A
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE
Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):
ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO
Itajaí – 2011
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE
Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):
ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO
Dissertação submetida ao Programa de
Mestrado em Ciências Farmacêuticas, da
Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Itajaí, Fevereiro de 2011
3
K672c
Klein Júnior, Luiz Carlos, 1985Contribuição ao estudo farmacognóstico de Polygala
cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE)
[manuscrito] : aspectos químicos e avaliação de seu potencial
gastroprotetor e anti-hipernociceptivo / Luiz Carlos Klein Júnior. –
2011.
152 f. : il. ; 30 cm
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Próreitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2011.
“Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho”.
Bibliografia: f. 130-144.
1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacognosia.
4. Química vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
CDU: 615.32
4
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE
Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):
ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO
Luiz Carlos Klein Júnior
Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
______________________________________________________
Valdir Cechinel Filho, Doutor
Orientador
______________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
_______________________________________________________
Valdir Cechinel Filho, Doutor (UNIVALI)
Presidente
______________________________________________________________
Sérgio Faloni de Andrade, Doutor (UNIVALI)
Co-orientador
______________________________________________________________
Nara Lins Meira Quintão, Doutora (UNIVALI)
Membro interno
_____________________________________________________________
Vanderlan da Silva Bolzani, Doutora (UNESP)
Membro externo
5
Itajaí, 24 de fevereiro de 2011
Dedico
esta dissertação àqueles que
sempre se dedicam a mim:
Maria Luiza e Luiz Carlos,
meus dedicados pais!!!
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AGRADECIMENTOS
Certa vez ouvi dizer que deveríamos agradecer apenas àquelas pessoas que não
são da família e que não receberam nenhuma remuneração por seu “auxílio”. As primeiras
não deveriam ser agradecidas pois não fizeram mais que sua obrigação de apoiar o
estudante, afinal são membros da família. Já os profissionais remunerados, da mesma
forma, fizeram o que lhes é incumbido conforme contrato de trabalho. Então também não
mereceriam agradecimentos.
Permito-me discordar veementemente desta opinião alheia. A família não é obrigada
a suportar ausências nos finais de semana pois artigos precisam ser terminados. Da mesma
forma, ela não precisa aturar o mau humor quando uma coluna cromatográfica não sai
conforme o esperado ou quando isolamos “uma mistura de glicose e frutose para adoçar o
café” (by FDM).
Os profissionais... Sim, são remunerados! Mas esta remuneração inclui responder emails desesperados nos sábados, a meia-noite e quatorze minutos? O contrato de trabalho
prevê um orientador “caixa eletrônico” (disponível 24 horas por dia)? Duvido!
Assim sendo, nada mais justo e mandatório que fazer meus agradecimentos:
Mãe... impossível seria sem você. Me ouvindo, me fazendo ouvir, me colocando os
pés no chão quando a cabeça queria voar. Sendo Mãe, com letra maiúscula. A distância
nunca me deixou esquecer que você sempre foi e será o meu exemplo a ser seguido. Meu
norte (mesmo estando ao sul). Te amo;
Pai... impossível seria sem você. Sempre com sua opinião mais sensata e racional.
Ouvindo, pesando e expressando o essencial. Obrigado! E obrigado também por sua
compreensão e respeito ao meu ritmo e espaço. Te amo;
Família... especialmente Rodrigo, Taiana e Bety. Obrigado por me apoiarem, cada
qual à sua maneira, neste período, me respeitando e me aconselhando. Sempre “segurando
as pontas”;
Cechinel... meu orientador. Eterno pai científico e, sem dúvidas, amigo! Não há no
dicionário
de
língua
portuguesa
palavra
para
expressar
meus
mais
sinceros
agradecimentos. Te admiro enquanto pesquisador, orientador, amigo, compositor, escritor...
ufa! Obrigado por me fazer uma pessoa melhor!
Faloni... meu “co-chefe”, como tenho mania de chamar. Obrigado por seu apoio e por
sua amizade. Um dos melhores “conselheiros” que tive. Obrigado também pela colaboração
neste e noutros projetos;
7
Tania... te agradeço enquanto professora, coordenadora e amiga. Grato por sua
colaboração nesta dissertação, bem como por seu enorme apoio enquanto mestrando. Seu
profissionalismo e dedicação são inspiradores;
Nara... agradeço especialmente a você por vários motivos: professora, colaboradora
importante desta dissertação e por suas valiosas considerações enquanto membro interno
da banca. Ainda, obrigado por sua disponibilidade, mesmo com a Julia “no colo”;
Márcia e Ângela... obrigado por suas sugestões como banca interna, bem como por
suas atuações como Professoras;
Niero e Christiane Meyre... obrigado por sempre estarem dispostos a sanar minhas
dúvidas e pela colaboração no Laboratório de Pesquisa em Fitoquímica;
Profa. Dra. Vanderlan da Silva Bolzani... agradeço por ter aceito participar da minha
banca de defesa de dissertação, o que, indubitavelmente, irá contribuir significativamente
para o melhoramento deste trabalho;
Prof. Franco Delle Monache (FDM)... grato por seu auxílio na determinação estrutural
dos compostos isolados, bem como por seus e-mails bem humorados;
Demais docentes do PMCF... obrigado por, em maior ou menor grau, contribuírem
para minha formação;
Funcionários... especialmente Joel, Helenize, Maggie, Juliano , Pedro e Luciana que
auxiliaram de forma tão signficativa para a concretização desta dissertação;
Amigos e colegas do PMCF... Aline, Philipe, José, Isabel, Marivane, Jaqueline,
Thaisa, Alessandro, Gislaine e Nicole. A muitos, devo parte desta dissertação. A todos,
grande parte da diversão! Obrigado.
Zhelmy... mi hermanita! Muchas gracias por tu amistad, por tu conocimiento y por tus
oídos! 2010 fue mucho mejor con tu presencia.
Colegas de laboratório… especialmente Priscila, Bruna, Luisa e Mariana. Tanto
aprendemos juntos, rimos juntos e erramos juntos. Se fosse diferente, nem teria graça.
Amigos fora da UNIVALI... especialmente Joi, Daia, Má e Ale por terem me apoiado,
das mais diversas formas, enquanto mestrando. Obrigado por seus ouvidos (ou olhos)!
Instituições... UNIVALI e CAPES por seu apoio financeiro direto ou indireto. FAPESC
e CNPq pelas bolsas de mestrado que me foram concedidas enquanto mestrando.
Os demais... que de alguma forma contribuíram para meu crescimento científico,
profissional e/ou pessoal durante estes dois anos, meu muito obrigado. Desculpem-me se
não incluo o nome de todos, mas infelizmente seria inviável.
Nada seria obtido, nenhum objetivo atingido, nenhuma meta alcançada, se não
fossem as colaborações. Esta dissertação é fruto de um importante trabalho conjunto.
Nenhum mérito é individual. Obrigado a todos...
8
“Ninguém pode construir em teu lugar
as pontes que precisarás passar
para atravessar o rio da vida
- ninguém, exceto tu, só tu.
Existem, por certo, atalhos sem números,
e pontes, e semideuses
que se oferecerão para levar-te além do rio;
mas isso te custaria a tua própria pessoa;
tu te hipotecarias e te perderias.
Existe no mundo um único caminho
por onde só tu podes passar.
Onde leva? Não perguntes, segue-o!”
Nietzche
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE
Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):
ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO
Luiz Carlos Klein Júnior
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Fevereiro/2011
Orientador: Valdir Cechinel Filho, Doutor
Co-orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor
Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.
Número de páginas: 152.
Polygala cyparissias é uma planta popularmente conhecida como pinheiro da praia
ou gelol. É etnofarmacologicamente utilizada como analgésico local de aplicação
tópica, já tendo sido evidenciada a atividade antinociceptiva da planta. Caracterizase quimicamente pela presença de xantonas. Considerando que tais metabólitos já
possuem atividade anti-úlcera descrita, objetivou-se o estudo químico da espécie e a
avaliação do potencial gastroprotetor e anti-hipernociceptivo. Para tanto, foram
utilizados métodos cromatográficos clássicos no isolamento dos metabólitos
principais de P. cyparissias e métodos in vivo e in vitro para verificar seu potencial
farmacológico. A partir do extrato acetônico (EA), foi possível isolar: espinasterol
(PC1), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona
(PC3),
1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona
(PC4)
e
1,7dihidroxi-2,3dimetoxixantona (PC5). Da fração metanólica obteve-se pela primeira vez para a
planta um flavonóide denominado astragalina (PC6). Para avaliar a atividade
gastroprotetora do EA e da fração metanólica (FM) de P. cyparissias utilizou-se os
modelos de lesão gástrica induzida por etanol/HCl e indometacina/betanecol.
Nesses modelos, respectivamente, para o EA obteve-se um índice de
gastroproteção (IG) na dose de 250 mg/kg de 67,4 ± 4,8% e 77,9 ± 7,2%. Já para a
FM, os IGs nas mesmas doses foram 74,5 ± 6,1% e 75,0 ± 2,9%. Além disto, através
dos modelos de úlcera induzida por etanol/HCl associada a um inibidor da óxido
nítrico sintase (L-NAME) e a um quelante dos grupamentos sulfidrila (NEM) foi
evidenciada a significativa (p<0,01) participação do óxido nítrico (NO) e dos
grupamentos sulfidrila (SHs) na gastroproteção promovida pelo extrato e fração de
P. cyparissias. No modelo curativo de úlcera crônica induzida por ácido acético, o
EA e a FM geraram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4 ± 4,4%,
respectivamente. Avaliando o efeito gastroprotetor de PC1, PC2 e PC3 no modelo
de lesão induzida por etanol/HCl, obteve-se os seguintes IGs: 86,2 ± 3,4%, 71,3 ±
9,4% e 81,1 ± 5,8%, respectivamente. Também, objetivando verificar a ação de P.
cyparissias sobre Helicobacter pilory, realizou-se o ensaio de diluição do extrato e
fração em ágar sólido, porém não foi observado efeito sobre o crescimento
bacteriano. A atividade anti-hipernociceptiva, foi avaliada frente a diferentes agentes:
carragenina, lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante completo de Freund (CFA),
prostaglandina E2 (PGE2) e epinefrina. Foi realizado também o modelo de constrição
parcial do nervo ciático (CPNC). Nos modelos de hipernocicepção inflamatória
(carragenina, LPS, CFA e PGE2) as inibições encontradas para as doses mais
efetivas do extrato metanólico (EM) de P. cyparissias foram: 67,8 ± 3,4%, 89,0 ±
4,8%, 42,6 ± 3,4% e 88,5 ± 11,5%, respectivamente. Na hipernocicepção induzida
por epinefrina, o extrato apresentou atividade anti-hipernociceptiva apenas nos
primeiros 15 minutos. Já no modelo de CPNC, a maior inibição foi de 44,4 ± 4,6%.
Os compostos PC1 a PC4 foram avaliados na hipernocicepção induzida por
carragenina, sendo que apenas PC1, PC3 e PC4 foram ativos, com inibições de:
41,6 ± 6,2%, 47,8 ± 5,2% e 63,6 ± 4,4%, para as doses mais efetivas. Assim sendo,
foi possível isolar seis metabólitos diferentes de P. cyparissias, sendo um deles o
10
flavonóide astragalina, obtido pela primeira vez para a espécie. Além disto,
demonstrou-se o potencial gastroprotetor e curativo do EA, FM e de alguns
metabólitos, estando estas atividades relacionadas ao NO e aos SHs. Por fim, o EM
e PC1, PC3 e PC4 evidenciaram ação anti-hipernociceptiva, principalmente em
modelos de hipernocicepção inflamatória.
Palavras-chave:
Xantonas
Polygala
cyparissias.
Gastroproteção.
Anti-hipernocicepção.
CONTRIBUTION TO THE PHARMACOGNOSTIC STUDY OF
Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):
CHEMICAL ASPECTS AND EVALUATION OF THE
GASTROPROTECTIVE AND ANTI-HYPERNOCICEPTIVE POTENTIAL
11
Luiz Carlos Klein Júnior
February/2011
Supervisor: Valdir Cechinel Filho, PhD.
Co-Supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD.
Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances
Number of pages: 152.
Polygala cyparissias is a plant popularly known as “pinheiro da praia” or “gelol”. It is
ethnopharmacologically used as topical anesthetic, and its antinociceptive activity
has already been demonstrated. It is chemically characterized by the presence of
xanthones. Considering that these metabolites display antiulcer activity, the aim of
this work was to carry out a chemical study of the species, and evaluate its
gastroprotective and anti-hypernocicetive potential. Traditional chromatographic
methods were used to isolate the major metabolites of P. cyparissias, and in vivo and
in vitro methods were used to verify the pharmacological activity. From the acetone
extract (AE), it was possible to isolate the following: spinasterol (PC1), 1,3-dihydroxy7-methoxyxanthone (PC2), 1,7-dihydroxy-2,3-methylenedioxyxanthone (PC3),
1,3,6,8-tetrahydroxy-2,7-dimethoxyxanthone
(PC4)
and
1,7-dihydroxy-2,3dimethoxyxanthone (PC5). From the methanol fraction, a flavonoid was isolated for
the first time, which was named astragalin (PC6). To evaluate the gastroprotective
activity of the AE and the MF (Methanolic Fraction) of P. cyparissias, the ethanol/HCland indomethacin/bethanecol-induced ulcer models were used. For the AE, at a dose
of 250 mg/kg, a gastroprotection index (GI) of 67.4 ± 4.8% and 77.9 ± 7.2% was
obtained, respectively. For the MF, the GIs at in the same dose were 74.5 ± 6.1%
and 75.0 ± 2.9%. Also, using the ethanol/HCl-induced ulcer model with a nitric oxide
synthase inhibitor (L-NAME) and a chelant of the sulphydril groups (NEM), a
significant (p<0.01) involvement of the nitric oxide (NO) and sulphydril groups (SHs)
in gastroprotection was demonstrated, a response elicited by the extract and the
fraction of P. cyparissias. In the chronic curative model of ulcer induced by acetic
acid, the AE and the MF demonstrated cure indices of 67.5 ± 5.5% and 58.4 ± 4.4%,
respectively. Evaluating the gastroprotector effect of PC1, PC2 and PC3 in the
ethanol/HCl-induced ulcer, GIs of: 86.2 ± 3.4%, 71.3 ± 9.4% and 81.1 ± 5.8% were
obtained, respectively. Also, seeking to verify the action of P. cyparissias on
Helicobacter pilory, the agar solid dilution assay was used, but no effect was
observed on bacterial growth. The anti-hypernociceptive activity was evaluated in
models induced by: carrageenan, lipopolysaccharide (LPS), Freund’s complete
adjuvant (FCA), prostaglandin E2 (PGE2) and epinephrine. The partial constriction of
the sciatic nerve model (PCSN) was also used. In the models of inflammatory
hypernociception (carrageenan, LPS, FCA and PGE2), the inhibitions, demonstrated
at the most effective doses of the methanol extract (ME) of P. cyparissias were: 67.8
± 3.4%, 89.0 ± 4.8%, 42.6 ± 3.4% e 88.5 ± 11.5%, respectively. In the
hypernociception induced by epinephrine, the extract demonstrated antihypernociceptive activity in the first 15 minutes. In the neuropathic model of
hypernociception induced by PCSN, the inhibition was 44.4 ± 4.6%. Compounds PC1
to PC4 were also evaluated in the hypernociception induced by carrageenan, but
only PC1, PC3 and PC4 were effective, with inhibitions of: 41.6 ± 6.2%, 47.8 ± 5.2%
and 63.6 ± 4.4%. Thus, it was possible to isolate six different metabolites from P.
cyparissias, one of them the flavonoid astragalin, being obtained for the first time for
the plant. The gastroprotector and curative potential of AE, MF and some metabolites
12
was also demonstrated, these activities being related to the NO and SHs. Finally, the
EM and PC1, PC3 and PC4 elicited anti-hypernociceptive activity, particularly in
models of inflammatory hypernociception.
Key
words:
Polygala
cyparissias.
Gastroprotection.
Anti-hypernociception.
Xanthones.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação do ramo de Polygala cyparissias. ....................................34
13
Figura 2: Foto de Polygala cyparissias.....................................................................34
Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias..........................................................34
Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias:
espinasterol (1), salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (7) e
1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8)...........................................................................35
Figura 5: Esquema demonstrando a sensibilização dos neurônios secundários. Esta
sensibilização ocorre quando há um estímulo sustentado emitido pelos nociceptores
periféricos. Na fase aguda há a liberação de glutamato e substância P, ligando-se a
receptores NMDA, AMPA e NK-1 (A). Todavia, com uma estimulação sustentada, há
uma expressão exagerada de receptores, especialmente NMDA através de c-fos e
c-jun, levando à sensibilização do neurônio secundário (B). (Fonte: adaptado de
MARCHAND, 2008). .................................................................................................45
Figura 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de
Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados...........53
Figura 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de
Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados. ........57
Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de
Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados.........60
Figura 9: Espinasterol. .............................................................................................76
Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado. .......77
Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado
expandido na região de 0,70 a 2,10 ppm. .................................................................77
Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada
expandido na região de 3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm. ...................................78
Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl3................................79
Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona. ................................................................82
Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada. .............83
Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido
na região de 6,5 a 8,0 ppm........................................................................................83
Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona....................................................84
Figura 18: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada. .............85
14
Figura 19: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada expandido
na região de 7,3 a 8,1 ppm........................................................................................86
Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona. ................................................86
Figura 21: Espectro de RMN ¹H do composto PC4 em piridina deuterada. .............87
Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona. ..........................................................88
Figura 23: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada. .............89
Figura 24: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada expandido
na região de 3,5 a 9,0 ppm........................................................................................89
Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado. .............................................................90
Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD. ..............................91
Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD expandido na região
de 5,0 a 9,0 ppm. ......................................................................................................91
Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD3OD..............................92
Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 1 descrito na Tabela 10.......................................95
Figura 30: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 2 descrito na Tabela 11.......................................96
Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 3 já descrito.........................................................96
Figura 32: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 4 descrito na Tabela 12.......................................97
Figura 33: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 5 descrito na Tabela 13.......................................98
Figura 34: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 6 descrito na Tabela 14.......................................99
Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 7 descrito na Tabela 15.......................................99
Figura 36: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da
coleta de 2009, conforme método 8 descrito na Tabela 16.....................................100
Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias, conforme
método 8 descrito na Tabela 16. .............................................................................101
15
Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P.
cyparissias, conforme método 8 descrito na Tabela 16. .........................................101
Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de
PC2, conforme método 8 descrito na Tabela 16. ....................................................102
Figura 40: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e
pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas
por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão
expressos em média ± EPM....................................................................................104
Figura 41: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e
pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas
por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão
expressos em média ± EPM....................................................................................104
Figura 42: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e
pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas
por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão
expressos em média ± EPM....................................................................................106
Figura 43: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e
pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas
por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão
expressos em média ± EPM....................................................................................107
Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125
mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl
(60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70
mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A
estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01
quando comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os
grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01). ..................109
Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125
mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl
(60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg,
i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística
foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando
comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os grupos
pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01).....................................110
Figura 46: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.),
pelo extrato acetônico (125 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias
(125 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por ácido acético 20% (50 µl) em
camundongos (n = 6), no modelo de úlcera crônica. Os resultados estão expressos
em média ± EPM.....................................................................................................112
Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.)
e pelos compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl
16
(60%/0,3M) em camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os resultados estão expressos em
média ± EPM...........................................................................................................114
Figura 48: Intensidade de hipernocicepção, avaliada no grupo controle e em animais
tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são
expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos
indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05,
**
p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................117
Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (330 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100
ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada
grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata,
onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................118
Figura 50: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias
(0,3-3 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20
µl/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada
grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata,
onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................120
Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (330 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE2 (0,1
nmol/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada
grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata,
onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................121
Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (330 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina
(100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da
pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001................................................................123
Figura 53: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3
e 10 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a constrição parcial do
nervo ciático. Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da
pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. FOP = falso operado.............................123
Figura 54: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados PC1 (0,02 – 0,24 µmol/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são
17
expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos
indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05,
**
p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................126
Figura 55: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados PC2 (0,04 – 0,39 µmol/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são
expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos
indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05,
**
p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................127
Figura 56: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados PC3 (0,04 – 0,37 µmol/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são
expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos
indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05,
**
p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................127
Figura 57: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no
grupo controle e em animais tratados PC4 (0,03 – 0,31 µmol/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são
expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos
indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05,
**
p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................128
LISTA DE TABELAS
18
Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico de P.
cyparissias.................................................................................................................51
Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1. ........................................................51
Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P.
cyparissias.................................................................................................................55
Tabela 4: Junção das frações obtidas na CC2. ........................................................55
Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11..............................................56
Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P.
cyparissias.................................................................................................................58
Tabela 7: Junção das frações obtidas na CC3. ........................................................58
Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3. ....59
Tabela 9: Junção das frações obtidas na CC4. ........................................................59
Tabela 10: Descrição do método 1. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH.
Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62
Tabela 11: Descrição do método 2. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN.
Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62
Tabela 12: Descrição do método 4. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN.
Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62
Tabela 13: Descrição do método 5. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN.
Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62
Tabela 14: Descrição do método 6. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C =
MeOH. Fluxo de 1 ml/min..........................................................................................63
Tabela 15: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN;
C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min. ..................................................................................63
Tabela 16: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN;
C = MeOH. Fluxo de 0,8 ml/min. ...............................................................................64
Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias. .............75
Tabela 18: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos
para PC1 em comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em
CDCl3. .......................................................................................................................79
Tabela 19: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos
para PC6 e comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em
CD3OD. .....................................................................................................................94
19
Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P.
cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30
mg/kg; v.o.) e veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)
em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis
camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste
de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001. ......................................................103
Tabela 21: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta
de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e
veículo em úlcera induzida por indometacina (100 mg/kg; v.o.)/betanecol (5 mg/kg;
i.p.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis
camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste
de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001. ......................................................105
Tabela 22: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta
de 2007) na dose de 125 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e do veículo no
modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético 20% (ensaio curativo).
Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação
estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05 e **
p<0,01. ....................................................................................................................111
Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona
(PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo
de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados
apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística
realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and ***
p<0,001. ..................................................................................................................114
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
20
ABTS – Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolino)-6-sulfônico
ACN – Acetonitrila
AcOEt – Acetato de etila
AINE – Anti-inflamatório não-esteróide
AMP – Adenosina monofosfato
AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
ANOVA – Análise de variância
ASIC – Canal iônico sensível ao ácido
ATCC – Coleção de cultura do tipo Americana
ATP – Adenosina trifosfato
AUC – Área sob a curva
BK – Bradicinina
CC – Cromatografia em coluna
CCD – Cromatografia em camada delgada
CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa
CFA – Adjuvante completo de Freund
cGMP – Guanosina monofosfato cíclico
CGRP – Peptídeo relacionado ao gene de calcitonina
CIM – Concentração inibitória mínima
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
COX – Ciclooxigenase
CPNC – Constrição parcial do nervo ciático
DCM - Diclorometano
EPM – Erro padrão da média
FOP – Falso operado
IC – Concentração inibitória
IG – Índice de gastroproteção
IL – Interleucina
i.p. – Intraperitoneal
i.pl. – Intraplantar
J – Constante de acoplamento
L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster
LPS – Lipopolissacarídeo
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno
21
MEK – Quinase ativadora da MAPK
NEM – N-etilmaleimida
NGF – Fator de crescimento neuronal
NIQFAR – Núcleo de investigações químico-farmacêuticas
NMDA – N-metil-D-aspartato
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido nítrico sintase
PC1 – Espinasterol
PC2 – 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona
PC3 – 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona
PC4 – 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona
PC5 – 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona
PC6 – Astragalina
PG – Prostaglandina
PGE2 – Prostaglandina E2
PKA – Proteína quinase A
PKC – Proteína quinase C
RMN ¹H e ¹³C – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13
SH – Grupamento sulfidrila
SNC – Sistema nervoso central
TFA – Ácido trifluoracetico
TNF-α – Fator de necrose tumoral α
ULI – Índice de lesão ulcerativa
UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí
v.o. – Via oral
WDR – Neurônio de faixa ampla
δ – Deslocamento químico
SUMÁRIO
22
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................24
2 OBJETIVOS...........................................................................................................26
2.1 Objetivo geral ................................................................................................27
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................27
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................28
3.1 Plantas medicinais........................................................................................28
3.2 Família Polygalaceae ....................................................................................31
3.3 Gênero Polygala............................................................................................32
3.4 Espécie Polygala cyparissias ......................................................................33
3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera .......................................................36
3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori...............................37
3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides...............38
3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse.................................................................39
3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor ......................39
3.7 Aspectos gerais relacionados à dor............................................................41
3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda ................................................................41
3.7.2 Cronificação da dor ...................................................................................43
3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo.....................47
4 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................49
4.1 Materiais e equipamentos ............................................................................49
4.2 Análise fitoquímica .......................................................................................49
4.2.1 Material vegetal.........................................................................................49
4.2.2 Obtenção dos extratos ..............................................................................50
4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados..................................50
4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias ....................................61
4.2.4.1 Preparo das amostras.........................................................................61
4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico......................................61
4.3 Testes farmacológicos .................................................................................65
4.3.1 Animais .....................................................................................................65
4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora .....................................................65
4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl ...............................65
4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide
associada à estimulação parassimpaticomimética .........................................66
4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético..........................67
23
4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor..........................................68
4.3.3.1 Participação do óxido nítrico...............................................................68
4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas............................................68
4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory...........................................69
4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory..................................................................69
4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) .....................69
4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva.............................................70
4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e
monofilamento de Von Frey............................................................................70
4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina .......................71
4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS).....72
4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de
Freund (CFA)..................................................................................................72
4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E2 (PGE2) .73
4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina ..........................73
4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo
ciático (CPNC) ................................................................................................73
4.3.6 Análise estatística .....................................................................................74
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................75
5.1 Análise fitoquímica .......................................................................................75
5.1.1 Extratos obtidos.........................................................................................75
5.1.2 Identificação dos compostos obtidos.........................................................76
5.1.2.1 PC1.....................................................................................................76
5.1.2.2 PC2.....................................................................................................81
5.1.2.3 PC3.....................................................................................................84
5.1.2.4 PC4.....................................................................................................86
5.1.2.5 PC 5....................................................................................................87
5.1.2.6 PC 6....................................................................................................90
5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias ..................94
5.2 Testes farmacológicos ...............................................................................102
5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora ...................................................102
5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory .......................................116
5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva...........................................116
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................130
24
REFERÊNCIAS.......................................................................................................132
ANEXO A – Artigo publicado................................................................................147
ANEXO B – Artigo de revisão aceito para publicação .......................................151
1 INTRODUÇÃO
25
O uso de plantas medicinais é provavelmente a terapêutica mais antiga
utilizada, com evidências que remetem à aproximadamente 3000 anos a.C.
(HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). Hoje em dia, as
plantas medicinais continuam sendo muito utilizadas, especialmente na atenção
primária à saúde, apesar do avanço da química sintética (GANESAN, 2008).
Além do seu uso etnofarmacológico, as plantas medicinais são importantes
fontes
de
moléculas
biologicamente
ativas
como
potenciais
fitofármacos
(BARREIRO; BOLZANI, 2009). De fato, grande parte dos medicamentos hoje
disponíveis
são
de
origem
vegetal
ou
inspirados
nestes
(MCCHESNEY;
VENKATARAMAN; HENRI, 2007; BARREIRO; BOLZANI, 2009). Entretanto, mesmo
com todo o arsenal terapêutico atualmente disponível, estima-se que apenas 1% das
espécies presentes em florestas tropicais foram estudadas sob o âmbito
farmacêutico (GURIB-FAKIM, 2006), o que justifica fortemente estudos abordando
tais aspectos.
Além da variada constituição química inter-espécies, outro motivo para a
ampliação do número de moléculas potencialmente bioativas é a variação intraespécies (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER, 2009). Alguns fatores
que podem influenciar tal variação são: exposição solar, umidade, constituição do
solo, localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI,
2007). Isto sempre deve ser levado em consideração quando se estuda e utiliza uma
determinada planta medicinal, visto que estes fatores podem promover variações na
concentração de metabólitos secundários (moléculas potencialmente bioativas) e,
inclusive, modificá-los (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Considerando o uso de plantas medicinais como alternativa terapêutica, duas
patologias carentes de tratamento farmacológico efetivo e que vêm sendo foco de
estudos sob esta temática são a úlcera (FALCÃO et al., 2008) e a dor de caráter
persistente (CALIXTO et al., 2000). A úlcera se caracteriza por um desequilíbrio
entre os fatores agressivos e de proteção da mucosa gástrica (CHAN; LEUNG,
2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Dentre os fatores etiológicos,
destacam-se a infecção por Helicobacter pylori, o uso de anti-inflamatórios nãoesteróides e o estresse (LU; GRAHAM, 2006). Já a dor crônica pode ser definida
como um processo sem estímulo contínuo ou patologia definida que dura mais que o
período normal de cura e recuperação (MEYR; SAFFRAN, 2008).
26
Estudos vêm demonstrando a atividade anti-úlcera e anti-hipernociceptiva de
espécies do gênero Polygala (LAPA et al., 2007, 2009). Particularmente, Polygala
cyparissias, utilizada popularmente por sua ação analgésica, já demonstrou
atividade sobre a nocicepção aguda induzida por diferentes mediadores químicos
(CAMPOS et al., 1997). Em adição, P. cyparissias é fitoquimicamente caracterizada
por xantonas (PINHEIRO et al., 1998), uma classe de metabólitos secundários
relacionada com atividade gastroprotetora (BO; LIU, 2004; BANERJI et al., 1994),
deixando indícios de que P. cyparissias possa apresentar atividade anti-úlcera. Uma
vez que a espécie apresenta ampla distribuição no Brasil, especialmente em Santa
Catarina (WURDACK; SMITH, 1971), no presente estudo propô-se o estudo químico
e farmacológico da espécie apresentada.
2 OBJETIVOS
27
2.1 Objetivo geral
Estudar a composição química de Polygala cyparissias St. Hil. & Moq., além
de verificar a potencial atividade gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de seus
extratos, frações e compostos isolados.
2.2 Objetivos específicos
a) Isolar por métodos cromatográficos os principais constituintes químicos
presentes no extrato acetônico e na fração metanólica de P. cyparissias;
b) Identificar através de métodos espectroscópicos de ressonância magnética
nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e/ou de carbono-13 (RMN 13C) os compostos
isolados;
c) Obter perfil cromatográfico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
do extrato metanólico de P. cyparissias;
d) Avaliar a atividade gastroprotetora em camundongos do extrato acetônico e
fração metanólica de P. cyparissias através dos modelos de úlcera aguda
induzida por etanol/HCl e por
anti-inflamatório não-esteróide (AINE)
associado à estimulação parassimpaticomimética, bem como suas atividades
sobre o sistema oxinitrérgico, grupamentos sulfidrilas (SHs) e sobre
Helicobacter pilory por diluição em ágar sólido;
e) Avaliar a atividade curativa do extrato acetônico e fração metanólica de P.
cyparissias no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em
camundongos;
f) Avaliar a atividade gastroprotetora dos compostos isolados através do modelo
de úlcera aguda induzida por etanol/HCl em camundongos;
g) Investigar o efeito preventivo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias
frente à hipernocicepção mecânica persistente induzida pela injeção i.pl. de
adjuvante
completo
de
Freund
(CFA),
prostaglandina
E2
(PGE2),
lipopolissacarídeo (LPS), carragenina e epinefrina em camundongos;
h) Avaliar o efeito curativo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias sobre a
dor neuropática induzida pela contrição parcial do nervo ciático (CPNC) em
camundongos;
28
i) Avaliar o efeito preventivo dos compostos isolados sobre a hipernocicepção
mecânica induzida pela injeção i. pl. de carragenina em camundongos;
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Plantas medicinais
29
Diversas evidências demonstram que o uso de plantas medicinais é o modo
mais antigo e difundido de tratamento de várias enfermidades. Há aproximadamente
5000 anos, plantas já eram utilizadas com fins terapêuticos de forma empírica,
encontrando-se tal prática disseminada entre o povo mesopotâmico, egípcio e grego
(HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). A história também
evidencia o uso de plantas medicinais, em diversas épocas, pelos chineses,
indianos, tibetanos, astecas, maias, dentre outros (HALBERSTEIN, 2005).
Já na história mais recente, o uso de plantas medicinais tornou-se mais
avançado, envolvendo o isolamento de princípios ativos como potenciais
fitofármacos (LARSSON; BACKLUND; BOHLIN, 2008; RISHTON, 2008). Esta
tendência foi iniciada em 1804 pelo farmacêutico Friedrich Wilhelm Adam com o
isolamento da morfina do ópio obtido de Papaver somniferum, inspirando a obtenção
de uma série de análogos e não-análogos, os quais vieram a fazer parte da classe
de hipnoanalgésicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LIU; WANG, 2008; BARREIRO;
BOLZANI, 2009). De fato, a farmacologia contemporânea encontra suas bases
firmadas no conhecimento adquirido em diversos estudos com plantas medicinais
(LIU; WANG, 2008), inclusive auxiliando na descoberta de novos mecanismos de
ação (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; HARVEY, 2008).
Durante algum tempo, diversos fármacos puramente sintéticos foram
lançados no mercado (GANESAN, 2008). Pesquisas envolvendo o desenvolvimento
de fitofármacos acabaram dividindo espaço com estudos guiados por relação
estrutura-atividade, química combinatória, desenvolvimento de fármacos in silico,
dentre outras técnicas (SCHMIDT et al., 2008). Isto acabou fazendo com que
diversas indústrias farmacêuticas reduzissem o investimento na pesquisa de
produtos naturais, apesar de seu sucesso já evidenciado (BALUNAS; KINGHORN,
2005; LAM, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; HARVEY, 2008;
SCHMIDT et al., 2008).
Porém, nos últimos anos, a importância dos estudos envolvendo plantas
medicinais
foi
reavivada,
especialmente
por
seus
avanços
na
atividade
anticacerígena, voltando a despertar o interesse social e econômico sobre os
produtos naturais, permanecendo estes como uma importante fonte de novas
moléculas bioativas (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; SCHMIDT et al.,
2008; SHINDE; DHALWAL; MAHADIK, 2008; BRAZ-FILHO, 2010). A maioria dos
30
fármacos atualmente disponíveis ou são de origem natural ou foram inspirados em
produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN;
HENRI, 2007).
De 1994 até 2007, aproximadamente metade dos fármacos
aprovados e liberados para uso foram baseados em fitoconstituintes, sendo que de
2005 a 2007, dos 30 fitomedicamentos lançados, cinco representaram os primeiros
membros de novas classes terapêuticas. Mais de cem compostos de origem natural
estão em estudos clínicos e aproximadamente a mesma quantidade, em estudos
pré-clínicos (HARVEY, 2008).
Cerca de 50% dos fitofármacos hoje disponíveis foram obtidos de plantas
superiores. Estima-se que existam no mundo aproximadamente 300,000 espécies
de plantas, sendo que em torno da metade localizam-se em florestas tropicais
(GURIB-FAKIM, 2006; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). De fato, as
florestas tropicais são grandes fontes de novas moléculas potencialmente bioativas,
visto que apenas 1% das espécies foi estudada do ponto de vista farmacêutico,
sendo esta uma justificativa importante a ser considerada para a preservação da
biodiversidade (GURIB-FAKIM, 2006; BARREIRO; BOLZANI, 2009).
Muitas das moléculas bioativas são geradas pelo metabolismo secundário dos
organismos vegetais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). O metabolismo secundário é
responsável pela sobrevivência da espécie no meio em que se encontra
(HARTMANN, 2007), adotando um perfil adaptativo frente ao progresso evolutivo do
ambiente, conhecido como “efeito rainha vermelha”, o que justifica serem fontes de
moléculas potencialmente ativas (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER,
2009). Assim sendo, a composição química das plantas depende de uma série de
fatores, como espécie vegetal, exposição solar, umidade, constituição do solo,
localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI, 2007;
GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Considerando isto, a variedade de moléculas
geradas pelos organismos vegetais é enorme, constituindo uma fonte quase que
inesgotável de estruturas químicas (LAM, 2007; ROLLINGER, 2009).
Além da diversidade molecular, outro aspecto que justifica o interesse por
metabólitos secundários é sua complexidade estrutural. Muitas vezes tais estruturas
são desafiadoras para a síntese orgânica (BALUNAS; KINGHORN, 2005;
MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; PHILLIPSON, 2007), uma vez que
envolvem diversos centros estereogênicos, muitos anéis aromáticos, alto grau de
insaturações, grande número de heteroátomos, dentre outros (BALUNAS;
31
KINGHORN, 2005). Porém, mesmo com este abismo molecular entre fitofármacos e
fármacos sintéticos, muitos deles seguem de forma semelhante às regras de Lipinski
(GANESAN, 2008; HARVEY, 2008). Tais regras relacionam a estrutura do fármaco
com a sua potencial farmacocinética, estabelecendo que não deve haver mais de 5
grupos doadores de ligações hidrogênio, massa molecular inferior a 500 Da, log P
inferior a 5 e menos de 10 grupos aceptores de ligações de hidrogênio para que se
tenha uma absorção e permeabilidade adequadas (ZHANG; WILKINSON, 2007).
Contudo, eventualmente algumas modificações moleculares se fazem necessárias,
tanto por motivos farmacocinéticos quanto farmacodinâmicos. Dentre as estratégias
utilizadas, destacam-se homologação linear e ramificada e introdução de grupos
vinílogos, fenílogos e benzílogos (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
Porém, o desenvolvimento de fármacos a partir de produtos naturais enfrenta
grandes desafios. Talvez o maior deles esteja relacionado ao baixo rendimento que
geralmente é obtido de produtos isolados, inviabilizando, inclusive, seus estudos
clínicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005). Além disto, quando comercializado, a
demanda é variável, podendo atingir centenas a milhares de quilogramas por ano do
composto isolado (MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Ainda, há uma
grande necessidade de colaboração interdisciplinar, uma vez que os estudos ligados
a plantas medicinais envolvem diversas áreas, como a botânica, a bioquímica, a
farmacognosia, a farmacologia, a fitoquímica, a medicina, a toxicologia, a
biotecnologia, dentre outras (PHILLIPSON, 2007).
3.2 Família Polygalaceae
Polygala é uma união das palavras gregas poly (muito) e gala (leite),
referenciando suas propriedades lactantes quando em infusão. Porém, as espécies
atualmente pertencentes à família Polygalaceae não apresentam tal característica,
visto que este nome foi primeiramente utilizado para designar a espécie atualmente
conhecida como Gallega officinalis (Fabaceae) e, equivocadamente, foi empregado
por botânicos do século XVI em uma espécie diferente, tendo este erro originado a
família Polygalaceae (PASTORE, 2006).
A família é constituída de ervas, arbustos, pequenas árvores, trepadeiras e
algumas saprófitas (FURNESS; STAFFORD, 1995), dividida em três tribos:
Polygaleae, Moutabeae e Xanthophylleae (ERIKSEN, 1993). Engloba em torno de
32
17 gêneros e mais de 1000 espécies, sendo aproximadamente metade destas
pertencentes ao gênero Polygala. É uma família quase cosmopolita, estando
ausente apenas na Nova Zelândia e no Círculo Ártico, encontrando-se presente
principalmente em regiões de clima temperado e tropical. A maior parte das
espécies européias está restrita à região sul e mediterrânea, com apenas 10
espécies do gênero Polygala na região norte do continente (FURNESS; STAFFORD,
1995). No Brasil, a família é representada por sete gêneros envolvendo 240
espécies em todas as formações vegetais (AGUIAR; ARANHA-FILHO, 2008).
Além das espécies pertencentes ao gênero Polygala, diversas outras já
demonstraram potencial farmacológico. Raízes de Securidaca longepedunculata
foram
avaliadas,
demonstrando
atividades
antinociceptivas,
antidepressivas
(ADEBIYI et al., 2006), antimicrobianas (JUNAID et al., 2008) e relaxante da
musculatura lisa dos corpos cavernosos (MEYER; RAKUAMBO; HUSSEIN, 2008). O
extrato alcoólico das folhas de Carpolobia lutea inibiu significativamente diarréia e
úlcera experimentalmente induzidas em roedores (NWAFOR; BASSEY, 2007).
Raízes de Securidaca inappendiculata demonstraram possuir atividade citotóxica em
macrófagos (YUI et al., 2001).
Assim sendo, destaca-se o grande interesse na família Polygalaceae, visto
que sua importância medicinal ainda é economicamente pouco explorada, além do
interesse taxonômico, com espécies de ocorrência em praticamente todas as
formações vegetais, ideal para estudos comparativos (AGUIAR; ARANHA-FILHO,
2008).
3.3 Gênero Polygala
O gênero Polygala possui aproximadamente 350 espécies, com ampla
distribuição, especialmente nas áreas neotrópicas. Estima-se que este gênero seja
aquele que tenha maior representatividade da família Polygalaceae no Brasil, com
aproximadamente 110 espécies e 30 variedades. Geralmente apresentam-se como
ervas ou arbustos, sendo árvores extremamente raras (WURDACK; SMITH, 1971;
COELHO; AGRA; BARACHO, 2008).
Diversos estudos destacam as propriedades farmacológicas de espécies do
gênero Polygala, especialmente relacionados às suas potencias atividades sobre o
sistema nervoso central (SNC). Todavia, existem estudos também demonstrando
33
suas atividades anti-nociceptivas e gastroprotetoras. Meotti et al. (2006) verificaram
que as frações diclorometano, acetato de etila e butanol, além de três dihidroestiril-2pironas, α-espinasterol, escopoletina, acetilescopoletina e benzoilescopoletina
obtidas de P. sabulosa foram capazes de inibir as contorções provocadas por ácido
acético em camundongos. O extrato hidroalcoólico também foi capaz de inibir a
nocicepção induzida por glutamato, N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido α-amino-3hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e
interleucina 1β (IL-1β) (RIBAS et al., 2008).
Lapa et al. (2009) demonstraram que o extrato hidroalcoólico de P. paniculata
teve ação inibitória sobre contorções abdominais induzidas por ácido acético, sobre
as duas fases do teste da formalina, bem como nocicepção induzida por capsaicina,
glutamato, NMDA, IL-1β, TNF-α e cinamaldeído. Para a mesma espécie, foi
evidenciado seu potencial gastroprotetor em modelos de úlcera induzida por etanol e
por AINEs, sem alterar o volume e acidez da secreção gástrica (LAPA et al., 2007).
Além das espécies já citadas, diversas outras demonstram atividade biológica,
destacando-se a espécie Polygala cyparissias (COELHO; AGRA; BARACHO, 2008).
3.4 Espécie Polygala cyparissias
Popularmente conhecida como pinheiro da praia, avenca da praia e gelol, a
espécie Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin é encontrada no Brasil, da
Paraíba ao Rio Grande do Sul, na Argentina e no Uruguai (WURDACK; SMITH,
1971; COELHO; AGRA; BARACHO, 2008). É uma erva glabra, de 12-50 cm de
comprimento, com folhas numerosas e alternas e com flores que variam da cor
branca à roxa (Figuras 1-3). Também é uma planta muito ramifica, estando seus
ramos geralmente sobre a superfície da areia, crescendo em zonas planas ou
pequenas depressões, próximas ao lençol de água. É característica da restinga
litorânea do sul do Brasil (WURDACK; SMITH, 1971).
34
Figura 1: Representação do ramo de Polygala
cyparissias.
Figura 2: Foto de Polygala cyparissias.
(Fonte: AUTOR)
(Fonte: COELHO; AGRA; BARACHO, 2008)
Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias.
(Fonte: STEFANI, 2010)
A espécie P. cyparissias é popularmente utilizada como anestésico local,
especialmente de aplicação tópica. Considerando isto, Campos et al. (1997)
avaliaram o efeito do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias, demonstrando sua
ação antinociceptiva pronunciada contra nocicepção inflamatória e neurogênica,
além de prevenir a hiperalgesia induzida por bradicinina e substância P. Seguindo a
mesma linha, Sayah et al. (1999) verificaram que o mesmo extrato e o composto
isolado 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona antagonizaram, por mecanismo de ação
não-competitivo, mas de modo reversível, a contração de traquéia promovida por
diversos mediadores da inflamação, como bradicinina, substância P, prostaglandina
E2, tromboxano A2, análogo estável da prostaglandina H2 U 46619, histamina e
acetilcolina em cobaias ex vivo. Também, tanto o extrato quando a xantona
demonstraram atividade antagônica às contrações promovidas por ovalbumina.
35
A espécie também já foi estudada quimicamente. Do extrato hexânico, foram
isolados o α-spinasterol (1) e altas concentrações de salicilato de metila (2). Do
extrato obtido com acetato de etila foram isoladas seis xantonas: 1,3-dihidroxi-7metoxixantona
(3),
1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona
(4),
1,3,6-trihidroxi-2,7-
dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8) (Figura 4) (PINHEIRO
et al., 1998).
O
H3C
O
OH
(2)
CH3
CH3
CH3
O
CH3
CH3
CH3
OH
H3C
O
HO
O
(3)
OH
O
(1)
CH3
OH
HO
O
O
CH3
O
O
O
(5) HO
O
OH
O
CH3
OH
CH3
(4)
O
CH3
OH
HO
OH
O
O
O
OH
O
CH3
O
O
(6)
O
HO
(7) HO
O
OH
OH
O
CH3
(8)
O
OH
Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias: espinasterol (1),
salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8).
Além disto, conforme demonstrado por Weinhold et al. (2008), o óleo-resina
extraído por CO2 de P. cyparissias apresentou ser constituído por p-benzoquinona,
acetileugenol, éster metílico do ácido 11,14-octadecanóico, cadineno, óxido de β-
36
cariofileno, N,N-bis(2-hidroxietil)dodecanamida, α-spinasterol, ácido hexadecanóico,
dodecano, n-tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano,
octadecano e nonadecano. Em outro estudo, Pizzolatti et al. (2009) demonstraram
que o principal constituinte dos compostos voláteis presentes nas raízes de P.
cyparissias é o salicilato de metila (97,8%), enquanto que para as flores são acetato
de bornila (19,2%) e 1,8-cineol (7,2%).
Visto que apenas o extrato hexânico e o extrato com acetato de etila foram
estudados para fins de isolamento, percebe-se quão promissora pode ser a
investigação química do vegetal por outros métodos extrativos. Da mesma forma,
considerando que poucas atividades farmacológicas foram avaliadas, especialmente
dos compostos isolados, cabe vislumbrar outros estudos na área da farmacologia.
Assim, considerando o exposto, o presente trabalho visa isolar por métodos
cromatográficos os compostos já relatados na literatura, dando ênfase às xantonas,
além de buscar metabólitos secundários ainda não descritos para a espécie.
Ademais, objetiva-se a obtenção de um perfil cromatográfico por CLAE para futuros
fins de quantificação. Finalizando, o estudo propõe-se a avançar em testes
farmacológicos relacionados a duas atividades: anti-hipernociceptiva, considerando
seu uso popular e os estudos já apresentados; e atividade gastroprotetora, por
existir espécie do gênero com tal potencial e pela presença significativa de xantonas,
metabólitos secundários estes com atividade anti-úlcera já descrita (BANERJI et al.,
1994; BO; LIU, 2004).
3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera
A úlcera é causada por um desequilíbrio entre os fatores agressivos e de
proteção da mucosa gástrica. Tem sido, por mais de um século, uma importante
causa de morbidade e mortalidade. Também, avalia-se que os gastos com o
tratamento desta doença alcancem mais de cinco bilhões de dólares por ano nos
Estados Unidos, além dos custos de medicamentos, não computados neste valor
(CHAN; LEUNG, 2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Em países
industrializados, estima-se que aproximadamente 10% da população seja afetada
por esta patologia, sendo que apenas no continente americano mais de dois milhões
de adultos sofrem desta doença em alguma fase de sua vida. Em termos de
37
prevalência, verifica-se que a úlcera afeta mais homens (11 a 20%) do que mulheres
(8 a 11%) (KLOPELL et al., 2007).
De modo geral, na úlcera gástrica, a lesão é provocada por uma redução da
capacidade protetora da mucosa, diminuindo a secreção de bicarbonato e de muco,
além de reduzir a reepitelização. Com isto, a mucosa fica mais suscetível à
permeação do ácido gástrico, sendo assim lesionada e permitindo, também, a lesão
da submucosa. Os mastócitos presentes nesta submucosa, bem como na lâmina
própria, degranulam e liberam a histamina, um dos agentes responsáveis por
estimular a secreção de ácido clorídrico e promover a inflamação local. O ácido
ainda pode atingir vasos sanguíneos e estimular nervos presentes na parede
gástrica, gerando contrações exacerbadas (RODRIGUES et al., 2008).
A reepitelização também serve como mecanismo de defesa na garantia de
funcionamento da barreira mucosa. Fatores que reduzem a proliferação celular,
como radicais livres, citocinas inflamatórias e estresse fisiológico, acabam por
propiciar o desenvolvimento de lesão. Também, o rompimento desta barreira,
especialmente por AINEs, facilita a entrada de íons H+, aumentando a acidose
tecidual, o que contribui para a formação da úlcera (RODRIGUES et al., 2008).
Assim, diversos fatores são responsáveis por sua formação, destacando-se a
infecção por Helicobacter pylori, AINEs e estresse (LU; GRAHAM, 2006).
3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori
Durante a maior parte do século 20, acreditava-se que a principal causa da
úlcera estomacal estava relacionada com a hiperestimulação estomacal, ou seja, o
estômago, quando hiperestimulado, secretava ácido clorídrico de modo excessivo,
gerando assim as lesões (HOBSLEY; TOVEY; HOLTON, 2008). Porém, mais
recentemente, após o isolamento de H. pylori a partir de fragmentos de biópsia
gástrica de pacientes com gastrite crônica e úlcera péptica por Warren e Marshall
(Prêmio Nobel de Medicina 2005), vem se admitindo a interação deste microganismo
na formação de úlceras (SIQUEIRA et al., 2007).
Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa, microaerófila e espiralada,
em forma de S ou de bastonete curvo, com parede celular externa lisa, possuindo
quatro a seis flagelos unipolares embainhados e com bulbo terminal. Provavelmente
é o agente de infecção crônica mais comum em seres humanos, colonizando
38
especificamente a mucosa gástrica e microvilosidades gástricas das células
epiteliais (SIQUEIRA et al., 2007). Geralmente o indivíduo é infectado na infância,
porém H. pylori permanece latente por um longo período (LU; GRAHAM, 2008).
Estima-se que metade da população esteja infectada por H. pylori, apesar de
80% destes não apresentarem evidências clínicas da doença. Porém, mesmo assim,
a bactéria está relacionada à maioria das úlceras duodenais (90-95%) e gástricas
(60-70%) (SIQUEIRA et al., 2007).
H. pylori contribui diretamente na lesão das células gástricas através da
liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase,
urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007). Além
disto, a bactéria reduz a secreção de bicarbonato pelo duodeno, permitindo uma
penetração substancial de íons H+ e de outros agentes lesivos na mucosa,
destruindo as células presentes. Também, a infecção por H. pylori parece estimular
o reflexo vago-vagal que, somado com o dano direto à mucosa, inibição das células
D e estimulação das células G, resulta em uma hipergastrinemia e aumenta a
secreção de H+, contribuindo para a ulcerogênese (KONTUREK; KONTUREK;
OCHMAŃSKI, 2004).
3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides
Apesar de na década de 1950 as internações hospitalares por úlceras em
países desenvolvidos terem começado a diminuir, foi observado um aumento
significativo em internações por úlceras hemorrágicas e perfurações especificamente
entre idosos. Este aumento foi justificado pelo maior uso de AINEs por estes
indivíduos (CHAN; LEUNG, 2002). O uso destes anti-inflamatórios aumenta o risco
de desenvolvimento de úlcera em quase vinte vezes. Dentre os fatores de risco
associados estão o histórico de úlcera, idade avançada, altas doses de AINEs, uso
de diferentes medicamentos desta classe e uso concomitante de corticosteróides e
anticoagulantes (LU; GRAHAM, 2006).
Os AINEs inibem a enzima ciclooxigenase (COX), importante na conversão
de ácido araquidônico em prostaglandinas. Existem três isoformas desta enzima:
COX-1, COX-2 e COX-3. Acredita-se que a última esteja de alguma forma
relacionada à inflamação crônica, bem como ao Alzheimer e ao câncer (KAM; SO,
2009). Já a COX-2 está ligada ao processo inflamatório, enquanto que a COX-1 está
39
relacionada à manutenção da mucosa gástrica e à agregação plaquetária (LU;
GRAHAM, 2006). Assim, com a inibição da COX-1, há um enfraquecimento na
defesa da mucosa contra agentes agressores luminais (CHAN; LEUNG, 2002).
Além da atuação sobre a COX, acredita-se que os AINEs estejam de alguma
forma relacionados à diminuição da secreção de óxido nítrico (NO). Com isto há uma
redução no fluxo sanguíneo local e na secreção de muco, além de estimular a
adesão de neutrófilos através da promoção de síntese de TNF-α e leucotrienos. De
fato, a adesão de neutrófilos à mucosa provoca a produção de espécies reativas de
oxigênio, liberando proteases e obstruindo o fluxo sanguíneo capilar, sendo todos
estes fatores relacionados à ulcerogênese (CHAN; LEUNG, 2002).
3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse
Apesar de H. pylori e AINEs estarem presentes em muitos pacientes com
úlcera, uma substancial porção destes (5-20%) apresenta a doença sem etiologia
definida. Além disto, diversos indivíduos estão infectados pela bactéria ou usam um
anti-inflamatório do tipo não-esteróide e não desenvolveram úlcera. Isto deixa claro
que a ulcerogênese está atrelada, também, a fatores psicossomáticos. Apesar de
não existirem estudos que indiquem uma relação direta entre o estresse psicológico
e a úlcera, acredita-se que este seja um fator importante e passível desencadear a
lesão (JONES, 2006).
Sabe-se que o estresse fisiológico pode provocar úlcera de diversas formas.
Uma delas envolve a peroxidação lipídica, que acaba por gerar espécies reativas de
oxigênio,
ocasionando
comumente
dano
oxidativo
na
mucosa
gástrica
(RODRIGUES et al., 2008). Além disto, há um aumento na secreção de ácido
clorídrico, redução no fluxo sanguíneo local e de produção de mucina (JONES,
2006). As lesões provocadas geralmente apresentam perda do epitélio superficial e
necrose, porém raramente geram perfurações ou sangramento (STOLLMAN; METZ,
2005).
3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor
O tratamento da úlcera evoluiu da vagotomia aos inibidores da bomba de
prótons. Porém, mesmo com tamanho avanço, o interesse por terapias alternativas e
o uso de plantas medicinais vem crescendo. De fato, os extratos de plantas são
40
promissoras fontes de novos fitofármacos, inclusive para o tratamento da úlcera
(FALCÃO et al., 2008). Existem diversos estudos de produtos obtidos de fontes
naturais que demonstram sua atividade gastroprotetora (SCHMEDA-HIRSCHMANN;
YESILADA, 2005; ZAYACHKIVSKA et al., 2005).
O
Núcleo
de
Investigações
Químico-Farmacêuticas
(NIQFAR)
da
Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) já estudou uma série de plantas com
atividade
gastroprotetora
pronunciada.
Através
de
uma
abordagem
quimiossistemática, Andrade et al. (2007; 2008) avaliaram o efeito do extrato
hidroalcoólico, frações e de 3,15-dioxo-21-α-hidroxifriedelano obtidos de Maytenus
robusta. O extrato foi testado frente a três diferentes modelos de indução de úlcera:
por etanol, por AINEs e por estresse. Em todos eles, M. robusta demonstrou
potencial gastroprotetor, além de ter sido capaz de diminuir o volume de secreção e
a acidez do suco gástrico. Ademais, as frações hexano, clorofórmio e acetato de
etila, bem como o terpeno isolado, foram capazes de prevenir a formação de úlcera
pelo modelo de etanol/HCl em camundongos.
Em outro estudo do grupo, foi evidenciado o potencial gastroprotetor de
Eugenia umbelliflora, sendo esta atividade justificada parcialmente pela presença de
diversos
terpenos
já
descritos
na
literatura
com
atividade
anti-úlcera
(BITTENCOURT et al., 2009). Zanatta et al. (2009) avaliaram a atividade protetora
sobre a mucosa gástrica do extrato alcaloídico de Galipea longiflora. Este foi capaz
de inibir significativamente as lesões provocadas por etanol, AINEs e estresse, além
de reduzir o volume e acidez de secreção gástrica. Verificando seu possível
mecanismo de ação, foi evidenciado que essa atividade parece estar relacionada à
via oxinitrérgica. Também, o alcalóide 2-fenilquinolina, isolado da planta, demonstrou
prevenir a úlcera induzida por etanol.
Santin et al. (2010), em um estudo de abordagem etnofarmacológica,
validaram o potencial gastroprotetor de Achyrocline satureoides. O extrato
hidroalcoólico da planta foi capaz de promover a proteção gástrica contra etanol e
AINEs, além de produzir um aumento na secreção de muco, essencial para a
proteção da parede gástrica. Também, Santin et al. (2011) demonstraram que o óleo
essencial de Syzygium aromaticum e o seu constituinte majoritário, eugenol, inibiram
a úlcera induzida por etanol e AINEs, estando este potencial gastroprotetor
relacionado ao aumento de produção de muco, não sendo dependente da via
oxinitrérgica nem dos grupamentos SHs.
41
3.7 Aspectos gerais relacionados à dor
No ano de 1996, a Associação Internacional para o Estudo da Dor definiu
como dor “uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada a dano
presente ou potencial, ou descrita como tal” (STEEDS, 2009). Assim, a dor pode ser
influenciada por diversos fatores intrínsecos à existência humana, tal como emoção
e cognição (FARQUHAR-SMITH, 2007).
Todavia, ao descrever dor como uma “experiência”, faz-se necessária uma
distinção em relação à nocicepção. Esta se refere ao processo neuronal envolvendo
a transdução e transmissão de um estímulo doloroso ao cérebro, enquanto que a
dor já envolve uma relação com diversos outros sistemas sinalizadores e
moduladores do SNC, além de abranger a percepção única de cada indivíduo ao
estímulo (STEEDS, 2009). Este é o motivo pelo qual, ao estudarmos a dor em
modelos animais, a referenciamos como nocicepção, visto que a percepção
emocional do animal ao estímulo doloroso ainda não pode ser medida ou
quantificada.
3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda
Quando o estímulo nociceptivo (seja ele mecânico, químico ou térmico) ativa
os nociceptores periféricos, o sinal é conduzido através dos neurônios primários até
o corno dorsal da medula espinhal. No corno dorsal, o neurônio primário realiza
sinapse com o neurônio secundário que, cruzando a medula espinhal, envia a
informação até o SNC. Suas aferências realizam uma segunda sinapse com
neurônios terciários no núcleo lateral e medial do tálamo. Por fim, estes neurônios
enviam sinais ao córtex somatossensorial primário e secundário, envolvidos com
localização, duração e intensidade do estímulo nociceptivo (FARQUHAR-SMITH,
2007; VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008).
Conforme mencionado, os estímulos nociceptivos podem ser diversos, porém,
dependendo do tipo, a ativação dos nociceptores se dará de forma distinta. O
estímulo mecânico é causado por um estiramento físico da terminação nervosa,
ativando canais transmembranares. Estes canais, geralmente fechados, quando
estimulados permitem o influxo de íons, resultando na despolarização da célula. Os
42
nociceptores térmicos respondem tanto ao estímulo frio (através de receptores
TRAAK, TRPM8 e TREK-1) quanto quente (através de receptores TRPV1). Já os
nociceptores químicos são ativados por íons e citocinas específicas, sendo estas
substâncias pertencentes ao meio ou liberadas por células danificadas. Elas incluem
íons (H+ e K+), espécies reativas de oxigênio, histamina, serotonina, cininas,
prostaglandinas,
substância
P,
dentre outras
(MEYR;
STEINBERG,
2008;
BASBAUM et al., 2009).
A ativação dos nociceptores por estes diferentes estímulos acarretará em
uma cascata de eventos. Moléculas inflamatórias pró-nociceptivas são liberadas na
periferia produzindo hiperalgesia (resposta aumentada a um estímulo já doloroso).
Estes mediadores estimulam os nociceptores diretamente ou os sensibilizam para
estímulos subsequentes, ambos por meio de receptores ligados a segundos
mensageiros (FAQUHAR-SMITH, 2007).
Os nociceptores, que também são responsáveis pela transmissão do sinal,
são divididos em três grupos: fibras Aβ, fibras Aδ e fibras C. As fibras Aβ estão
principalmente ligadas à condução de estímulos não-nociceptivos, como vibração e
movimento. São mais mielinizadas com uma velocidade de condução rápida (35-75
m/s), estando relacionadas à modulação da nocicepção, ativando interneurônios
inibitórios para a redução do estímulo nociceptivo. As fibras Aδ são relativamente
mielinizadas, com uma velocidade de condução menor que das fibras Aβ (5-30 m/s).
São divididas em mecanonociceptores (sensíveis a estímulos mecânicos intensos e
potencialmente danosos) e em polimodais (sensíveis a estímulos mecânicos,
térmicos e químicos), sendo responsáveis pela primeira sensação dolorosa. Por fim,
as fibras C são de pequeno calibre e amielinizadas, tendo uma velocidade de
condução bem inferior às demais fibras (0,5-2 m/s). Possuem caráter polimodal,
sendo responsáveis pela sensação dolorosa tardia (FARQUHAR-SMITH, 2007;
VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008).
Considerando a diferença de velocidade de transmissão do estímulo entre as
fibras Aδ e C, a nocicepção se apresenta de uma forma característica.
Primeiramente, as fibras Aδ transmitem rapidamente uma sensação nociceptiva
breve e aguda, percebida exatamente no ponto de estímulo. Em seguida, as fibras C
transmitem a sua informação com um pequeno retardo, resultando em uma
sensação dolorosa mais profunda e difusa (MARCHAND, 2008).
43
Em seguida, o sinal nociceptivo é transmitido pelas fibras Aδ e C até a medula
espinhal, onde ocorre a primeira sinapse com os neurônios secundários,
principalmente localizados nas regiões superficiais do corno dorsal (lâminas I e II) e
lâmina V. Estes neurônios podem ser divididos em neurônios nociceptores
específicos e em neurônios de faixa ampla (wide dynamic range – WDR). Os
primeiros, como pode ser deduzido pelo nome, respondem exclusivamente ao
estímulo nociceptivo. Já os do tipo WDR, respondem a estímulos que variam desde
inofensivos até nociceptivos, visto que recebem informação tanto das fibras Aδ e C
quanto da Aβ (MARCHAND, 2008).
Posteriormente, estes neurônios alcançam o tálamo por dois caminhos
principais: trato espinatalâmico e trato espinoreticular. No tálamo, ocorre a segunda
sinapse: os neurônios terciários do núcleo ventrobasal se conectam ao córtex
primário e secundário, responsáveis pela sensação nociceptiva, enquanto que os do
núcleo centromediano se conectam ao sistema límbico, responsável pelo caráter
emocional da dor (MARCHAND, 2008).
3.7.2 Cronificação da dor
A dor aguda geralmente é descrita como sendo uma resposta normal e
fisiológica a alguma forma de estímulo nociceptivo. Muitas vezes é, inclusive,
descrita como uma reação saudável do organismo, permitindo identificar um
desequilíbrio homeostátitco, indicando que alguma atitude deve ser tomada em
relação à fonte geradora do estímulo (MEYR; STEINBERG, 2008). Porém, apesar
de muitas vias de sinalização serem as mesmas já descritas para a dor aguda, a dor
crônica passa a ser considerada um processo patológico (MEYR; SAFFRAN, 2008).
A dor crônica pode ser definida como uma dor sem estímulo contínuo ou
patologia definida que dura mais que o período normal de cura e recuperação
(MEYR; SAFFRAN, 2008). Ela tipicamente é de origem inflamatória ou neuropática,
sendo caracterizada pelo aumento da percepção dolorosa a um estímulo nociceptivo
(hiperalgesia) e pela percepção alterada de estímulos táteis e térmicos (alodínia)
(VANDERAH, 2007).
A cronificação da dor é resultante de um processo de sensibilização periférica
e central, processo este possível devido ao caráter dinâmico da dor e das vias
44
envolvidas, através de mecanismos excitatórios e inibitórios (MARCHAND, 2008;
MEYR; SAFFRAN, 2008). A sensibilização periférica é resultante de mudanças no
ambiente químico dos nociceptores associadas à inflamação. Assim, com o dano
tecidual, há um acúmulo de fatores liberados tanto pelos próprios nociceptores
quanto por células não-neurais, tais como mastócitos, basófilos, plaquetas,
macrófagos, neutrófilos, células endoteliais, queratinócitos e fibroblastos. Dentre tais
fatores encontram-se neurotransmissores, peptídeos, eicosanóides, neurotrofinas,
citocinas, quimiocinas, proteases extracelulares e íons H+. Toda esta “sopa
inflamatória” ativa os nociceptores, sensibilizando-os (FARQUHAR-SMITH, 2007;
BASBAUM et al., 2009).
Já a sensibilização central está associada a uma alta frequência de
estimulação de fibras C, que pode acabar provocando um somatório de seus
potenciais, visto a condução relativamente lenta destas fibras. Isto gera um aumento
na percepção ao segundo estímulo, promovendo uma excitabilidade dos neurônios
secundários, podendo levar à sensibilização central. Além disto, a estimulação de
uma área maior irá ativar mais nociceptores que em uma área menor, resultando em
uma percepção dolorosa mais intensa. Ainda, a ativação intensiva das fibras C, tanto
por estímulo repetido, quanto por um estímulo tônico, leva à sensibilização central
mudando a resposta dos neurônios secundários. A ativação prolongada de
receptores NMDA leva à transcrição de genes de expressão imediata (c-fos, c-jun),
resultando na expressão aumentada destes receptores e sensibilizando as fibras
secundárias (MARCHAND, 2008) (Figura 5).
45
Figura 5: Esquema demonstrando a sensibilização dos neurônios secundários. Esta sensibilização
ocorre quando há um estímulo sustentado emitido pelos nociceptores periféricos. Na fase aguda há a
liberação de glutamato e substância P, ligando-se a receptores NMDA, AMPA e NK-1 (A). Todavia,
com uma estimulação sustentada, há uma expressão exagerada de receptores, especialmente NMDA
através de c-fos e c-jun, levando à sensibilização do neurônio secundário (B). (Fonte: adaptado de
MARCHAND, 2008).
46
Epidemiologicamente, a dor crônica causa um grande impacto à saúde dos
indivíduos, aos serviços de saúde e à sociedade de uma forma geral, podendo ser
considerada uma síndrome mundial (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007).
Tomando como exemplo a dor lombar, nos Estados Unidos, estima-se que ela seja
responsável pela perda de mil e quatrocentos dias de trabalho por mil habitantes por
ano. Na Europa, é a causa mais frequente de limitação em pessoas com menos de
45 anos e a segunda causa mais frequente de consulta médica (KRELING; CRUZ;
PIMENTA, 2006).
No Brasil, em estudo realizado por Kreling, Cruz e Pimenta (2006) com 505
servidores da Universidade Estadual de Londrina (Paraná), com idade variando
entre 22 e 69 anos, demonstrou uma prevalência de 61,4% de dor crônica. Também
observaram que houve uma maior frequência de dor crônica em mulheres e que a
maior prevalência de local da dor foi face e boca (26,7%), seguido de região lombar,
sacro e cóccix (19,4%).
O estudo citado corroborou com dados já consistentes na literatura, visto que
as mulheres apresentam maiores riscos de desenvolverem dor crônica ao longo de
sua vida. Além disto, estima-se que com o aumento da idade do indivíduo, há
também um aumento na prevalência de dor crônica, sendo este risco potencializado
pela predisposição genética. Dentre os fatores ambientais, pode-se destacar como
potencialmente predisponentes o estresse, a ansiedade, depressão, estilo de vida e
aspectos ocupacionais (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007; MARCHAND,
2008).
Conforme apontado recentemente por Grubb (2010), ainda há uma grande
carência no diagnóstico e métodos de prevenção da dor crônica. Tão preocupante
quanto, há uma falta de alternativas terapêuticas efetivas. Esta é uma informação
inquietante, visto que dados recentes evidenciam que 44% de indivíduos com dor
crônica em tratamento com opióides fizeram o uso de alguma terapia complementar
e alternativa nos últimos 12 meses, sendo que a prevalência de usuários deste tipo
de terapia varia, conforme o estudo, de 35 a 63%. Se considerarmos que
pouquíssimas terapias alternativas têm comprovação científica e são consideradas
efetivas, temos uma informação realmente alarmante (LEE; RAJA, 2010).
Porém, apesar da complexidade fisiopatológica da dor crônica, existem
diversos alvos potenciais para o desenvolvimento de novos fármacos, destacandose: agonistas dos receptores canabinóides, bloqueadores dos canais de K+ e dos
47
canais de Na+ e Ca2+ voltagem dependentes, inibidores do fator de crescimento
neural, de quimiocinas e de citocinas pró-inflamatórias, além de antagonistas dos
receptores de glutamato, neurocininas e cininas. Assim, estes dados reforçam a
necessidade de maiores investigações quanto a novos fármacos potencialmente
ativos (GRUBB, 2010).
3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo
O tratamento da dor, especialmente crônica, é bastante limitado, geralmente
envolvendo o uso de AINEs e, algumas vezes, de fármacos de ação central, como
opióides, anticonvulsivantes ou antidepressivos (MARCHAND, 2008). Porém, o uso
de tais medicamentos acarreta em uma série de efeitos adversos, além de sua baixa
eficácia, o que muitas vezes acaba por reduzir a adesão ao tratamento. Assim,
diversas plantas já foram estudadas como potenciais fontes de fitomedicamentos
para o tratamento da dor (CALIXTO et al., 2000).
O NIQFAR/UNIVALI já estudou uma série de plantas com potencial
antinociceptivo, tendo publicado diversos artigos científicos na área. Algumas
plantas merecem especial destaque, como Marrubium vulgare. Foi demonstrado que
o extrato hidroalcoólico desta planta promoveu efeito antinociceptivo em modelos de
dor aguda em camundongos, estando sua ação atrelada à inibição de diferentes
agentes pró-inflamatórios (DE SOUZA et al., 1998). Seu constituinte majoritário,
marrubiina, foi eficaz enquanto inibindo a nocicepção induzida por diferentes
agentes em modelos clássicos de dor em camundongos (DE JESUS et al., 2000)
De grande importância também foram os estudos realizados com espécies do
gênero Rubus. Niero et al. (2002) evidenciaram o potencial antinociceptivo do
extrato metanólico dos ramos e das raízes de R. imperialis, bem como das frações
obtidas por particionamento com hexano, clorofórmio e acetato de etila. Também
demonstraram o efeito do niga-ichigosídeo F1, isolado da fração acetato de etila das
partes aéreas de R. imperialis nos modelos de dor induzida por ácido acético e por
formalina (NIERO et al., 1999). Posteriormente, Ardenghi et al. (2006) verificaram
que
a
atividade
do
niga-ichigosídeo
F1
está
relacionada
aos
sistemas
dopaminérgico, colinérgico, glutamatérgico, taquicinérgico e oxinitrérgico. Em
estudos realizados com a espécie R. rosaefolius, pôde-se constatar a ação
48
antinociceptiva dose-dependente de seu extrato hidroalcoólico das partes aéreas,
bem como do composto isolado ácido 28-metoxitormentico (KANEGUSUKU et al.,
2000).
Outra planta que vem sendo estudada exaustivamente pelo grupo é a
Aleurites moluccana. Demonstrou-se que o extrato bruto e, especialmente, a fração
hexânica da planta apresentaram significativa atividade antinociceptiva no modelo
de contorções abdominais induzidas por ácido acético. A via de ação parece não
envolver o sistema opióide, tampouco a liberação de glicocorticóides endógenos
(MEYRE-SILVA, 2003). Um dos metabólitos isolados que explica, em parte, a ação
do extrato de A. moluccana é o flavonóide 2”-O-ramnosil-swertisina, que foi cerca de
16 vezes mais potente do que a aspirina no modelo de contorções abdominais
(MEYRE-SILVA, 1999). Estes promissores resultados viabilizaram uma parceria
entre a UNIVALI e a indústria Eurofarma, propiciando o desenvolvimento de um
novo fitoterápico de ação analgésica e anti-inflamatória de uso oral que já conta com
patente depositada nacional e internacionalmente (CECHINEL-FILHO, 2009).
Mais recentemente, De Souza et al. (2009) descreveram a atividade
antinociceptiva de filiceno, um triterpeno isolado das folhas de Adiantum cuneatum.
O composto foi capaz de inibir de forma dose-dependente as contorções abdominais
induzidas por ácido acético. Através do estudo de mecanismo de ação, foi
evidenciado que parece envolver uma interação entre os sistemas colinérgico,
dopaminérgico, glutamatérgico, GABAérgico e taquicinérgico. Também, Da Silva et
al. (2010) demonstraram a capacidade inibitória de contorções abdominais induzidas
por ácido acético e de nocicepção induzida por capsaicina e carragenina do
composto orientina, isolado de Piper solmsianum.
Hess et al. (2010) averiguaram o potencial antinociceptivo do ácido mirsinóico
B, isolado de espécies do gênero Rapanea, constatando que ele possui capacidade
inibitória sobre diferentes modelos de avaliação, envolvendo principalmente vias
relacionadas ao NO, aos α-adrenoceptores, bem como os sistemas serotoninérgico
e colinérgico. Quintão et al. (2010) demonstraram a atividade anti-hipernociceptiva
do óleo essencial obtido das folhas de Ugni myricoides. Sua atividade, bem como de
seu constituinte majoritário α-pireno, foi evidenciada em modelos de hipernocicepção
mecânica induzida por carragenina e CFA. Também, o óleo essencial inibiu a
hipernocicepção neuropática após constrição parcial do nervo ciático.
49
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais e equipamentos
Os seguintes solventes e drogas foram utilizados: hexano, clorofórmio,
acetato de etila, acetona, etanol, metanol, ácido clorídrico, ácido acético e hidróxido
de sódio (Dinâmica®); acetonitrila e metanol grau CLAE (Tedia®); piridina, metanol
e clorofórmio deuterados (CIL.Inc); éter etílico (Isofar®); indometacina, omeprazol,
cimetidina, carragenina, adjuvante completo de Freund, L-NAME, NEM e betanecol
(Sigma®); hidrado de cloral (Vetec®). Além disto, foram utilizadas placas de sílica
gel 60 F254 e sílica gel 60 (0,063-0,200 para cromatografia em coluna aberta e
0,040-0,063
para
cromatografia
flash)
fornecidas
pela
Merck®;
coluna
cromatográfica para CLAE C18 (Phenomenex®). Os principais equipamentos
utilizados foram os seguintes: espectrômetro de RMN AC-300 (Bruker®),
cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu®) e von Frey eletrônico (Insight®)
4.2 Análise fitoquímica
4.2.1 Material vegetal
Polygala cyparissias foi primeiramente coletada em novembro de 2007 na
Praia da Esplanada, em Santa Catarina, sendo esta utilizada para fitoquímica inicial
e ensaios gastroprotetores. Posteriormente foi coletada em março de 2009 e em
janeiro de 2010 na praia de Navegantes, também em Santa Catarina. Com o extrato
oriundo da coleta de 2009 foram realizados os ensaios anti-hipernociceptivos e os
experimentos por CLAE. Já o obtido da coleta de 2010 foi utilizado para isolar
novamente metabólitos já isolados, objetivando obter maior quantidade dos
mesmos. Um exemplar foi submetido para análise botânica no Herbário FLOR da
Universidade Federal de Santa Catarina, sendo este identificado pela Professora
Leila da Graça Amaral, sob o número de depósito 22.744. Após a secagem a
temperatura ambiente em sala com controle de umidade por um tempo médio de
três semanas, o material vegetal foi triturado e acondicionado para posterior
preparação dos extratos.
50
4.2.2 Obtenção dos extratos
O material obtido em 2007 (1,3 kg de material fresco) e, posteriormente, o de
2010 (1,55 kg de material seco), foram triturados e submetidos a um processo de
extração com acetona por sete dias, objetivando a extração direcionada das
xantonas já descritas (PINHEIRO et al., 1998), obtendo-se os extratos denominados
PCTL-1 (2007) e PCTL-15 (2010). Em seguida, os materiais vegetais foram
submetidos à extração com metanol pelo mesmo período, visando a extração dos
compostos mais polares não obtidos no primeiro processo. Por fim, os extratos
metanólicos foram particionados com clorofórmio para extrair compostos mais
apolares do extrato que não foram totalmente extraídos pela acetona, gerando as
frações clorofórmicas PCTL-2A e PCTL-16A e as frações metanólicas PCTL-2B e
PCTL-16B, de 2007 e 2010, respectivamente. Após filtragem dos extratos, o
solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão reduzida,
para obtenção dos respectivos extrato e frações. Já o material coletado em 2010
(13,57 g) sofreu o mesmo procedimento descrito acima, porém a extração foi
realizada direta e unicamente com metanol.
4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados
Em um primeiro momento, 23,5 g do extrato acetônico (PCTL-1) obtido da
planta coletada em 2007 foi submetido à cromatografia em coluna aberta (CC1),
utilizando 290g de sílica, coluna de Ø de 6 cm e frações coletadas com volume de
aproximadamente 20 ml. O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na
Tabela 1. Tal gradiente foi escolhido baseado na observação prévia do
comportamento do extrato frente a diferentes eluições do mesmo em cromatografia
em camada delgada (CCD). As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e,
posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 2.
51
Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico (23,5g) de P.
cyparissias.
Eluente
%
Volume eluído (ml)
Frações obtidas
Hexano/AcOEt
95:5
500
1-14
Hexano/AcOEt
90:10
500
15-55
Hexano/AcOEt
80:20
500
56-93
Hexano/AcOEt
50:50
250
94-118
AcOEt
100
250
119-141
AcOEt/MeOH
80:20
250
142-166
AcOEt/MeOH
50:50
150
167-181
MeOH
100
200
182-193
Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1.
Frações
Rendimento (mg)
Rendimento (%)
PCTL-3A (1-16)
212
0,90
PCTL-3B (17-54)
205
0,87
PCTL-3C (55-78)
189
0,80
PCTL-3D (79-95)
192
0,81
PCTL-3E (96-139)
242
1,03
PCTL-3F (140-158)
513
2,18
PCTL-3G (159-191)
5910
25,15
As frações estudadas, considerando seu perfil cromatográfico em CCD,
foram: PCTL-3C, -3D e -3E. A fração PCTL-3C foi submetida à cromatografia em
coluna flash (CC flash 1) (Ø = 2 cm) com 19 g de sílica. A eluição foi realizada de
modo isocrático com hexano/AcOEt (80:20), levando à obtenção de 60 frações de
aproximadamente 8 ml cada, sendo que a fração PCTL-4A (61 mg) apresentou perfil
cromatográfico promissor em CCD. A esta fração foi adicionado metanol e levado a
aquecimento brando. Em seguida, após solubilização do material obtido na fração,
este foi levado à refrigeração, promovendo a recristalização de um material amorfo e
de coloração branca. O material foi filtrado e o retido (PCTL-5) (32,3 mg) demonstrou
apenas uma banda quando eluído com diferentes fases móveis em CCDs e
reveladas com anisaldeído sulfúrico, sendo denominado como PC1.
52
A fração PCTL-3D foi cromatograda em CC flash (CC flash 2) (Ø = 2 cm), com
20 g de sílica e eluída isocraticamente com hexano/AcOEt (60:40). Foram obtidas 18
frações de aproximadamente 8 ml cada, sendo que PCTL-6B (18 mg) formou cristais
de coloração amarelada e, quando eluído em CCDs com diferentes fases móveis,
obteve-se apenas uma banda quando reveladas com cloreto férrico ou anisaldeído
sulfúrico. Foi denominado PC2 e enviado para elucidação estrutural por RMN.
A fração PCTL-3E foi submetida à cromatografia flash (CC flash 3) (Ø = 2
cm), com 22 g de sílica. A eluição foi isocrática com hexano/AcOEt (60:40), obtendose 66 frações de aproximadamente 8 ml cada. A fração PCTL-7B (9,5 mg) formou
cristais amarelados e, em CCDs eluída com diferentes fase móveis e reveladas com
cloreto férrico ou anisaldeído sulfúrico, apresentou apenas uma banda, denominado
como PC3. O material foi encaminhado para RMN para elucidação estrutural.
Todas as CC flash que seguem foram eluídas com hexano/AcOEt (60:40). A
fração PCTL-7C (73 mg) foi cromatografada novamente (CC flash 4) (Ø = 1 cm; 5,5
g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se 66 frações. PCTL-8A (54 mg) foi novamente
cromatografada (CC flash 5) (Ø = 1 cm; 6,4 g de sílica; frações de 5 ml), sendo
isolado mais 3,5 mg do composto PC3 (PCTL-9A). A fração PCTL-9B (23 mg) foi
recromatografada (CC flash 6) (Ø = 1 cm; 7,1 g de sílica; frações de 5 ml), obtendose a fração PCTL-10A (1,2 mg), identificada como PC3, PCTL-10C (5,7 mg),
identificada como PC4 e PCTL-10B (16 mg), uma mistura de ambos. Assim, PCTL10B foi novamente submetida à CC flash (CC flash 7) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica;
frações de 5 ml), obtendo-se fração PCTL-11A (3,2 mg) como PC3, PCTL-11B (5
mg) como mistura de PC3 e 4 e PCTL-11C (6,1 mg) como PC4.
A fração PCTL-9C (15 mg) da CC flash 5 foi recromatografada (CC flash 8) (Ø
= 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se as frações PCTL-12A (2,1 mg),
identificada como PC3, PCTL-12B (3 mg), como mistura de PC3 e 4 e PCTL-12C
(5,1 mg) como PC4. A fração PCTL-7D (18 mg) da CC flash 3 foi submetida a nova
cromatografia (CC flash 9) (Ø = 1 cm; 8,6g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se a
fração PCTL-13B (0,9 mg) de PC4 e a fração PCTL-13C (7 mg), como mistura de
PC3 e 4. Esta foi cromatografada (CC flash 10) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de
5 ml), obtendo-se as frações PCTL-14A (1,0 mg), identificada como PC3, PCTL-14B
(0,4 mg), uma mistura de PC3 e 4 e PCTL-14C (0,1 mg) como PC4. Na figura 6
encontra-se um organograma da sequência de isolamento.
53
CC1
CC flash 1 CC flash 2
Recristalização
CC flash 3
CC flash 9
CC flash 4
CC flash 5
CC flash 6
CC flash 10
CC flash 8
CC flash 7
Figur
54
a 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados.
55
Posteriormente foram realizados novos procedimentos de purificação com
parte do extrato obtido a partir da coleta de janeiro de 2010. Todavia, visando a
obtenção direcionada dos compostos já isolados (PC1-4), adotou-se nova
metodologia para o isolamento destes. Assim, 20 g do extrato acetônico (PCTL-15)
foi submetido à coluna aberta (CC2), utilizando 397 g de sílica, coluna de Ø de 6 cm
e frações coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando
observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado
apresenta-se descrito na Tabela 3.
Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias.
Eluente
%
Volume eluído (ml)
Frações obtidas
Hexano/Acetona
85:15
1200
1-4
Hexano/Acetona
75:25
1200
5-8
Hexano/Acetona
65:35
800
9-11
Hexano/Acetona
50:50
800
12-15
Acetona
100
800
16-19
MeOH
100
500
20
As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente,
agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 4.
Tabela 4: Junção das frações obtidas na CC2.
Frações
Rendimento (mg)
Rendimento (%)
PCTL-17A (1-2)
2450
12,25
PCTL-17B (3)
313
1,56
PCTL-17C (4-5)
421
2,10
PCTL-17D (6-7)
1523
7,62
PCTL-17E (8-9)
170
0,85
PCTL-17F (8’-9’+10-11)
958
4,79
PCTL-17G (12-13)
342
1,71
PCTL-17H (14-20)
7999
40,00
56
As frações 8 e 9 foram reunidas e lavadas repetidas vezes com clorofórmio,
originando a fração 8’-9’ (solúvel em clorofórmio) que foi reunida às frações 10 e 11
por semelhança química. Objetivando o reisolamento das xantonas PC2-4, optou-se
por seguir a purificação com a fração PCTL-17E, visto que esta se encontrava
enriquecida nas mesmas. Assim, realizou-se cromatografia flash (CC flash 11) (Ø =
2 cm; 21 g de sílica; 3 ml por fração), eluída com DCM/AcOEt (80:20), levando a
obtenção de 80 frações.
Estas foram reunidas por semelhança química conforme a
tabela 5.
Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11.
Frações
Rendimento (mg)
Rendimento (%)
PCTL-18A (1-22)
18
0,09
PCTL-18B (23-31)
45
0,22
PCTL-18C (32-40)
35
0,17
As frações PCTL-18B e -18C foram submetidas, separadamente, a repetidas
CCDs preparativas (CCDPs). Em cada placa (20 x 20 cm) não foram aplicados mais
que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de 16 cm, com fase móvel
constituída de benzeno/AcOEt (8:2). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando
uma melhor separação dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se
22,6 mg de PC3, além de ter sido possível isolar outro composto ainda não isolado
até então, denominado PC5 (12,3 mg). Um organograma para o adequado
entendimento encontra-se ilustrado na figura 7.
57
CC2
CC flash 11
CCDPs
Figur
a 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados.
58
Além do extrato acetônico, a fração metanólica (14,2 g) obtida da coleta de
2007 (PCTL-2B) também foi estudada fitoquimicamente. Esta foi submetida à
cromatografia aberta (CC3), utilizando 246 g de sílica e uma coluna de Ø = 5 cm. As
frações foram coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando
observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado
apresenta-se descrito na Tabela 6. Da mesma forma que na CC1, o gradiente foi
escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a
diferentes eluições do mesmo em CCD.
Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P. cyparissias.
Eluente
%
Volume eluído (ml)
Frações obtidas
DCM
100
500
1
DCM/MeOH
95:05
1300
2-9
DCM/MeOH
90:10
400
10
DCM/MeOH
80:20
700
11-13
DCM/MeOH
50:50
800
14-16
MeOH
100
400
17
As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente,
agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 7.
Tabela 7: Junção das frações obtidas na CC3.
Frações
Rendimento (mg)
Rendimento (%)
PCTL-20A (1-3)
93
0,46
PCTL-20B (4-9)
407
2,04
PCTL-20C (10-12)
524
2,62
PCTL-20D (13-15)
4429
22,14
PCTL-20E (16)
3034
15,17
PCTL-20F (17)
1253
6,26
Considerando os perfis cromatográficos e os rendimentos, a fração PCTL-20D
foi recromatografada em coluna aberta (CC4) (226 g de sílica; Ø = 4,5 cm; 10 ml por
fração). O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 8.
59
Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3.
Eluente
%
Volume eluído (ml)
Frações obtidas
DCM/AcOEt/MeOH 60:20:20
800
1-45
DCM/AcOEt/MeOH 50:30:20
400
46-77
DCM/AcOEt/MeOH 30:40:30
300
78-100
MeOH
300
101
100
As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente,
agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 9.
Tabela 9: Junção das frações obtidas na CC4.
Frações
Rendimento (mg)
Rendimento (%)
PCTL-21A (1-7)
32
0,22
PCTL-21B (8-26)
38
0,27
PCTL-21C (27-82)
577
4,06
PCTL-21D (83-100)
734
5,17
PCTL-21E (101)
1012
7,13
A fração PCTL-21B foi submetida a repetidas CCDPs. Em cada placa (20 x 20
cm) não foram aplicados mais que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de
16 cm, com fase móvel constituída de AcOEt/Acetona/MeOH/H2O/MeCOOH
(25:8:3:1:1). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando uma melhor separação
dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se 16,8 mg de PC6. Um
organograma para o adequado entendimento encontra-se ilustrado na figura 8.
60
CC3
CC4
CCDPs
Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados.
61
4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias
Para a obtenção de perfil cromatográfico do extrato metanólico de P.
cyparissias foi utilizada CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos. Este método
foi escolhido pelas características químicas dos compostos obtidos, especialmente
das xantonas. Estes metabólitos são caracterizados pela presença de quatro bandas
de intensidade decrescente de absorção em espectros de ultravioleta. As bandas
situam-se nos respectivos comprimentos de onda: 225 a 245 nm (banda I), 245-270
nm (banda II), 300 a 345 nm (banda III) e 335 a 410 (banda IV) (KUSTER; ROCHA,
2007).
4.2.4.1 Preparo das amostras
Foram pesados exatamente cerca de 20 mg de extrato metanólico de P.
cyparissias (coleta de 2009), sendo este solubilizado por sonicação em metanol e o
volume ajustado em balão volumétrico para 10 ml. A solução foi filtrada em filtro de
celulose regenerada (Ø do poro = 0,45 µm), sendo posteriormente disponibilizada
para as análises. Já como padrão, foi eleita a xantona PC3 visto a quantidade de
material disponível. Para verificar seu grau de pureza, foi preparada uma solução
0,55 mg/ml, solubilizada em uma mistura de ACN/MeOH (1:1), com auxílio de
sonicação. Esta solução também foi filtrada conforme já descrito e analizada.
4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico
Objetivando uma adequada separação dos compostos presentes no extrato
de P. cyparissias, vários métodos cromatográficos foram testados. Em todos eles a
temperatura do forno foi de 30 °C, o volume de injeção de 20 µl, o monitoramento
em 254 nm e a coluna utilizada foi uma C18 (250 mm). O único método isocrático
utilizado (método 3) empregou como fase móvel uma mistura de ACN, MeOH e água
acidificada (TFA 0,0125%, pH = 2,9) em uma proporção de 10:10:80. Os métodos
com gradiente encontram-se descritos nas Tabelas 10 a 16.
62
Tabela 10: Descrição do método 1. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
0
95
5
60
0
100
Tabela 11: Descrição do método 2. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
0
80
20
5
70
30
6
60
40
60
0
100
65
0
100
70
80
20
Tabela 12: Descrição do método 4. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
0
98
2
10
80
20
11
70
30
31
50
50
41
30
70
46
30
70
48
98
2
53
98
2
Tabela 13: Descrição do método 5. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
0
98
2
60
0
100
63
Tabela 14: Descrição do método 6. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de
1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0
97
1
2
60
0
30
70
Para os dois últimos métodos empregados, optou-se por acidificar a água
com ácido acético a uma concentração de 2%, a fim de verificar o potencial impacto
da mudança do agente acidificante sobre o perfil cromatográfico. Apesar desta
mudança, o pH foi mantido (pH = 2,9).
Tabela 15: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo
de 1 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0
97
1
2
5
97
1
2
10
80
10
10
15
80
10
10
18
70
15
15
23
70
15
15
33
60
20
20
36
60
20
20
41
50
20
30
46
50
20
30
51
30
20
50
54
30
20
50
59
20
25
55
62
20
25
55
67
10
30
60
70
10
30
60
75
0
30
70
80
0
30
70
85
97
1
2
64
O método 8, descrito na tabela 16, foi considerado adequado para obtenção
do perfil cromatográfico do extrato metanólico. Levando isto em consideração, o
padrão (PC3) também foi analisado conforme o mesmo método.
Tabela 16: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo
de 0,8 ml/min.
Tempo (min)
A (%)
B (%)
C (%)
0
90
5
5
5
80
10
10
7
80
10
10
10
75
10
15
15
75
10
15
20
70
15
15
25
70
15
15
30
65
15
20
35
65
15
20
40
60
20
20
45
60
20
20
47
55
20
25
50
55
20
25
55
50
20
30
60
40
20
40
65
30
20
50
70
30
20
50
75
20
25
55
80
10
35
55
85
0
60
40
90
90
5
5
65
4.3 Testes farmacológicos
4.3.1 Animais
Nos testes farmacológicos foram utilizados camundongos Swiss machos e
fêmeos, pesando entre 25-40 g provenientes do Biotério Central da UNIVALI. Os
animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura
mantida a aproximadamente 25 °C e ciclo claro/escuro controlado, com ração e
água ad libitum. Para os experimentos de atividade gastroprotetora, os animais
foram mantidos em jejum por doze horas antes da realização dos experimentos,
sendo adicionada à caixa uma grade para inibir a coprofagia e tiveram livre acesso à
água. Os protocolos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em
Pesquisa da UNIVALI, sendo aprovado sob o número 414/09 (Anexo C).
4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora
Na avaliação da atividade anti-úlcera foram realizados experimentos
embasados nos fatores etiológicos da doença no homem, como o aumento da
acidez e da secreção do suco gástrico, uso de AINEs e abuso de álcool etílico. Cada
experimento constituiu-se dos grupos testes, controle positivo e negativo (veículo),
dependendo da necessidade de cada modelo. Todos os experimentos foram
realizados com o auxílio da equipe do Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade.
4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl
A metodologia que foi utilizada foi descrita por Mizui e Doteuchi (1983), com
modificações. Após jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em
diferentes grupos (n=6). O controle positivo foi tratado com omeprazol 30 mg/kg
(0,08 mmol/kg), o controle negativo recebeu o veículo e os grupos tratados
receberam o extrato/frações nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg. Quando utilizado os
compostos isolados, as doses foram de 0,12 mmol/kg (PC1), 0,19 mmol/kg (PC2) e
0,18 mmol/kg (PC3).
Transcorrido uma hora e meia, foram administrados aos animais 0,5 ml de
solução etanol/HCl (60%/0,3 M) (agente lesivo) por via oral e, após mais uma hora e
66
meia, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os
estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e, após serem
esticados, foram colocados entre placas de vidro para que as imagens pudessem
ser captadas através de scanner e analisadas pelo software EARP, a fim de
determinar-se o número de lesões e seus tamanhos. Posteriormente, realizou-se a
determinação da área total de lesão (mm²), o percentual de área lesada, o índice de
gastroproteção (IG) em porcentagem e o índice de lesões ulcerativas (ULI) calculado
através da severidade das lesões da mucosa gástrica. Para tanto, as úlceras foram
classificadas em tipo 1 (área de úlcera menor que 1mm²), tipo 2 (área de úlcera
entre 1 e 3 mm²) e tipo 3 (área de úlcera maior que 3 mm²). Em seguida, o ULI foi
calculado com base na seguinte fórmula:
ULI = 1 x (T1) + 2 x (T2) + 3 x (T3)
onde T1, T2 e T3 são, respectivamente, o número de úlceras do tipo 1, do tipo 2 e
do tipo 3. O IG foi calculado através da seguinte fórmula:
IG = 100 – (ULItratado x 100 / ULIcontrole)
4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide
associada à estimulação parassimpaticomimética
A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Rainsford (1980).
Após o jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em diferentes grupos
(n=6). O controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo
com o veículo e os grupos tratados com o extrato/fração nas doses de 50, 125 e 250
mg/kg. Após uma hora e meia da administração, os animais receberam 100 mg/kg
de indometacina por via oral, associada à betanecol via intraperitonial na dose de 5
mg/kg em solução fisiológica.
Após cinco horas da administração de indometacina os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo
da curvatura maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre
placas de vidro para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e
analisadas pelo software EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e seus
67
tamanhos. Posteriormente realizou-se a determinação da área total de lesão,
percentual de área lesada, IG e ULI, conforme descrito anteriormente.
4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético
A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Takagi, Okabe e
Saziki (1969). Antes da indução da úlcera, os animais sofreram uma adaptação
contra o estresse causado durante a administração das doses, sendo necessária a
restrição alimentar por 2 horas diárias (9:00 às 10:00 e 17:00 às 18:00). O acesso à
água foi mantido livre e duas vezes ao dia (10:30 e 18:30) foi administrado 0,5 ml de
água, por três dias.
Passado este período, os animais foram deixados em jejum de 12 horas nas
condições já descritas. Após anestesia com tiopental sódico, foram e submetidos a
uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide. Com a exposição do
estômago, foi injetado na camada subserosa da parede externa do órgão 50 µl de
solução de ácido acético 20% na face posterior e 50 µl de solução salina na face
anterior.
O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do
líquido injetado. O estômago foi lavado com salina e a parede abdominal suturada.
Após a recuperação dos animais, iniciou-se o tratamento (2x/dia). Por 7 dias o
controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo com o
veículo e os grupos tratados com o extrato/fração na dose de 125 mg/kg.
Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, e os estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura
maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre placas de vidro
para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e analisadas pelo
software EARP, a fim de determinar-se se houve regressão da lesão nos
tratamentos quando comparados com o controle, onde realizou-se a determinação
da área total de lesão e o percentual de área lesada.
68
4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor
4.3.3.1 Participação do óxido nítrico
Para a realização deste experimento, foi utilizado o método descrito por
Arrieta et al. (2003), com algumas modificações. Os camundongos foram separados
em oito grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com LNAME (N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase, na
dose de 70 mg/kg, i.p. e os quatro grupos restantes foram pré-tratados com salina,
i.p. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se o teste de indução de úlcera
por etanol, utilizando como tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de
P. cyparissiass, na dose de 125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg)
e controle negativo (veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram
sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura,
esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o % de área lesada.
4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas
Para a avaliação dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção foi adotado o
modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Os animais foram separados em oito
grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com NEM (Netilmaleimida), um quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg, i.p. e os
quatro grupos restante foram pré-tratados com salina, i.p. Após 30 minutos dos prétratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol, utilizando como
tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias, na dose de
125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg) e controle negativo
(veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram sacrificados e os
estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de
Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de
imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada.
69
4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory
4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory
A cepa de Helicobater pilory ATCC 43504 utilizada foi cedida pelo laboratório
de micro-organismos de referência da Fiocruz-RJ. Foi mantida congelada a – 70⁰C
no laboratório de imunologia da Universidade Regional de Blumenau. Para ativação,
foi semeada em caldo Brucella e incubada a 35⁰C por 24-48 horas. Após esse
período, foi inoculada em ágar Brucella acrescido de 10% de sangue de carneiro e
incubada 48-72 horas a 35⁰C em condições de microaerofilia (85% N2, 10% CO2 e
5% O2) e alta umidade. A identificação bacteriana foi realizada através da morfologia
característica na coloração de Gram e testes bioquímicos de catalase, oxidase e
urease positivos.
4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
O teste foi realizado pelo aluno de mestrado Alessandro Conrado de Oliveira
Silveira, sob a orientação do Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz. A CIM foi determinada
pelo método de diluição em ágar sólido, de acordo com as recomendações do
Clinical Laboratory Standards Institute (2007). A partir de soluções estoque dos
extratos de 40 mg/ml, foram realizadas diluições seriadas. Em vidros individuais, 50
70
µl de cada diluição foi adicionado à 950 µl de ágar Brucella acrescido de 10 % de
sangue carneiro, líquido a 45-50⁰C, atingindo concentrações de 2.000, 1.000, 500,
250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 µg/ml. O inóculo bacteriano foi preparado baseado na
escala turbidimétrica 0,5 de MacFarland. Após solidificação do meio de cultura, foi
semeado 1 µl da suspensão bacteriana em cada vidro com os extratos diluídos em
ágar. Foram incubados em condições ideais de microaerofilia e umidade, a 35⁰C por
48-72 horas. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato capaz de
inibir completamente o crescimento bacteriano. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata.
4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva
4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e monofilamento
de Von Frey
Todos os experimentos foram realizados pela aluna de mestrado Nicole
Anzanello Meira, sob a orientação da Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão. Para
avaliar a hipernocicepção mecânica, os animais submetidos aos modelos de
hipernocicepção mecânica induzida por diferentes agentes ou por procedimento
cirúrgico
foram
colocados
individualmente
em
compartimentos
de
acrílico
transparentes (9 x 7 x 11 cm), localizados em uma plataforma de arame elevada
para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os animais foram
aclimatados por, pelo menos, 1 hora antes dos testes comportamentais para
determinar o limiar mecânico basal. Após determinado esse parâmetro, os animais
71
foram tratados com o extrato, compostos isolados ou veículo e posteriormente,
receberam uma injeção intraplantar do agente irritante.
A hipernocicepção mecânica dos animais que receberam carragenina por via
i.pl. foi avaliada através de um anestesiômetro eletrônico, que consiste em um
transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em
gramas. O contato do transdutor de pressão à pata dos animais é realizado por meio
de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 mm de diâmetro adaptada a
este, que entre as malhas da rede de arame, é exercida uma pressão linearmente
crescente no centro da planta da pata do camundongo até que o animal produza
uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada. Os
estímulos são repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar três
medidas similares com uma clara resposta de “flinch” após a retirada da pata. A
intensidade de hipernocicepção é quantificada como a variação na pressão obtida
subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) observada antes
do procedimento experimental (limiar basal dos animais) da média de três valores
em gramas (força) após a administração do agente em diferentes intervalos de
tempo (CUNHA et al., 2004).
Nos demais modelo, foi utilizado o monofilamento de von Frey 0,6 g, que
consiste em um filamento de nylon de 0.6 mm de diâmetro. Com este aparato foi
exercida uma pressão no centro da planta da pata do camundongo até que o animal
produzisse o “flinch” da pata estimulada. Os estímulos foram repetidos dez vezes
com a finalidade de se obter a freqüência de resposta em porcentagem de cada
animal.
4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina
A indução da hipernocicepção de origem inflamatória em camundongos foi
realizada através da injeção i.pl. de 50 µl de carragenina (300 µg/pata) na superfície
plantar da pata direita traseira. De acordo com dados descritos na literatura, esta
dose é capaz de produzir edema, hipernocicepção e aumento significativo do
tamanho
da
pata
injetada,
porém
os
animais
continuam
apresentando
comportamento normal (DE CAMPOS et al., 1996; BORTOLANZA et al., 2002;
QUINTÃO et al., 2005). Inicialmente, os animais foram pré-tratados com o extrato
72
metanólico de P. cyparissias (3, 10 e 30 mg/kg, i.p.) ou compostos obtidos, nas
doses de 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg para PC1, 0,04, 0,12 e 0,39 µmol/kg para PC2,
0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg para PC3 e 0,03, 0,09 e 0,31 µmol/kg para PC4, todos via
i.p.. Após 30 minutos, os animais foram levemente sedados com éter para receber
uma injeção i.pl. de carragenina, sendo posteriormente avaliados quanto à
hipernocicepção mecânica através von Frey eletrônico, nos intervalos de 1, 3, 4, 6,
24 e 48 horas após a injeção de carragenina.
4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS)
Na indução da hipernocicepção mecânica por LPS bacteriano, a medida basal
de todos os camundongos foi avaliada e em seguida, os animais foram pré-tratados
com o extrato metanólico de P. cyparissias nas mesmas doses já citadas. Após 30
minutos, os animais foram levemente anestesiados e receberam uma injeção
intraplantar de LPS (100 ng/pata, 20 µl) na pata direita traseira. Posteriormente, foi
avaliada a hipernocicepção mecânica através do monofilamento de von Frey nos
intervalos de tempo de 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas (SAFIEH-GARABEDIAN et al., 2000)
após a injeção do agente irritante.
4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freund
(CFA)
Para induzir a resposta inflamatória persistente, os animais receberam injeção
i.pl. de 20µl de CFA (1 mg/ml de bacilo de Mycobacterium tuberculosis inativado por
calor; cada mililitro de veículo contém 0,85ml de óleo de parafina + 0,15ml de
monooleato de manida) na superfície plantar da pata direita traseira, sendo que a
hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey.
Para avaliar o efeito preventivo sobre a hipernocicepção mecânica, os
animais foram previamente tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias nas
doses de 0,3, 1 e 3 mg/kg. Após 30 minutos, os animais receberam uma injeção i.pl.
de CFA, e a hipernocicepção mecânica foi avaliada em diferentes intervalos de
tempos (1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas) com o monofilamento de Von Frey (CAO et al.,
1998).
73
4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E2 (PGE2)
Na indução da hipernocicepção mecânica pela PGE2, a medida basal dos
animais foi previamente avaliada através do von Frey eletrônico antes de serem prétratados. Os animais do grupo tratado receberam o extrato metanólico de P.
cyparissias nas mesmas doses já citadas e, após 30 minutos, os animais foram
anestesiados levemente com éter para receber injeção intraplantar de 20 µl de PGE2
(0,1 nmol/pata) na pata direita traseira. Em seguida, a hipernocicepção mecânica foi
avaliada através do monofilamento de von Frey, nos intervalos de tempo de 1, 2, 4 e
6 horas após a injeção i.pl. de PGE2 (INCEOGLU et al., 2006).
4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina
Primeiramente foi avaliada a medida basal dos animais através do von Frey
eletrônico antes de serem tratados. Nos camundongos dos grupos tratados foi
administrado o extrato metanólico de P. cyparissias nas doses já citadas e, 30
minutos após, os animais foram levemente anestesiados e receberam injeção
intraplantar de 20 µl de epinefrina (100 ng/pata) na pata direita traseira. Em seguida,
a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey nos
intervalos de tempo de 10, 30 minutos, 1, 2, 4 e 6 horas após a injeção de epinefrina
(KHASAR et al., 2005).
4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo ciático
(CPNC)
Antes da cirurgia, foi avaliada a medida basal do limiar dos animais para
posterior
comparação
e
confirmação
do
desenvolvimento
da
neuropatia.
Inicialmente, os camundongos foram anestesiados com hidrato de cloral 7% (8
ml/kg, i.p.) e a CPNC foi realizada amarrando 1/3 a ½ da porção dorsal do nervo
ciático com fio de seda 8.0. Um grupo de animais teve o nervo ciático exposto, no
74
entanto não foi efetuada a amarração (grupo falso-operado). No 7º dia pósoperatório os animais foram avaliados quanto à hipernocicepção mecânica através
do monofilamento de von Frey. Depois de confirmado o desenvolvimento de
neuropatia, foi iniciado o tratamento com o extrato metanólico de P. cyparissias nas
doses de 3 e 10 mg/kg. O tratamento foi realizado 2 vezes ao dia (no início da
manhã e no final da tarde) por 4 dias consecutivos, e a hipernocicepção mecânica
foi avaliada 6 horas após a primeira administração do dia (SELTZER; DUBNER;
SHIR, 1990; MALMBERG; BASBAUM, 1998).
4.3.6 Análise estatística
Os resultados estão apresentados como a média ± erro padrão da média
(EPM, 95%). Para os dados referentes à gastroproteção, utilizou-se a análise de
variância (ANOVA) com pós-teste de Dunnett ou de Tukey. Para os dados referentes
à atividade anti-hipernociceptiva, as porcentagens de inibição são citadas como a
média ± EPM da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas obtidas
para cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. A
análise estatística dos dados foi realizada por meio de ANOVA de duas vias,
seguido do teste de Bonferroni. Para ambas as atividades, valores de p menores
que 0,05 (p<0,05) são considerados como valores significantes. Todas as análises
citadas acima foram realizadas utilizando o programa Graphpad PRISM 4.0® ou
Graphpad Instat®.
75
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise fitoquímica
5.1.1 Extratos obtidos
Os rendimentos dos extratos e frações encontram-se na Tabela 17.
Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias.
Material
Coleta
Solvente
Massa (g)
Rendimento (g) Rendimento (%)
Extrato
2007
Acetona
1300*
43,50
3,35
Fração
2007
Clorofórmio
1300*
4,70
0,36
Fração
2007
Metanol
1300*
24,30
1,87
Extrato
2009
Metanol
13,57
3,98
29,33
Extrato
2010
Acetona
1550
83,81
5,41
Fração
2010
Clorofórmio
1550
15,04
0,97
Fração
2010
Metanol
1550
46,66
3,01
76
* Material fresco
Através da comparação por CCD dos extratos e frações obtidos em 2007 e
em 2010, observou-se que não houve variação dos seus perfis químicos qualitativos.
5.1.2 Identificação dos compostos obtidos
5.1.2.1 PC1
Obteve-se 32,3 mg do composto PC1. Este foi identificado através de co-CCD
com padrão conhecido, RMN ¹H (figuras 10-12) e RMN ¹³C (figura 13). Assim,
considerando todas as informações obtidas, foi confirmado a estrutura de (24 S)-24etil-5α-colesta-7,E-22-dien-3β-ol (PM = 412), também conhecido como espinasterol
(Figura 9).
21
18
12
11
19
1
2
9
10
H
3
HO
4
5
H
20
17
13
8
23
16
14
H
29
28
22
24
25
26
27
15
7
6
Figura 9: Espinasterol.
Os simpletos em 0,55 e 0,80 ppm correspondem aos hidrogênios das metilas
C-18 e C-19, respectivamente. Os sinais dos prótons das metilas C-21, C-26, C-27 e
C-29 encontram-se centrados em: 1,03 ppm (d, J = 6Hz), 0,82 ppm (d, J = 6 Hz),
0,85 ppm (d, J = 6Hz) e 0,80 ppm (dd, J indeterminado). Os hidrogênios olefínicos
de C-22 e C-23 foram detectados pelos dupletos de dupletos centrados em 5,16
ppm (J = 15 e 9 Hz) e em 5,02 (J = 15 e 9 Hz). Já o próton de C-7 foi identificado
pelo sinal em 5,15 ppm. Por fim, o tripleto de tripleto centrado em 3,60 ppm refere-se
ao hidrogênio de C-3.
77
Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado.
Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado expandido na região de
0,70 a 2,10 ppm.
78
Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada expandido na região de
3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm.
79
Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl3.
Os sinais referentes aos carbonos estão apresentados na tabela 18, bem
como os de hidrogênio, sendo esses comparados à literatura (GAZONI, 2009).
Tabela 18: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC1 em
comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em CDCl3.
80
RMN ¹H
RMN ¹H
RMN ¹³C
RMN ¹³C
δ (ppm); mult; J (Hz)
δ (ppm); mult; J (Hz)
δ (ppm)
δ (ppm)
PC1
Literatura
PC 1
Literatura
1
-
-
37,2
37,1
2
3,60; tt
3,61; tt
31,5
31,5
3
-
-
71,1
71,0
4
-
-
38,0
38,0
5
-
-
40,3
40,2
6
-
-
29,7
29,6
7
5,15
5,16
117,5
117,4
8
-
-
139,6
139,5
9
-
-
49,5
49,4
10
-
-
34,3
34,2
11
-
-
21,6
21,5
12
-
-
39,5
39,4
13
-
-
43,3
43,3
14
-
-
55,2
55,1
15
-
-
23,0
23,0
16
-
-
28,5
28,5
17
-
-
55,9
55,8
18
0,55
0,55
12,1
12,0
19
0,80
0,80
13,1
13,0
20
-
-
40,8
40,8
21
1,03; d; 6
1,03; d; 6,5
21,4
21,4
22
5,16; dd; 15,0/9,0
5,16; dd; 15,5/8,5
138,2
138,2
23
5,02; dd; 15,0/9,0
5,03; dd; 15,5/8,5
129,5
129,4
24
-
-
51,3
51,2
25
-
-
31,9
31,9
26
0,82; d; 6,0
0,80; d; 6,0
19,0
19,0
27
0,85; d; 6,0
0,85; d; 6,5
21,1
21,1
28
-
-
25,4
25,4
29
0,80; t; indeterminado
0,81; t; 7,5
12,2
12,2
Carbono
81
Diversos estudos farmacológicos já foram realizados com o espinasterol.
Através de um estudo bioguiado, Villaseñor et al. (1996) verificaram a atividade
antigenotóxica do esteróide frente ao teste do micronúcleo e, posteriormente, sua
atividade antimutagênica, visto que foi capaz de diminuir a incidência de tumor de
pele em ratos na ordem de 55,6 % (VILLASEÑOR; DOMINGO, 2000). Jeon et al.
(2005) demonstraram a eficácia do espinasterol contra células cancerosas de seio e
ovário. Mais recentemente, Ravikumar et al. (2010) evidenciaram que o esterol foi
capaz de inibir a proliferação celular contra linhagem CACO-2, além de proteger
contra a mutação induzida por metil metano sulfonado. Jeong et al. (2010)
verificaram que espinasterol aumentou a resistência de células hipocampais HT22
ao dano oxidativo causado por glutamato, além de suprimir a expressão de enzimas
e mediadores pró-inflamatórios induzida por LPS, inibindo, também, a produção de
NO, PGE2, TNF-α e IL-1β.
Em outro estudo, Jeong et al. (2004) demonstraram a capacidade do
espinasterol em inibir a proliferação de células mesangiais glomerulares induzida
pela alta concentração de glicose, sendo em torno de mil vezes mais potente que a
sinvastatina, além de reduzir o aumento nos níveis séricos de triglicérides, bem
como a excreção de proteínas na urina de ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina.
Meotti et al. (2006) e Boller et al. (2010) demonstraram a atividade
antinociceptiva do esterol no modelo de contorções induzidas por ácido acético e,
posteriormente, contra a nocicepção induzida por glutamato (RIBAS et al., 2008),
enquanto que Mata et al. (1997) demonstraram sua capacidade espasmolítica sobre
íleo de rato.
5.1.2.2 PC2
Através de CCDs eluídas com diferentes fases móveis e reveladas com
diferentes reveladores, confirmou-se o isolamento de 18 mg de um composto
fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 15 e 16), obtido com piridina deuterada,
confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et al. (1998), 1,3-dihidroxi-7metoxixantona (PM = 258) (Figura 14).
82
CH3
O
O
1
7 8
6
5
OH
O
4
2
3
OH
Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona.
O simpleto presente em 13,61 ppm indica um próton do grupo hidroxila
quelado na posição C-1. Outro simpleto em 3,71 ppm refere-se aos três hidrogênios
do grupo metoxila em C-7. O dupleto centrado em 6,73 ppm com constante de
acoplamento meta J = 1,8 Hz é referente ao H-4, enquanto que o centrado em 6,76
ppm com acoplamento meta J = 1,8 Hz refere-se ao H-2. Observa-se que estes
dados encontram-se descritos na literatura (PINHEIRO et al., 1998), todavia, pela
pequena diferença de deslocamento químico, eles podem ser intercambiáveis. H-8 é
definido pelo dupleto centrado em 7,81 ppm com constante de acoplamento meta J
= 2,7 Hz. Os sinais em 7,40 ppm referem-se a H-5 e H-6. Todos estes dados
confirmam a estrutura de 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona.
Também chamada de isogentisina, 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona já foi
isolada anteriormente de Gentiana lutea (ABERHAM et al., 2007) e Polygala
alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), tendo sido estudada farmacologicamente
frente a diferentes potenciais atividades. Savikin et al. (2009) demonstraram sua
atividade antimicrobiana contra várias bactérias gram-positivas e gram-negativas,
bem como contra Candida albicans. Já em outro estudo, Capettini et al. (2009)
evidenciaram o efeito vaso relaxante da xantona em anéis de aorta de forma dose
dependente, não estando esta atividade atrelada a propriedade antioxidante do
metabólito. Schmieder et al. (2007) verificaram que isogentisina foi capaz de
proteger o dano no epitélio vascular causado pelo cigarro, estando esta propriedade
relacionada à ativação das funções de reparo celular, não interferindo diretamente
com os componentes químicos do cigarro.
83
Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada.
Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido na região de 6,5
a 8,0 ppm.
84
5.1.2.3 PC3
O isolamento de um composto fenólico foi determinado por revelação de
diferentes CCDs, utilizando eluentes distintos, com cloreto férrico. O espectro de
RMN ¹H (Figuras 18 e 19) demonstrou o isolamento de 43,1 mg de 1,7-dihidroxi-2,3metilenodioxixantona (PM = 272) (Figura 17).
O
HO
OH
7 8
1
6
4
5
O
O
2
3
O
Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona.
Em 13,50 ppm há um sinal referente ao hidrogênio de uma hidroxila quelada
em C-1. O simpleto em 6,15 ppm caracteriza os dois prótons refrente a um grupo
metilenodioxi, encontrado em C-2 e C-3. O simpleto em 6,70 ppm refere-se ao H-4,
estabelecendo a substituição do anel A. H-8 é definido pelo dupleto centrado em
8,04 ppm (J = 3,0 Hz) com constante de acoplamento meta. O dupleto centrado em
7,48 ppm (J = 9,0 Hz) é atribuído a H-5 orto relacionado. Assim, há a confirmação da
estrutura de 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona. O metabólito já foi isolado
também de Polygala fallax (MA et al, 2003), sendo que ainda não investigado
farmacologicamente.
85
Figura 18: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada.
86
Figura 19: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada expandido na região de 7,3
a 8,1 ppm.
5.1.2.4 PC4
Por diferentes CCDs com revelação por cloreto férrico e anisaldeído sulfúrico,
foi possível detectar o isolamento de 17,9 mg de um composto fenólico. O espectro
de RMN ¹H (Figura 21) confirmou se tratar do composto 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7dimetoxixantona (PM = 320) (Figura 20).
OH
CH3
O
HO
O
OH
7 8
1
6
4
5
O
O
2
3
CH3
OH
Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona.
Pelo RMN ¹H pôde-se deduzir uma estrutura simétrica, visto que o espectro
apresentou apenas três sinais. O simpleto em 3,96 ppm é atribuído aos seis prótons
87
de dois grupos metoxílicos (C-2 e C-7). O simpleto em 12,56 ppm indica a presença
de dois hidrogênios de hidroxilas queladas em C-1 e C-8. O simpleto em 6,74 ppm
refere-se aos dois prótons CH aromáticos. Assim, tem-se a estrutura de 1,3,6,8tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona, uma xantona não estudada do ponto de vista
farmacológico e até então só descrita para P. cyparissias.
Figura 21: Espectro de RMN ¹H do composto PC4 em piridina deuterada.
5.1.2.5 PC 5
Através de CCDs com posterior revelação com cloreto férrico, detectou-se o
isolamento de 12,3 mg de um composto fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 23
e 24), obtido com piridina deuterada, confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et
al. (1998), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (PM = 288) (Figura 22).
88
O
HO
OH
7 8
1
6
4
5
O
O
2
3
CH3
O
CH3
Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona.
O simpleto presente em aproximadamente 13,47 ppm indica um próton de
grupo hidroxila quelado na posição C-1. Já os simpletos em 3,87 ppm e 3,98 ppm
são referentes aos três hidrogênios de grupos metoxílicos da posição C-2 e C-3.
Juntamente com o simpleto em 6,62 ppm, referente a H-4, tem-se a estrutura do
primeiro anel. No segundo anel há um dupleto em 8,05 ppm (J = 2,6 Hz), indicando
acoplamento meta, referente a H-8. Os demais sinais encontram-se encobertos pelo
sinal da piridina. Porém, conforme a literatura (PINHEIRO et al., 1998), deveria-se
observar um dupleto em aproximadamente 7,54 ppm com J próximo a 8,5 Hz,
referente a H-5 acoplando em orto com H-6. Ainda, um duplo dupleto centrado em
aproximadamente 7,60 ppm (J aproximadamente 9,0 e 2,9 Hz), atribuído a H-6, ortoe meta-acomplando com H-5 e H-8.
89
Figura 23: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada.
Figura 24: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada expandido na região de 3,5
a 9,0 ppm.
90
Até o momento, PC5 já foi isolado também de Polygala tenuifolia (FUJITA et
al., 1991) e de Polygala alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), existindo apenas dois
estudos farmacológicos realizados. Sayah et al. (1999), verificaram que a xantona foi
capaz de antagonizar, por mecanismo de ação não-competitivo, mas de modo
reversível, a contração promovida por diversos mediadores em traquéia de cobaias
in vitro. Ademais, de Campos et al. (1997) demonstraram sua atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.
5.1.2.6 PC 6
Por meio de CCD eluída com diferentes fases móveis, revelada com
anisaldeído sulfúrico e cloreto férrico, foi possível detectar o isolamento de 16,8 mg
de um composto fenólico. Através do espectro de RMN ¹H (Figuras 26 e 27) e de ¹³C
(Figura 28) em CD3OD, confirmou-se a estrutura de kaempferol 3-O-β-D-glicosilado,
também conhecido como astragalina (PM = 448) (Figura 25).
OH
HO
2' 3' 4'
5'
1'
6'
O
1
7 8
6
5
4
2
3
O
O
OH
OH
6"
O
5"
4"OH
HO
3"
1"
2"
OH
Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado.
91
Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD.
Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD expandido na região de 5,0 a 9,0 ppm.
92
Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD3OD.
No espectro de RMN ¹H, centrado em 8,05 ppm, há um dupleto (J = 7,8 Hz)
referente a dois hidrogênios da genina: H-2’ e H-6’. O sinal referente a H-3’ e H-5’ é
visualizado no dupleto (J = 7,8 Hz) centrado em 6,89 ppm. Em 6,38 ppm há um
dupleto (J não identificável) indicativo do H-8, enquanto que em 6,19 ppm há outro
dupleto (J não identificável), indicando H-6. Ademais, o dupleto referente ao
hidrogênio anomérico encontra-se em aproximadamente 5,14 ppm, com um J de 6,0
Hz, indicativo de acoplamento axial-axial.
Já no espectro de RMN ¹³C pode-se observar os seguintes sinais para a
genina e seus carbonos atribuídos: 179,5 ppm (C-4), 167,9 ppm (C-7), 163,0 ppm
(C-5), 161,8 ppm (C-4’), 159,2 ppm (C-2), 158,8 ppm (C-9), 135,6 ppm (C-3), 132,5
ppm (C-2’, 6’), 122,8 ppm (C-1’), 116,3 ppm (C-3’, 5’), 105,3 ppm (C-10), 100,7 ppm
93
(C-6) e 95,4 ppm (C-8). Os demais sinais são referentes à porção glicosídica da
molécula: 104,5 ppm (C-1”), 78,5 ppm (C-5”), 78,1 ppm (C-3”), 75,7 ppm (C-2”), 71,4
ppm (C-4”) e 62,6 ppm (C-6”).
Tomados os dados em conjunto e os comparando à literatura (FENG et al.,
2007), conforme Tabela 19, é possível determinar a estrutura como sendo
astragalina. Destaca-se que esta é a primeira vez que este composto é isolado da
espécie em estudo.
Farmacologicamente, a astragalina já foi bastante estudada. Lee et al. (1981)
demonstraram sua atividade anti-leucêmica, enquanto que Kameda et al. (1987)
verificaram seu potencial inibitório sobre a enzima conversora de angiotensina. Mais
recentemente, demonstrou-se sua capacidade inibitória sobre o desenvolvimento de
dermatites, envolvendo a redução de liberação de histamina e de IgE (KOTANI et
al., 2000). Ni et al. (1999) evidenciaram sua propriedade inibitória de proliferação de
células humanas mesangiais, indicando sua potencial aplicabilidade para prevenção
de doenças crônicas renais. Seu potencial antioxidante também já foi demonstrado
pelo método ABTS (HAN et al., 2004), bem como sua atividade lipolítica (OHKOSHI
et al., 2007). Ademais, Inaba et al. (2008) demonstraram sua atividade inibitória
sobre a produção de PGE2 em células epiteliais da gengiva.
94
Tabela 19: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC6 e
comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em CD3OD.
RMN ¹H
RMN ¹H
RMN ¹³C
RMN ¹³C
δ (ppm); mult; J (Hz)
δ (ppm); mult; J (Hz)
δ (ppm)
δ (ppm)
PC6
Literatura
PC 6
Literatura
2
-
-
159,2
159,1
3
-
-
135,6
135,4
4
-
-
179,5
179,5
5
-
-
163,0
163,3
6
6,19; d; indeterminado
6,19; d; 1,3
100,7
99,9
7
-
-
167,9
166,2
8
6,38; d; indeterminado
6,39; d; 1,3
95,4
94,8
9
-
-
158,8
158,5
10
-
-
105,3
105,7
1’
-
-
122,8
122,8
2’
8,05; d; 8,4
8,04; d; 8,8
132,5
132,3
3’
6,89; d; 7,8
6,87; d; 8,8
116,3
116,1
4’
-
-
161,8
161,6
5’
6,89; d; 7,8
6,87; d; 8,8
116,3
116,1
6’
8,05; d; 8,4
8,04; d; 8,8
132,5
132,3
1’’
5,14; d; 6,0
5,24; d; 7,2
104,5
104,1
2’’
-
-
75,7
75,7
3’’
-
-
78,1
78,0
4’’
-
-
71,4
71,4
5’’
-
-
78,5
78,4
6’’
-
-
62,6
62,6
Carbono
5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias
Como metodologia inicial, foi utilizado o sistema gradiente apresentado na
Tabela 10 (gradiente linear H2O/MeOH). A partir desta, obteve-se o cromatograma
demonstrado na Figura 29.
30
30
20
20
10
10
0
mAU
50
40
40
mAU
50
0
95
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60
65
70
Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 1 descrito na Tabela 10.
Neste cromatograma foi possível observar que a maioria dos compostos
foram eluídos ao fim da corrida. Além disto, provavelmente pela presença de
metanol no método, a linha base não ficou estável após os 25 minutos. Assim,
partiu-se para o método 2, descrito na Tabela 11 (gradiente linear H2O/ACN). Com a
mudança do metanol pela acetonitrila, esperou-se obter uma eluição menos tardia
dos compostos presentes no extrato, visto o aumento de força (hidrofobicidade) do
solvente, bem como uma melhor estabilização da linha base. O cromatograma
obtido está apresentado na Figura 30.
60
60
50
50
40
40
mAU
30
30
20
20
10
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60
65
mAU
70
70
0
96
70
Figura 30: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 2 descrito na Tabela 11.
Com o método 2, ao contrário do que ocorreu com o primeiro método, os
compostos eluíram muito precipitadamente, obtendo-se uma baixa separação entre
eles. Na sequência, objetivando facilitar o método, partiu-se para uma eluição
isocrática de H2O/ACN/MeOH 80:10:10 (método 3 já descrito). O cromatograma está
60
60
40
40
20
20
0
mAU
100
80
80
mAU
100
0
apresentado na Figura 31.
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Minutes
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 3 já descrito.
97
Observa-se uma piora na resolução dos picos, já que praticamente todos os
compostos eluíram de forma conjunta no início da corrida. Com isto, descartou-se
metodologias isocráticas, partindo para novo gradiente no método 4, descrito na
Tabela 12 (gradiente com steps H2O/ACN). O cromatograma está disposto na Figura
30
30
20
20
10
10
0
mAU
50
40
40
mAU
50
0
32.
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60
65
70
Figura 32: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 4 descrito na Tabela 12.
No cromatograma observa-se que muitos compostos eluíram conjuntamente
após 10 minutos de corrida. Assim, testou-se o método 5, descrito na Tabela 13
(gradiente linear H2O/ACN), diminuindo a força de eluição, obtendo-se o
cromatograma apresentado na Figura 33.
80
80
60
60
mAU
40
40
20
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60
65
mAU
100
100
0
98
70
Figura 33: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 5 descrito na Tabela 13.
Observou-se uma melhora na separação dos compostos, porém demonstrouse a necessidade de diminuir ainda mais a força do solvente orgânico. Assim,
tentou-se o método 6 com metanol, descrito na Tabela 14 (gradiente linear
H2O/ACN/MeOH). O uso de 2 solventes orgânicos diferentes (metanol e acetonitrila)
foi escolhido para propiciar diferentes interações entre o extrato, a coluna e a fase
móvel, objetivando uma melhor separação entre os picos. O cromatogroma é
apresentado na Figura 34.
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
-5
mAU
40
35
35
mAU
40
-5
99
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60
65
70
Figura 34: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 6 descrito na Tabela 14.
Através do cromatograma obtido, observa-se uma melhor separação entre os
compostos. Porém, também, é demonstrada a necessidade de trabalhar com steps
visando aumentar a resolução entre picos. Assim, o método 7, descrito na Tabela 15
(gradiente
com
steps
H2O/ACN/MeOH),
foi
empregando,
obtendo-se
o
60
60
50
50
40
40
mAU
30
30
20
20
10
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Minutes
50
55
60
65
70
75
80
mAU
70
70
0
cromatograma da Figura 35.
85
Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 7 descrito na Tabela 15.
100
Observa-se uma significativa melhora na resolução dos picos. Todavia,
mesmo assim, optou-se por evoluir mais na separação. Além de mudar o método,
optou-se por mudar o fluxo para aumentar a interação entre a fase móvel, fase
estacionária e o extrato. Com isto o método 8, descrito na Tabela 16 (gradiente com
steps H2O/ACN/MeOH, fluxo 0,8 ml/min), foi testado. O cromatograma obtido está
15
15
10
10
5
5
0
mAU
25
20
20
mAU
25
0
apresentado na Figura 36.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
55
60
65
70
75
80
85
90
95
Figura 36: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009,
conforme método 8 descrito na Tabela 16.
Conforme
pode
ser
observado,
a
resolução
dos
picos
melhorou
significativamente. Assim, optou-se por injetar o padrão de PC3 para verificar sua
pureza e identificá-la no extrato em estudo. Com isto, obteve-se o cromatograma
apresentado na figura 37 e sua representação em três dimensões na figura 38.
101
600
600
400
400
200
200
0
mAU
1000
800
800
mAU
1000
0
2: 254 nm, 8 nm
161110 Metilenodioxixantona em 091209
161110 Metilenodioxixantona em 091209-Rep2
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
Minutes
Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias, conforme método 8 descrito na
Tabela 16.
Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P. cyparissias, conforme
método 8 descrito na Tabela 16.
102
Objetivando verificar a presença de pequenas impurezas, foi injetado apenas
o solvente e eluído também conforme método 8, obtendo-se o cromatograma da
300
300
200
200
100
100
0
-100
mAU
500
400
400
mAU
500
0
figura 39.
-100
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
Minutes
Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de PC2, conforme
método 8 descrito na Tabela 16.
Descontando as áreas dos picos presentes no cromatograma do solvente,
pôde-se determinar a pureza de PC3, sento esta estimada em 90%. Conforme o
cromatograma do extrato é possível detectar a presença da xantona PC3 (aos 70
minutos de eluição), porém, para futuros fins de quantificação de PC3, faz-se
necessário ajustes no método para aumentar a resolução entre os picos próximos à
xantona.
5.2 Testes farmacológicos
5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora
Os resultados referentes à gastroproteção demonstrada pelo extrato e frações
obtidos de P. cyparissias coletada em 2007 no modelo de úlcera induzida por
etanol/HCl encontram-se resumidos na Tabela 20. Os grupos tratados com 50, 125 e
250 mg/kg da fração clorofórmica não demonstraram uma redução significativa no
índice de lesão e percentual de lesão, apesar de ter demonstrado uma redução
significativa na área total de lesão quando comparado ao grupo controle (p<0,05). O
percentual de inibição para as três doses foi de 50,9 ± 9,3 %, 54,6 ± 7,3 % e 60,3 ±
5,5 %, respectivamente. Também, o índice de lesão não foi reduzido de forma
103
significativa na dose de 50 mg/kg do extrato acetônico e fração metanólica. Por outro
lado, as doses de 125 e 250 mg/kg reduziram significativamente este índice
(p<0,05). O extrato acetônico também reduziu de forma significativa a área total de
lesão e o percentual de lesão em todas as doses (p<0,05). Um efeito semelhante foi
observado para a fração metanólica (p<0,05). Os percentuais de inibição de úlcera
foram 45,2 ± 12,9 %, 63,0 ± 3,5 % e 67,4 ± 4,8 % para o extrato acetônico (Figura
40) e 43,7 ± 5,1 %, 64,6 ± 5,6 % e 74,5 ± 6,1 % para a fração metanólica (Figura 41).
Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P. cyparissias (coleta
de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e veículo no modelo
de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como
média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós*
**
***
teste de Dunnett. p<0,05, p<0,01 and p<0,001.
Tratamento Dose
Área total
% de área
Índice de
Índice de
(v.o.)
de lesão
lesada
lesão
gastroproteção
ulcerativa
(%)
(mg/kg)
(mm²)
Controle
Omeprazol
Extrato
acetônico
Fração
clorofórmica
Fração
metanólica
-
71,1 ± 12,7
5,8 ± 2,8
30,3 ± 3,1
-
30
18,3 ± 5,2***
3,4 ± 0,8***
13,6 ± 2,3***
67,8 ± 5,3
50
23,0 ± 4,5*
4,4 ± 0,7*
23,2 ± 5,5
45,2 ± 12,9
125
5,0 ± 1,0***
1,3 ± 0,3***
15,7 ± 1,5*
63,0 ± 3,5
250
4,8 ± 1,7***
1,0 ± 0,3***
13,8 ± 2,0*
67,4 ± 4,8
50
26,1 ± 7,9
*
6,0 ± 1,9
20,8 ± 3,9
50,9 ± 9,3
125
23,1 ± 5,7*
5,8 ± 1,8
10,2 ± 3,1
54,6 ± 7,3
250
26,1 ± 7,9*
11,1 ± 4,8
16,8 ± 2,3
60,3 ± 5,5
50
26,0 ± 4,2*
4,6 ± 0,7*
23,8 ± 2,2
43,7 ± 5,1
125
18,2 ± 2,7**
3,7 ± 0,5**
15,0 ± 2,4**
64,6 ± 5,6
250
11,9 ± 4,5**
2,1 ± 0,6**
10,8 ± 2,6**
74,5 ± 6,1
104
Índice de gastroproteção (%)
100
Ome prazol (mg/kg; v .o.)
75
50
25
0
Controle
30
50
125
250
Extrato ace tônico (mg/kg; v .o.)
Etanol/HCl (60%/0,3M ; v .o.)
Figura 40: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pelo extrato
acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)
em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.
Índice de gastroproteção (%)
100
Ome prazol (mg/kg; v .o.)
75
50
25
0
Controle
30
50
125
250
Fração M e tanólica (mg/kg; v .o.)
Etanol/HCl (60%/0,3M ; v .o.)
Figura 41: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pela fração
metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M;
v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.
A formação de lesões na mucosa gástrica por agentes necrosantes, como o
etanol, é reportada por envolver a redução de mecanismos de defesa gástricos
105
(KINOSHITA et al., 1995). A formação destas lesões que seguem à administração
de etanol envolve diversos mecanismos: (1) uma redução no fluxo sanguíneo
gástrico,
contribuindo
no
desenvolvimento
de
hemorragia
e
necrose;
(2)
solubilização do muco presente no estômago, resultando em uma redução da
diferença de potencial transmucosa, aumentando o fluxo de íons Na+ e K+ ao lúmen,
secreção de pepsina e perda de íons H+ e histamina no lúmen; (3) indução do
estresse oxidativo; (4) aumento da atividade de xantina oxidase e níveis de
malondialdeído; e (5) redução nos níveis totais de glutationa nas células da mucosa
gástrica (SZABO; VATTAY, 1990; MAROTTA et al., 1999). O HCl presente no
modelo acelera o processo de ulcerogênese gástrica e intensifica as lesões,
reduzindo a proteção da mucosa contra agentes químicos (SUN; MATSUMOTO;
YAMATA, 1991).
Sabe-se que a úlcera gástrica é causada por um desequilíbrio entre os fatores
agressivos (HCl, pepsina) e a habilidade da mucosa gástrica de se proteger e curar
a si própria (muco e secreção de HCO3-, prostaglandinas, fluxo de sangue e óxido
nítrico) (LU; GRAHAM, 2006). Diversos fatores podem aumentar o risco de
incidência de úlcera, tais como o estresse, o fumo, deficiências nutricionais, uso de
AINEs, predisposição hereditária e infecção por H. pilory (BARROS et al., 2008).
Considerando o exposto, optou-se por prosseguir os experimentos avaliando
o comportamento do extrato e fração frente ao modelo de úlcera induzida por
indometacina/betanecol. Todavia, visto que a fração clorofórmica demonstrou
apenas uma atividade superficial, este modelo foi realizado apenas com o extrato
acetônico e a fração metanólica. Os resultados são apresentados na Tabela 21. Os
percentuais de inibição de úlcera foram 28,1 ± 12,4 %, 60,2 ± 6,6 % e 77,9 ± 7,2 %
para os grupos tratados com 50, 125 e 250 mg/kg do extrato acetônico de P.
cyparissias (Figura 42). Para os grupos tratados com a fração metanólica, o
percentual de inibição de úlcera foram 46,1 ± 6,9 %, 67,4 ± 4,4 % e 75,0 ± 2,9 %,
respectivamente (Figura 43).
Tabela 21: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas
doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e veículo em úlcera induzida por
indometacina (100 mg/kg; v.o.)/betanecol (5 mg/kg; i.p.) em camundongos. Resultados apresentados
como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida
*
**
***
de pós-teste de Dunnett. p<0,05, p<0,01 and p<0,001.
106
Tratamento Dose
Área total
% de área
Índice de
Índice de
(v.o.)
de lesão
lesada
lesão
gastroproteção
ulcerativa
(%)
(mg/kg)
(mm²)
Controle
Cimetidina
Extrato
acetônico
Fração
metanólica
-
6,4 ± 0,6
***
1,4 ± 0,2
***
25.,6 ± 4,4
***
-
100
1,8 ± 0,6
0,4 ± 0,2
6,5 ± 1,0
74,4 ± 4,0
50
1,3 ± 0,4***
0,4 ± 0,1**
18,4 ± 3,2
28,1 ± 12,4
125
0,9 ± 0,1***
0,4 ± 0,1**
10,2 ± 1,7**
60,2 ± 6,6
250
0,4 ± 0,1***
0,2 ± 0,1***
5,7 ± 1,8***
77,9 ± 7,2
50
6,0 ± 0,9
1,2 ± 0,2
13,8 ± 1,8
46,1 ± 6,9
125
3,2 ± 0,6**
0,5 ± 0,1*
8,3 ± 1,1***
67,4 ± 4,4
250
2,7 ± 0,3**
0,6 ± 0,1*
6,4 ± 0,8***
75,0 ± 2,9
Índice de gastroproteção (%)
100
Cime tidina (mg/kg; v .o.)
75
50
25
0
Controle
100
50
125
250
Extrato ace tônico (mg/kg; v .o.)
Indome tacina (100 mg/kg; v .o.)
Figura 42: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pelo extrato
acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg;
v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.
107
Índice de gastroproteção (%)
100
Cime tidina (mg/kg; v .o.)
75
50
25
0
Controle
100
50
125
250
Fração me tanólica (mg/kg; v .o.)
Indome tacina (100 mg/kg; v .o.)
Figura 43: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pela fração
metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg;
v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.
Os AINEs, como é o caso da indometacina, têm capacidade de bloquear a
COX, demonstrando fortes evidências que o efeito ulcerogênico destes está
amplamente correlacionado à sua capacidade de suprimir a síntese das
prostaglandinas (PGs). PGs endógenas regulam o fluxo sanguíneo da mucosa,
proliferação de células epiteliais, regeneração epitelial, atividade imune da mucosa,
secreção de muco e de HCO3- e secreção basal de ácido. Assim, com a inibição da
síntese de prostaglandinas, há um enfraquecimento nas defesas da mucosa,
diminuindo a sua capacidade de resistir a agressores (CHAN; LEUNG, 2002).
Porém, a diminuição na síntese de PGs não é a única via responsável pela formação
de úlcera por AINEs. Paralelamente, os AINEs levam a um aumento dos níveis de
mieloperoxidase e malondialdeído, ambos responsáveis pelo dano oxidativo, além
de reduzir a síntese de NO, relacionado à secreção de muco, regulação do fluxo
sanguíneo e prevenção da peroxidação lipídica (SULEYMAN et al., 2010).
Mesmo
não
sendo
um
modelo
específico,
pode-se
inferir
que
a
gastroproteção gerada por P. cyparissias provavelmente relaciona-se com as PGs.
O extrato acetônico e a fração metanólica podem tanto estar aumentando a síntese
de
PGs,
especialmente
através
da
COX-1,
constitutiva
e
relacionada
à
108
gastroproteção, quanto possuir um efeito antagônico à indometacina, impedindo sua
ação. Outra possibilidade é que os consituintes presentes no extrato e fração
tenham um efeito que mimetiza os efeitos das PGs, como é o caso do misoprostol,
um análogo da PGE2 que atua inibindo a secreção gástrica e estimulando a
produção de muco (ARONSSON et al., 2007).
Considerando que o modelo de úlcera induzida por etanol é bastante geral e
inespecífico e que o modelo de úlcera induzida por indometacina, apesar de
evidenciar uma forte relação com as PGs, não é adequado para o estabelecimento
de um possível mecanismo de ação, realizaram-se experimentos para verificar o
potencial envolvimento do NO e de SHs.
Para a avaliação da participação do NO no mecanismo de gastroproteção
induzida por P. cyparissias, realizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol
associada ao L-NAME, um bloqueador da óxido nítrico sintase (NOS). O L-NAME é
um análogo da L-arginina e é hidrolisado em L-nitroarginina, gerando a inibição da
NOS (GRANGER et al., 1994). Portanto, conforme se pode observar na figura 44, os
tratamentos com o extrato acetônico e a fração metanólica nos animais que
receberam L-NAME, não foram capazes de diminuir significativamente o percentual
de área lesada quando comparados com o controle. Já os animais que receberam o
extrato e a fração e foram pré-tratados com solução salina exibiram uma redução
significativa (p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle
(0,95 ± 0,30% e 2,12 ± 0,64%, respectivamente), também sendo estes resultados
significativamente diferentes aos observados nos grupos que receberam o L-NAME
(p<0,01). Consequentemente, demonstra-se a participação importante do NO no
mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração
metanólica de P. cyparissias.
109
30
% de área lesada
#
20
#
10
0
L-NAM E (70 mg/kg; i.p.)
Solução salina
#
**
**
Controle Controle
-
+
+
-
Veículo (v.o.)
**
125
125
125
125
200
200
-
+
-
+
-
+
-
+
Ext. acetônico
(mg/kg; v.o.)
-
+
Fr. metanólica
(mg/kg; v.o.)
+
Carbenoxolona
(mg/kg; v.o.)
Etanol/HCl (60%/0,3M )
Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e
carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos
pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média
± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey.
**
p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos
pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01).
O NO é um transmissor endógeno que possue diversas funções no sistema
gastrointestinal. Ele é principalmente associado à proteção da mucosa contra
agentes vasoconstritores e com a inibição da secreção ácida das células parietais
(GRANGER et al., 1994). Também, diminui a degranulação de mastócitos, a
liberação de TNF-α por macrófagos e o recrutamento de neutrófilos, além de
aumentar a produção de muco (WALLACE, MA, 2001).
Para avaliar a participação de SHs no mecanismo gastroprotetor de P.
cyparissias, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol associada ao NEM,
um quelante destes grupamentos. Observando a figura 45, pode-se verificar que
tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica, quando associados ao prétratamento com NEM, não foram eficazes na diminuição do percentual de área
lesada quando comparados ao controle. Porém, os animais que receberam apenas
o tratamento com o extrato ou a fração, demonstraram uma redução significativa
110
(p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle (0,95 ± 0,30%
e
2,12
±
0,64%,
respectivamente).
Além
disto,
estes
resultados
foram
significativamente diferentes àqueles observados para os grupos que receberam
NEM (p>0,01). Com isto, demonstra-se a participação dos grupamentos sulfidrila no
mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração
metanólica de P. cyparissias.
40
% de área lesada
30
#
#
20
#
10
0
**
**
Controle Controle
NEM (10 mg/kg; i.p.)
-
+
Solução salina
+
-
Veículo (v.o.)
125
-
125
125
+
-
+
Ext. acetônico
(mg/kg; v.o.)
**
125
200
200
+
-
+
+
Fr. metanólica
(mg/kg; v.o.)
+
Carbenoxolona
(mg/kg; v.o.)
Etanol/HCl (60%/0,3M )
Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e
carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos
pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ±
EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey.
**
p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos
pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01).
Os SHs são importantes protetores da mucosa gástrica, principalmente
quando espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no processo de lesão
gástrica. Estudos afirmam que as lesões causadas pelo etanol estão fortemente
associadas com uma redução nos níveis de SHs na mucosa (BARBASTEFANO et
al. 2007).
111
Os modelos empregados até o momento objetivaram a determinação do
potencial gastroprotetor do extrato. Porém, sabe-se que a úlcera gástrica é
comumente uma doença crônica, podendo persistir por 10 a 20 anos (OKABE;
PFEIFFER, 1972). Levando isto em consideração, foi realizado o modelo de úlcera
crônica induzida por ácido acético. Este modelo foi escolhido pois produz lesão
gástrica de forma similar à úlcera crônica humana, sendo os extratos utilizados de
uma forma curativa, com o tratamento após a ulcerogênese, mimetizando o uso
clínico. Neste modelo, o ácido acético promove dano à mucosa principalmente pela
liberação de histamina, que aumenta a permeabilidade capilar e a difusão de HCl
(TAKAGI et al., 1969), confinado ao estômago glandular (DHARMANI et al., 2004). O
tratamento com 125 mg/kg do extrato acetônico e da fração metanólica reduziram de
forma significativa a área total de lesão (p<0,01) e o percentual de área lesada
(p<0,05). Ambos os tratamentos induziram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4
± 4,4%, respectivamente (Tabela 22 e Figura 46). Os fatores presentes na
cicatrização da úlcera crônica estão relacionados particularmente a fatores de
crescimento, propiciando a angiogênese, re-epitelização, migração e proliferação
celular (SZABO; VINCZE, 2000).
Tabela 22: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) na dose
de 125 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera crônica induzida
por ácido acético 20% (ensaio curativo). Resultados apresentados como média ± EPM para seis
*
camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett.
**
p<0,05 e p<0,01.
Tratamento Dose
Área total de %
(vo)
lesão (mm²)
lesada
-
9,2 ± 1,2
3,5 ± 0,5
100
4,1 ± 0,8**
1,3 ± 0,4*
61,3 ± 11,9
125
4,5 ± 1,0**
1,1 ± 0,2*
67,5 ± 5,5
125
4,9 ± 1,0**
1,4 ± 0,2*
58,4 ± 4,4
Controle
Cimetidina
Extrato
acetônico
Fração
metanólica
(mg/kg)
de
area Índice de cura
(%)
-
112
Índice de cura (%)
125
100
Cime tidina (mg/kg; v .o.)
Extrato ace tônico (mg/kg; v .o.)
Fração me tanólica (mg/kg; v .o.)
75
50
25
0
Controle
100
125
125
Ácido acético 20% (50 µ l)
Figura 46: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.), pelo extrato
acetônico (125 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg; v.o.) em lesões
induzidas por ácido acético 20% (50 µl) em camundongos (n = 6), no modelo de úlcera crônica. Os
resultados estão expressos em média ± EPM.
Através do modelo de úlcera crônica, também foi demonstrado o importante
papel de P. cyparissias na via histaminérgica. No sistema gastrointestinal, a
histamina é liberada por células enterocromafins que estão em contato próximo com
as células parietais. Assim, de forma parácrina, a histamina atua em receptores H2
das células parietais e promove o aumento da secreção ácida gástrica através da
elevação dos níveis intracelulrares de AMP cíclico (MERCHANT, 2007). De fato,
antagonistas dos receptores H2 são largamente empregados na terapia antiúlcera
(SUNG, 2006). Corroborando com estes resultados, Sayah et al. (1999) já haviam
demonstrado a capacidade antagônica do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias
contra a histamina.
Outra espécie do mesmo gênero também foi estudada quanto a seus efeitos
gastroprotetores, porém as vias envolvidas parecem se diferenciar daquelas
descritas para P. cyparissias. Lapa et al. (2007), avaliaram o potencial gastroprotetor
do extrato hidroalcoólico de Polygala paniculata. A espécie foi estudada
fitoquimicamente, sendo descrita a presença de xantonas, uma cumarina, o flavonol
rutina e os esteróis espinasterol e ∆25-espinasterol (CRISTIANO et al., 2003). No
estudo foi demonstrado que o extrato foi capaz de reduzir significativamente o índice
de úlcera no modelo induzido por etanol nas doses de 100 e 300 mg/kg (v.o.) e de
113
10 e 30 mg/kg (i.p.). Este efeito foi parcialmente explicado pelo aumento de
secreção de muco, que é estimulada principalmente pelo NO e pelas PGs. Todavia,
o extrato de P. paniculata foi incapaz de inibir de forma significativa as lesões
geradas por indometacina, relacionado à síntese de PGs, bem como demonstrou
não ser dependente do NO. O mecanismo de gastroproteção da planta também não
está relacionado à diminuição da acidez do conteúdo gástrico nem ao volume de
secreção, porém pode apresentar relação com seu potencial antioxidante, verificado
também para a rutina, um dos seus compostos isolados.
Objetivando verificar os potenciais compostos responsáveis pela atividade
gastroprotetora, optou-se por realizar procedimentos cromatográficos para o
isolamente de metabólitos secundários, conforme descrito no item 4.2.3. Após o
isolamento dos compostos, três deles foram testados frente a sua atividade
gastroprotetora no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl em camundongos:
PC1, PC2 e PC3.
Os resultados encontram-se sumarizados na Tabela 23 e na Figura 47. PC2
(0,19 mmol/kg; v.o.) reduziu significativamente o percentual de lesão, a área total de
lesão e o ULI (p<0,001, p<0,001 e p<0,01, respectivamente), assim como PC3 (0,18
mmol/kg; v.o.) (p<0,001 para todos os parâmetros). Os percentuais de inibição de
úlcera foram 71,3 ± 9,4 % e 81,1 ± 5,8 %, respectivamente. PC1 (0,12 mmol/kg; v.o.)
também reduziu significativamente o percentual de lesão, área total de lesão e o ULI
(p<0,001 para todos os parâmetros) e demonstrou um percentual de inibição de
úlcera de 86,2 ± 3,4 %.
114
Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2)
(0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol
(0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em
camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação
*
**
***
estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. p<0,05, p<0,01 and p<0,001.
Tratamento Dose
Área total
% de área
Índice de
Índice de
(vo)
(mmol/
de lesão
lesada
lesão
gastroproteção
kg)
(mm²)
ulcerativa
(%)
Controle
-
71,1 ± 12,7
15,8 ± 2,9
30,3 ± 3,1
Omeprazol
0,08
18,3 ± 5,2***
3,4 ± 0,8***
13,6 ± 2,3***
***
***
***
67,8 ± 5,3
PC1
0,12
1,6 ± 0,7
0,6 ± 0,3
5,8 ± 1,4
86,2 ± 3,4
PC2
0,19
5,6 ± 1,3***
1,7 ± 0,4***
12,2 ± 4,0**
71,3 ± 9,4
PC3
0,18
2,1 ± 0,9***
0,7 ± 0,3***
8,0 ± 2,4***
81,1 ± 5,8
Índice de gastroproteção (%)
150
Ome prazol (mmol/kg; v .o.)
PC1 (mmol/kg; v .o.)
PC2 (mmol/kg; v .o.)
PC3 (mmol/kg; v .o.)
100
50
0
Controle
0,08
0,12
0,19
0,18
Etanol/HCl (60%/0,3M ; v .o.)
Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e pelos
compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em
camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2)
(0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os
resultados estão expressos em média ± EPM.
Com isto, demonstra-se a potencial participação dos compostos ensaiados no
mecanismo de atividade gastroprotetora do extrato acetônico de P. cyparissias,
corroborando com resultados já demonstrados na literatura. Além de estudos que
relatam
a
atividade
antiúlcera
de
xantonas
(SHANKARANARAYAN;
GOPALAKRISHNAN; KAMESWARAN, 1979; BANERJI et al., 1994), já foi descrito o
115
potencial antiulcerogênico de uma série de compostos fenólicos (HAMAUZU et al.,
2008; BARROS et al., 2008; PRIYA, SABU, JOLLY, 2009). Considerando que o
dano oxidativo é um causador comum da ulcerogênese, as propriedades
antioxidantes intrínsecas aos compostos fenólicos podem ser uma das vias
responsáveis pela gastroproteção, atuando também como citoprotetores (BARROS
et al., 2008).
Reyes-Chilpa et al. (2006) também demonstraram a capacidade das xantonas
6-desoxijacareubina,
xantona
e
jacareubina,
1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-
1-hidroxi-3,5,6-tri-O-acetil-2(3,3-dimetilalil)-xantona,
isoladas
de
Calophyllum brasilienses, bloquearem a atividade da bomba H+, K+-ATPase, última
etapa envolvida com a secreção ácida no estômago, com IC50 variando de 47 µM a
1,6 mM. No estudo puderam inferir sobre a relação estrutura-atividade de xantonas,
evidenciando que a presença de hidroxila na posição C-6 parece ser essencial para
a atividade. Além disso, grupamentos volumosos em C-2 poderiam diminuir a
potência do metabólito. Considerando as xantonas PC2 e PC3 isoladas de P.
cyparissias, pode-se observar que nenhuma das duas apresenta a hidroxila em C-6,
o que indicaria que ambas exercem sua atividade gastroprotetora por outras vias
que não o bloqueio da bomba H+, K+-ATPase. Todavia, trata-se apenas de uma
inferência, não podendo ser descartado tal mecanismo de ação gastroprotetor.
Já em outro estudo avaliando a atividade antiúlcera da mangiferina, uma
xantona
glicosilada
isolada
de
Mangifera
indica,
Carvalho
et
al.
(2007)
demonstraram, nos modelos de úlcera induzida por etanol e por indometacina,
índices de gastroproteção variando de 22 a 63%. Seu efeito demonstrou estar
associado à diminuição do volume de secreção ácida, bem como à sua capacidade
antioxidante avaliada pelo modelo de úlcera induzida por etanol associada ao prétratamento com NEM. Assim, reforça-se que as xantonas possam apresentar
atividade gastroprotetora por sua capacidade antioxidante.
O esterol PC1 também apresentou índice de gastroproteção bastante
significativo (86,2 ± 3,4%), muito semelhante ao encontrado para o β-sitoesterol
(85,6 ± 6,3%) por Navarrete, Trejo-Miranda, Reyes-Trejo (2002). Neste estudo
também afirma-se que a hidroxila presente em C-3 é essencial para o potencial
antiulcerogênico de esteróis e triterpenos, também presente em PC1, sendo
sugerido que seu efeito estaria relacionado à restauração dos níveis de PGs, de
uma forma similar à ação da carbenoxolona. Todavia, a classe de fitoesteróis foi
116
pouco estudada quanto ao seu potencial gastroprotetor, não apresentando estudos
que possam delimitar um provável mecanismo de ação.
5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory
Sabe-se que um importante agente etiológico da úlcera é a infecção por H.
pilory. É uma bactéria gram-negativa que tem como habitat específico a mucosa
gástrica, contribuindo diretamente na lesão das células gástricas através da
liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase,
urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007).
Assim, objetivando-se determinar o potencial anti-H. pilory do extrato
acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias, realizou-se o seu estudo in vitro
através de diluição destes em ágar sólido. Observou-se que, mesmo na maior
concentração (2000 µg/ml), nem o extrato nem a fração foram capazes de inibir o
crescimento da bactéria.
5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva
Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado pelo
extrato metanólico de P. cyparissias (coleta 2009) no modelo de hipernocicepção
induzida por carragenina encontram-se apresentados na figura 48. Pode-se observar
que o tratamento preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi
capaz de reduzir significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado
ao grupo controle (p<0,05), com inibições de 30,7 ± 7,8 %, 46,7 ± 7,1 % e 67,8 ± 3,4
%, para as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato na dose de 30 mg/kg pôde reduzir
significativamente a hipernocicepção inflamatória até as 24h após a administração
do agente irritante.
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Carragenina (300 µg/pata)
Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)
***
***
***
50
40
AUC
Intensidade de hipernocicepção
117
**
*** ***
*** ***
***
3
6
4
Tempo (h)
**
10
***
24
**
20
0
1
*
30
48
Controle
3
10
30
Extrato M eOH bruto (mg/kg, i.p.)
Carragenina (300 µ g/pata)
Figura 48: Intensidade de hipernocicepção, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o
extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a
injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6
animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata,
*
**
***
onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
A carragenina é um agente pró-inflamatório muito conhecido e utilizado em
estudos envolvendo a hiperalgesia inflamatória em ratos e camundongos (MORRIS,
2003). Ela promove, inicialmente, a liberação de TNF-α que, por sua vez, poderá
agir por dois caminhos distintos: indução da COX-2 e subsequente síntese de
eicosanóides por IL-1β; e indução da produção de aminas simpaticomiméticas por
IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). A resposta induzida pela carragenina é caracterizada
por ser bifásica: até 2,5h após a adminstração do agente, há a liberação
principalmente de histamina, serotonina e bradicinina; em seguida, na segunda fase,
há um aumento na produção de prostaglandinas e radicais livres (PANTHONG et al.,
2004).
Outro modelo utilizado para a avaliação da atividade anti-hipernociceptiva foi
o de hipernocicepção inflamatória induzida por LPS. Na Figura 49 estão
apresentados os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado
pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo. Primeiramente, destaca-se
que a injeção i.pl. de LPS foi capaz de reduzir o limiar de sensibilidade mecânica dos
camundongos quando comparado aos valores basais. Além disto, o tratamento
preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir
significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo
controle (p<0,01), com inibições de 52,6 ± 7,4 %, 83,5 ± 5,0 % e 89,0 ± 4,8 % para
as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato pôde reduzir significativamente, em todas
118
as
doses,
a
hipernocicepção
inflamatória
durante
todo
o
período
de
LPS (100 ng/pata)
Extrato bruto(3 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)
90
500
80
400
70
60
50
40
30
20
***
***
***
***
10
0
***
***
B 1
***
***
***
2
4
**
***
***
6
Tempo (h)
***
***
***
***
AUC
Frequência de resposta (%)
acompanhamento do teste (48h).
**
300
200
**
100
***
24
**
***
0
48
Basal Controle
3
10
30
Extrato MeOH bruto (mg/kg)
LPS (100ng/pata)
Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média
± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de
*
**
***
retirada da pata, onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
O LPS é uma endotoxina bacteriana e está envolvido com a produção de
citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, prostaglandinas e, especialmente, óxido
nítrico (BONATERRA et al., 2010). O óxido nítrico é um radical livre gasoso, sendo
rapidamente metabolizado a nitrato e nitrito. É produzido por uma enzima
denominada NOS, que é dividida em três isoformas: as constitutivas cNOS e eNOS
e a induzida iNOS. Esta última é estimulada por agentes pró-inflamatórios, como é o
caso do LPS (KASSIM et al., 2010). Com a liberação do NO há a ativação direta de
fibras sensoriais cerebrais, levando à liberação do peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CGRP) e ao aumento das concentrações de cGMP e cAMP. Estes
segundos mensageiros, através de fosforilações, aumentam o fluxo de Na+ e Ca2+,
diminuindo de K+, o que gera a sensibilização das fibras nociceptivas (CODERRE,
2009; DRAY, 2009).
No modelo de úlcera induzida por etanol associada ao L-NAME (bloqueador
da NOS), foi observado que o extrato acetônico e a fração metanólica de P.
cyparissias agiam de forma a induzir a produção de NO, visto que a gastroproteção
demonstrada foi dependente do sistema oxinitrérgico. Já
no modelo de
119
hipernocicepção induzida por LPS, causada especialmente pelo aumento da síntese
de NO, o extrato metanólico da planta apresentou capacidade antagônica, seja por
inibir a ação do NO ou por reduzir sua síntese. Porém, conforme já relatado, existem
diferentes isoformas de NOS. As envolvidas com a gastroproteção são as isoformas
constitutivas, enquanto que aquela envolvida com a hipernocicepção inflamatória é a
induzida (WALLACE, MA, 2001). Consequentemente, é possível que os extratos e
fração de P. cyparissias atuem tanto de forma antagônica quanto agônica com NO e
NOS.
Clark et al. (2010) recentemente demonstraram que o LPS também induz a
liberação de IL-1β e a fosforilação do MAPK p38 através de receptores P2X7 (classe
de receptores purinérgicos). A IL-1β ativa os nociceptores diretamente, gerando sua
sensibilização através da ativação de quinases intracelulares, além de indiretamente
poder gerar sensibilização pela indução de produção de cininas e prostanóides. Já a
ativação de MAPK p38, assim como de outras quinases, são importantes
reguladores da excitabilidade das fibras através da alteração de transcrição gênica
(DRAY, 2009). Em comparação com a carragenina, o LPS induz uma resposta
inflamatória mais branda, com o pico de edema atingido após 3h, enquanto que na
carragenina o pico ocorre após 6h de indução (KASSIM et al., 2010).
Investigando ainda a ação do extrato metanólico de P. cyparissias sobre a
hipernocicepção inflamatória, este foi testado frente ao modelo induzido por CFA.
Conforme pode ser observado na figura 50, o pré-tratamento com o extrato
metanólico de P. cyparissias, nas doses de 1 e 3 mg/kg, foi capaz de inibir de forma
significativa a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle
(p<0,01), com índices de inibição de 42,6 ± 3,4 % e 24,7 ± 9,0 % respectivamente.
Porém, ao se observar a resposta obtida variando conforme o tempo, pode-se
perceber que sua eficácia limitou-se até a quarta hora, perdendo seu potencial antihipernociceptivo após este período.
120
CFA (20 µL/pata)
Extrato bruto (0,3 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (0,1 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (1 mg/kg, i.p.)
600
80
70
500
60
**
50
*
** ***
***
40
30
**
300
200
20
100
10
0
**
400
AUC
Freqüência de resposta (%)
90
0
B 1
2
3
4
6
24
48
Basal
Controle
Tempo (h)
0,3
1
3
Extrato M e OH bruto (mg/kg, i.p.)
CFA (20µ
µ l/pata)
Figura 50: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (0,3-3 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µl/pata). Os dados são expressos como a média ±
EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de
*
**
***
retirada da pata, onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
A administração local de CFA causa extravasamento plasmático, infiltração de
células inflamatórias com um aumento nos níveis de diversos mediadores
inflamatórios, tais como citocinas, neutrofinas e eicosanóites (BURSTEIN et al.,
2004). Todavia, uma das principais vias de ação do CFA é a liberação do fator de
crescimento neuronal (NGF) (WOOLF, C. J., 1997).
O NGF é uma neutrofina especialmente relacionada à sensibilização
neuronal. Ele é capaz de aumentar a expressão de receptores do tipo: TRPV1,
especialmente sensíveis a temperaturas elevadas e a variações de pH; P2X3,
relacionados à dor produzida por ATP; ASIC, associados, juntamente com TRPV1, à
dor causada por acidose tecidual; BK, sensíveis às bradicininas, atuando tanto na
manutenção da hiperalgesia inflamatória persistente, quanto na amplificação da
formação de edema; e canais de Na+ e K+, relacionados à despolarização do
nociceptor (MENDELL, 2009).
Objetivando verificar o papel do extrato diretamente sobre um importante
mediador inflamatório, realizou-se o modelo de hipernocicepção induzida pela
injeção de PGE2. Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo
demonstrado pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo encontram-se
apresentados na figura 51. Pode-se observar que o tratamento preventivo (i. p.) com
121
o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir significativamente a
hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,01), com
inibições de 88,5 ± 11,5 % e 73,6 ± 7,3 % para as doses de 3, 10 mg/kg. Todavia,
para a dose de 30 mg/kg, não foi observado um efeito anti-hipernociceptivo. Este
comportamento contrário ao esperado muitas vezes se deve à saturação de
receptores, o que acaba levando à ação pró-nociceptiva por vias paralelas onde,
normalmente, o extrato não agiria. Além disso, observa-se que o melhor efeito foi
observado após uma hora de injeção do agente lesivo, sendo que após as seis
horas, nenhuma dose do extrato foi capaz de inibir significativamente a
PGE2 (0,1 nmol/pata)
Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)
90
80
400
70
60
50
*
*
*
***
***
300
*
AUC
Freqüência de resposta (%)
hipernocicepção provocada por PGE2.
40
30
20
***
0
B 1
2
4
Tempo (h)
**
100
10
0
**
200
6
Basal Controle
3
10
30
Extrato Me OH bruto (mg/kg)
PGE2 (0,1 nmol/pata)
Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE2 (0,1 nmol/pata). Os dados são expressos como a
média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do
*
**
***
limiar de retirada da pata, onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
As PGs, de uma forma geral, são consideradas mediadores finais da dor
inflamatória, visto que podem ativar diretamente os nociceptores, independendo da
liberação de outros mediadores, promovendo a sua sensibilização para uma dada
estimulação posterior, não causando dor espontânea (FERREIRA et al., 2009). De
uma forma geral, a PGE2 pode aumentar a permeabilidade vascular e a produção de
IL-6, promover a vasodilatação, além de diminuir o limiar de disparos de potenciais
de ação, facilitando a ativação neuronal, levando à hiperalgesia (CALDER, 2009;
122
FERREIRA et al., 2009). A sensibilização central é decorrente do aumento de
liberação de glutamato, despolarização direta dos neurônios no corno dorsal e
inibição dos receptores de glicina sensíveis à estricnina (ZEILHOFER, 2007).
No modelo de úlcera induzida por AINEs, observou-se que o extrato acetônico
e a fração metanólica de P. cyparissias foram capazes de proteger o estômago
contra os danos causados principalmente pela inibição da COX. Todavia, o extrato
metanólico da planta foi capaz de inibir a ação hipernociceptiva da PGE2, principal
PG envolvida na gastroproteção. De fato, a ação da PGE2 é bastante paradoxal e
complexa, envolvendo efeitos pró- e anti-inflamatórios (HATA, BREYER, 2004),
sendo os extratos e a fração da planta em estudo capazes de inibirem os seus
efeitos nociceptivos e promoverem sua ação gastroprotetiva.
Em outro modelo, objetivou-se verificar o papel dos adrenoceptores α1 e α2,
envolvidos mais diretamente com a dor neuropática (DRAY, 2009). Assim, o efeito
anti-hipernociceptivo do extrato metanólico de P. cyparissias foi avaliado frente ao
modelo de hipernocicepção mecânica induzida por epinefrina. Os resultados
referentes a este modelo estão demonstrados na Figura 52. Como pode-se
observar, o extrato metanólico de P. cyparissias não foi capaz de antagonizar a
hipernocicepção
mecânica
promovida
pela
epinefrina,
sugerindo
que,
provavelmente, o efeito anti-hipernociceptivo do extrato esteja mais envolvido com o
bloqueio de vias envolvidas na hipernocicepção inflamatória, não atuando por meio
Epinefrina (100 ng/pata)
Extrato bruto (3mg/kg, i.p.)
Extrato bruto (10mg/kg, i.p.)
Extrato bruto(30mg/kg, i.p.)
100
200
75
150
50
25
0
AUC
Freqüência de resposta (%)
dos adrenoceptores.
*
**
***
***
100
50
0
B 0.25
0.5
1
2
Tempo (h)
4
6
Basal Controle
3
10
30
Extrato M eOH bruto (mg/kg, i.p.)
Epinefrina (100 ng/pata)
123
Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina (100 ng/pata). Os dados são expressos como a
média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do
*
**
***
limiar de retirada da pata, onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
A epinefrina é uma catecolamina que, através da ativação de segundos
mensageiros envolvendo cAMP e PKA, promove a redução do limiar dos
nociceptores e aumenta a excitabilidade da membrana neuronal (MANJAVACHI et
al., 2010). A exposição prolongada à epinefrina também gera uma expressão
aumentada de α-adrenoceptores nas fibras, além de promover o brotamento de
terminações nervosas simpáticas no gânglio da raiz dorsal, aumentando o contato
entre estas terminações e as fibras nociceptivas (STEEDS, 2009), o que provoca a
sua sensibilização.
Considerando ainda a possível atuação de P. cyparissias sobre a dor
neuropática, realizou-se o experimento de CPNC. Na figura 53 observa-se o efeito
do extrato metanólico de P. cyparissias neste modelo. Conforme os gráficos
apresentados, o tratamento com o extrato dos animais expostos a este modelo foi
capaz de reverter a sensibilização mecânica induzida, com inibição de 44,4 ± 4,6 %
e 40,0 ± 4,0 % para as doses de 3 e 10 mg/kg, mantendo seu efeito por até 12 dias
após a cirurgia.
Operado
Extrato MeOH bruto (3mg/kg, i.p.)
Extrato MeOH bruto (10mg/kg, i.p.)
Falso-operado
600
80
500
70
400
60
***
***
50
40
30
AUC
Freqüência de resposta (%)
90
***
***
*** *** ***
*
***
*** ***
***
**
**
3
10
200
100
20
0
10
0
300
B
C
7
8
9
10
11
12
13
14
Basal
FOP
Controle
Extrato M e OH
(mg/kg, i.p.)
Dias
Figura 53: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3 e 10 mg/kg, i.p.) em diferentes
intervalos de tempo após a constrição parcial do nervo ciático. Os dados são expressos como a
média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do
*
**
***
limiar de retirada da pata, onde p<0,05, p<0,01 e p<0,001. FOP = falso operado.
124
Diversos mecanismos estão envolvidos na hiperalgesia provocada pela
CPNC. Após a lesão, ocorre uma ativação constante das fibras lesadas,
promovendo a liberação de mediadores nociceptivos e de citocinas próinflamatórias, como IL-1β e TNF-α, gerando a sensibilização dos nociceptores
periféricos (CUI et al, 2001).
A lesão do nervo ciático promove descargas ectópicas, tanto pelas fibras
lesionadas quanto pelas intactas. Esta característica é explicada, ao menos em
parte, pela liberação periférica de NGF, que acarreta na sensibilização das fibras
não lesionadas. Esta sensibilização se dá pela ativação de receptores trkA pelo NGF
que, por consequência, fosforilam através de cascatas ligadas à PKA, PKC, MEK e
MAPK os receptores TRPV1, gerando a sensibilização. Ademais, o NGF promove a
liberação de fator neurotrófico derivado de células da glia, substância P e de fator
neurotrófico derivado do cérebro. Também, o complexo trkA-NGF é internalizado na
fibra, sendo direcionado ao gânglio da raiz dorsal, onde ativa uma série de cascatas
sinalizadoras, promovendo a expressão aumentada de TRPV1 (OSSIPOV;
PORRECA, 2009).
A lesão das fibras também promove uma expressão aumentada de canais
voltagem-dependentes de sódio, especialmente do tipo Nav1.3, Nav1.8 e Nav1.7.
Estes canais estão amplamente relacionados à geração de potenciais de ação
presentes na excitação neuronal, levando à sensibilização das fibras nociceptivas.
Outros canais importantes são os canais de cálcio do tipo N. Sua expressão e
atividade aumentadas resultam em uma liberação expressiva de substância P,
CGRP e de glutamato (OSSIPOV; PORRECA, 2009).
Grande parte destes eventos são apenas periféricos, sendo o mecanismo
responsável pela manutenção da dor neuropática atrelado à sensibilização central.
Esta ocorre pela diminuição do limiar de despolarização e pelo aumento do número
de fibras responsivas à estimulação nociceptiva (OSSIPOV; PORRECA, 2009). O
aumento de liberação de diversos mediadores nociceptivos (substância P, CGRP e
glutamato) pelas fibras periféricas causa resposta prolongada do corno dorsal,
promovendo o recrutamento de receptores NK1, AMPA e NMDA, sensibilizando os
neurônios secundários, o que causa a hiperalgesia e alodínia (MARCHAND, 2008).
Anteriormente, já foram realizados estudos com P. cyparissias evidenciando
seu potencial anti-nociceptivo. O extrato hidroalcoólico da planta foi capaz de inibir a
125
nocicepção neurogênica induzida pela formalina (primeira fase) e pela capsaicina,
demonstrando sua potencial ação sobre diferentes mediadores químicos, como as
cininas, taquicininas e prostaglandinas. A nocicepção inflamatória, característica da
segunda fase do modelo da formalina, foi inibida de forma mais significativa pelo
extrato, além de inibir o edema causado por este agente. Diferentemente da primeira
fase, na fase inflamatória apenas as cininas e as prostaglandinas parecem estar
envolvidas, mas não o sistema taquicinérgico. O extrato também foi capaz de
antagonizar a hipernocicepção induzida por bradicinina e por substância P. O estudo
também sugere que o efeito anti-nociceptivo de P. cyparissias não parece ter
relação com o sistema opióide (DE CAMPOS et al., 1997).
Em outro estudo, foi evidenciado o efeito inibitório do extrato hidrolacoólico de
P. cyparissias sobre contrações induzidas por diferentes agentes inflamatórios em
traquéias isoladas de cobaias (SAYAH et al., 1999). Dentre tais agentes, destacamse bradicinina, substância P, PGH2, análogo estável de tromboxano A2 U46619,
histamina e acetilcolina, todos mediadores envolvidos com a resposta nociceptiva e
inflamatória nas vias aéreas.
Baseado nos estudos prévios e tomando os resultados obtidos para a
atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias de forma conjunta, verifica-se que
sua ação foi evidenciada principalmente em modelos de hipernocicepção
inflamatória. De fato, os extratos da planta demonstraram antagonismo a diversos
mediadores da inflamação, bem como a agentes pró-inflamatórios, como a
carragenina, CFA e LPS. Em contrapartida, o extrato não apresentou atividade antihipernociceptiva no modelo de nocicepção induzida por epinefrina. Todavia, gerou
resultados promissores no modelo de CPNC. Como descrito, este último modelo
promove a sensibilização periférica e central por diferentes e variados mecanismos,
envolvendo mediadores inflamatórios e mediadores nociceptivos centrais.
Com isto demonstra-se uma atuação potencialmente sinérgica do extrato
metanólico de P. cyparissias, envolvendo uma série de distintos mecanismos para
gerar sua atividade anti-hipernociceptiva. Esta ação sinérgica é bastante comum
para extratos, visto a variabilidade molecular existente em sua constituição,
permitindo que atue por diferentes vias.
Objetivando a verificação do papel dos diferentes compostos isolados de P.
cyparissias, PC1 a PC4 foram avaliados no modelo de hipernocicepção induzida por
carragenina. Os resultados estão apresentados nas figuras 54 a 57. Para PC1,
126
observou-se uma redução significativa na resposta à hipernocicepção mecânica
(p<0,05) em todas as doses, com inibições de 21,2 ± 5,8 %, 37,3 ± 5,8 % e 41,6 ±
6,2 %, respectivamente para 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg. Todavia, esta atividade foi
observada apenas para os períodos iniciais após o tratamento. Já PC2 não foi capaz
de inibir significativamente a resposta nociceptiva, evidenciando que, provavelmente,
não participe do potencial anti-hipernociceptivo de P. cyparissias. PC3 foi capaz de
inibir a resposta dos animais à estimulação mecânica em todas as doses (p<0,01),
sendo o composto mais efetivo, com inibições de 34,2 ± 3,6 %, 47,8 ± 5,2 % e 22,1 ±
5,0% para as doses de 0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg, respectivamente. Além disto, sua
atividade perdurou durante todas as 48h de avaliação. Porém, não demonstrou
apresentar um perfil dose-resposta. Por fim, PC4 também foi efetivo quanto à
redução da hiperalgesia induzida pela carragenina (p<0,01), porém apenas nas
doses de 0,09 e 0,31 µmol/kg, com inibições de 63,6 ± 4,4 % e 40,4 ± 7,7 %,
respectivamente. Sua atuação limitou-se à 24h após a administração do agente
lesivo.
90
600
75
60
**
**
**
15
0
*
4
**
200
*** ***
***
3
**
300
100
0
B1
*
400
**
45
30
500
**
AUC
Freqüência de resposta (%)
Carragenina (300 µg/pata)
PC1 (0,02 µmol/kg, i.p.)
PC1 (0,07 µmol/kg, i.p.)
PC1 (0,24 µmol/kg, i.p.)
6
Tempo (h)
24
48
Basal Controle 0,02
0,07
0,24
PC1 (µ
µ mol/kg, i.p.)
Carragenina (300µ
µ g/pata)
Figura 54: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados PC1 (0,02 – 0,24 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção
i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde
*
**
***
p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
Carrageenina (300 µg/pata)
PC2 (0,04 µmol/kg, i.p.)
PC2 (0,12 µmol/kg, i.p.)
PC2 (0,39 µmol/kg, i.p.)
600
90
500
75
400
60
45
AUC
Freqüência de resposta (%)
127
***
200
30
15
0
300
100
***
***
B 1
3
4
6
24
0
48
Tempo (h)
Basal Controle 0,04
0,12
0,39
PC2 (µ
µ mol/kg, i.p.)
Carrage nina (300 µ g/pata)
Carragenina (300 µg/pata)
PC3 (0,04 µmol/kg, i.p.)
PC3 (0,11 µmol/kg, i.p.)
PC3 (0,37 µmol/kg, i.p.)
90
600
500
75
400
60
AUC
Freqüência de resposta (%)
Figura 55: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados PC2 (0,04 – 0,39 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção
i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde
*
**
***
p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
45
*** *
**
30
15
0
**
**
B 1
***
***
***
*
***
*
***
300
4
6
Tempo (h)
24
48
**
**
200
100
0
3
**
Basal Controle 0,04
0,11
0,37
PC3 (µ
µ mol/kg, i.p.)
Carrage nina (300 µ g/pata)
Figura 56: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados PC3 (0,04 – 0,37 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção
i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde
*
**
***
p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
Carragenina (300 µg/pata)
PC4 (0,03 µmol/kg, i.p.)
PC4 (0,09 µmol/kg, i.p.)
PC4 (0,31 µmol/kg, i.p.)
90
600
500
75
400
*
***
60
45
***
30
***
*** ***
***
B1
3
4
6
Tempo (h)
**
300
**
200
***
***
15
0
AUC
Freqüência de resposta (%)
128
100
24
48
0
Basal Controle 0,03
0,09
0,31
PC4 (µ
µ mol/kg, i.p.)
Carragenina (300 µ g/pata)
Figura 57: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados PC4 (0,03 – 0,31 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção
i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em
cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde
*
**
***
p<0,05, p<0,01 e p<0,001.
Estes resultados sugerem que os compostos PC1, PC3 e PC4 podem ser
parcialmente responsáveis pela atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias.
Ademais, considerando apenas as xantonas, pode-se inferir que um maior volume
molecular existente nas suas posições 2 e 3 contribui para a atividade, visto que: em
PC4 há a presença de um substituinte metóxi em C-2 e uma hidroxila em C-3; em
PC3 há um anel metilenodióxi substituindo C-2 e C-3; já em PC2, há apenas uma
hidroxila em C-3. Assim, com o aumento do volume dos substituintes, há um
aumento na atividade. Ademais, a presença de grupos aceptores de prótons
também pode estar relacionado ao aumento da atividade anti-hipernociceptiva. Em
PC2 há um grupo doador e aceptor (hidroxila) em C-3. Já em PC3 há a presença do
mesmo grupo na mesma posição, porém há um grupo aceptor em C-2 (metóxi).
Todavia, em PC3, há apenas grupos aceptores em ambas as posições
(metilenodióxi), podendo este fator ser parcialmente responsável pela melhor
atividade.
Alguns estudos já demonstraram a atividade anti-nociceptiva de xantonas. Em
um estudo com xantonas sintéticas 2-carboxiladas, foi evidenciada a atividade
destas moléculas sobre a nocicepção inflamatória (ECKSTEIN; MARONA; MAZUR,
1983). Já Bianco et al. (1989) sintetizaram 2-hidroxiacetil-7-acetilxantona, que,
quando avaliada frente ao modelo de contorções abdominais e edema de pata em
129
camundongos, foi capaz de gerar respostas anti-nociceptiva e anti-inflamatória
pronunciadas. Ainda, De Campos et al. (1997) verificaram que a 1,7-dihidroxi-2,3dimetoxixantona, identificada como PC5 no presente trabalho, foi capaz de reduzir o
número de contorções abdominais induzidas por ácido acético.
Mais recentemente, Dar et al. (2005) objetivaram determinar o mecanismo de
ação da mangiferina, uma xantona glicosilada. Ela foi capaz de inibir as contorções
abdominais induzidas por ácido acético, sendo sugestionado que está ação
envolveria o sistema opióide. Também, diversas xantonas sintéticas foram testadas
por Librowski et al. (2005), demonstrando que várias delas apresentaram atividade
anti-nociceptiva e anti-inflamatória, além de não provocarem efeitos adversos sobre
a mucosa gástrica. Já Cui et al. (2010) evidenciaram que tanto a α-mangostina
quanto
a
γ-mangostina,
ambas
xantonas
preniladas,
apresentaram
efeito
antinociceptivo nos modelos da placa quente e de formalina, estando esta ação
relacionada, periféricamente, à inibição da síntese de PGs e ao seu efeito
antioxidante e, centralmente, ao seu efeito antagonista sobre a histamina e a
serotonina.
Quanto ao espinasterol, Jeong et al. (2010) demonstraram seu efeito
supressor sobre mediadores pró-inflamatórios induzidos por LPS, inibindo, também,
a produção de NO, PGE2, TNF-α e IL-1β. Também, Meotti et al. (2006) e Boller et al.
(2010) verificaram a atividade antinociceptiva do esterol no modelo de contorções
induzidas por ácido acético e, posteriormente, contra a nocicepção induzida por
glutamato (RIBAS et al., 2008).
Assim, os resultados farmacológicos obtidos para o extrato e compostos
isolados ensaiados nos modelos propostos, demonstram a potencial atividade
gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de P. cyparissias. Cabe salientar que um
extrato ou metabólito isolado que apresente ambas as atividades é de extremo
interesse, visto que os AINEs, comumente utilizados por suas propriedades
analgésicas, podem gerar úlceras gástricas, conforme relatado anteriormente.
Destaca-se que avanços para delineamento de mecanismo de ação para
ambas as atividades farmacológicas são necessários, tanto para o extrato quanto
para os compostos isolados. Em adição, estes metabólitos podem servir como
protótipos para futuros estudos de derivatização de suas estruturas, objetivando
melhoramento farmacocinético e farmacodinâmico, enriquecendo ainda mais as
130
potencias aplicabilidades de produtos de origem natural para o tratamento da úlcera
e da dor.
6 CONCLUSÕES
a) Através de métodos cromatográficos clássicos, foi possível isolar 5 compostos
do extrato acetônico de Polygala cyparissias: α-espinasterol (PC1), 1,3dihidroxi-7-metoxixantona
(PC2),
1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona
(PC3), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) e 1,7dihidroxi-2,3dimetoxixantona (PC5). Além disto, da fração metanólica obteve-se, pela
primeira vez para o gênero Polygala, o flavonóide astragalina;
b) Obteve-se um perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias
que, futuramente, deverá ser aprimorado para fins de quantificação do
marcador PC3 em extratos de coletas sazonais e de diferentes partes da
planta;
131
c) O extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias apresentaram
atividade gastroprotetora frente a dois modelos de indução de lesão gástrica:
etanol/HCl e indometacina/betanecol;
d) Tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica demonstraram atividade
curativa das lesões ulcerativas no modelo de úlcera crônica induzida por
ácido acético;
e) Nem o extrato acetônico nem a fração metanólica foram capazes de inibir o
crescimento de H. pilory;
f) O extrato acetônico e a fração metanólica da planta em estudo promovem
gastroproteção de forma dependendete do NO e dos SHs;
g) O espinasterol (PC1) e as xantonas 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) e
1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona
(PC3)
demonstraram
atividade
gastroprotetora frente ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl;
h) O extrato metanólico bruto de P. cyparissias foi capaz de antagonizar a
hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, LPS, CFA e PGE2;
i) Aparentemente o efeito anti-hiperálgico de P. cyparissias não se relaciona às
vias adrenérgicas, visto que foi incapaz de reverter o estado hiperálgico
induzido por epinefrina;
j) O extrato metanólico evidenciou ser capaz de inibir a hipernocicepção
mecânica persistente induzida pela CPNC até o 12° dia;
k) Os
compostos
isolados
espinasterol
(PC1),
1,7-dihidroxi-2,3-
metilenodioxixantona (PC3) e 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4)
apresentaram atividade anti-hipernociceptiva no modelo de nocicepção
inflamatória induzida por carragenina;
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ANEXO A – Artigo publicado
148
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ANEXO B – ARTIGO DE REVISÃO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO