultados dos testes, observou-se que
46
a terapêutica fotodinâmica, usando os FSs testados, foi eficaz na redução do
número de UFC/ ml de Candida albicans entre 0,54 log10 e 3,07 log10 e que esta
redução dependeu da densidade de energia do laser utilizado. A redução do log
UFC/mL de Candida albicans cresceu com o aumento da densidade de energia do
laser de 15,8 J/cm2 a 39,5 J/cm2 para todos os FSs testados. No grupo tratado com
laser, na ausência de FS, houve uma redução do número de UFC/mL, sugerindo
que a levedura apresenta susceptibilidade à luz laser. Nenhum dos FSs testados
(azul de toluidina, azul de metileno ou verde malaquita) exerceu um efeito citotóxico
em Candida albicans na ausência de luz.
Com a idéia de que a deficiência respiratória aumenta os níveis intracelulares
de moléculas reativas de oxigênio em leveduras, Chabrier-Roselló et al. (2010)
usaram um inibidor do metabolismo respiratório (antimicina A) e cepas alteradas
geneticamente, com deficiência na função respiratória, para determinar se a
interferência na cadeia de transporte de elétrons e de sua função resulta em
sensibilidade aumentada à terapia fotodinâmica (PDT) sobre Candida albicans,
Candida glabrata, e
ema levedura não patogênica, S. cerevisiae. Utilizaram
porfirina catiônica meso-tetra como FS (N-metil-4-piridil) Porphine tetra tosilato
(TMP-1363), que foi ativado por luz visível a partir de lâmpadas fluorescente (4,0
mW/cm2, 4 J/cm2 e 575 - 700 nm) por 10 min. A inibição metabólica da respiração
aumentou a sensibilidade de Candida ao estresse oxidativo induzido pela PDT,
resultando em uma redução de 2 log10 de UFC/mL em comparação com as cepas
sem deficiência respiratória. As cepas alteradas geneticamente com deficiência
respiratória também apresentaram uma maior sensibilidade à PDT e isto não foi
resultado do aumento do acúmulo de porfirinas endógenas. Os resultados do estudo
demonstram que a inibição seletiva do ETC (Complexos III e IV) aumenta
significativamente a sensibilidade de Candida albicans, Candida glabrata, e S.
cerevisiae à PDT quando sensibilizadas com TMP-1363.
Mang; Mikulski; Sala (2010) testaram o efeito da terapia fotodinâmica (PDT)
sobre espécies de Candida (Candida albicans, Candida glabrata, Candida
parapsilosis, Candida krusei e Candida tropicalis) resistentes e sensíveis ao
fluconazol e a anfotetricina B, que foram isoladas de pacientes adultos com AIDS.
Utilizaram o Photofrin (25 µg/mL), como FS, e luz lazer KTP: YAG (comprimento de
47
onda = 630 nm, densidade de potência = 150 mW/cm2 e doses de = 45, 90, 135
J/cm2). Os resultados mostraram uma significativa redução na viabilidade de
Candida em todas as doses de luz. Este estudo demonstrou que a PDT, induzida
por Photofrin, pode eliminar espécies de Candida com eficiência significativa. As
cepas, que tinham demonstrado resistência antifúngica a fluconazol e anfotericina B,
isoladas de pacientes com AIDS, apresentaram sensibilidade equivalente à PDT,
assim como os controles formados por cepas ATCC, não resistentes, da mesma
espécie. Os controles foram formados pelas culturas que não foram tratadas com
PDT, que foram apenas irradiadas, sem o Photofrin, e por as que foram tratadas
apenas com o FS.
Porficenos catiônicos (Py3MeO-TBPO), derivados de porfirina, foram
testados, in vitro, como FSs na PDT contra espécies de leveduras (Cândida albicans
e Candida krusei), assim como contra diferentes bactérias Gram-positivas
(Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis) e Gram-negativas (Acinetobacter
baumanii,
Escherichia
coli,
Proteusmirabilis
e
Pseudomonas
aeruginosa).
Suspensões de bactérias (108 CFU/mL) e de levedura (107 UFC/mL), foram
incubadas em no escuro à temperatura ambiente durante 30 min com concentração
de Dimetilacetamida (DMA) gradativamente aumentada a partir de 5 mM. Todas as
bactérias e Candida albicans foram irradiadas com uma luz não coerente de 652 nm
± 15 nm e taxa de fluência de 125 mW/cm2. A Suspensão de C. krusei foi irradiada
por meio de Photocare (Sorisa) a 635 ± 10 nm e taxa de fluência de 35 mW/cm2.
Todas as espécies bacterianas Gram-positivas foram completamente eliminadas
pela PDT com Py3MeO-TBPO. E. faecalis foi a espécie mais sensíveis com redução
de 6 log10 na viabilidade bacteriana na concentração de 0,5 µM e uma dose de
energia de 30 J/cm2 cm. Para a inativação de espécies gram-negativas foi
necessário concentrações do FS e doses de luz maiores para reduzir de 6 log10 na
viabilidade bacteriana.
Ambas as espécies de Candida foram completamente
eliminadas por Py3MeO-TBPO com concentração do FS e dose de luz dependente.
A concentração de 50 µM e uma dose de luz de 30 J/cm2 produziu uma redução de
5 log10 na viabilidade de Candida albicans. Apenas uma concentração de 10 µM e
dose de luz de 15 J/cm2 foram necessárias para produzir a mesma redução na
viabilidade celular de Candida krusei (RAGAS et al., 2010).
48
Quiroga et al. (2010) avaliaram o efeito da fotoativação, in vitro, de 5,10,15,20
- tetra (4-N-metilpiridil) porfirina (TMPyP) contra células de Cândida albicans sob
diferentes condições experimentais. Suspensões celulares (106 CFU/mL) foram
incubadas, no escuro, com 1, 5 e 10 mM do FS pelo período de 30 min. Depois
disso, as culturas foram expostas a visível luz por diferentes intervalos de tempo.
Experimentos controles foram realizados sem iluminação na ausência e na presença
do sensibilizador. As suspensões de células irradiadas e controles foram diluídas em
série com solução salina, cada solução foi semeada em triplicada em meio
Sabouraud e o número de colónias formadas após de 48 h de incubação a 37 oC
foram contadas. Com os resultados, foi possível observar que o aumento na
quantidade de FS ligado a Células de Candida albicans não foi observada quando o
tempo de incubação foi estendido para 30 min. O FS apresentou um efeito tóxico
contra as células de Candida albicans, produzindo uma redução de 1,5 log10 de
sobrevivência celular, apenas na concentração de 10 mM. Por isso, foi escolhida a
concentração de 5 mM do FS para as experiências nas suspensões de células. A
viabilidade de Candida albicans não foi afetada quando aplicada a luz na ausência
do FS. Quando a concentração do FS variou de 1 mM para 5 mM, houve uma
redução de 3,5 log10 para 5 log10. Sob estas condições, a inativação de Candida
albicans foi proporcional ao tempo de irradiação. O estudo concluiu que o TMPyP é
um sensibilizador efetivo para aplicação na PDT de Candida albicans em
suspensões celulares e em focos de infecções localizadas.
Em um estudo que utilizou Fotogem®, como FS, e diodo emissor de luz
(LED), como luz visível (λ ≅ 455 nm e 12,5 mW/cm2), Dovigo et al. (2010) avaliaram
o efeito da PDT na susceptibilidade, in vitro, de quatro espécies de Candida
(Candida albicans , Candida dubliniensis , Candida tropicalis e Candida krusei).
Suspensões de cada espécie (106 UFC/mL) foram tratadas, no escuro, com três
concentrações diferentes de FS (10, 25 e 50 mg/L) durante 30 minutos. Em seguida,
foram irradiadas com três fluências ou doses de luz: 18,0; 25,5 e 37,5 J/cm2 de luz
LED, que corresponde aos tempos de 50, 34 e 24 minutos. As suspenções controles
foram tratadas apenas com FS, apenas expostas à luz ou nem expostas luz, nem ao
FS. Dezesseis condições experimentais foram obtidas e cada condição foi realizada
em triplicata. De cada exemplo, diluições em série foram obtidas e as alíquotas
foram plaqueadas em Agar Sabouraud Dextrose. Depois a incubação das placas (37
49
°C durante 48 horas), as colónias foram contadas (U FC/mL). Foi observada a
eliminação completa de Candida albicans com uma dose de luz de 18,0 J/cm2, em
associação com 50 mg/L de FS. C. dubliniensis foram inativadas após 18,0 J/cm2,
utilizando 25 mg/L do FS. A inativação de Candida tropicalis, foi observada após a
fotossensibilização com 25 mg/L e subsequente iluminação de 25,5 J/cm2. Para
Candida krusei, nenhuma das associações entre FS e luz resultou em completa
inativação desta espécie. PDT se mostrou eficaz para a inativação de Candida
albicans, Candida dubliniensis e Candida tropicalis e redução significativamente a
viabilidade celular de Candida krusei.
Dovigo et al. (2011a) avaliaram o efeito da fotoativação do Photogem® com
luz LED (diodo emissor de luz), com comprimento de onda de 630 nm, sobre cepas
(ATCC) de Candida albicans e Candida glabrata resistente ao fluconazol.
Suspenções (106 células/mL) de cada espécie de Candida foram tratadas com cinco
concentrações de Photogem® (2,5, 5, 10, 25 e 50 mg/ml) por 30 min e irradiadas
com uma intensidade de luz LED de 12,5 mW/cm 2 e comprimento de onda de 450
nm, com quatro densidades 10,5; 18,0; 25,5 e 37.5 J cm2, resultando
respectivamente nos seguintes tempos de iluminação: 14, 24, 34 ou 50 min.
Também foi avaliado o efeito na viabilidade das espécies de Candida apenas a luz
LED e somente ao Photogem®. O controle constitui-se de suspenções de Candida
que não foram expostas nem a luz LED, nem ao FS. Após a PDT, foram obtidas
diluições seriadas de cada amostra (10-1 e 10-3), e alíquotas de 25µl dessas diluições
foram plaqueadas em ASD. As placas foram incubadas a 37°C por 48horas. Após a
incubação, foi realizada a contagem de UFC/mL.
Para avaliar o efeito da PDT
contra biofilmes de Candida, alíquotas da cultura de células foram transferidas para
a superfície de filtros de membrana de nitrato de celulose para formar o biofilme, que
tratados com 25 mg/mL do FS e irradiado com 37,5 J/cm2. Suspensões planctônicas
de Candida resistente ao fluconazol foram efetivamente inativadas após PDT. O
efeito fungicida da PDT foi dependente da espécie. Reduções significativas na
viabilidade do biofilme foram observadas para as três cepas de Candida albicans e
por duas cepas de Candida glabrata. Os resultados demonstraram que a dose de luz
mínima que promoveu a completa inativação das duas cepas de Candida albicans
foi 18J/cm2, em associação com 50mg/L de Photogem®. Observou-se diferenças
estatisticamente significantes na obtenção da inativação total das duas cepas de
50
Candida glabrata. Para as espécies ATCCs, não houve crescimento de colônias
viáveis após o tratamento com 10, 25 e 50mg/L de Photogem® seguido de
iluminação a 37,5J/cm2. No entanto, somente as concentrações de 25 e 50mg/L
foram capazes de eliminar a Candida glabrata resistente a fluconazol nas doses de
25,5 e 37,5J/cm2. Além disso, na forma de biofilmes as espécies foram menos
suscetíveis à PDT do que nas formas planctônicas.
Em 2011, Pupo et al. avaliaram a susceptibilidade de Candida albicans à
terapia fotodinâmica e, paulatinamente, comparou a eficácia dos agentes
fotossensibilizantes azul de metileno e azul de toluidina, ambos na concentração de
100 µg/mL. Como fonte de luz, foi utilizado o laser índio-gálio-alumínio (InGaAI) com
densidade de energia de 53 J/cm2. Foram preparadas suspensões de 108 células/mL
de Candida albicans e colocadas em placas de microtitulação de 96 poços, nas
quais foram adicionados os corantes. Em seguida, foi aplicada a luz laser por 5
minutos e as placas foram incubadas por 48 horas a 37 oC. Os resultados foram
obtidos pelo número de unidades formadoras de colônia por mL (UFC/mL). Os
resultados mostraram que o número de células viáveis de Candida albicans reduziu
significativamente após a aplicação da luz laser associada ao azul de metileno e
azul de toluidina.
Martins
et
al.
(2011)
verificaram
o
efeito
da
terapia
fotodinâmica
antimicrobiana em lesões de Candida albicans induzidas no dorso da língua de
ratos, utilizando AM como FS. Cinquenta e seis animais foram submetidos ao
desenvolvimento da candidíase no dorso da língua por meio de inoculações Candida
albicans. Após 5 dias, os animais foram divididos em quarto grupos de acordo com o
tratamento recebido: FS e Laser (FS+L+), somente laser (L+FS-), apenas o FS e
apenas solução fisiológica (L-FS-). Após a PDT, foram coletadas amostras das
lesões da cavidade oral para contagem das unidades formadoras de colônia por mL
(UFC/mL). Colônias foram isoladas para avaliação das atividades de protease e
fosfolipase. Os ratos foram sacrificados para análise microscópica do dorso da
língua. Com os resultados encontrados, os autores concluíram que a terapia
fotodinâmica reduziu as lesões microscópicas de candidíase experimental em ratos
e inibiu a atividade de proteinase de Candida albicans.
51
O PDT entre bactérias e fungos foi comparado no estudo de Huang et al.
(2010), em que investigaram a efetividade de 4 novas bacterioclorinas estáveis
sintéticas, com 2, 4 ou 6 grupos de quaternário de amônia ou 2 grupos básicos de
amina. A mostra foi composta por uma bactéria gram-positivas (Staphylococcus
aureus), uma bactéria gram-negativas (Escherichia coli) e uma levedura de fungos
dimórficos (Cândida albicans). Foram preparadas suspenções, com densidade
celular de 108 células/mL para as bactérias, e de 107 células/mL, para Candida
albicans. Alíquotas (1 mL) foram transferidas para uma placa de 24 poços e foram
iluminadas à temperatura ambiente com uma fonte de laser de diodo (comprimento
de onda de 732 nm, irradiância de 130 mW/cm2 e fluência de 10 J/cm2) por 77 s. Em
seguida, as células foram tratadas com bacterioclorina e incubadas, no escuro por
30 min. Após a irradiação, alíquotas de 100 µL foram retirados de cada poço para
determinar o número de unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL). A
seletividade foi avaliada pela determinação da fototoxicidade contra células
cancerosas humanas, nas mesmas condições. Todos os quatro compostos foram
altamente ativos contra S. aureus e apresentaram seletividade tanto para as
bactérias, quanto sobre as células humanas. Observou-se que o aumento da carga
catiônica, melhorou a inativação de E. coli. e apenas o composto com grupos
básicos foram altamente ativos contra Candida albicans.
Queiroga et al. (2011) avaliaram a fotoinativação de espécies de Candida
(Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei e Candida guillermondii),
utilizando, como FS, o azul de metileno e o lazer de diodo, com comprimento de
onda de 660 nm e potência de 40mW, como fonte de luz visível. Foram obtidas
suspensões de espécies de Candida, contendo 106 UFC/mL. Alíquotas de 100µL
foram transferidas para placas de microtitulação de 96 furos e foram expostas a 03
doses de luz laser (60 J/cm2, 120 J/cm2 e 180 J/cm2), resultando em 1, 2 e 3
minutos de irradiação respectivamente, na presença de AM (150µg/mL).
Suspensões adicionais foram tratadas apenas com o AM, somente com luz de laser
ou com 0,85% de solução salina (grupo de controle). Após os tratamentos, alíquota
de 1µl das suspensões foram transferidas para placas de petri e preparadas em
duplicada. As placas foram incubadas a 37 °C durante 24-48 horas e, após este
período, foi realizada a contagem de colónias (UFC/mL). A dose de luz laser a
52
180 J/cm2 de foi a mais eficaz, resultando em inativação de 78% de UFC/mL. Nesta
dose, a Candida albicans foi a espécie mais suscetível.
Os efeitos da PDT sobre a patogenicidade de Candida albicans, em um
modelo de candidíase bucal desenvolvida no dorso da língua de ratos, foram
avaliados por Silva Martins em 2011. Cinquenta e seis ratos foram submetidos ao
desenvolvimento da candidíase no dorso da língua por inoculações Candida
albicans. Após 5 dias, os animais foram distribuídos nos seguintes grupos
experimentais: tratados com laser e FS (L+FS+); Tratados somente com laser
(L+FS-); tratada somente com FS (L-FS+) e controle, que foram tratados somente
com uma solução fisiológica (L-FS-). O FS utilizado foi uma solução de 0,1 mg/mL
de AM preparado através da dissolução do pó (Sigma, São Paulo , Brasil) em uma
solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,85 % (NaCl). A fonte de luz utilizada foi o
laser a de gálio - alumínio – arseneto (GaAlAs), com um comprimento de onda de
660 nm, potência de saída 100 mW, a densidade de energia de 245 J/cm2 e tempo
de 69 segundos. A irradiação laser foi aplicada no dorso da língua por contato. O AM
foi aplicado no dorso da língua e, após 1 min (tempo de pré-irradiação), duas
aplicações de 69 segundos foram feitas. Em seguida, as amostras da cavidade oral
foram coletadas para a contagem de unidades formadoras de colônias por
mL. Colônias foram isolados para avaliação das atividades de proteinase e
fosfolipase. O número de C. albicans recuperadas a partir da cavidade bucal dos
ratos foram semelhante entre os grupos (P = 0,106). O grupo PDT mostrou menos
lesões microscópicas de candidíase do que o grupo sem tratamento (P = 0,001) e
também apresentou menor atividade de proteinase em comparação com os demais
grupos. A terapia fotodinâmica reduziu as lesões microscópicas de candidíase
experimental em ratos e inibiu a atividade de protease de Candida albicans.
No estudo de Dai et al. (2011), infecções cutâneas por Candida albicans em
camundongos foram tratadas com PDT, utilizando os FSs: o azul de toluidina a 82%
(TBO), o azul de metileno a 85% (AM) e um novo azul de metileno (NAM) a 70%,
que foram ativados com luz vermelha emitida não-coerente (LumaCare, Newport
Beach, CA), com espectro de luz visível de 635 ± 15nm para TBO-NAM, 660 ±
15nm para AM. Para a inativação fotodinâmica de Candida albicans, in vitro, foram
adicionados às suspensões de Candida albicans (107 UFC/mL) os FS na
53
concentração de 20 µM e, em seguida, foi realizada a irradiação com luz visível
(32,5 mW/cm2) nos tempos de 0 , 1 , 2 , 3 , 4 , e 5 min, que correspondem
respectivamente as doses de luz de 0; 1,95; 3,90, 5,85, 7,80 , e 9,75 J/cm2. Os
resultados, in vitro, da PDT produziu uma inativação de 4,43 log10 CFU de Candida
albicans quando foi utilizado o NAM como FS na uma dose de luz de 9,75 J/cm2.
Nas condições equivalentes, o AM e TBO apresentaram uma inativação modesta.
As feridas produzidas abrasão da pele foram inoculadas com uma gota (40 µL) da
suspensão de cultura preparada, contendo 106 ou 107 UFC/mL de Candida albicans.
A PDT, in vivo, foi iniciada entre 30 min e 24 h após a inoculação do fungo. Foi
aplicada uma dose de luz de 78 J/ cm 2) (30 min após a infecção) ou 120 J/cm2 (24 h
pós-infecção). Os resultados mostraram que o NAM foi superior a TBO e AM como a
FS na inativação fotodinâmica de Candida albicans in vitro. A eficácia da PDT foi
diretamente proporcional a concentração de FS e a densidade de células fúngicas.
Estes dados sugerem que a PDT é uma abordagem viável para a profilaxia e
tratamento de infecções cutâneas de Candida albicans.
Mitra et al. (2011) investigaram a eficácia do FS meso-tetra (N-metil-4-piridil)porfina de tetra tosilato (TMP-1363) para o tratamento fotodinâmico de Candida
albicans, in vitro, e da sua seletividade em um modelo animal. A eficácia de TMP1363 na PDT de Candida albicans, in vitro, foi comparada com a do AM. As células
foram incubadas por 30 minutos com ambos os FS na concentração de 10 mM e,
em seguida, irradiadas com luz visível a partir de uma caixa com um banco de
lâmpadas fluorescentes (4,0 mW/cm2, 2,4 J/cm2) por 10 min. A infecção, in vivo, no
rato foi estabelecida por inoculação de levedura Candida albicans no espaço
intradérmico do pavilhão auricular. Dois dias após a infecção, 0,3 mg/mL de TMP1363 foi administrado por via tópica. Trinta minutos após a aplicação de TMP-1363,
as orelhas foram irradiados a 514 nm, utilizando uma fluência de 90 J/cm2 aplicada
com uma irradiação de 50 mW/cm2. As orelhas foram excisadas 2 horas após a
irradiação, homogeneizados e a carga de organismo foi determinada através de um
ensaio de UFC. In vivo, a localização do FS em relação a Candida albicans foi
avaliada por imagens de fluorescência confocal. In vitro, a Fotossensibilização com
TMP-1363 resultou em inativação de Candida albicans 3 log10 maior em comparação
com AM. In vivo, as imagens de fluorescência demonstraram um elevado grau de
marcação seletiva de Candida albicans por TMP-1363. A PDT da infecção usando
54
TMP-1363 resultou numa redução significativa em CFU/orelha em relação aos
controlos não tratados. Ouvidos infectados submetidos à PDT exibiram cura
completa ao longo do tempo, sem danos observáveis ao pavilhão auricular.
O estudo de Mima et al. (2011) provou que a terapia fotodinâmica pode
reduzir a carga de fungos em dentaduras, podendo ser usada como um tratamento
coadjuvante da estomatite protética. Para a realização desta pesquisa utilizaram: o
FS (Fotogem®), que foi iluminado com luz LED, e diferentes espécies de Candida
(Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida dubliniensis e
Candida krusei) em próteses totais superiores. 34 próteses, confeccionadas para o
estudo e esterilizadas com óxido de etileno, foram inoculadas individualmente com
uma das espécies de Candida e incubadas a 37oC por 24h. As dentaduras
submetidos a PDT (FS+L+) foram pulverizadas individualmente com 50 mg/L de FS
e, após 30 min, iluminadas por uma luz de LED por 26 min (37,5 J/cm2). Próteses
adicionais foram tratados apenas com o FS (FS+ L-) ou LED (FS- L+) ou não
tratadas (FS- L-). As amostras das diluições em série foram espalhados em agar
Sabouraud dextrose e incubadas a 37 ° C durante 48 h. As colónias foram contadas
e os valores de log (UFC/mL) foram analisados. Com resultados encontrados, foi
possível observar que todas as espécies de Cândida tratadas com PDT
apresentaram redução significativa que variou entre 1,73 a 3,99 log10 nos valores de
UFC/mL em comparação com o grupo que não recebeu o tratamento. Reduções
significativas (p <0,05) também foram observadas nos grupos tratados apenas com
o FS (FS+ L-) ou somente com Luz (FS -L+) em comparação o grupo sem
tratamento (FS-L-). Esta investigação demonstrou que a PDT, através da aplicação
tópica de Photogem® seguido pela iluminação de com luz LED azul, aplicada às
dentaduras, promoveu uma redução significativa na viabilidade das diferentes
espécies de Cândida comumente encontradas em próteses dentárias.
Nas células dos mamíferos, a PDT tem sido aplicada para obter moléculas
reativas de oxigénio, resultando em modificações oxidativas imediata de moléculas
biológicas e na morte celular por apoptose (LAM, M et al., 2011). Estes autores
verificaram, por meio de um estudo in vitro, a citototoxicidade e o mecanismo de
ação da PDT, usando o FS silício ftalocianina (Pc 4), em células planctônicas de
Candida albicans. As mitocôndrias foram os sítios de localização do Pc 4
55
em Candida albicans, evidenciada por ensaios de co-localização, bem como por
ensaios XTT e FUN-1, o que indica que a via mitocondrial pode estar envolvida na
morte celular induzida pela PDT com Pc 4. Em comparação com células de
mamíferos, a dose de fotoirradiação de PC 4-PDT (1,0 mM e 2 J/cm2) eficaz foi
maior para C. ablicans (reduziu a sobrevivência da célula por 4 log10). A necessidade
de doses mais elevadas de PDT em fungos pode ser devido à presença de
morfologia diferente, ou seja, a estrutura de hifas, a qual poderia ser mais resistente
ao tratamento de outras formas de levedura. Os resultados da atividade metabólica
e ensaios clonogênicos demonstram que Pc 4-PDT foi eficaz em matar células
planctônicas de Candida albicans in vitro . Além disso, semelhante aos efeitos
observados em células de mamíferos, Pc 4-PDT causa apoptose de Candida
albicans, como mecanismos de morte celular. Além disso, observou-se mudanças
na morfologia e característica nuclear da apoptose, que foram justificados pelo
aumento da externalização de fosfatidilserina e fragmentação do DNA. Os dados
demonstram que Pc 4-PDT pode ter potencial para se tornar um tratamento
antifúngico, apesar de ainda ser necessário investigar os efeitos do PC 4-PDT em
biofilmes de Candida.
O efeito da terapia fotodinâmica, mediada por eritrosina, foi testada em
culturas planctônicas e biofilmes de Candida albicans e Candida dubliniensis. Como
fonte de luz, foi utilizado um diodo emissor de luz verde (LED) com um comprimento
de onda 532 ± 10 nm, uma potência de 90 mW, uma energia de saída de 16,2J e um
tempo de 3 min, de um ritmo de fluência de 237 mW/cm2 e uma fluência de 42,63
J/cm2. A área irradiada para as culturas planctônicas e biofilmes foi de 0,38 cm2.
Culturas de suspensões planctônicas padronizadas (106 células/mL) de Candida
ssp.,em placas de microtitulação de 96 poços, foram tratadas com concentrações de
eritrosina de 0,39-200 µM. Os biofilmes formados no fundo de uma placa de
microtitulação de 96 poços foram tratados com 400 µM de eritrosina e luz
LED. Depois da PDT, os biofilmes foram analisados por microscopia eletrônica de
varredura (MEV). O efeito antimicrobiano da PDT contra culturas planctônicas e
biofilmes foi verificada através da contagem de unidades formadoras de colônia
(UFC /mL). Não foram detectáveis após PDT a presença de culturas planctônicas de
Candida albicans e Candida dubliniensis nas concentrações de eritrosina maiores
ou igual a 3,12 µM. Os valores de UFC/mL obtidos a partir de biofilmes foram
56
reduzidos em 0,74 log10 para Candida albicans e 0,21 log10 para Candida
dubliniensis. Em conclusão, Candida albicans e Candida dubliniensis foram
sensíveis à ativação eritrosina com LED, mas os biofilmes de ambas as espécies
foram mais resistentes do que suas formas planctônicas (COSTA et al., 2011).
Um melhor conhecimento dos mecanismos de resistência da Candida
albicans pode proporcionar o desenvolvimento de novos tratamentos, como também
a combinação da Inativação fotodinâmica antimicrobiana com outras terapias
(PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012).
Prates et al. (2011) investigaram se o principais sistemas de efluxo multidroga
(MFS e ABC) afetam a eficiência da terapia fotodinâmica antimicrobiana, utilizando
AM e luz laser de diodo GaAIAs (660nm; 50 mW; 0 a 60 J/cm2; 165 mW/cm2), contra
fungos patogênicos. Testaram ainda inibidores específicos do efluxo com o objetivo
potencializar a PDT. Suspensões de Candida albicans (107 células/mL) do tipo
selvagem e alteradas geneticamente que expressavam duas classes de MES
[cassete de ligação a ATP (ABC) e grande superfamília facilitador (MFS)] foram
tratadas com PDT com e sem a adição de inibidores de sistema de efluxo.
A
absorção e a localização do FS no citoplasma foram conseguidas, utilizando
microscopia confocal a laser. A associação da PDT com verapamil, inibidor da
bomba de efluxo ABC, aumentou a absorção de AM e potencializou a inativação do
fungo.
Quando a PDT foi associada com INF, inibidor MFS, a captação de AM e
inativação do fungo foram inibidas o que não era esperado. Os autores justificam
que última descoberta pode ser explicada pela hipótese de que o canal MFS
também pode servir como um mecanismo de absorção para AM. O estudo conclui
que as bombas ABC estão diretamente relacionadas com o efluxo do AM do
citoplasma celular. Tanto o influxo e efluxo de AM podem ser regulados pelos
sistemas de MFS. O bloqueio da bomba MFS, antes da incubação com AM, pode
diminuir a absorção e os efeitos da PDT. Um inibidor ABC poderia ser útil para
potencializar a PDT em infecções de Candida albicans.
Utilizando o AM, como FS, luz visível de baixa potência do laser InGaAlP (660
nm; 100 mW e 350 J/cm2) por 98s, Pereira et al. (2011) avaliaram o efeito da terapia
fotodinâmica (PDT) sobre a viabilidade e Candida albicans, S. aureus e S. mutans
na forma de biofilme. Os biofilmes foram cultivados em discos de acrílico imersos em
57
caldo estéril de infusão de cérebro e coração (BHI) contendo 5% de sacarose,
inoculados com suspensão microbiana (106 células/mL) e incubou-se durante 5
dias. No quinto dia, foram avaliados os efeitos do AM a uma concentração de 0,1
mg/mL, durante 5 min e laser AlGaInP (660 nm) durante 98 s. Diluições em série de
dez vezes foram realizados e as alíquotas semeadas em ágar seletivo, que foram,
então, incubadas durante 48 h. Posteriormente, a quantidade de UFC/mL (log10)
foram contados e analisados estatisticamente. A microscopia eletrônica de varredura
(MEV)
dos
discos
tratados
com
PDT
e
dos
grupos
controles
foi
realizada. Observaram-se reduções significativas na viabilidade de todos os
microrganismos expostos a PDT, mediada pelo corante AM. O biofilme formado por
apenas um tipo de espécies foram mais sensíveis ao PDT (redução na viabilidade
celular de 2,32 a 3,29 log10) em comparação com os formados por dois e três
espécies de microrganismos (redução na viabilidade celular de 1 a 2,44 log10). Estes
dados demonstram que a maior complexidade na composição dos biofilmes parece
tornar os microrganismos mais resistentes a PDT. Micrografias de microscopia
eletrônica de varredura sugeriram que a fotossensibilização letal ocorreu
predominantemente nas camadas mais externas dos biofilmes. Os resultados
mostraram que a PDT mediada pelo corante AM, pode ser uma abordagem útil para
o controle de biofilmes orais.
A curcumina (CUR), na concentração de 600 µM, foi fotoirradiada com luz de
LED (440 a 460 nm; 22 mW/cm2) por Dovigo et al., (2011b) com o objetivo de avaliar
o efeito da PDT contra isolados clínicos de Candida albicans, Candida tropicalis e
Candida glabrata, tanto em formas planctônicas e quanto de biofilmes. Alíquotas 100
µL de suspensões celulares de Candida (107 células/mL) foram transferidas
individualmente para placas de microtitulação de 96 poços, em que foram
adicionadas soluções a cumarina para resultar em concentrações finais de 5 (1,8),
10 (3,7) e 20 (7,4) µM (mg/L). Depois de um tempo de pré-irradiação de 20 min, a
placa foi colocada no dispositivo de diodo emissor de luz e a iluminação foi realizada
em 5,28; 18; 25,5; e 37,5 J/cm2. Diluições em série de dez vezes a partir de
alíquotas do conteúdo de cada poço foram obtidas e semeadas em placa de petri.
Após incubação (37 oC e 48 h), a contagem de colônias foram quantificadas e as
unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/ml) foram determinadas e
transformadas em logaritmo (log10). A concentração de CUR (20 µM) e fluências
58
leves (5,28 e 18 J/cm2) foram as que apresentaram os resultados mais promissores
contra culturas planctônicas e foram selecionadas para ser testado contra biofilmes
de Candida. Quando foi utilizado 40 µM e fluência de18 J/cm2 de CUR, a atividade
metabólica de Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e biofilmes foi
reduzida em 85%, 85%, e 73%, respectivamente. A PDT, mediada por CUR,
também diminuiu a biomassa do biofilme de todas as espécies avaliadas. Os
resultados da presente investigação demonstraram que baixas concentrações CUR
podem ser altamente eficazes para a inativação de isolados de Candida, quando
associado com a excitação de luz.
Já em 2012, Costa et al. avaliaram os efeitos da terapia fotodinâmica em
culturas de Candida albicans nas formas planctônica e biofilme, utilizando os FSs,
rosa bengala e eritrosina, ativados com luz LED. Sete espécies de origem clínica e
uma cepa padão (ATCC 18804) foram usadas no estudo. As culturas planctônicas e
biofilmes de cada Candida albicans foram submetidos às seguintes condições
experimentais: (a) tratamento com rosa bengala e LED (RB+L+), (b) o tratamento
com eritrosina e LED (E+L+) e (c) grupo controle, sem irradiação LED ou sem
tratamento com FS (FS-L-). Após a irradiação das células planctônicas e biofilmes,
as culturas foram semeadas em ágar dextrose Sabouraud (37°C a 48 h) para
contagem de unidades formadoras de colónias (CFU/mL). Os biofilmes foram
analisados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados
revelaram uma redução significativa de 3,45 log10 e 1,97 log10 para as culturas
planctônicas e <1 log10 para biofilmes quando tratadas com PDT, mediada por
eritrosina ou rosa bengala, respectivamente. Os dados do MEV revelaram que a
PDT foi eficaz na redução e destruição de Candida albicans na forma de
blastoconídeos e hifas. Os resultados mostram que eritrosina e rosa bengala com
irradiação LED foi eficaz no tratamento de Candida albicans.
Um FS natural, que é considerado uma droga da nova geração para PDT,
denominado de Hipericina, foi utilizado por Rezusta et al. (2012) para avaliar os
efeitos da PDT contra várias espécies de Candida. Para determinar possíveis efeitos
colaterais do FS, avaliaram sua fototoxicidade aos queratinócitos (HaCaT) e aos
fibroblastos dérmicos (hNDF). Um efeito fungicida 3 log10 foi observado para duas
espécies de Cândida albicans, Cândida parapsilosis e Cândida krusei nas
concentrações de hipericina de 0,625, 1,25, 2,5 e 40 µM, respectivamente, a uma
59
fluência de 18 J/cm2 (lâmpada LED emitindo em 602 ± 10 nm). Para conseguir uma
redução de 6 log10, foi necessário uma dose de luz de 37 J/cm2 e concentrações de
hipericina significativamente mais elevados, tais como: 5 µM para Candida albicans;
320µM para C. parapsilosis e C. krusei. Os queratinócitos e fibroblastos podem ser
preservados, mantendo a concentração de hipericina abaixo de 1 µM e a dose de luz
inferior a 37 J/cm2.
Após concluir uma revisão dos artigos publicados sobre Inativação
fotodinâmica antimicrobiana para controlar infeções por Candida albicans tanto na
forma planctônica quanto de biofilme, Pereira Gonzales; Maisch (2012) concluíram
que o aumento mundial de resistência aos antimicrobianos tem resultado na busca
por terapias antimicrobianas alternativas, tal como a terapia fotodinâmica
antimicrobiana para o tratamento de infecções por Candida albicans susceptíveis ao
tratamento tópico. Segundo os autores, a ausência de genotoxicidade e
mutagenicidade de fungos ou células humanas favorece a segurança da terapia em
longo prazo. Observaram ainda que os estudos demonstram que nem o FS, nem as
subsequentes reações localizadas, em virtude da fotoativação, podem causar danos
aos tecidos circundantes ou perturbar a flora residual do tecido. As indicações
promissoras desta terapia seria para erradicar infecções orais em uma única sessão
principalmente em pacientes mais susceptíveis e particularmente propensos a
desenvolver resistência, como HIV positivos ou doentes submetidos à quimioterapia.
O desenvolvimento da resistência microbiana a fotossensibilização ainda está em
debate. Se os microrganismos podem desenvolver resistência aos radicais de
oxigênio, como por exemplo, o oxigênio singleto, é questionável, uma vez que o
processo fotodinâmico é tipicamente multialvo e o mecanismo de ação é diferente do
da maioria dos medicamentos antimicrobianos.
A ação da fotoativação do AM, conjugado com nanopartículas de ouro, com
luz laser de diodo (densidade de energia = 38,2 J/cm2; 660- nm) foi avaliada como
uma nova abordagem terapêutica para inibir biofilmes de Candida albicans. Ensaios
antibiofilme, laser confocal e a microscopia eletrônica de varredura foram utilizados
para investigar os efeitos do conjugado. As características físicas das nanopartículas
de ouro (21 ± 2,5 nm e 0,2 mg/ml) e AM (20 µg/mL) de conjugação foram
confirmadas por meio de técnicas físico-químicas e de microscopia eletrônica. Estes
ensaios mostraram redução significativa do biofilme e efeitos adversos contra
60
células de Candida na presença do conjugado. O estudo espectroscópico de
fluorescência confirmou a toxicidade contra o biofilme de Candida (KHAN, S. et al.,
2012)
Para Snell; Foster; Haidaris (2012), a aplicação clínica da PDT depende de
estratégia para melhorar o poder inibição microbiana e minimizar os danos teciduais
do hospedeiro. Para os autores supracitados, aumentar a sensibilidade dos agentes
infecciosos para a PDT poderá alcançar estes objetivos, tais como interferir no
metabolismo respiratório do fungo. A partir destes conceitos os pesquisadores
avaliaram compostos de uso clínico para aumentar o estresse oxidativo causado
pela PDT, contribuindo para formação de espécies reativas de oxigênio (ROS).
Utilizaram o FS catiônico meso-tetra (N-metil-4-pyridyl) porphine Tetra tosilato (MP1363) e luz visível a partir de uma caixa equipada com um banco lâmpadas
fluorescente (1,0 J/cm2; 575-700 nm). Foram testados vários antifúngicos,
miconazol, clotrimazol, cetoconazol, e fluconazol, para avaliar sua capacidade para
aumentar a o efeito PDT in vitro. Apesar do miconazol e cetoconazol terem
estimulados a produção de ROS, somente o miconazol potencializou a inativação
das células de Candida albicans. Os dados sugerem que o miconazol poderia ser
utilizado para aumentar a eficácia da PDT contra Candida albicans.
Os biofilmes formados por leveduras oportunistas funcionam com um
reservatório persistente de infecção e prejudicam o tratamento das doenças
fúngicas. A inativação pela PDT foi testada em um modelo experimental de biofilme
de Candida spp e de patógenos emergentes, como Trichosporon mucoides e
Kodamaea ohmeri. Uma nanoemulsão catiônica de zinco 2,9,16,23-tetraquis
(feniltio)-29H, 31H-ftalocianina (ZnPc) foi fotoativada com um laser GaAIAs (26,3
J/cm2). A eficiência da inativação fotodinâmica foi avaliada por meio da contagem de
unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Todos os biofilmes estudados foram
suscetíveis a PDT com diferenças estatisticamente significativas. As cepas do
gênero Candida foram mais resistentes à PDT do que os patógenos emergentes T.
mucoides e K. ohmeri. Uma redução média de 0,45 log foi conseguida para biofilmes
Cândida spp., e uma redução de 0,85 e 0,84, foram atingidos por biofilmes formados
por T. mucoides e K. ohmeri, respectivamente. Assim, a PDT, mediada por ZnPc e
um laser, reduziu o número de células nos biofilmes formados por espécies de
61
Candida albicans e não-Candida albicans, bem os patógenos emergentes T.
mucoides e K. ohmeri (JUNQUEIRA et al., 2012)
Para avaliar a eficácia da PDT na desinfecção de próteses totais, Ribeiro et
al. (2012) coletaram amostras de biofilme de 60 pacientes usuários de próteses, os
quais foram aleatoriamente em quatro grupos experimentais de 15 indivíduos cada
um. Estes grupos foram divididos de acordo com o tratamento recebido: indivíduos
cujas próteses totais superiores foram pulverizadas com 50 e 100 mg/L de
suspensão Photogem® (grupos FS 50 e FS 100) e pacientes cujas dentaduras
foram tratadas com 50 e 100mg/L de gel Fotogem® (grupos P50G e P100G). As
próteses com FSs foram deixadas no escuro durante 30 minutos (tempo de préirradiação) e, em seguida, irradiada com luz LED azul a 37,5 J/cm2 por 26 min.
Amostras das dentaduras foram tiradas com cotonete estéril antes (superfícies
laterais esquerdas) e depois (superfícies do lado direito) da PDT. Todo o material
microbiano foi diluído e semeado em meio seletivo para a Cândida spp.,
Staphylococcus spp. e Estreptococos mutans. Após incubação (48 h/37 ° C), o
número
de
unidades
formadoras
de
colónias
(ufc/mL)
foi
contado.
Os
microrganismos cultivados em meios seletivos foram identificados utilizando
métodos bioquímicos antes e depois da PDT. Nenhum crescimento após PDT foi
observada em 60, 53, 47, e 40% das próteses dos P100G, P50G, FS100, e grupos
FS50, respectivamente. Nos casos em que foi observada evidência de crescimento
de microrganismos, os protocolos da PDT eliminaram mais de 90% dos
microrganismos nas dentaduras. Este estudo clínico demonstrou que PDT foi eficaz
para a desinfecção de próteses totais.
Em 2013, Kato et al. realizaram um estudo cujo o objetivo foi avaliar se a
exposição a PDT pode alterar as características de patogenicidade de células de
Candida albicans. Diferentes métodos de análise foram empregados para avaliar o
efeito da PDT, mediada pelo AM, sobre a capacidade de crescimento celular, sobre
a formação de tubos germinativos e sobre o potencial para causar infecção
sistêmica ou patogenicidade. Também foram avaliados a susceptibilidade de
Candida albicans ao fluconazol e sua sensibilidade a diferentes agentes indutores de
stress, como dodecilsulfato de sódio (SDS), a cafeína, o peróxido de hidrogénio
(H2O2), menadiona e NaCl. Candida albicans foi exposta a PDT subletal usando AM
como um FS (0,05 mM por 10 min), combinada com um laser de diodo GaAIAs (λ
62
660 nm, 75 mW/cm2, 9 a 27 J/cm2). In vitro, avaliou-se os efeitos da PDT sobre
crescimento de Candida albicans, formação de tubo germinativo, a sensibilidade
para o estresse oxidativo e osmótico, a integridade da parede celular, e
suscetibilidade fluconazol. In vivo, avaliou a patogenicidade de Candida albicans
com um modelo de infecção sistêmica em rato. A sobrevivência dos animais foi
avaliada diariamente. A PDT, com AM, reduziu a taxa de crescimento e a
capacidade de Candida albicans para formar tubos germinativos em comparação
com células não tratadas (P <0,05). A sobrevivência de ratinhos infectados
sistemicamente com Candida albicans e pré-tratados com PDT foi significativamente
aumentada em comparação com ratinhos infectados com levedura e não tratados (P
<0,05). PDT aumentou a sensibilidade de Candida albicans ao sulfato de dodecilo
de sódio, cafeína, e peróxido de hidrogénio. A concentração inibitória mínima (MIC)
do fluconazol para Candida albicans também foi reduzida após a PDT. No entanto,
nenhum desses parâmetros patogênicos foi alterado nas células filhas de Candida
albicans submetidas à PDT. Estes dados sugerem que PDT pode inibir os fatores de
virulência e reduzir in vivo a patogenicidade de Candida albicans. A ausência de
alterações em células-filhas indica que os efeitos PDT são transitórios. A redução de
valores de MIC para fluconazol sugere que este antifúngico pode ser combinado
com PDT para o tratamento de infecções de Candida albicans.
Com o objetivo de buscar alternativas para potencializar os efeitos da PDT e,
assim, diminuir os feitos tóxicos da terapia as células eucarióticas humanas, Chien
et al. (2013) avaliaram a capacidade da quitosana, um biopolímero policatiônico,
para aumentar susceptibilidade de espécies de Candida á PDT. Culturas de Candida
albicans e de Candida de origem clínica resistente ao fluconazol nas formas
planctônicas e biofilme foram utilizadas no estudo. A quitosana, mesmo em baixas
concentrações (0,25%), potencializou o efeito da PDT, mediada por azul de toluidina
(TBO), em células planctônicas e biofilmes de Candida albicans, que foram
incubadas com o quitosano durante 30 minutos antes da PDT. No entanto, a
quitosana sozinha, sem a PDT, não apresentou atividade antimicrobiana significativa
para os mesmo 30 minutos de incubação. Estes resultados sugerem que a
quitosana só aumentou o efeito fungicida depois de as células terem sido
danificadas pela PDT. O aumento da dosagem de quitosana ou do tempo de
incubação prolongando reduziu completamente a viabilidade Candida albicans pela
63
PDT. Estes resultados indicam claramente que a combinação de quitosana com
PDT pode ser abordagem antimicrobiana promissora para o tratamento de doenças
infecciosas. Devido às características de biocompatibilidade e salinidade, a
quitosana é bastante promissora para aumentar a eficácia da PDT para
erradicar infecção por Candida albicans.
64
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
- Avaliar o efeito da terapia fotodinâmica na Inativação de células planctônicas de
Candida albicans com terapia fotodinâmica empregando azul de metileno como
fotossensibilizador.
3.2 Objetivos Específicos
- Avaliar o efeito de diferentes concentrações (37,5 µg/mL; 75 µg/mL; 150 µg/Ml e
300 µg/m) de azul de metileno na inativação fotodinâmica de Candida albicans;
- Avaliar a toxicidade do azul de metileno em diferentes concentrações de azul de
metileno e ausência de luz laser em células planctônicas de Candida albicans;
- Verificar o efeito da luz laser na viabilidade celular de Candida albicans;
- Observar a relação entre o tempo de incubação (tempo de pré-irradiação) do azul e
a fotoinativação de células planctônicas de Candida albicans.
65
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Tipo e Local do Estudo
Esta pesquisa tratou-se de uma pesquisa experimental que foi realizada no
laboratório do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos-FIP/ PB no
período de abril a julho de 2014.
4.2 Instrumentos
4.2.1 Microrganismo e meio de cultura
Foram utilizadas cepas de Candida albicans (ATCC10231) adquiridas da
coleção de culturas tropicais (CCT) da fundação André Tosello (Figura 2). O
certificado da cultura encontra-se no anexo A.
Figura 2 - Cepa de Candida albicans utilizada no estudo.
Fonte: Do autor
Para a realização dos experimentos, utilizou-se o meio de cultura Agar
Sabouraud Dextrose - ASD (União Química, São Paulo, Brasil) com 5 µg/mL
cloranfenicol, conforme preconiza Pereira et al. (2011).
O ASD contendo 5 µg/mL de cloranfenicol é um meio seletivo para fungos e
será usado nas semeaduras das placas de Petri após procedimentos experimentais
envolvendo as culturas planctônicas. Para o preparo do meio de cultura, foram
utilizados 65 g do pó para 1 L de água destilada, conforme a proporção
66
recomendada pelo fabricante. Após dissolução completa do meio de cultura, o
béquer contendo a mistura foi levado à autoclave vertical para esterilização a 121°C
por 15 minutos. Após a esterilização, ainda na fase líquida, cerca de 20 mL do meio
foi vertido em placas de Petri estéreis descartáveis, mantendo proximidade de 10 cm
da chama do bico de Bunsen (Figura 3). As placas de Petri foram individualmente
fechadas e mantidas em temperatura ambiente até a completa solidificação do meio
de cultura. Após a solidificação, todas as placas de Petri foram devidamente
identificadas e datadas.
Figura 3 - Preparo do meio de cultura nas placas de Petri
Fonte: Do autor
4.2.2 Preparo do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubação
O agente FS (Figura 4A) utilizado foi o azul de metileno (AM) PA (SigmaAldrich, São Paulo, Brasil). Soluções de estoque a partir de AM PA, nas
concentrações 75 µg/mL; 150 µg/mL; 300 µg/mL e 600 µg/mL (Figura 4B) foram
preparadas por dissolução do pó em solução salina estéril (0,85% de Na Cl) em pH
7 (SOUZA et al., 2006). As soluções com o FS foram filtradas através de uma
membrana de filtro estéril de 0,22 mm e armazenadas em recipiente de cor âmbar
por no máximo 14 dias a 4°C no escuro antes de usar . Durante o experimento, em
poços de placas de microtitulação, 100 µL das soluções de estoque do FS, em
temperatura ambiente, foram novamente diluídas pelo acréscimo 100 µL de
suspenção de Candida albicans em solução salina a 0,85% (QUEIROGA et al.,
2011), resultando em um volume final de 200 µL. Como o volume do poço é
duplicado (100 µL de FS e 100 µL de suspenção celular), a concentração do FS é
reduzida a metade: 37,5 µg/mL; 75 µg/mL; 150 µg/Ml e 300 µg/mL (concentrações
de trabalho)
67
Figura 4 - Em A, Azul de Metileno forma de apresentação em pó. Em B, o
corante manipulado nas concentrações testes.
Fonte: Do autor
Em seguida, o corante AM ficou em contado com as células de Candida
albicans, no escuro e a temperatura ambiente, antes da iluminação, por um período
de incubação de 1, 5, 10 e 20 minutos (tempo de pré-irradiação). Com este
propósito, as placas ficaram em um ambiente sem luminosidade e evolvidas por uma
lâmina de papel alumínio, como pode ser observado na Figura 5 abaixo.
Figura 5 - Placa de microtitulação na ausência de luz e envolvida por uma
lâmina de papel alumínio.
Fonte: Do autor
68
4.2.3 Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (PDT)
A fonte emissora de luz (Figura 6A) foi um Laser semicondutor portátil (Laser
DUO®, GaAlAs, InGaAlP, λ880nm e λ660nm, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP –
Brasil). Este aparelho apresenta potência de saída constante em 100 mW e área do
feixe de laser de 3 mm2, a qual coincide com a área da abertura de cada um dos 96
poços de fundo em U das placas de microtitulação (Figura 7) utilizadas neste estudo.
Para o protocolo de irradiação, o equipamento foi ajustado para um comprimento de
onda de 660 nm, que correspondente à faixa de absorção do AM, e para o tempo de
iluminação de 128s, resultando em uma influência de energia de 426 J/cm2.
Antecipadamente à realização dos experimentos, o laser foi calibrado com auxílio de
um dispositivo (Check MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP – Brasil) como mostra a
figura 6B.
Figura 6 - Em A, aparelho de laser e, em B, calibração da potência do aparelho
no comprimento de onda de 660 nm.
Fonte: Do autor
69
Figura 7 - Placas de microtitulação estéreis com 96 poços
Fonte: Do autor
Antes de cada irradiação, a ponteira do aparelho ficou imersa em solução de
digluconato de clorexidina a 2% por 5 min para promover a sua desinfecção. Após
este período, o agente antimicrobiano era removido do dispositivo por meio de
irrigação com 10 mL de solução salina estéril (0,9%) e secado com gaze
autoclavada (Figura 8).
Figura 8 - Desinfecção da ponteira do aparelho
Fonte: Do autor
70
4.2.4 Preparo do inóculo de Candida albicans
Conforme pode ser observado na Figura 9, células de Candida albicans
(ATCC 10-231) foram subcultivadas a partir de frascos estoques em Agar
Sabouraud Dextrose – ASD sob condições aeróbicas a 37oC. Após 24 h de
incubação, uma amostra de colónias foi removido da superfície do agar da placa e
suspensas em solução fisiológica estéril a 0,85 % de NaCl (MUNIN et al., 2007) a
uma densidade celular de 106 células viáveis/mL. Após agitação com o auxílio do
aparelho Vortex (Vision®) durante 2 minutos, a turbidez da suspensão de células foi
ajustada com auxílio de um espectrofotômetro a 530 nm para obter suspensões com
densidade óptica de 0,284, que corresponde a uma concentração de fungos de 106
unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL) (PEREIRA et al., 2011;
QUEIROGA et al., 2011; KATO et al., 2013)
71
Figura 9 - Preparação do inóculo de Candida albicans com densidade celular
de 106 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL)
Fonte: Do autor
72
4.3 Condições Experimentais
Todas as condições testadas foram realizadas no escuro à temperatura
ambiente e em condições assépticas no interior de uma câmara de fluxo laminar
(Figura 10). As placas microtitulação foram cobertas com lâminas de papel alumínio
para impedir a penetração da luz do ambiente.
Figura 10 - Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos.
Fonte: Do autor
4.3.1 Grupo Terapia fotodinâmica (Grupo PDT)
No grupo terapia fotodinâmica (Figura 11), grupo PDT (FS+L+), as cepas de
Candida albicans foram sensibilizadas com o FS, azul de metileno, e expostas ao
laser (L). Com agitação constante, alíquotas de 100µL da suspensão do fungo (106
UFC/mL) foram transferidas individualmente para um poço de uma placa de
microdiluição com 96 poços. Em seguida, foi acrescentado o mesmo volume de AM
(100µl) em uma das concentrações testadas (75; 150, 300 e 600 µg/ml), resultando
em um volume final de 200 µl por cada poço e concentrações finais de 37,5µg/ml
(grupo PDT AM-37,5µg/ml), 75µg/ml (grupo PDT AM-75µg/ml), 150µg/ml (grupo PDT
AM-150µg/ml) e 300µg/ml (grupo PDT AM-300µg/ml). Posteriormente, as placas
contendo as suspensões resultantes foram deixadas em repouso, no escuro,
73
durante um dos tempos de incubação (1, 5, 10 e 20 min.). Após cada tempo de préirradiação, as placas foram abertas e as células da levedura foram continuamente
irradiadas, a partir do topo da placa de microtitulação, com um diodo laser
(comprimento de onda de 660nm; potencia de 100mW e dose de 426 J/cm2) por
128s (Figura 12). O conteúdo dos poços foi devidamente homogeneizado antes da
iluminação e da amostragem.
Figura 11 - Ilustração esquemática do grupo terapia fotodinâmica
Fonte: Do autor
A ponteira do equipamento foi posicionada perpendicularmente a abertura dos
poços e a irradiação foi efetuada com ângulo de incidência de 900. Para evitar um
possível efeito cumulativo devido ao espalhamento da irrradiação, cada amostra
será irradiada e coletada individualmente (QUEIROGA et al., 2011).
74
Figura 12 - Em A, Transferência de alíquotas de 100µL da suspensão do fungo
para o poço da placa de microtitulação. Em B, transferência do mesmo volume
de AM para o poço. Em C, placa no escuro durante o período de incubação e,
Em D, irradiação do conteúdo do poço.
Fonte: Do autor
4.3.2 Grupo Azul de Metileno (Grupo AM)
No grupo AM (Figura 13), grupo AM, o efeito do FS sozinho, na inativação de
células de Candida albicans, foi testado pela a aplicação da solução de AM seguindo
o mesmo protocolo estabelecido para o grupo PDT (FS+L+), principalmente com
relação ao volume (100µL), a concentrações testadas (37,5; 75; 150 e 300 µg/ml) e
tempos de incubação (1, 5, 10 e 20 min.) com ausência de luz, porém sem o
tratamento com o laser. Neste grupo foi possível avaliar a toxicidade das diferentes
concentrações de AM de acordo com o tempo de contato direto.
75
Figura 13 - Ilustração esquemática do grupo Azul de Metileno
Fonte: Do autor
4.3.3 Grupo Laser (Grupo L)
No grupo laser (Figura 14), grupo L, as cepas de Candida albicans foram
expostas à luz laser (L), mas não foram sensibilizadas pelo FS. Com este grupo foi
possível avaliar o efeito da luz laser isoladamente na inativação das células da
levedura.
Alíquotas
de
100µL
da
suspensão
celular
foram
transferidas
individualmente para um dos poços de uma placa de microtitulação. Em seguida
seguir, o mesmo volume de solução salina 0,85% estéril foi transferido para o poço.
O sistema de ensaio foi mantido no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos
grupos anteriores (1, 5, 10 e 20 min.). Após cada período de pré-irradiação, as
placas foram abertas e o mesmo protocolo de iluminação do grupo PDT foi aplicado.
76
Figura 14 - Ilustração esquemática do grupo Laser
Fonte: Do autor
4.3.4 Grupo solução salina (Grupo SS)
No grupo solução salina (Figura 15), grupo SS, as células de Candida
albicans não receberam nenhum tratamento, ou seja, nem foram sensibilizadas pelo
FS, nem foram expostas à luz. Alíquotas de 100 µL da suspensão (106 UFC/mL)
foram transferidas para os poços da placa de microtitulação e, em seguida, o mesmo
volume de solução salina a 0,85% foi depositado no poço e a placa ficou é em
repouso no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos grupos anteriores (1, 5,
10, 20 e 30 min.).
77
Figura 15 - Ilustração esquemática do grupo solução salina
Fonte: Do autor
Os resultados obtidos com as culturas dessas amostras foram utilizados como
parâmetro para comparação com aqueles que foram obtidos com as culturas das
amostras submetidas às condições experimentais.
4.3.5 Avaliação da viabilidade das células de Candida albicans
Para todas as condições avaliadas, foram realizadas diluições seriadas de 1:3
a partir das amostras contidas nos poços das placas. Para isso, uma alíquota de 100
µL foi removida de cada poço e transferida para um tubo de ensaio contendo 900 µL
de solução salina (0,85%) autoclavada. Este tubo foi agitado vigorosamente em
agitador de tubos (Vortex - Vision®) e uma nova alíquota de 100 µL foi removida do
mesmo e colocada em outro tubo de ensaio contendo 900 µL de solução salina
autoclavada. Esse procedimento foi realizado três vezes para cada amostra e, desta
78
forma, as diluições seriadas de 10-1 a 10-3 foram obtidas. Foram utilizadas as
diluições seriadas (10-1, 10-2, e 10-3) para a realização da semeadura nas placas de
Petri contendo o meio de cultura Ágar Sabouraud Dextrose.
A seguir, alíquotas de 25 µL de cada diluição seriada foram pipetadas em
duplicata. Adicionalmente, alíquotas de 25 µL foram removidas do poço das placas e
transferidas diretamente para uma da placa de Petri, sem a realização de diluição
(Figura 16). Uma alça de Drigalsky estéril foi utilizada para espalhar a solução sobre
o meio de cultura na placa. Também os procedimentos de semeadura foram
realizados em duplicata. Após 48 horas de incubação a 37 oC, as placas de Petri
referentes às amostras das condições experimentais avaliadas foram submetidas à
contagem de colônias. Para este procedimento, a quantificação das colônias foi
realizada e os números de unidades formadoras de colônias foram calculados.
79
Figura 16 - Ilustração esquemática das diluições seriadas pipetadas em
duplicata
Fonte: Do autor
80
4.3.6 Técnica de Contagem das UFC/mL
A leitura das placas foi efetuada pela contagem padrão de colônias
de Candida albicans (Unidade Formadora de Colônias - UFC/mL) com o auxílio de
um contador de colônias (Figura 17).
Figura 17 - Contagem das UFC com auxílio de um contador de colônias
Fonte: Do autor
Para a contagem, selecionaram-se placas que continham um número de
colônias que se encontrava dentro do intervalo de precisão e repetibilidade de 30 a
300 colônias conforme o método de Swanson; Petran; Hanlin (2001). Para cada
diluição (10-1; 10-2 e 10-3), os resultados do número de colônias foi obtido pela média
aritmética dos resultados das placas em duplicata multiplicada pela diluição
correspondente (10, 100 ou 1000). O resultado de cada grupo foi encontrado por
meio da média aritmética das três diluições. Em seguida, para encontrar o número
UFC por mL, converteu-se resultado de cada grupo a partir da quantidade inoculada
de 25µL para 1 mL, dividindo o resultado por 0,025, obtendo o resultado final de
UFCs/mL em potência de 10. Para a análise da contagem de UFC/ml de Candida
albicans, optou-se por transformar os valores em potência de 10, utilizando-se o
logarítimo decimal deste número para a análise estatística, como pode ser
observado no exemplo abaixo:
81
Exemplo:
Nas situações em que todas as placas apresentaram menos que 30 colônias,
o resultado foi expresso pelo número de colônias da placa de menor diluição.
Quando todas as placas apresentaram mais de 300 colônias na maior diluição e foi
possível realizar a contagem, o resultado foi encontrado multiplicando o valor do
número de colônias em cada placa pelas respectivas diluições e, em seguida,
calculando a média aritmética. Quando o número de colônias foi excessivamente
alto para contar, escolheu-se uma porção representativa da distribuição das colônias
em toda placa e estimou-se o número de colônias presentes (SWANSON; PETRAN;
HANLIN, 2001).
4.3.7 Análise estatística
Os resultados dos log10 (UFC/mL) para cada condição testada foram
comparados utilizando teste estatístico Kruskal-Wallis e no caso de diferença
significativa foram utilizadas comparações múltiplas do referido teste. Valores de P
inferiores a 0,05 foram considerados significativos. A escolha do teste Kruskal-Wallis
foi devido ao número de grupos. A margem de erro utilizada nas decisões dos testes
estatísticos foi de 5%. Os dados foram digitados na planilha EXCEL e o programa
utilizado para obtenção dos cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for
the Social Sciences) na versão 21.
82
5 RESULTADOS
Os resultados desta pesquisa foram expressos através das medidas
estatísticas: média, desvio padrão (DP) e mediana. Na Tabela 1, apresentam-se as
estatísticas do logaritmo decimal (log10) do número de unidades formadoras de
colônias (UFC/mL) para cada grupo controle em relação ao tempo de incubação. Ao
comparar os resultados da contagem de UFC/ml entre os grupos que avaliaram a
toxicidade no escuro do azul de metileno (Grupo AM) e da luz na dose empregada
(Grupo laser) com o grupo que não recebeu nenhum tratamento (Grupo solução
salina), observou-se que somente o AM ou somente a luz não exerceu efeito
inibitório contra as células de Candida albicans.
Tabela 1 – Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de unidades
formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles nos diferentes tempos
de incubação.
Tabela 1- Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de unidades
formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles nos diferentes tempos
de incubação
Tempo de incubação (minutos)
Grupos
Sol. S.
Laser
AM
Valor de p
1
5
10
20
Valor de p
Média ± DP (Mediana)
Média ± DP (Mediana)
Média ± DP (Mediana)
Média ± DP (Mediana)
5,68 ± 0,79 (5,89)(A)
5,51 ± 0,67 (5,60) (A)
5,54 ± 0,72 (5,60) (A)
5,62 ± 0,75 (5,74) (A)
p(1) = 0,955
5,62 ± 0,75 (5,78) (A)
5,57 ± 0,71 (5,69) (A)
5,47 ± 0,64 (5,56) (A)
5,49 ± 0,66 (5,57) (A)
p(1) = 0,937
5,68 ± 0,71 (5,87) (A)
p(1) ˃0,05
5,58 ± 0,64 (5,69) (A)
p(1) ˃0,05
5,51 ± 0,59 (5,60) (A)
p(1) ˃0,05
5,60 ± 0,65 (5,72) (A)
p(1) ˃0,05
p(1) = 0,699
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal Wallis.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses não são iguais, comprova-se que não houve diferença significativa entre as
avaliações correspondentes pelas comparações pareadas do referido teste.
Conforme pode ser observado no gráfico 1, na ausência de luz, o aumento da
concentração do corante AM e do tempo de contato deste fotossensibilizador com as
células do fungo (tempo de pré-irradiação ou de incubação) também não reduziu a
83
viabilidade celular da cepa de Candida albicans em comparação o grupo controle (p
> 0,05).
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
Teste de Kruskal Wallis.
Obs.: Se todas as letras são iguais, comprova-se que não houve diferença significativa entre as avaliações correspondentes
pelas comparações pareadas do referido teste.
Figura 18 - Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e
300µg/mL) de azul de metileno, na ausência de luz, com tempos de incubação
de 1, 5, 10 e 20 min.
A partir de 5 min de incubação, os grupos irradiados com luz laser, associada
a concentrações de 75, 150 e 300 µg/mL de azul de metileno como
fotossensibilizador (grupo PDT AM), apresentaram uma menor média no valor de
log10UFC/mlL em relação aos grupos tratados com azul de metileno sem iluminação
(p˂0,05) (Tabela 2). No grupo PDT AM, com azul de metileno na concentração 37,5
µg/mL, não foi observada diferença significante no tempo de incubação de 5 min (p =
0,089), apresentando efetividade apenas após 10 min de incubação. Nenhuma das
concentrações de AM testadas inibiu o crescimento de Candida albicans no tempo
de incubação de 1 minuto. Não houve diferença significativa entre os tempos de
incubação de 10 e 20 min em todas as concertações de AM avaliadas.
No gráfico 2, observam-se que a redução na média de log10UFC/ml foi mais
acentuada nos grupos PDT AM-37,5µg/mL, com 10 min incubação; PDT AM75µg/ml, PDT AM-150µg/ml, em 5,10 e 20 min de incubação, e PDT AM-300µg/ml
(com 10 e 20min de incubação). Esta redução foi significativa (p = 0,019) quando
84
comparada estes grupos com todos os grupos PDT AM nos tempos de 1 min e em 5
min de incubação para os grupos PDT AM - 37,5µg/ml e PDT AM- 300µg/ml.
Tabela 2 - Comparação da média e desvio padrão do log10UFC/mL entre os
grupos AM e PDT AM segundo as concentrações de AM e tempos de
incubação
Tempo de incubação (minutos)
Concentração Grupo
1
5
10
20
Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana)
• 37,5 µg/ml
AM
AM PDT
Valor de p
• 75 µg/ml
AM
AM PDT
Valor de p
• 150 µg/ml
AM
AM PDT
Valor de p
• 300 µg/ml
AM
AM PDT
Valor de p
5,68 ± 0,79 (5,88)
5,55 ± 0,69 (5,71)
5,46 ± 0,64 (5,55) (A)
5,66 ± 0,79 (5,78) (A)
2,39 ± 2,77 (2,30)
3,70 ± 2,49 (4,76)
1,02 ± 2,04 (0,00) (B)
3,55 ± 2,39 (4,48) (B)
p(1) = 0,053
p(1) = 0,089
p(1) = 0,007*
p(1) = 0,030*
5,71 ± 0,81 (5,94)
5,54 ± 0,68 (5,67)(A)
5,49 ± 0,65 (5,61) (A)
5,56 ± 0,69 (5,72) (A)
3,94 ± 2,67 (4,95)
2,37 ± 2,74 (2,26) (B)
2,14 ± 2,48 (2,12) (B)
2,34 ± 2,71 (2,21) (B)
p(1) = 0,104
p(1) = 0,031*
p(1) = 0,008*
p(1) = 0,016*
5,66 ± 0,78 (5,84)
5,64 ± 0,77 (5,76) (A)
5,57 ± 0,68 (5,76) (A)
5,65 ± 0,77 (5,78) (A)
3,91 ± 2,65 (5,04)
2,10 ± 2,42 (2,04) (B)
2,32 ± 2,69 (2,17) (B)
2,21 ± 2,56 (2,04) (B)
p(1) = 0,298
p(1) = 0,012*
p(1) = 0,014*
p(1) = 0,031*
5,69 ± 0,80 (5,87)
5,61 ± 0,73 (5,76) (A)
5,53 ± 0,65 (5,70) (A)
5,55 ± 0,66 (5,75) (A)
3,94 ± 2,68 (4,94)
3,71 ± 2,53 (4,64) (B)
2,30 ± 2,67 (2,13) (B)
2,22 ± 2,59 (2,04) (B)
p(1) = 0,163
p(1) = 0,020*
p(1) = 0,017*
p(1) = 0,032*
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre concentrações
correspondentes.
85
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
Teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste
Figura 19 - Comparação da média do log10UFC/mL entre os grupos PDT AM e
grupos controles
86
6 DISCUSSÃO
As propriedades terapêuticas da luz têm sido estudadas há anos, mas sua
aplicação com finalidade antimicrobiana é relativamente mais recente (ALLISON;
MOTA; SIBATA, 2004). Os estudos nesta área são motivados principalmente pelos
casos de resistência aos antimicrobianos convencionais (TEICHERT et al., 2002;
DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; DOVIGO et al, 2011b; KHARKWAL et
al., 2011; LAM et al., 2011; PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Estratégias
antimicrobianas convencionais tornaram-se cada vez mais ineficazes devido ao
surgimento de resistência a múltiplas drogas entre os microrganismos patogênicos.
A necessidade de superar essas deficiências provocou a exploração de tratamentos
alternativos e abordagens não convencionais para o controle de infecções
microbianas (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012).
Atualmente, o tratamento antimicrobiano a base de luz é denominado de
terapia fotodinâmica (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; RYSKOVA; BUCHTA;
SLEZAK, 2010; KATO et al., 2013), que utiliza um corante fotossensível, que na
presença de oxigênio, produz radicais reativos letais para os microrganismos
(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; DAI et
al., 2011; LYON et al., 2011; HUANG et al., 2012; PEREIRA GONZALES; MAISCH,
2012).
Candida albicans é um patógeno oportunista mais comum na cavidade bucal
(SILVA MARTINS et al., 2011). Pode causar infecções locais e sistêmicas (MUNIN et
al., 2007; MITRA et al., 2011) e está associada principalmente a imunodepressão
(MANG; MIKULSKI; SALA, 2010). O aumento da resistência antifúngica muitas
vezes diminui a eficácia das terapias convencionais (PEREIRA GONZALES;
MAISCH, 2012). Vários trabalhos, que avaliaram espécies de Candida resistente
azólicos, observaram que estas cepas eram sensíveis a PDT (JACKSON et al.,
1999; CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2008; DONNELLY; McCARRON; TUNNEY,
2008; MANG; MIKULSKI; SALA, 2010; DOVIGO et al., 2011a; LYON et al., 2011). A
aplicação do fotossensibilizador e da luz especificamente no local afetado pela
candidíase reduz drasticamente os efeitos colaterais locais e sistêmicos (BLISS et
87
al., 2004), fazendo com que a terapia fotodinâmica possa ser vista como um
tratamento promissor contra Candida albicans (PELOI et al., 2008; CHIEN et al.,
2013).
As fontes de luz utilizadas com mais frequência na PDT contra Candida
albicans foram o LED (PELOI et al., 2008; DOVIGO et al., 2010; DOVIGO et al.,
2011, MIMA et al., 2011) e o laser de baixa intensidade, destacando-se o laser de
diodo (TEICHERT at al., 2002; SOUZA et al., 2006; MUNIN et al.; 2007; GIROLDO
et al., 2009; QUEIROGA et al., 2011). Nesta pesquisa foi utilizado laser de diodo da
MM OPTICS (Laser DUO®) que, por ser portátil e possuir bateria, apresenta uma
maior versatilidade de manuseio sem dependência de fonte de energia, podendo ser
aplicado a pacientes em ambientes doméstico, ambulatorial, unidades de saúde da
família ou em unidades de terapia intensiva.
Os três componentes principais da PDT são a luz visível, o FS e oxigênio (DAI
et al., 2012). Em função do fato de absorverem luz com elevada eficiência, em
alguma região do espectro visível, alguns dos FSs são capazes de induzir ou
participar de reações fotoquímicas (MACHADO, 2000) e produzir moléculas reativas
de
oxigênio
(CALZAVARA-PINTON;
VENTURINI;
SALA,
2005;
KONOPKA;
GOSLINSKI, 2007; CARVALHO; FELIPE; COSTA, 2009; (PEREIRA GONZALES;
MAISCH, 2012; SILVA MARTINS et al., 2011; HUANG et al., 2012).
O azul de metileno foi o fotossensibilizador utilizado neste estudo porque é
um corante de baixa toxicidade com forte absorção da luz visível em comprimentos
de onda maiores do que 620 nm (TEICHERT et al., 2002). É utilizado com diferentes
finalidades na microbiologia e farmacologia há bastante tempo e, ultimamente, tem
sido aplicado na PDT como droga fotossensibilizante em associação com uma fonte
de luz contínua (TARDIVO at al., 2005). Para que o fotossensibilizador possa ser
fotoativado pelo laser é necessário que a luz aplicada apresente um comprimento de
onda específico (TEICHERT et al., 2002; LYON et al., 2011). Utilizou-se neste
estudo a luz vermelha com comprimento de onda de 660 nm que foi ajustada no
aparelho antes da iluminação. Este comprimento de onda corresponde ao espectro
de absorção do azul de metileno.
88
Os estudos de Teichert at al. (2002); Souza et al. (2006); Munin et al. (2007);
Peloi et al. (2008); Giroldo et al. (2009); Souza et al. (2010); Martins et al. (2011);
Pupo et al. (2011); Queiroga et al. (2011); Silva Martins (2011), Dai et al., (2011);
Pereira et al.(2011); Khan et al. (2012) e Kato et al., (2013) estudaram os efeitos da
terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de Candida albicans utilizando o azul de
metileno, como fotossensibilizador. Os resultados destes estudos comprovaram o
efeito antifúngico desta modalidade de tratamento. No entanto, alguns aspectos
ainda precisavam ser mais bem esclarecidos, antes de recomendá-la para terapia
clínica. Há necessidade de determinar protocolos com parâmetros bem definidos,
como a dosimetria adequada do FS e da luz e o tempo em que o corante deve
permanecer em contato com o microrganismo (KHARKWAL et al., 2011).
Com o objetivo de potencializar o efeito da PDT em um menor tempo de
trabalho sem prejuízo na qualidade do tratamento, testaram-se diferentes tempos de
incubação e concentrações de azul de metileno. A hipótese era descobrir qual o
melhor custo-benefício para PDT em relação à concentração do azul de metileno e o
tempo em que esta sustância necessitaria ficar em contato com as células de
Candida albicans para produzir um efeito antimicrobiano satisfatório.
Como o estudo apresentava muitas vaiáveis (quatro concentrações de AM e
quatro tempos de incubação), optou-se por realizar um estudo in vitro. O modelo
experimental escolhido foi placas de microtitulação com 96 poços de fundo em U.
Esta metodologia tem sido bastante utilizada nas pesquisas que avaliaram o efeito
antimicrobiano da PDT sobre microrganismo na forma planctônica a partir de uma
suspenção celular (MUNIN et al., 2007; GIROLDO et al., 2009; SOUZA et al., 2010;
PUPO et al., 2011; QUEIROGA et al., 2011).
O efeito fotodinâmico depende da concentração do FS empregado,
combinado com os parâmetros de irradiação que ativam o corante (RYSKOVA;
BUCHTA; SLEZAK, 2010; KATO et al., 2013). Os estudos que avaliaram o efeito da
PDT sobre Candida albicans, utilizaram diferentes concentrações de azul de
metileno, desde 10 µg/mL (GIROLDO et al., 2009) a 500 µg/mL (TEICHERT at al.,
2002) e o tempo de incubação mais utilizado foi 5 mim (SOUZA et al., 2006;
QUEIROGA et al., 2011; PEREIRA et al., 2011). Assim, para responder a hipótese
de que o aumento da concentração e do tempo de incubação potencializaria o efeito
89
da PDT, utilizaram-se neste estudo as concentrações de 37,5, 75, 150 e 300 µg/mL
e os tempos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min.
O
fato
de
a
maioria
dos
FSs
serem
tanto
fluorescente,
quanto
fotoquimicamente ativo, permite que várias estratégias e protocolos possam ser
combinados na terapia fotodinâmica. O fator mais importante que regula os
resultados da PDT é forma como o FS interage com as células no tecido ou lesão
alvo, e o aspecto chave desta interação está relacionado à localização intracelular
do FS (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). O tempo de incubação é
necessário para permitir que a droga possa ser absorvida pelo microrganismo e
acumular-se nas estruturas celulares (LYON et al., 2011), como mitocôndrias,
lisossomos, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e membrana plasmática
(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; LAM, M et al., 2011). Durante a
irradiação é necessário que o FS já esteja localizado no interior da célula, pois o
oxigénio singleto, formado após a aplicação da luz, apresenta difusão mínima
(100nm) e efeito citotóxico apenas no local onde é produzido (RYSKOVA; BUCHTA;
SLEZAK, 2010).
Assim como foi observado nos estudos de Wilson; Mia (1993); Souza et al.
(2006); Souza et al. (2010); Queiroga et al. (2011), a irradiação com luz laser de
Candida albicans, na ausência de AM, não apresentou influência sobre a viabilidade
dos microrganismos. Já na ausência de luz, o azul de metileno não apresentou, em
nenhuma das concentrações testadas, efeito citotóxico sobre as células de Candida
albicans, corroborando com os estudos citados acima. Tanto o fotossensibilizador,
quanto a luz, são relativamente inofensivos por si só, mas quando combinados, na
presença de oxigênio, causam destruição seletiva na área afetada (MACHADO,
2000; GIROLDO et al., 2009; DAI et al., 2012). Segundo Bliss et al. (2004); Ryskova;
Buchta;
Slezak,
(2010);
Pereira
Gonzales;
Maisch,
(2012),
os
agentes
fotossensibilizadores exibem nenhuma ou mínima toxicidade inerente e o efeito
citotóxico somente ocorre após a sua iluminação com luz de comprimento de onda
específico.
A fotoativação do AM, na concentração 37,5 µg/mL, apenas reduziu
significativamente o número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) quando
foi incubado por um período de 10 (p= 0,007) e 20 min (p= 0,03), mas não houve
90
diferença de um tempo para outro (p = 0,286). Nas concentrações de 75, 150 e 300
µg/mL, a redução das UFC/mL foi significativa a partir de 5 min de incubação e
também não houve diferença entre os tempos. Com estes resultados, pode-se
observar que o aumento da concentração de 37,5 para 75 µg/mL resultou em um
maior efeito da terapia fotodinâmica no tempo de incubação de 5 min, corroborando
com as pesquisas de Munin et al. (2007); Giroldo et al. (2009). No entanto, este
resultado não foi observado nos tempos de incubação de 10 e 20 min, em que o
aumento da concentração não resultou em efeito antimicrobiano adicional a PDT, o
que pode está relacionado as baixas concentrações de AM testadas. No estudo de
Teichert at al. (2002), a irradiação com laser de diodo (275 J/cm2) de azul de
metileno nas concentrações de 250, 275, 300, 350 e 400 µg/ml, após 10 min de
incubação, reduziu o crescimento Candida albicans, mas também não houve
diferença entre elas. Já nas concentrações de 450 e 500 µg/ml de AM, a Candida
Candida albicans foi totalmente eliminada.
No tempo de incubação de 1 min, não foi observado redução significativa no
número de UFC/ml para nenhuma das concentrações testadas. Os piores resultados
encontrados nos tempos de incubação menores que 5 min podem está relacionados
a pouca absorção do fotossensibilizador, produzindo reduções de UFC/mL
modestas, mesmo em altas concentrações do fotossensibilizador (BLISS et al.,
2004). Assim, de acordo com os parâmetros deste estudo e com a relação do custobenefício em relação à concentração da droga e o tempo clínico do procedimento,
os protocolos de PDT mais eficazes foram os que utilizaram o tempo de incubação
de 5 min e as concentrações de azul de metileno de 75µg/ml e 150 µg/ml. Utilizando
um tempo de incubação de 5 min e concentrações de azul de metileno de 50µg/ml,
100µg/ml e 150 µg/ml, Giroldo et al. (2009); Pereira et al. (2011) e Queiroga et al.
(2011) respectivamente observaram redução significativa na viabilidade celular de
espécies de Candida albicans.
Ao
avaliar
fotossensibilizador,
os
estudos
observou-se
que
uma
aplicaram
grande
o
azul
de
metileno
carência de estudos
como
clínicos
controlados e randomizados, utilizando o tratamento antifúngico contra Candida
albicans por meio da terapia fotodinâmica o que, apesar dos estudos em animais e
in vitro serem muito promissores, impossibilita a indicação clínica desta terapia com
base na Odontologia baseada em evidência científica. Assim, a terapia fotodinâmica
91
carece que estudos clínicos sejam desenvolvidos para dar-lhe uma sustentação e
aplicabilidade terapêutica.
A limitação deste estudo foi o fato de utilizarmos apenas uma única espécie
de Candida. No entanto, como esta pesquisa apresentava muitas variáveis e vários
protocolos foram testados, está metodologia atendeu aos objetivos iniciais para o
experimento. Outros trabalhos poderão ser desenvolvidos utilizando este método
para avaliar o efeito da PDT contra todas as espécies de Candida ou em estudo
clínico.
92
7 CONCLUSÕES
A terapia fotodinâmica reduziu o número de UFC/ml Candida albicans,
apresentando efeito antifúngico contra este microrganismo.
O fotossensibilizador azul de metileno não apresentou citotoxicidade no
escuro sobre Candida albicans em nenhuma das concentrações ou tempos de
incubação testados;
A luz laser não alterou a viabilidade celular de Candida albicans na ausência
do fotossensibilizador;
Os tempos de incubação de 5, 10 e 20 min apresentaram melhores resultados
na redução no número de log10UFC/ml, porém este resultado está diretamente
relacionado com a concentração de azul de metileno aplicada.
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ANEXO A – Certificado da cultura utilizada no estudo