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Interbio v.6 n.2 2012 - ISSN 1981-3775
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DA Ilex Paraguariensis
STUDY OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF HIDROALCOHOLIC EXTRACT
OF Ilex Paraguariensis
BITTENCOURT-JUNIOR, Felipe Francisco 1; PAIXÃO DOS SANTOS, Fabricio Mello2;
VASCONCELOS, Nathalie Gaebler3; PIMENTA- RODRIGUES, Marcus Vinicius4
Resumo
Este trabalho tem como objetivo avaliar a potencial tividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico da
planta Ilex paraguariensis frente a algumas espécies de interesse médico. O extrato utilizado foi obtido
através da mistura do material vegetal a uma solução hidroalcoólica (álcool 70%) posteriormente filtrado e
evaporado após 25 dias. Nos testes, discos de papel filtro foram embebidos em 10uL do extrato e esses discos
então aplicados em uma placa de ágar mueller hinton com a cultura bacteriana testada. Nas confrontações
do extrato com Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa
não houve atividade inibitória do crescimento bacteriano, por outro lado, na confrontação com
Staphylococcus aureus a atividade inibitória foi considerada moderada, em relação ao Streptococcus
pyogenes houve atividade inibitória de crescimento. O extrato testado apresentou atividade inibidora contra
Streptococcus pyogenes e atividade inibitória relativamente boa contra Staphylococcus aureus.
Palavras-chave: atividade antimicrobiana; ilex paraguariensis; erva mate
Abstract
This study aims to evaluate the potential antimicrobial activity of hydroalcoholic extract of Ilex
paraguariensis in front of some species of medical interest. The extract used is obtained by mixing the plant
material, which mixed with a hydro-alcohol solution (alcohol 70%) then filtered and evaporated after 25
days. For the tests, disks of filter paper are soaked in 10ul of the extract and these disks are then applied to a
Mueller Hinton agar plate with bacterial culture to be tested. The extract when confronted with Enterococcus
faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa had no inhibitory activity
against bacterial growth, moreover, in confrontation with Staphylococcus aureus inhibitory activity was
considered moderate, in relation to Streptococcus pyogenes, growth inhibitory activity occurred. The extract
tested showed inhibitory activity against Streptococcus pyogenes and relatively good inhibitory activity
against Staphylococcus aureus.
Key-words: natural antimicrobials; Ilex paraguariensis properties; antimicrobial activity
1
Discente do programa de Mestrado em Recursos Naturais da Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul
– UEMS, Dourados / MS.
2
Docente do curso de Biomedicina do Centro Universitário da Grande Dourados, Dourados / MS.
3
Biomédica do laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da universidade Federal da Grande
Dourados – UFGD, Dourados / MS.
4
Docente da Universidade do Oeste Paulista- UNOESTE. e-mail para contato: [email protected]
BITTENCOURT-JUNIOR, Felipe Francisco et al.
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Introdução
A Erva Mate (Ilex paraguariensis)
pertence à família Aquifoleaceae, tem sua
origem na América do Sul, nos países
Argentina, Paraguai e Brasil, estando
distribuída principalmente pelos estados do
Mato Grosso, São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul. Mais
especificamente na região sul do Brasil.
Grande parte devido ao consumo regular do
chimarrão
(ALIKARIDIS,
1987;
BRUNETON, 1993; ESMELINDRO et al.,
2002).
Esta planta era consumida pelos
indígenas que habitavam a região sul do
Brasil antes mesmo da chegada dos
colonizadores, sendo sua propriedade
estimulante já conhecida (EVANS, 1998).
Alguns estudos indicam que os
derivados desta planta possuem várias
propriedades benéficas, estudos comprovam
atividade antioxidante, antimicrobiana,
diurética, digestiva, cicatricial e estimulante,
conferindo um grande potencial terapêutico
(ASOLINI et al., 2006; FILIP et al., 2000;
GORZALCZANY
et
al.,
2001;
GONÇALVES et al., 2005; KOWALCZYK
et al., 2006; VIDOR et al., 2002).
Entretanto, de acordo com Bromatos
(2000) o uso da planta também apresenta
algumas contraindicações como em casos de
ansiedade,
taquicardia,
hipertensão,
gastrites, úlceras gastrintestinais e algumas
doenças hepáticas.
Estudos indicam que o perfil
fitoquímico da Ilex paraguariensis apresenta
uma variedade de substâncias, incluindo
flavonóides, terpenóides, metilxantinas,
saponinas,
taninos,
carotenóides,
aminoácidos, ácidos graxos, carboidratos,
proteínas, glicídios, vitaminas e minerais
(ALIKARIDIS, 1987; BORILLE et al.,
2005; BORTOLUZZI, 2006; BRENELLI,
2003; DUCAT; QUINÀIA, 2004; FILIP et
al., 2001; GNOATTO et al., 2005;
GNOATTO et al., 2007; REISSMANN;
CARNEIRO, 2004).
Haraguchi et al. (1999), sugerem que
a potencial atividade antimicrobiana do
gênero Ilex ocorra devido a presença de
triterpenos. Estas substâncias geram uma
mudança na permeabilidade da célula
bacteriana, resultando em uma alteração da
membrana lipídica do microrganismo.
Estudos
descritos
por
Hongpattarakere
e
Johnson
(1999)
corroboram os dados apresentados por
Haraguchi et al. (1999), nesse estudo foi
observado que outros metabólitos eram
responsáveis pela ação antimicrobiana da
planta, Hongpattarakere e Johnson (1999)
afirmam que outros metabólitos secundários
(além dos triterpenos) contribuem para esta
atividade, dentre eles estão a cafeína e os
derivados do ácido clorogênico, atuando
tanto em bactérias Gram-positivas quanto
em Gram-negativas.
Com crescente aumento das taxas de
resistência bacteriana frente aos antibióticos
atuais faz com que a busca por substâncias
com atividade antibacteriana seja estimulada
e pesquisada com maior propriedade.
Baseado no descrito acima o
presente trabalho tem como objetivo avaliar
a potencial atividade antibacteriana do
extrato hidroalcoólico da erva mate (Ilex
paraguariensis)
frente
a
amostras
bacterianas de interesse médico.
Material e Métodos
Foi necessária a obtenção do extrato
da erva mate (Ilex paraguariensis) a fim de
verificar sua atividade antimicrobiana. As
características desse tipo de pesquisa são
análise e descrição dos acontecimentos em
situações preestabelecidas e controladas
estabelecendo relações de casualidade entre
as variáveis (BARUFFI, 2002; RUDIO,
1978).
O presente trabalho não envolveu
pesquisa em seres humanos, pois se tratou
de um estudo experimental com a atividade
antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de
Ilex paraguariensis contra variadas bactérias
de importância clínica, portanto não foi
encaminhada ao Comitê de Ética em
Pesquisa com seres humanos.
BITTENCOURT-JUNIOR, Felipe Francisco et al.
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Para a realização desta pesquisa,
utilizou-se o laboratório de análises clínicas
localizado no bloco 3 da UNIGRAN (Centro
Universitário
da
Grande
Dourados)
localizada na cidade de Dourados, Mato
Grosso do Sul.
A erva mate utilizada para a
produção do extrato foi obtida a partir da
erva mate comercializada pela empresa
Campanário, proveniente de supermercados
locais de Dourados-MS. O trabalho foi
realizado com 6 diferentes espécies de
bactérias doadas pelo professor Msc.
Marcus Vinícius Pimenta Rodrigues.
Foi utilizado o Teste de KruskalWallis seguido pelo teste de Dunn para
comparação da eficácia antimicrobiana do
extrato estudado em relação à droga padrão.
Para a estatística do teste de antibiograma
foram atribuídos escores aos parâmetros:
sensibilidade
total,
sensibilidade
intermediária ou resistência.
Obtenção do extrato hidroalcoólico de
erva mate
O material vegetal foi misturado
com solução hidroalcoólica (álcool etílico
70%), na proporção de 10%. Essa solução
foi estocada à temperatura ambiente,
protegida da luz, por um período de 25 dias,
procedendo-se, em seguida, à filtragem do
material. A partir da solução filtrada,
obteve-se o extrato, com auxílio de rotaevaporador a 50°C para a retirada de todo o
solvente. O evaporado final recebeu o nome
de "extrato hidroalcoólico de erva-mate" e
foi testado logo em seguida.
Avaliação do efeito antimicrobiano
Nas confrontações com o extrato
vegetal,
foram
utilizados
isolados
bacterianos padrões ATCC de Escherichia
coli (ATCC 25922), Enterococcu faecalis
(ATCC 19433), Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 27853), Staphylococcus aureus
(ATCC 14458) e Streptococcus pyogenes
(ATCC 19615).
Para
avaliação
dos
efeitos
antimicrobianos foi usado o método da
difusão em ágar, a metodologia adotada foi
a descrita pela Farmacopéia Brasileira
(DIAS DA SILVA, 1929) adaptado por
Younes et. al. (2000). As bactérias foram
enriquecidas em caldo BHI (Brain Heart
Infusion), a 37°C, durante um período de 6
horas. Os cultivos foram suspensos em
solução salina estéril até ajuste da turvação à
escala 0,5 de McFarland (3,0 x 108 unidades
formadoras de colônias/mL). Para a
avaliação da atividade antimicrobiana do
extrato hidroalcoólico, empregou-se o
método da difusão de disco em Ágar
(Método de Kirby Bauer), baseado na
técnica descrita por Rabanal et al. (2002) e
por Karaman et al. (2003) que consiste na
aplicação de 10 μL da solução de agente
antimicrobiano em discos de papel de filtro
estéril de 6 mm de diâmetro, em diferentes
concentrações,
variando
de 250 a
1000μg/mL (250 mg/mL, 500 mg/mL, 750
mg/mL, 1000 mg/mL). Foram semeados
100µL de cada inóculo bacteriano em Ágar
Mueller Hinton e as concentrações de
extrato foram diluídas em água estéril.
Os
testes
com
o
extrato
hidroalcoólico
de
erva-mate
foram
realizados em triplicata e os resultados
expressos em milímetros pela média do
diâmetro dos halos de inibição formados ao
redor dos discos nas três repetições. O teste
controle negativo foi realizado com disco
embebido em água e o teste controle
positivo com o disco contendo 0,5 µg do
antibiótico adequado para o tipo de bactéria
em questão.
Após este procedimento, as placas
foram incubadas a 35°C durante 24h.
Depois, com auxílio de um paquímetro, a
leitura dos halos de inibição do crescimento
foi feita. De acordo com a dimensão do
halo, os microrganismos foram classificados
como sensíveis, quando o diâmetro da zona
de inibição for maior que o controle positivo
ou no máximo 3 mm menor que este;
moderadamente sensíveis, halo maior que 2
mm e menor que o controle positivo quando
este apresentar halo com mais de 3 mm; e
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resistentes, diâmetro igual ou menor que 2
mm.
Para verificação de pureza, cada
inóculo foi semeado em uma placa de ágar
sangue. Esta placa foi incubada durante 24
horas a fim de detectar culturas eventualmente
contaminadas e fornecer colônias recémisoladas para os testes.
Resultados e Discussão
Do total de 6 diferentes bactérias
analisadas, duas espécies mostraram ser
sensíveis ao extrato hidroalcoólico de erva
mate. A tabela 1 demonstra os resultados
obtidos relacionando os microrganismos
testados perante as diferentes concentrações
do extrato hidroalcólico de erva mate.
Tabela 1: Resultados obtidos nas confrontações do extrato testado com as bactérias.
Diâmetro da inibição por concentração do extrato (mm)
Microrganismo
250
500
750
1000
Avaliação
Desvio
testado
mg/mL
mg/mL mg/mL mg/mL
padrão
Enterococcus
0
0
0
0
Resistente
0
faecalis
Escherichia
0
0
0
0
Resistente
0
coli
Klebsiella
0
0
0
0
Resistente
0
pneumoniae
Pseudomonas
0
0
0
0
Resistente
0
aeruginosa
Staphylococcus
3
4
5
6
Moderadamente
1,29
aureus
sensível
Streptococcus
7
8
9
11
Sensível
1,70
pyogenes
Nas confrontações do extrato com
Enterococcus faecalis, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas
aeruginosa não houve atividade inibitória
do crescimento bacteriano, por outro lado,
na confrontação com Staphylococcus aureus
a atividade inibitória foi considerada
moderada, já que a inibição ficou entre 3 e 6
mm considerando as concentrações de
extrato testadas. Partindo deste mesmo
princípio, a inibição do crescimento da
bactéria Streptococcus pyogenes foi a de
maior notoriedade, com 7 mm de inibição na
concentração mínima chegando a 11 mm na
maior concentração do extrato testado. Os
halos de inibição (S. aureus e S. pyogenes)
podem ser vistos nas figuras 1 e 2.
Gonçalves (2005), em estudo com
extratos hidroalcoólicos de erva-mate
demonstrou atividade contra Staphylococcus
aureus e também ausência de atividade
contra Escherichia coli e Pseudomonas
aeruginosa. Estes resultados convergem
parcialmente com os obtidos neste estudo.
Por outro lado, De Biasi et. al. (2009) em
estudo com extratos hidro-alcoólicos das
folhas e ramos de Ilex paraguariensis
(expostos ou não ao sol) encontraram
atividade inibitória para P. aeruginosa
(diferentemente deste estudo). Os autores
afirmam que isto pode ter ocorrido
provavelmente pela época de coleta,
separação entre folhas e ramos e exposição
ou não ao sol.
Atualmente, a busca por terapêuticas
alternativas é o principal propósito para o
estudo da atividade de plantas medicinais,
estes estudos também englobam a Ilex
paraguariensis (erva mate) que, de acordo
com pesquisas feitas por diversos autores
em
várias
áreas
de
abrangência
comprovaram suas propriedades.
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Figura 1: Atividade inibitória perante S. aureus nas concentrações de
250mg/mL (1), 500mg/mL (2), 750mg/mL (3) e 1000mg/mL (4).
Afirmam também que os resultados
indicam que a atividade antimicrobiana de
Ilex paraguariensis sofre interferência pela
exposição ou não ao sol e apresentam
diferença entre as atividades dos extratos
hidro-alcoólicos de folhas e ramos, estando
nestes a maior atividade. Nas quatro
concentrações de extrato testadas a bactéria
Escherichia coli não demonstrou ser
sensível, assim como todas as outras
bactérias Gram-negativas submetidas aos
testes. De acordo com Pessini et al. (2003),
isto pode ocorrer devido a presença de uma
membrana mais externa que impossibilitaria
a entrada de determinados compostos e/ou
enzimas.
Figura 2: Atividade inibitória perante S. pyogenes nas concentrações de
250mg/mL (1), 500mg/mL (2), 750mg/mL (3) e 1000mg/mL (4).
Os dados obtidos no estudo diferem
da citação de Hongpattarakere e Johnson
(1999) que afirmam que outros metabólitos
secundários
(além
dos
triterpenos)
contribuem para a atividade (cafeína e
derivados do ácido clorogênico) e que atua
tanto em bactérias Gram-positivas quanto
em Gram-negativas, o que não aconteceu
neste estudo.
Dentre as Gram-positivas testadas,
somente
o
Enterococcus
faecalis
apresentou-se totalmente resistente ao
extrato de Ilex paraguariensis, o que pode
indicar que as demais Gram-positivas
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Interbio v.6 n.2 2012 - ISSN 1981-3775
possuam características próprias que as
tornaram susceptíveis as substâncias do
extrato a que foram submetidas.
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Conclusão
BRUNETON, J. Elementos de Fitoquímica y de
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1993
O crescente aumento nas taxas de
resistência bacteriana tem estimulado a
busca por agentes com atividade
antimicrobiana. Baseado nisso, através
desses resultados superficiais a erva mate
(Ilex paraguariensis) pode ser considerada
para futuras pesquisas, uma vez que o
extrato hidroalcoólico apresentou alguma
atividade contra cocos Gram positivos.
É importante ressaltar que para
considerar esses resultados promissores
estudos mais aprofundados se fazem
necessários, inclusive para isolar os
possíveis
compostos
com
atividade
antibactriana.
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