BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
PARA BIORREMEDIAÇÃO NA INTERFACE SOLO-PLANTAMICRORGANISMOS
João Victor Rego Ferreira
Rio de Janeiro
2012
JOÃO VICTOR REGO FERREIRA
Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia
Matrícula 0913800325
BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO PARA BIORREMEDIAÇÃO NA
INTERFACE SOLO-PLANTA-MICRORGANISMOS
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,
apresentado ao curso de Graduação em
Tecnologia em Biotecnologia da UEZO como
parte dos requisitos para a obtenção do grau de
Tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação
da Prof.a Ida Carolina Neves Direito.
Rio de Janeiro
Julho de 2012
F383
Ferreira, João Victor Rego.
Bioprospecção e identificação de microrganismos
com potencial biotecnológico para biorremediação na
interface solo-planta-microrganismos / João Victor
Rego Ferreira.
31 f.; 30 cm.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação
Tecnologia em Biotecnologia ) — Fundação Centro
Universitário Estadual da Zona Oeste, Rio de Janeiro,
2012.
Bibliografia: f. 24-31.
1. ácido2,4-diclorofenoxiacético. 2.Biodegradação.
3. Bioprospecção. 4. hortaliças I. Título.
CDD 620.112
ii
BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO PARA BIORREMEDIAÇÃO NA
INTERFACE SOLO-PLANTA-MICRORGANISMOS
Elaborado por João Victor Rego Ferreira
Aluno do curso de Tecnologia em Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com
Grau: 10 (dez)
Rio de Janeiro, de 09 de Julho 2012
_________________________________________________
Thiago Bretz Carvalho
Dr. em Biotecnologia Vegetal
_________________________________________________
Ronaldo Figueiró Portella Pereira
Dr. em Ecologia
_________________________________________________
Ida Carolina Neves Direito
Dr.a em Biotecnologia Vegetal
iii
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, professora Ida Carolina Neves Direito e meu co-orientador
Andrew Macrae pelo apoio, paciência e exemplo.
Aos técnicos do laboratório LTBM, Rafael Gomes, Adriano Pereira, Verônica
Torres e Francisco Júnior. Ao técnico José Olavo do laboratório de Biotecnologia
Sustentável e Bioinformática Microbiana da UFRJ.
Aos companheiros de laboratório Juliana Succar, Andressa Sbano, Barbara Peckle,
Angel Gomes, Kayo Bianco, Aline Lorete, Pedro Rodrigues, Juliana Chal, Ezaine
Torquato, Amanda Monteiro e Adriana Sacramento.
Aos meus amigos da UEZO, em especial Lígia Ferreira, Marcos Felipe e Yuri
Faria.
A UEZO pelo apoio financeiro e pela experiência e conhecimento adquirido.
A minha namorada Andressa Sbano que esteve ao meu lado nos momentos mais
difíceis e melhores na UEZO. Dando-me todo o apoio e tranquilidade durante a escrita
deste trabalho.
Aos professores João Bosco de Salles, Maria Cristina de Assis e Jessica Manya por
deixarem utilizar os seus laboratórios.
A toda minha família, em especial minha mãe Ilma Rego, minha irmã Luana
Rodrigues, meu pai Ilson Ferreira, minha avó Hilda Rodrigues e meu avô João Severino do
Rego.
Aos meus amigos, em especial Alleson Costa, Luan Pereira, Marcello dos Anjos e
Yuri Lima por me apoiarem nos estudos e entender os dias que fiquei ausente estudando.
A Deus por ter me dado a oportunidade de estudar nesta faculdade e conseguir
todas as glórias em minha vida!!!
iv
RESUMO
Ao longo dos anos, o aumento da agricultura em área cultivada e produtividade foi baseada
no uso de pesticidas, fertilizantes químicos e outras substâncias sintéticas. Os pesticidas
são utilizados para controlar pragas, doenças e ervas daninhas em culturas para garantir a
produtividade e qualidade do produto. Devido à toxicidade e persistência dos pesticidas,
existe uma meta mundial para desenvolver meios mais eficientes de remover os resíduos
destes presentes no meio ambiente. Uma forma de degradação dos pesticidas no meio
ambiente é a biodegradação. Um modo para localizar e descobrir o potencial de
microorganismos que degradam pesticidas é a bioprospecção. A bioprospecção representa
uma estratégia importante para a obtenção de microrganismos para a biorremediação de
áreas contaminadas. Neste estudo, foi utilizado o herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D) como um modelo para a bioprospecção de microrganismos capazes de degradar
este pesticida. O objetivo deste estudo foi a bioprospecção de bactérias degradadoras do
herbicida 2,4-D em solo aderido a hortaliças comercializadas no Rio de Janeiro - RJ.
Amostras de solo utilizadas foram coletadas a partir de solo aderido à mandioca, alface,
couve e chicória. A biopprospecção foi realizada utilizando meio MEMB. 247 isolados
foram obtidos. Os resultados corroboram com os resultados de estudos preliminares que
mostraram que bactérias com esta capacidade estão presentes em locais sem histórico de
aplicação de pesticidas.
Palavras-Chave: ácido 2,4-diclorofenoxiacético, biodegradação, hortaliças.
v
ABSTRACT
Over the years, agriculture increase in crop area and productivity was based in the
pesticides, chemical fertilizers and other synthetic substances applied. Pesticides are used
to control pests, diseases and weeds in crops to ensure productivity and product quality.
Due to the toxicity and persistence of pesticides, there is a world goal to develop efficient
ways of removing their waste from the environment. One way of degradation of pesticides
in the environment is the biodegradation. One manner to locate and discover the potential
of pesticide degrading microorganisms is the bioprospection. The bioprospection
represents an important strategy in order to obtain microrganisms for the bioremediation of
contaminated areas. In this study, was used herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D) as a model for bioprospection of microorganisms capable of degrading this pesticide.
The aim of this study was the bioprospection of degrading bacteria for 2,4-D herbicide in
soil adhering to vegetables sold in Rio de Janeiro - RJ. Soil samples used were colected
from soil adhered to cassava, lettuce, kale and chicory. The biopprospection was
performed employing MEMB medium. 247 isolates were obtained. Our results corroborate
with the results of preliminary experiments that showed that pesticide degrading bacteria
are present in places without historical of pesticides application.
Keywords: acid 2,4-dichlorophenoxyacetic, biodegradation, vegetables.
vi
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................. iv
ABSTRACT .......................................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... vii
LISTA DE TABELA .......................................................................................................... vii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................ viii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1. CONSUMO DE HORTALIÇAS ............................................................................ 2
1.1.1
IMPORTÂNCIA DAS HORTALIÇAS NA SAÚDE ................................... 2
1.1.2.
IMPORTÂNCIA FINANCEIRA DAS HORTALIÇAS NO BRASIL ......... 4
1.2. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NA SAÚDE PÚBLICA .......................... 5
1.3. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NO MEIO AMBIENTE ......................... 7
1.4. HERBICIDA ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO (2,4-D) ....................... 8
1.4.1 HISTÓRICO DO USO DO HERBICIDA 2,4-D ................................................. 8
1.4.2. CARACTERÍSTICAS DO HERBICIDA 2,4-D ................................................. 9
1.5. BIODEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS .............................................................. 10
1.5.1.
MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PESTICIDAS ................. 11
1.6. BIOPROSPECÇÃO .............................................................................................. 12
1.7. BIORREMEDIAÇÃO DE PESTICIDAS ............................................................ 12
1.8. JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 13
1.9. OBJETIVOS ......................................................................................................... 13
1.9.1.
OBJETIVO GERAL .................................................................................... 13
1.9.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 13
2. METODOLOGIA ........................................................................................................... 15
2.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D 15
2.2. COLORAÇÃO DE GRAM ...................................................................................... 16
2.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE
CARBONO ..................................................................................................................... 17
3. RESULTADOS ............................................................................................................... 18
3.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D 18
3.2. COLORAÇÃO DE GRAM ...................................................................................... 19
3.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE
CARBONO ..................................................................................................................... 20
4. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 21
5. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 24
ANEXO I............................................................................................................................. 31
Meios de cultura .............................................................................................................. 31
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Distribuição percentual dos ingredientes
ativos de pesticidas, por classes de uso - Brasil –
2005 (IBGE, 2010).
...................................................... 8
Figura 1.2. Estrutura química do 2,4-D (Ellis et al.,
.................................................. 10
2006).
Figura 2.1. Metodologia para isolamento de bactérias .................................................. 15
degradadoras do 2,4-D (modificado de Direito, 2009).
Figura 3.1. Fotos das placas após 15 dias de incubação .................................................19
Em meio MEMB.
LISTA DE TABELA
Tabela 1.1. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por ................................ 4
região geográfica, 2002-2003 (IBGE, 2012).
Tabela 1.2. Comercialização de pesticidas (em toneladas) para ................................ 5
as principais hortaliças entre os anos de 2004 a 2008 no
Brasil (Almeida et al., 2009).
Tabela 1.3. Uso de equipamentos de proteção individual por ................................... 6
trabalhadores que são expostos aos pesticidas (Faria et al., 2004).
Tabela 3.1. A tabela apresentada UFC.mL-1 em 24 e 48 horas
em função dos tipos de amostras.
................................... 18
Tabela 3.2. A tabela apresenta a quantidade de isolados obtidos .....................................19
pela bioprospecção.
Tabela 3.3. Classificação dos isolados oriundos dos solos aderidos...................................20
a cultura de chicória em gram positivos ou em gram negativos.
viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
%
Porcentagem
°C
Grau Celsius
µL
Microlitro
2,4,5-T
Ácido triclorofenoxiacético
2,4-D
Ácido 2,4 Diclorofenoxiacetico
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
DNA
Ácido desoxirribonucleico
EPA
Environmental Protection Agency
EPI
Equipamento de Proteção Individual
g
Gramas
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
LB
Meio de cultura Luria Broth
MEMB
Meio de cultura diferencial descrito por CHONG (2005)
mL
Mililitro
pH
Potencial Hidrogeniônico
pka
Constante de acidez
rpm
Rotações por minuto
UEZO
Centro Universitário Estadual da Zona Oeste
UFC
Unidade formadora de colônia
USEPA
Agência de Proteção Ambiental Americana
1
1. INTRODUÇÃO
Ao longo dos anos, a agricultura mundial cresceu em área cultivada e produtividade
acompanhada pelo uso intenso de pesticidas, adubos químicos e outras substâncias
sintéticas (Armas e Monteiro, 2005). O benefício mais comum associado à utilização
dessas substâncias químicas seria o aumento na produtividade da lavoura, ou seja, uma
maior produção agrícola obtida para uma determinada área plantada (Veiga, 2007). O
aumento na produtividade seria capaz de reduzir a demanda por recursos naturais (terra e
água) e por alguns recursos tecnológicos (mecanização) para a produção de uma mesma
quantidade de produtos agrícolas a ser ofertada (Veiga, 2007).
Utilizam-se pesticidas para controle de pragas, doenças e plantas daninhas em
plantações para assegurar a produtividade e a qualidade dos produtos (Vieira e Prado,
1998). As pragas causam vários danos mecânicos nas plantas, o que além de prejudicar a
produção vegetal, favorece o surgimento de doenças, principalmente fúngicas (Ghini e
Bettiol, 2000). As doenças infectam os vegetais causando doenças vasculares, foliculares,
seca das ramas, podridão das raízes, nematóides e morte prematura (Junqueira et al., 2000).
As plantas daninhas têm efeitos negativos na produção, uma vez que competem com a
cultura por espaço, água, luz e, principalmente, nutrientes; além de serem muitas vezes
hospedeiras de pragas e doenças (Vieira e Prado, 1998).
Dependendo da sua atuação, os pesticidas se apresentam em diversas classes como
herbicidas, acaricidas, fungicidas, larvicidas, algicidas e inseticidas (Coutinho et al., 2005).
Os herbicidas constituem uma importante classe de pesticidas usados no controle de
plantas daninhas (Amarante Júnior, 2002). A aplicação dos herbicidas tem aumentado nos
países desenvolvidos durante as últimas décadas (Guedes, 2010). Dentre os países
consumidores de pesticida, o Brasil foi o oitavo maior consumidor mundial destes em 2006
(Galli, 2006; apud Rodrigues e Andrietta, 2010). No mercado mundial dos pesticidas, os
herbicidas merecem destaque por representarem 47% do total comercializado, sendo
seguidos pelos inseticidas que representam 25% do mercado mundial de pesticidas
(Guedes, 2010).
O uso indiscriminado de pesticidas e sem conhecimento dos efeitos secundários
destes pelos agricultores acarretou danos ao meio ambiente e, logo, a qualidade de vida do
homem ficou comprometida (Vieira e Prado, 1998). Sem as devidas precauções e cuidados
em relação a manipulação, produção, estocagem e destino final dos pesticidas, não só o
2
meio ambiente corre risco, mas também a saúde das pessoas que de alguma forma entram
em contato com tais produtos (Dams, 2006). A utilização destes agentes químicos gerou a
contaminação de grãos, frutas, legumes, hortaliças e verduras, trazendo inúmeros
malefícios ao meio ambiente, produtores rurais e aos consumidores (Ciscato, 2011).
Embora a aplicação de pesticidas em monocultivos realizados em grande escala seja uma
prática difícil de ser abolida em função da dificuldade de práticas rápidas e eficientes de
controle de pragas, doenças e plantas daninhas, existe uma busca por tecnologias
alternativas que gerem menor impacto ao meio ambiente. Segundo Rodrigues e Andrietta
(2010), também há uma preocupação geral em desenvolver formas eficientes de remoção
de resíduos de pesticidas do meio ambiente.
Uma dificuldade para o desenvolvimento de uma forma eficiente de remoção de
resíduos de pesticidas do meio ambiente é o fato de que a persistência do pesticida no solo
dependente das características do solo, especialmente do tipo de argila, e dos fatores
climáticos tais como radiação, temperatura, umidade e oxigenação (Burns, 1975; apud
Direito, 2009). É a associação destes fatores, juntamente com as características da
molécula, que determinam o tempo de vida dos pesticidas no ambiente (Regitano e
Bonfleur, 2011).
A biorremediação vem se destacando por ser uma tecnologia que emprega
microrganismos para a remoção de poluentes no meio ambiente (Brito, 2010). Para
podermos fazer uso desta tecnologia, é preciso um estudo para o isolamento e a
identificação de microrganismos capazes de degradarem o poluente desejado, ou seja, a
bioprospecção (Santos, 2011). Neste trabalho, realizamos a bioprospecção de bactérias
degradadoras do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) em amostras de solos
aderidos a hortaliças. Para melhor compreensão da justificativa da realização deste estudo
apresentamos maiores informações nos tópicos que se seguem.
1.1.
CONSUMO DE HORTALIÇAS
1.1.1 IMPORTÂNCIA DAS HORTALIÇAS NA SAÚDE
Inúmeros estudos realizados nas últimas décadas têm demonstrado o importante
papel da alimentação causando ou prevenindo doenças (Figueiredo, 2008). A população
3
brasileira tem, ultimamente, mudado seus hábitos alimentares para pior (Monteiro et al.,
2000). O consumo de doces, refrigerantes e massas tem aumentado bastante, enquanto o
consumo de arroz, feijão, frutas e verduras vêm diminuindo muito (Monteiro et al., 2000).
Por esta razão, Monteiro et al. (2000) colocam que a qualidade da alimentação do
brasileiro está se tornando inadequada.
Nas últimas décadas, condições favoráveis à ocorrência de deficiências nutricionais
têm sido gradativamente substituídas por epidemia de obesidade e doenças crônicas
relacionadas ao consumo excessivo e desequilibrado de alimentos (Valla, 2000). Segundo
Claro et al. (2007), o padrão dietético associado à obesidade e a outras doenças crônicas é
caracterizado essencialmente pelo consumo insuficiente de frutas, legumes, verduras e pelo
consumo excessivo de alimentos de alta densidade energética e ricos em gorduras,
açúcares e sal.
O consumo insuficiente de hortaliças e frutas é um fator de risco relacionado à
causa de doenças crônicas não transmissíveis para a população (Melo, 2009). Esses
alimentos são importantes para uma dieta saudável, pois são fontes de micronutrientes,
fibras e de outros componentes com propriedades funcionais (Jaime et al., 2007). As frutas
e hortaliças têm baixa densidade energética, o que favorece a manutenção saudável do peso
corporal (Melo, 2009). Segundo Ornellas (2001) é de grande importância a inclusão de
hortaliças variadas na dieta por causa do seu efeito alcalinizante sistêmico, além de
favorecerem o preenchimento das quotas vitamínicas, minerais e aumentarem o resíduo
alimentar no trato digestivo. Comer uma variedade de hortaliças garante, seguramente,
uma adequada ingestão da maior parte dos micronutrientes, fibras e uma gama de fatores
nutricionalmente essenciais (Gomes, 2007). Além disso, o aumento do consumo de
hortaliças pode ajudar a substituir alimentos que possuem altas concentrações de gorduras
saturadas e sal (Gomes, 2007). As hortaliças, além de fornecerem componentes
importantes para desempenharem funções básicas do organismo como, por exemplo, ácido
ascórbico, betacaroteno e ácido fólico, são fontes de compostos bioativos diretamente
associados à prevenção de doenças (Faller e Fialho, 2009).
4
1.1.2. IMPORTÂNCIA FINANCEIRA DAS HORTALIÇAS NO BRASIL
A globalização da economia tem causado alterações em todos os elos da cadeia
produtiva brasileira de hortaliças (Melo e Vilela, 2007). Entre 1990 e 2006 no Brasil, a
área de produção de hortaliças cresceu 5%, enquanto a produção cresceu 63% em função
do aumento da produtividade de 54% (Melo e Vilela, 2007). Em 2003, o consumo de
hortaliças nas regiões Sudeste e Sul, em média, foi aproximadamente 60% superior à
média das regiões Norte, Nordeste e Centro-oeste (Tabela 1.1) (Melo e Vilela, 2007). Em
2005, a produção total de hortaliças foi de 17.385,9 mil toneladas, ocupando uma área
cultivada de 785,2 mil hectares (Melo e Vilela, 2007). O valor total da produção de 2005
foi estimado em R$ 11.482,42 milhões (IBGE, 2005).
Tabela 1.1. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por região geográfica, 20022003 (IBGE, 2012).
A produção de hortaliças é apresentada em grupos sendo o primeiro composto por
raízes, bulbos e tubérculos que correspondem a 40% da produção, o segundo composto por
“hortaliças frutos” (legumes) que correspondem a 37% da produção, o terceiro composto
por hortaliças folhosas que compreendem a 16% da produção, o quarto composto por
melancia, melão e morango que correspondem a 7,5% da produção, e o quinto composto
por outras hortaliças e condimentares que correspondem a 6,2% da produção (IBGE,
2005). Muito desta produção foi assegurada pelo uso de pesticidas no controle de pragas,
doenças e plantas daninhas (Tabela 1.2). O consumo de pesticida no grupo das hortaliças
aumentou em 8% entre os anos de 2004 a 2008 (Tabela 1.2).
5
Tabela 1.2. Comercialização de pesticidas (em toneladas) para as principais hortaliças
entre os anos de 2004 a 2008 no Brasil (Almeida et al., 2009).
Ano
Total de pesticidas
aplicados (t)
Hortaliças
Alho
Batata Inglesa
Cebola
Horticultura
Melão
Tomate Rasteiro (indústria)
Tomate Envarado (mesa)
Total
2004
2005
2006
2007
2008
463.604
485.969
480.120
599.834
673.892
123
8.259
611
4.318
264
1.385
3.800
18.760
169
8.146
655
4.399
332
1.657
4.146
19.504
113
8.436
632
632
298
1.589
3.158
17.813
144
8.151
586
7.031
264
1.805
3.322
21.303
148
8.414
755
4.455
296
1.720
4.519
20.307
Se a ingestão de hortaliças é um habito saudável e recomendado, com o emprego de
pesticidas os cuidados devem ser redobrados a estes alimentos comumente ingeridos crus.
Ao mesmo tempo, o uso de pesticidas nos desperta o interesse em verificar a presença de
organismos capazes de degradarem estes pesticidas aderidos ao solo destas hortaliças.
Neste trabalho, utilizamos amostras de solo aderidos as hortaliças chicória, alface lisa,
alface crespa, couve e aipim, comercializados regularmente no Rio de Janeiro, com a
finalidade de encontrar microrganismos degradadores de pesticida.
1.2.
IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NA SAÚDE PÚBLICA
A exposição ocupacional aos pesticidas tem um forte impacto na saúde pública
(Dams, 2006). Keifer e Mahurin (1997) observaram que as consequências neurotóxicas de
uma exposição aguda de alto nível estão associadas a uma série de sintomas e defeitos na
conduta neurológica e anormalidades na função nervosa. Os sintomas neurológicos menos
severos incluem dor de cabeça, tontura, náusea, vômito e excessivo suor (Dams, 2006). Já
os mais perigosos são o desenvolvimento de fraqueza muscular e bronquiespasmos,
podendo progredir para convulsões e coma (Dams, 2006). Entre algumas das
manifestações de intoxicação por pesticidas observadas em trabalhadores rurais estão a
diminuição das defesas imunológicas, anemia, impotência sexual masculina, cefaléia,
insônia, alterações da pressão arterial, alterações do humor e distúrbios do comportamento,
como surtos psicóticos (Lundberg et al., 1997).
6
A carência na assistência técnica ao homem do campo, a dificuldade do
cumprimento das leis e os próprios trabalhadores que se opõem ou não têm conhecimento
quanto ao uso dos equipamentos de segurança pessoal (Equipamento de Proteção
Individual – EPI) agravam a situação de contaminação tanto humana como ambiental
(Oliveira et al., 2000). A tabela 1.3 mostra o uso de equipamentos de proteção individual
por trabalhadores que são expostos aos pesticidas nas atividades agrícolas (Faria et al.,
2004). Segundo Faria et al. (2004), mais de 35,0% dos trabalhadores admitiram nunca usar
luvas, máscaras ou roupas de proteção. O uso de EPI foi mais frequente nos homens e nas
pessoas com escolaridade média de 5 a 8 anos, enquanto as mulheres e o grupo sem
escolaridade era o que menos usava estes equipamentos (Faria et al., 2004). O acesso a
orientações técnicas para práticas agrícolas mostrou-se relacionado a maior uso de EPI
específico para proteção química (Faria et al., 2004). Os trabalhadores rurais que usavam
mais EPI trabalhavam nos estabelecimentos com maior renda bruta de produção, maior
nível de mecanização e tinham jornada de trabalho agrícola mais extensa (Faria et al.,
2004).
Tabela 1.3. Uso de equipamentos de proteção individual por trabalhadores que são
expostos aos pesticidas (Faria et al., 2004).
Entrevistados
Características
Sexo
Masculino
Feminino
Idade em anos
15-19
20-29
30-39
40-49
50-59
60 ou mais
Aplica agrotóxico
Não
Até 2 dias por mês
3 ou mais dias por mês
Onde trabalha com agrotóxico
Uma propriedade
Mais de uma propriedade
Escolaridade em anos
Sem escolaridade
1-4
5-8
Mais de 8
Orientação técnica
Não
Até 1 vez por ano
Mais de 1 vez por ano
Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Total
Luvas (%)
Máscaras
(%)
Roupas de proteção
(%)
706
399
62,8
45,2
60,0
37,2
67,8
55,6
88
179
284
256
182
116
63,2
56,8
61,3
56,2
53,3
45,2
46,0
54,0
62,8
49,8
41,7
47,0
66,7
63,1
70,6
61,4
52,2
66,1
449
518
493
33,5
53,1
66,7
22,3
49,8
63,7
34,7
63,6
70,6
1.141
81
54,7
65,4
50,2
63,0
62,0
63,0
46
465
503
91
32,6
55,5
60,8
52,2
32,6
52,4
54,9
42,2
56,5
60,7
67,7
58,9
297
205
586
32,0
58,5
68,4
26,3
56,6
63,3
46,8
66,8
70,8
7
Além da contaminação ocupacional de produtores agrícolas, é possível que os
alimentos comercializados nas cidades apresentem resíduos de pesticidas (Dams, 2006).
Estudos têm demonstrado a presença de resíduos de vários produtos como inseticidas
organoclorados e fungicidas organofosforados em sucos de fruta e vinhos (Tadeo et al.,
2004). A contaminação dos alimentos pode vir de uma aplicação direta em uma das fases
da produção, do transporte ou do armazenamento, devido a uma possível manipulação
errada dos trabalhadores, ao uso excessivo dos pesticidas (Tadeo et al., 2004) ou da
comercialização de produtos sem respeitar o período de carência da aplicação de
pesticidas. Desta maneira, tanto produtores quanto consumidores podem se contaminar
diretamente pelo contato com pesticidas. Também a ingestão pelo ser humano de animais
contaminados através da biomagnificação (acúmulo do pesticida ao longo da cadeia
alimentícia) ou o contato com o meio ambiente contaminado podem gerar intoxicações. Os
riscos do uso de pesticidas não se limitam ao homem do campo ou ao consumidor, pois os
resíduos das aplicações atingem os mananciais e o solo (Dams, 2006).
1.3.
IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NO MEIO AMBIENTE
Ao utilizar produtos sintéticos, como os pesticidas, o homem tem contaminado o
ecossistema em decorrência da fácil dispersão desses produtos e de sua longa permanência
no meio ambiente (Moreira, 2004). Outra forma que pode ocasionar o aumento da área de
contaminação por pesticida no ambiente é através da contaminação indireta, que pode
ocorrer em decorrência de fortes chuvas e erosão nos solos tratados que desencadeiam a
movimentação dos pesticidas para outras áreas que não as de sua aplicação (Yang et al.,
2006). Os pesticidas podem ser volatilizados e dispersos pelo vento ou lixiviados, sendo
assim transportados através da atmosfera e do solo (Gonzalez et al., 2005).
Os pesticidas no meio ambiente também podem ser degradados. Uma das formas de
conseguir degradar o pesticida no meio ambiente é transformando-o (Damin, 2005). A
transformação de pesticida pode ser abiótica ou biótica (Bollag e Liu, 1990). A
transformação abiótica ocorre quando o pesticida é transformado pela ação de
componentes físicos ou químicos do ambiente (Damin, 2005). A elevação do pH do solo,
por exemplo, pode contribuir com a hidroxilação destas moléculas, sendo este um dos
principais processos envolvidos na degradação de pesticidas devido ao aumento de sua
8
polaridade (Bollag e Liu, 1990). Já a transformação biótica ou biodegradação ocorre pela
ação do metabolismo de microrganismos (Damin, 2005) (Veja item 1.5. Biodegradação de
pesticidas).
1.4.
HERBICIDA ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO (2,4-D)
Dentre os inúmeros herbicidas existentes, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
é o segundo herbicida mais utilizado no Brasil, ficando atrás apenas do glifosato (IBGE,
2010) (Figura 1.1). Ele é o ingrediente ativo de várias formulações de herbicidas que têm
sido amplamente aplicados para controlar plantas daninhas eudicotiledôneas em culturas
de milho, trigo, aveia, cevada e cana de açúcar (Guedes, 2010). O 2,4-D também é
empregado para controlar plantas daninhas em acostamentos de estradas e sob linhas de
transmissão elétrica (Vieira e Prado, 1998). Por ser uma auxina sintética, o 2,4-D é
utilizado em laboratórios para indução de calos e age como regulador de crescimento em
cultura de tecidos, tendo um efeito de supressão da morfogênese (Guerra e Nodari, 2006).
Figura 1.1. Distribuição percentual dos ingredientes ativos de pesticidas por classes de uso
- Brasil – 2005 (IBGE, 2010).
1.4.1 HISTÓRICO DO USO DO HERBICIDA 2,4-D
A utilização do 2,4-D em larga escala não é recente. Este composto foi
desenvolvido durante a Segunda Guerra Mundial (1939-1945) por uma equipe britânica
com o objetivo de aumentar a produção agrícola durante a guerra (Federation of American
9
Scientists, 2006). O composto também foi posteriormente utilizado na Guerra do Vietnã
(1954-1975), juntamente com o herbicida 2,4,5-T (ácido triclorofenoxiacético), para a
produção do agente laranja (Frumkin, 2003). Este composto foi utilizado como desfolhante
das florestas Vietnamitas na operação conhecida como “Ranch Hand” (1962-1971), onde
cerca de 68.000 m3 de 2,4-D foram aplicados por aviões e helicópteros americanos nas
áreas rurais (Federation of American Scientists, 2006). Segundo a Environmental
Protection Agency (EPA), os efeitos na saúde dos soldados americanos que participaram
da Guerra do Vietnã, incluindo alguns tipos de carcinoma, são resultado do contato direto
com o 2,4-D (Federation of American Scientists, 2006). Em 1946, quando foi
comercialmente lançado, o 2,4-D tornou-se o primeiro herbicida seletivo bem sucedido,
permitindo o controle de plantas daninhas em plantações como milho, trigo, arroz e cevada
(Guedes, 2010). Logo foi transformando-se rapidamente no herbicida mais extensamente
usado em todo o mundo (Amarante Júnior, 2002).
1.4.2. CARACTERÍSTICAS DO HERBICIDA 2,4-D
O 2,4-D é um herbicida seletivo, sistêmico e pós-emergente (Amarante Júnior,
2002). Uma vez absorvido pela planta, acumula-se nas raízes e age promovendo o
crescimento desordenado das células e, consequentemente, impedindo o transporte de água
e nutrientes através da planta (Amarante Júnior, 2002). O 2,4-D é classificado pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), pela Organização Mundial de Saúde
(World Health Organization - WHO) e pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados
Unidos (United States -Environmental Protection Agency/ US-EPA) como um herbicida
hormonal de toxicidade II (Amarante Júnior et al., 2003), por ser um agente carcinogênico
que afeta o coração, o fígado e o sistema nervoso central levando a convulsões (Silva e
Stets, 2006). Devido a estas características e por ser usado como fonte de carbono e
energia por bactérias presentes no solo, o herbicida 2,4-D é amplamente estudado e usado
como modelo para a compreensão dos mecanismos de degradação de compostos
cloroaromáticos (Bradley et al., 1996).
O 2,4-D tem a fórmula molecular C8H6Cl2O3 (Massa Molar = 221,0g.mol-1)
(Amarante Júnior, 2002) (Figura 1.2). Em condições ambientais, o 2,4-D apresenta-se
como sólidos cristalinos (Amarante Júnior, 2002). Este herbicida é um ácido orgânico com
10
pKa 2,6 e pouca solubilidade em água (Silva e Stets, 2006). Já na sua forma comercial
pode ser encontrado na forma de sais, amina e éster (Amarante Júnior et al., 2003). Nestas
condições, o 2,4-D é solúvel em água e pode ser facilmente pulverizado nas plantações.
Figura 1.2. Estrutura química do 2,4-D (Ellis et al., 2006).
Por todas as razões antes apresentadas, o herbicida 2,4-D foi utilizado como
modelo neste trabalho para a bioprospecção de microrganismos biodegradadores de
pesticidas. O uso indiscriminado e pouco criterioso de pesticidas trouxe e continua
trazendo problemas muitos sérios para o ambiente e para a saúde humana (Silva e Stets,
2006). Portanto, o desenvolvimento de um processo de degradação eficiente para
pesticidas é extremamente relevante e necessário (Silva e Stets, 2006).
1.5.
BIODEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS
Biodegradação é a decomposição de uma determinada molécula em componentes
mais simples, realizada por organismos vivos como: bactérias, fungos, plantas, animais e
etc (Lima et al., 2001). A degradação microbiana é realizada por bactérias, fungos e outros
microrganismos que utilizam o pesticida como fonte de carbono (Cerniglia, 1984).
Devemos lembrar que a degradação microbiana não depende somente da presença dos
microrganismos com as enzimas degradadoras apropriadas, mas também de uma série de
condições ambientais (He e Tang, 2005). A degradação microbiana geralmente ocorre no
solo, sendo sensíveis as condições de umidade, temperatura, aeração, pH, densidade das
raízes, fertilização e quantidade de matéria orgânica que geralmente afetam o grau da
degradação em virtude da direta influência desses fatores sobre o crescimento dos
microrganismos e a atividade microbiana (Hinsinger et al., 2003).
11
Os microrganismos do solo têm uma função importante na atenuação dos efeitos
ambientais dos compostos orgânicos, uma vez que podem adaptar-se à presença desses
compostos potencialmente tóxicos e sobreviver por meio de sua degradação, ou seja,
utilizar essas moléculas como fonte de carbono e energia (Silva et al., 2002).
1.5.1. MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PESTICIDAS
Os microrganismos degradadores de pesticidas são encontrados no mundo
microbiano tendo muitos tipos fisiológicos: aeróbios, anaeróbios (fermentativos,
metanogênicos, redutores de enxofre), quimiolitotróficos e organismos fotossintéticos
(Fogel et al., 2001). Os resíduos de pesticidas podem ser mineralizados por um simples
microrganismo ou por conjuntos de microrganismos (Fogel et al., 2001). A biodegradação
de um complexo de moléculas normalmente envolve o efeito interativo das comunidades
mistas de microrganismos e conta com a versatilidade metabólica das bactérias e fungos
(Cavalcanti, 1997). Uma forma muito utilizada de localizar e descobrir o potencial desses
microrganismos degradadores de pesticidas é utilizando a bioprospecção (Wilson, 1997).
Foi empregando a bioprospecção que Direito (2009) identificou isolados
pertencentes aos gêneros Bacillus, Paenibacillus, Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter,
Brevibacterium,
Streptomyces,
Brachybacterium,
Microbacterium,
Ochrobactrum,
Brevundimonas, Pseudomonas, Achromobacter e Tetrathiobacter capazes de crescerem na
presença do herbicida 2,4-D como única fonte de carbono. A autora também pôde observar
que a distribuição destes microrganismos era independente do sistema de cultivo agrícola
ter tido ou não contado com o 2,4-D ou qualquer outro tipo de pesticida.
Existem vários estudos quanto à distribuição dos microrganismos nos mais
diferentes ambientes (Madigan et al., 2004). Quando se pensa em solo, especialmente em
sistemas agrícolas, a comparação é feita entre rizosfera (solo sob influência radicular) e
bulk (solo sem influência radicular) (Direito, 2005). A rizosfera apresenta maior
abundância das populações bacterianas nas proximidades das raízes do que a observada em
bulk (Smalla et al., 2001). Por outro lado, a diversidade filogenética diminui com a
proximidade das raízes (Marilley e Aragno, 1999).
A partir dos relatos dos estudos acima citados, escolhemos as amostras de chicória,
alface lisa, alface crespa, couve e aipim, devido sua proximidade ao solo e,
consequentemente, maior proximidade com as bactérias da rizosfera. Sendo assim,
12
consideramos que nosso objetivo de encontrar bactérias degradadoras do herbicida 2,4-D
poderia ser mais facilmente atingido.
1.6.
BIOPROSPECÇÃO
A bioprospecção não é uma atividade nova na história humana (Trigueiro, 2009).
Desde seus primórdios, a humanidade experimenta os recursos biológicos disponíveis na
natureza e procura obter, a partir destes recursos, por exemplo, novos objetos e utensílios
para sua vida diária (Trigueiro, 2009). É o caso da utilização da pele dos animais para o
vestuário, do uso de ervas para o tratamento de doenças e das tinturas de determinadas
plantas para a pintura do corpo e para as artes (Trigueiro, 2009).
A bioprospecção pode ser definida como: “o método ou forma de localizar, avaliar
e explorar sistemática e legalmente a diversidade de vida existente em determinado local”
(Santos, 2011). Ela tem como principal finalidade a busca de recursos genéticos e
bioquímicos para fins comerciais (Santos, 2011). Podemos destacar como vantagens da
bioprospecção propiciar conhecimento da biodiversidade e seu potencial biotecnológico
(Wilson, 1997) e fornecer substâncias importantes ao homem, através das atividades
bioquímicas (Wilson, 1997). Assim, a bioprospecção de organismos selecionados
naturalmente representa uma estratégia importante, a fim de obter agentes para a
biorremediação de áreas contaminadas e por ser uma técnica de baixo custo (Martins,
2010).
1.7.
BIORREMEDIAÇÃO DE PESTICIDAS
A partir dos microrganismos selecionados pela bioprospecção, podemos
biorremediar áreas contaminadas (Brito, 2010). A biorremediação é uma ferramenta
importante na biotecnologia, pois propicia um aumento na biodegradação já existente no
solo, provocando um aumento da atividade microbiana degradadora já existente (Brito,
2010). É considerado um método natural e relativamente simples, menos agressivo e mais
adequado para a manutenção do equilíbrio ecológico, além do baixo custo quando
comparados às alternativas físicas e físico-químicas (Brito, 2010).
Biorremediação é um processo biológico definido, segundo a Agência de Proteção
Ambiental Americana (USEPA, 1990), como o “processo de tratamento que utiliza
13
naturalmente
microrganismos
para
degradar
substâncias
toxicamente
perigosas
transformando-as em substâncias menos ou não tóxicas”. A biorremediação pode ser
realizada por métodos in situ, onde o tratamento do ambiente contaminado é feito no
próprio local, ou por métodos ex situ, onde consistem em escavar o solo contaminado ou
extrair a água subterrânea por bomba para então poder aplicar o tratamento em outro local
(Jacques, 2007). Neste trabalho, buscamos a biprospecção de bactérias degradadoras do
2,4-D para futura aplicação em biorremediação.
1.8.
JUSTIFICATIVA
Para conter o avanço da contaminação do meio ambiente por pesticidas, uma
estratégia de bioprospecção de microrganismos degradadores de pesticidas usando como
modelo o herbicida 2,4-D foi traçada neste estudo. Visando conter esta contaminação,
escolhemos vegetais cultivados no Brasil para que os microrganismos neles presentes
possam ser, no futuro, utilizados em plantações para biorremediação de áreas
contaminadas pelo 2,4-D. Assim, estes microrganismos estariam adaptados ao clima e
outros fatores ambientais da região, minimizando a possibilidade de desequilíbrio
ecológico nas plantações onde esses microrganismos futuramente possam ser utilizados.
1.9.
OBJETIVOS
1.9.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi realizar a bioprospecção de bactérias degradadores do
herbicida 2,4-D em solos aderidos a hortaliças comercializadas no Rio de Janeiro - RJ.
1.9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Isolar bactérias capazes de crescerem na presença do herbicida 2,4-D em
amostras de solo aderidas a chicória, alface lisa, alface crespa, couve e
aipim usando meio diferencial.
14
•
Identificar bactérias capazes de crescerem na presença do herbicida 2,4-D
como única fonte de carbono empregando meio mineral.
15
2. METODOLOGIA
2.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D
Foram coletadas amostras de solo aderido ao aipim, chicória, alface lisa, alface
crespa e couve. Foi pesado 0,5 g do solo aderido a cada cultura e diluído a 10-1 em solução
salina. O material foi incubado a 150 rpm, por 50 minutos a 30°C. Foi preparada diluição
seriada em solução salina (NaCl 0,85%) de 10-2 a 10-7. De cada diluição de amostra foram
plaqueados 200 µL em cada placa de petri contendo meio diferencial MEMB (Chong,
2005) (Anexo I). O plaqueamento foi realizado a partir da diluição 10-2, em triplicata. Após
o plaqueamento as placas foram incubadas a 30°C (Figura 2.1). Foi realizada a
determinação de UFC.mL-1 (unidade formadora de colônia por mililitro) após 24 e 48h de
incubação das placas, os cálculos de UFC foram realizados em todas as placas que
apresentaram o número mínimo de 50 e máximo de 250 colônias. O isolamento foi
realizado através da seleção por visualização morfológica das colônias, sendo isoladas
colônias de todas as cores a exceção das azuis (colônias sem capacidade de degradação do
2,4-D pré-identificadas através do uso do meio diferencial) utilizando meio LB enriquecido
com 2,4-D a 500 mg.L-1. A técnica para obtenção de culturas puras foi a do esgotamento.
Figura 2.1. Metodologia para isolamento de bactérias degradadoras do 2,4-D (modificado
de Direito, 2009).
16
Os isolados obtidos foram conservados em estoque com glicerol 30%. Para fazer o
estoque destas bactérias foi realizado o cultivo em meio LB líquido enriquecido com 2,4-D
a 30ºC. Após 48 horas de incubação, cada tubo de ensaio foi homogeneizado e, em
seguida, concentrado em microtubo de 2 mL por centrifugação a 10.000 rpm por 10
minutos. O sobrenadante foi descartado e a operação repetida. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 0,5 mL de meio LB líquido enriquecido com
2,4-D e 0,5 ml de glicerol 30%. Após este processo os isolados foram congelados.
Dentre os cinco lotes de amostras, foi selecionado o lote de isolados oriundos da
cultura da chicória para realização da coloração de gram e a verificação da capacidade de
crescimento dos isolados em meio mineral contendo 2,4-D como a única fonte de carbono.
2.2. COLORAÇÃO DE GRAM
A primeira etapa da coloração de gram foi realizar a fixação dos isolados. A fixação
ocorreu da seguinte maneira: Uma quantidade mínima de amostra da colônia bacteriana de
uma placa de petri com meio MEMB foi coletada com o auxílio da alça de platina e
colocada sobre uma lâmina. Foi adicionado uma gota de água milli-Q estéril sobre o
material que, em seguida, foi espalhado sobre a lâmina. Em seguida, o material foi fixado
flambando a lâmina na chama da lamparina. A segunda etapa é cobrir a lâmina com a
solução de cristal violeta e deixar agir por 30 segundos a 1 minuto. Após este tempo o
excesso do corante é retirado deixando que o mesmo escorra da superfície da lâmina. Na
terceira etapa, ainda sem lavar a lâmina, cobre-se o material com solução de lugol e deixar
agir por 1 minuto. Em seguida, o excesso da solução é retirado deixando que o mesmo
escorra da superfície da lâmina. Na quarta etapa é realizada a lavagem da lâmina com a
solução de álcool-acetona até que não desprenda mais líquido na cor rósea, ou seja, até que
o descorante (álcool-cetona) se torne imediatamente incolor. Na quinta etapa a lâmina é
lavada com água corrente. Na sexta etapa a lâmina é coberta com fucsina, deixando agir
durante 30 segundos. Na sétima etapa o corante foi retirado sendo lavado com água
corrente. A observação da lâmina se deu em microscópio óptico.
17
2.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE
CARBONO
Os isolados de chicória foram repicados para tubos de ensaio com meio de cultura
mineral usando o 2,4-D como a única fonte de carbono (FÜSCHSLIN et al., 2003) (Anexo
I). Todos os isolados foram empregados em triplicata. Eles foram encubados por 21 dias a
30ºC. Após este período foi realizada a leitura dos tubos, através da visualização a olho nu,
para verificar o crescimento dos isolados através da turbidez do meio de cultura em relação
ao meio sem inoculação.
18
3. RESULTADOS
3.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D
A contagem de UFC.mL-1 com 24 e 48 horas após a incubação forneceu um
parâmetro das condições do inóculo inicial usado na bioprospecção (Tabela 3.1).
Tabela 3.1. A tabela apresentada UFC.mL-1 em 24 e 48 horas em função dos tipos de
amostras.
UFC.mL-1
Amostras de solo
24h
48h
Aipim
1,03x107
3,05x107
Alface lisa
6,4X105
3,25X106
Alface crespa
5,0x105
6,5x105
Chicória
3,96x105
8,03x105
Couve
1,21x105
4,66x105
Os isolados ficaram encubados por 15 dias, depois disso foi feita a seleção das
colônias em função de características morfológicas e realizados repiques para manter as
culturas puras. O principal meio utilizado neste trabalho é o MEMB que é uma variação do
meio EMB empregado na microbiologia para identificação de bactérias fermentadoras de
lactose (Loos, 1975; Direito, 2009). No MEMB, as colônias de microrganismos
degradadores de 2,4-D possuem coloração avermelhada e as não degradadoras a coloração
azulada (Direito, 2009). Como relatado por Direito (2009), além das colônias de coloração
azulada e avermelha, houve o crescimento de colônias com coloração verde e amarela
(Figura 3.1). A visualização das colônias que degradam o 2,4-D pela alteração da cor da
colônia é induzida pela acidificação do meio (Chong, 2005; Direito, 2009). Como as
colônias verdes e amarelas não são nem avermelhadas (degradadoras do 2,4-D) nem
azuladas (não degradadoras do 2,4D), estas também foram selecionadas.
isolados obtidos são apresentados na tabela 3.2.
O total de
19
A
B
C
Figura 3.1. Fotos das placas após 15 dias de incubação em meio MEMB.
As setas identificam em: A, colônias com coloração roxa; B, colônias com coloração verde (seta verde) e
amarela (seta amarela); C, colônias com coloração azul (seta azul) e vermelha (seta vermelha).
Tabela 3.2. A tabela apresenta a quantidade de isolados obtidos pela bioprospecção.
Amostras de solo
Quantidade de isolados
Aipim
62
Alface crespa
44
Couve
39
Chicória
45
Alface lisa
57
3.2. COLORAÇÃO DE GRAM
Foi observado que os isolados do lote oriundo do isolamento de bactérias isoladas
de solo aderido a cultura da chicória registrados sob os códigos CH1; CH7; CH10; CH11;
CH12; CH13; CH17; CH18; CH19; CH20; CH21; CH22; CH23; CH24; CH25; CH26;
CH27; CH29; CH32; CH33; CH34; CH38; CH40; CH42; CH44 e CH45
são gram
positivos (Tabela 3.3). Já os de códigos CH2; CH3; CH4; CH5; CH6; CH8; CH9; CH14;
CH15; CH16; CH28; CH30; CH31; CH35; CH36; CH37; CH39; CH41 e CH43 são gram
negativos (Tabela 3.3).
20
Tabela 3.3. Classificação dos isolados oriundos dos solos aderidos a cultura de chicória
em gram positivos ou em gram negativos.
Isolados
obtidos nas
amostras de
solo aderidas a
Chicória
CH 1
Gram
Positivo
Gram
Negativo
*
Isolados
obtidos nas
amostras de
solo aderidas
a Chicória
CH 16
Gram
Positivo
Gram
Negativo
*
Isolados
obtidos nas
amostras de
solo aderidas a
Chicória
CH 31
Gram
Positivo
Gram
Negativo
*
CH 2
*
CH 17
*
CH 32
*
CH 3
*
CH 18
*
CH 33
*#
CH 4
*
CH 19
*#
CH 34
*
CH 5
*
CH 20
*
CH 35
CH 6
*
CH 21
*
CH 36
*
CH 22
*
CH 37
*
CH 23
*
CH 38
CH 7
*
CH 8
*
CH 24
*
CH 39
CH 10
CH 9
*#
*
CH 25
*
CH 40
CH 11
*#
CH 26
*
CH 41
CH 12
*
CH 27
*#
CH 13
*
CH 28
CH 14
*
CH 29
CH 15
*
CH 30
CH 42
*
*
*
*
*#
*
*
*
*#
CH 43
*
CH 44
*
CH 45
*#
*, sinaliza o grupo do isolado; #, indica os isolados que apresentaram esporos.
3.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE
CARBONO
Passados os 21 dias de incubação em meio mineral contendo 2,4-D como única
fonte de carbono dos isolados oriundos das amostras de solo aderidas a cultura da chicória,
foi observado o crescimento em 38 destes. Nos outros 7 isolados não houve crescimento.
Para verificar se as amostras realmente não conseguiam sobreviver nas condições
experimentais ou se por um acaso pudesse ter ocorrido falha humana (Por exemplo: a alça
de platina poderia estar muito quente e ter matado o inoculo, não ter esperado o tempo
necessário para a alça esfriar ou na hora de repicar ter pego uma quantidade pequena do
inóculo). Com isso o experimento foi repetido para os 7 isolados que não cresceram no
primeiro experimento. Passados 21 dias apenas o isolado CH39 não cresceu. Ao final do
experimento, 44 dos 45 isolados conseguiram se desenvolver em meio mínimo usando o
2,4-D como única fonte de carbono.
21
4. DISCUSSÃO
Segundo Direito (2009), da mesma forma que os pesticidas podem ser volatilizados
e dispersos pelo vento ou lixiviados, os microrganismos podem ser distribuídos a partir de
um local para quilômetros de distância. Sendo assim, seria possível o isolamento de
bactérias degradadoras do 2,4-D em amostras de solos aderidos a hortaliças
comercializadas no Rio de Janeiro, fosse pelo contato com o herbicida no processo
produtivo ou, posteriormente, pelo transporte da molécula ou dos microrganismos pelo
meio ambiente. Poderíamos ainda atribuir este isolamento a teoria de Singer et al. (2003),
de que similaridades estruturais existentes entre compostos aromáticos oriundos do
metabolismo secundário vegetal e alguns pesticidas podem deixar aptos microrganismos à
utilizar pesticidas como fonte de carbono. Nossos resultados sinalizam que um destes
eventos tornou possível a existência de bactérias capazes de utilizarem 2,4-D como única
fonte de carbono em amostras de solos aderidos às hortaliças utilizadas neste estudo e
comercializadas no Rio de Janeiro.
Os alimentos de origem vegetal são geralmente consumidos na sua forma crua e
têm sido cada vez mais incorporados na dieta humana (Almeida, 2006). Entretanto, a busca
por uma alimentação mais saudável vem aumentando o risco de transmissão de doenças
veiculadas por estes alimentos, em função das condições as quais o produto é exposto
durante o período de produção e distribuição (Madden, 1992). O perfil microbiológico em
alimentos vegetais depende de diversos fatores que vão desde as etapas de produção
primária até o seu preparo para o consumo final (Brackett, 1992). O solo parece ser o
responsável pela maioria das contaminações, seguido da utilização de água não tratada
para irrigação e condições impróprias de lavagem e estocagem (Odumeru et al., 1997).
Estas considerações poderiam explicar a presença das bactérias aderidas às hortaliças neste
estudo, bem como a existência de resíduos de pesticidas.
No Brasil, no Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos
(PARA), foram analisadas 4.345 amostras de hortaliças no período compreendido entre
junho de 2001 e dezembro de 2004 em redes de supermercados das cidades de Belém, Belo
Horizonte, Campo Grande, Curitiba, Florianópolis, Goiânia, Palmas, Porto Alegre, Recife,
Rio de Janeiro, Rio Branco, São Paulo e Vitória. Os resultados desta pesquisa mostraram
que 931 (28%) das amostras de hortaliças apresentaram resultados em desacordo com a
legislação vigente, sendo que, dentre estas, 776 (83%) apresentaram resíduos de uso de
22
pesticida não autorizado para a cultura e 17% com concentrações acima do LMR (Limite
Máximo de Resíduo em mg.kg-1) (Lemes, 2007; apud ANVISA, 2011).
Se por um lado a distribuição dos microrganismos no meio ambiente e a existência
de resíduos de pesticidas corroboram para obtermos sucesso em nosso estudo, por outro,
também a seleção das espécies de hortaliças nos auxiliou para que obtivéssemos os
isolados. Das espécies selecionadas, uma é tubérculo e as outras são hortaliças folhosas
produzidas sobre o solo, ou seja, suas folhas ficam em contato direto com a terra. Podemos
afirmar que houve o contato de nossas amostras com o solo, porque havia resíduos de solo
nas amostras adquiridas nos pontos comerciais. Diferentemente do que seria observado
quando empregadas outras técnicas de cultivo em que a cultura não entra em contato com o
solo integralmente ou parcialmente, como por exemplo, hidroponia e plasticultura,
respectivamente.
Mesmo o 2,4-D não sendo empregado na horticultura, isso não impede que
existam microrganismos capazes de utilizá-lo como fonte de carbono. Como observado por
Direito (2009) em seu estudo, isolados capazes de utilizar 2,4-D como única fonte de
carbono foram obtidos em amostras de solos sem histórico de uso de pesticidas,
demonstrando que a distribuição destes é independente da aplicação nas plantações.
O isolamento de 247 bactérias capazes de degradar o 2,4-D abre novas
possibilidades para o desenvolvimento de recursos a serem empregados na biorremediação
deste herbicida. Neste estudo, os isolados obtidos pela bioprospecção podem ser novas
espécies bacterianas com potencial biotecnológico para degradação de 2,4-D. Contudo,
estudos para caracterizar este potencial de degradação, caracterização de toxicidade ao
homem e a identificação taxonômica são necessários para viabilizarmos o emprego destes
em biorremediação. A biodegradação de 2,4-D é uma perspectiva biotecnológica que pode
trazer benefícios para o meio ambiente.
23
5. CONCLUSÕES
A realização deste trabalho permitiu isolar bactérias capazes de crescerem na
presença do herbicida 2,4-D a partir de amostras de solo aderidas a chicória, alface lisa,
alface crespa, couve e aipim usando meio diferencial MEMB.
Permitiu também identificar culturas bacterianas capazes de crescerem na presença
do herbicida 2,4-D como única fonte de carbono empregando meio mineral, sendo assim
criada uma coleção de culturas de bactérias degradadoras do herbicida 2,4-D. Esta coleção
irá auxiliar os estudos de biodegradação por bactérias e permitir o uso destes em
biorremediação.
Para a continuidade deste trabalho, sugere-se um estudo a nível molecular dos
genes envolvidos no processo de degradação. Também devemos realizar a caracterização
do potencial de degradação dos isolados para posterior aplicação em processos de
biorremediação.
24
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, M. T. T. Avaliação microbiológica de alfaces (Lactuca sativa) em
restaurantes self-service no Município de Limeira – SP. 2006. 91p. Dissertação
apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência
e Tecnologia de Alimentos. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Piracicaba,
2006. Orientador: Cláudio Rosa Gallo.
ALMEIDA, V. E. S.; CARNEIRO, F. F.; VILELA, N. J. Agrotóxicos em hortaliças:
segurança alimentar, riscos socioambientais e políticas públicas para promoção da saúde.
Actas em Saúde Coletiva, vol. 4, n. 4, p. 84-99. 2009.
AMARANTE JUNIOR, O. P. Revisão das propriedades, usos e legislação do ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D). Cad. Pesq., São Luís, v. 13, n. 1, p. 60-70, jun. 2002.
AMARANTE JUNIOR, O. P.; SANTOS, T. C. R.; NUNES, G. S. Breve revisão de
métodos de determinação de resíduos do herbicida ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D).
Departamento de Tecnologia Química, Universidade Federal do Maranhão. Quim. Nova,
Vol. 26, No. 2, 223-229, 2003.
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Programa de Análise de Resíduos de
Agrotóxicos em Alimentos – PARA. Relatório do PARA de 2001-2004. Disponível em
<http://www.anvisa.gov.br/toxicologia/index.htm>. Acesso em 10 junho de 2011.
ARMAS, E. D.; MONTEIRO, R. T. R. Uso de agrotóxicos em cana-de-açúcar na bacia
do rio corumbataí e o risco de poluição hídrica. Centro de Energia Nuclear na
Agricultura, Universidade de São Paulo. Quim. Nova, Vol. 28, No. 6, 975-982, 2005.
BOLLAG, J. M.; LIU, S. Y. Biological transformation process of pesticides. Cheng. H.H.
(Ed.). Pesticides in the soil environmente: processes, impacts and modeling. Solil Science
Society of America, Vol. 2. p.169-210. dez. 1990.
BRACKETT, R. E. Shelf stability and safety of fresh produce as influenced by sanitation
and desinfection. Journal of Food Protection, n.10, p.808-814, abr. 1992.
BRADLEY, S. N.; HAMMILL, T. B.; CRAWFORD, R. L. Biodegradation of agricultural
chemicals. In: HURST, C. J.; KNUDSEN, G. R.; McINERNEY, M. J.; STETZENBACH,
L. D.; WALTER, M. V. Manual of environmental microbiology. United States of
America: ASM Press, 1996. Cap. 91. p. 815-821.
BRITO, G. C. B. A importância da bioprospecção de microrganismos em áreas
contaminadas com produtos derivados do petróleo. Centro Universitário Una – UNA.
Revista em Agronegócios e Meio Ambiente, v.3, n.3, p. 291-310, dez. 2010.
25
CAVALCANTI, A. P. B. Desenvolvimento sustentável e planejamento: bases teóricas e
conceituais. Fortaleza: UFC – Imprensa Universitária, 1997.
CERNIGLIA, C. E. Microbial metabolismo of polycyclic aromatic hydrocarbons.
Advances in Applied Microbiology, San Diego, v. 30, p. 31-71, 1984.
CISCATO, C. H. P. Pesquisa constata resíduos de herbicida em ovos. Faculdade de
Medicina Veterrinária e Zootecnia (FMVZ), da Universidade de São Paulo. Revista
Izunome, v. 43, p.35-37. Jul. 2011.
CHONG, N. M. Development of a tool for measuring the degradation capacity of
microorganisms for a xenobiotic. Enzyme and Microbial Technology, v. 37, p. 467-471.
Mai. 2005.
CLARO, R. M. et al. Renda, preço dos alimentos e participação de frutas e hortaliças na
dieta. Revista de Saúde Pública. São Paulo, v.41, n.4, p.12-20. Ago. 2007.
COUTINHO, C. F. B.; TANIMOTO, S. T.; GALLI, A.; GARBELLINI, G. S.;
TAKAYAMA, M.; AMARAL, R. B.; MAZO, L. H.; AVACA, L. A.; MACHADO, S. A.
S. Pesticidas: Mecanismo de ação, degradação e toxidez. Revista de Ecotoxicologia e
Meio Ambiente. Curitiba, v. 15, p. 65-72, dez. 2005.
DAMIN, V. Biodegradação, sorção e dessorção do herbicida 14C-Diuron em dois
latossolos tratados com lodo de esgoto. 2005. 71p. Dissetação de mestrado em
Agronomia, Área de concentração: Solos e Nutrição de Plantas. Universidade de São
Paulo. Piracicaba, Estado de São Paulo , 2005. Orientador: Arquimedes Lavorenti.
DAMS, R. I. Pesticidas: Usos e perigos à saúde e ao meio ambiente. Revista Saúde e
Ambiente / Health and Environment Journal. Universidade do Vale do Itajaí. Balneário
Camboriú, SC. v. 7, n. 2. Dez. 2006.
DIREITO, I. C. N. Bioprospecção e interações de populações bacterianas
degradadoras do herbicida 2,4-D em solos agrícolas. 2009. 190p. Tese de Doutorado
(Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 2009. Orientadores: Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça
Hagler.
DIREITO, I. C. N. Detecção de genes degradadores de compostos aromáticos em solos
de rizosfera sob manejo convencional e orgânico. 2005. 90p. Dissertação de mestrado
(Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 2005. Orientadores: Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça
Hagler.
26
ELLIS, L. B. M.; ROE, D.; WACKETT, L. P. Biocatalysis/Biodegradation Database: The
First Decade. Nucleic Acids Research, The University of Minnesota. v. 34, p. D17-D521.
Jan. 2006.
ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY – USEPA – U.S. Assessing UST
corrective action technologies: early screenig of clean-up technologies for the
saturated zone. [S. l.]: USEPA, 1990.
FALLER, A. L. K.; FIALHO E. Disponibilidade de polifenóis em frutas e hortaliças
consumidas no Brasil. Departamento de Nutrição Básica e Experimental. Instituto de
Nutrição Josué de Castro. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, RJ,
Brasil. Rev. Saúde Pública, vol.43. no.2 São Paulo Abr. 2009
FARIA, N. M. X.; FACCHINI, L. A.; FASSA, A. G.; TOMASI, E. Trabalho rural e
intoxicações por agrotóxicos. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, vol.43 no.4. p. 12981308. Out. 2004
FEDERATION OF AMERICAN SCIENTISTS.
National Programs Prior to and
During
2006.
World
War
II.
Disponível
em:
<http://www.fas.org/bwc/papers/review/wwii.htm>. Acesso em: 15 mai. 2010.
FIGUEIREDO, I. C. R.; JAIME, P. C.; MONTEIRO, C. A. Fatores associados ao consumo
de frutas, legumes e verdura em adultos da cidade de São Paulo. Revista de Saúde
Pública, São Paulo, v.42, n.5, p.30-36, out.2008.
FOGEL, S.; LANIONE, R. L.; SEWAL, A. E. Enhanced biodegradation of methoxychlor
in soil under sequential environmental conditions. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, v.44, p. 113-120, 2001.
FÜSCHSLIN, H. P.; RÜEGG, I.; VAN DER MEER, J. R.; EGLI, T. Effect of integration
of a GFP reporter gene on fitness of Ralstonia eutropha during growth with 2,4dichlorophenoxyacetic acid. Environmental Microbiology, v. 5, p. 878-887, 2003.
GHINI R.; BETTIOL W. Proteção de Plantas na Africultura Sustentável. Cadernos de
Ciência e Tecnologia. Brasília, 2000, v.17, p.61-70.
GOMES, F. S. Frutas, legumes e verduras: recomendações técnicas versus constructos
sociais. Revista de Nutrição, Campinas, v.20, n.6, p.18-24, nov./dez. 2007.
GONZALEZ, M.; MIGLIORANZA, K. S. B.; MORENO, J. E. A.; MORENO, V. J.
Evaluation of conventionally and organically produced vegetables for high lipophilic
27
organochlorine pesticide (OCP) residues. Food and Chemical Toxicology, v. 43, p. 261269. Fev. 2005.
GUEDES, S. F. Estudo da biodegradação do ácido 2,4-diclorofenoxiacético, um
herbicida selectivo amplamente utilizado na agricultura, por uma estirpe de
penicillium. 210. 280p. Universidade Nova De Lisboa, Faculdade de Ciências e
Tecnologia, Grupo de Disciplinas de Ecologia e Hidrosfera. Tese de mestrado, Monte da
Caparica, 2010. Orientadora: Ana Lúcia Leitão.
GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Apostila de biotecnologia, 2006. Disponivel em:
<http://www.lfdgv.ufsc.br/Apostila%20Biotecnologia.pdf>. Acesso em 10 de mar. 2012.
HE, Y.; XU, J.; TANG, C. W. Y. Facilitation of pentachlorophenol degradation in the
rhizosphere of ryegrass (Loluim perenne L.). Soil Biol. Biochem, vol. 37. n 2. p. 017-.024.
Jul. 2005.
HINSINGER, P.; PLASSARDT, C.; TANG, C. J. B. Origins of root-meidated pH changes
in the rhizosphere and their responses to environmentalm constraints. Plant and Soil, vol.
248. p. 43-59. Mai. 2003.
IBGE. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por região geográfica, 20022003.
Pesquisa
de
Orçamentos
Familiares
(POF).
Disponível
em:
<http://www.ibge.gov.br>. Acesso em 13 mai. 2012.
IBGE. Indicadores de desenvolvimento sustentável. Estudos e Pesquisa, Informação
Geográfica 7. Brasil, 2010.
IBGE. Produção Agrícola Municipal (PAM), 2005, Rio de Janeiro, IBGE. Disponível
em: <www.sidra.ibge.gov.br>. Acesso em 13 mai. 2012.
JACQUES, R.J.S. Characterization of a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading
microbial consortium from a petrochemical sludge landfarming site. Bioremediation
Journal, Philadelphia,v.11, n.1, p.1-11. Jan. 2007.
JAIME, P.C.; MACHADO F. M. S.; WESTPHAL M.F.; MONTEIRO C.A. Educação a
Saúde Pública. Revista de Saúde pública. v.41, n.1, p.154-7, Ago. 2007.
JUNQUEIRA, N. T. V.; TEIXEIRA, R. V. R.; ANJOS, J. R. N.; VERAS, M. C. M.;
NASCIMENTO, A. C.; SHARMA, R. D. Controle das principais doenças do
maracujazeiro no cerrado. Comunicado técnico. Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária, Embrapa Cerrados, n.8, p.1-5. Out. 2000.
28
KEIFER, M.; MAHURIN, R. Chronic neurological effects of pesticides overexposure.
Occup Med. vol. 12. p. 291-304. Jun. 1997.
LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.
industrial. Editora Edgar Blucher Ltda, vol. 3, n 1.p. 48-55. Nov. 2001.
Biotecnologia
LOOS, M. A. Indicator media for microorganisms degrading chlorinated pesticides.
Journal of Microbiology, Canadian, v. 21, p. 104-107. Jun. 1975.
LUNDBERG, I.; HOGBERG, M.; MICHEISEN, H.; NISSE, G. Effects of long term
organophosphate exposure on neurological symptoms, vibration sense and tremor among
South African farmer workers. Occup. Environ. Med. vol. 3. p. 343-350. Mai.1997.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Hábitats microbianos, ciclos de
nutrients e interações com plantas e animais. Microbiologia de Brock. Trad. C.M. Kyan.
10 ed., USA: Prentice Hall, 2004. (Tradução de: Brock biology of microorganisms) Cap.
20. CD-ROM.
MADDEN, J.M. Microbial pathogens in fresh produce: the regulatory perspective.
Journal of Food Protection, Ames, vol. 55, n. 10, p.821-823. Out. 1992.
MARILLEY, L.; ARAGNO, M. Phylogenetic diversity of bacterial communities differing
in degree of proximity of Lolium perenne and Trifolium repens roots. Applied Soil
Ecology, v. 13, p. 127-136. Jul. 1999.
MARTINS, A. Biorremediação. III Fórum de Estudos Contábeis, Faculdades Integradas
Claretianas. Rio Claro, SP. Disponível em: <www.ceset.unicamp.br/lte/artigos/3fec2401>.
Acesso em: 20 ago. 2010.
MELO, L. H. Importância Das Frutas E Hortaliças Na Promoção Da Saúde. 2009.
Disponivel
em
<http://www.artigonal.com/nutricao-artigos/importancia-das-frutas-ehortalicas-na-promocao-da-saude-1551323.html.> Acesso em: 12 de mai. 2012
MELO, P. C. T.; VILELA, N. J. Importância da cadeia produtiva brasileira de
hortaliças. Palestra apresenta pelo 1º autor na 13ª Reunião Ordinária da Câmara Setorial
da Cadeia Produtiva de Hortaliças / MAPA Brasília, DF - 2007.
MONTEIRO, C.A.; MONDINI, L.; COSTA. R.B.L. Mudanças na composição e
adequação nutricional da dieta familiar nas áreas metropolitanas do Brasil. Revista de
Saúde Pública, v.34, n.2, p.51-58. Mar. 2000.
29
MOREIRA, J. C. Avaliação integrada do impacto do uso de agrotóxicos sobre a saúde
humana em uma comunidade agrícola de Nova Friburgo, RJ. Ciência e Saúde Coletiva,
Rio de Janeiro,.vol 2. p. 299-311. Ago. 2004
ODUMERU, J. A. Assessment of the microbiological quality of ready-to-use vegetables
for the health-care food services. Journal of Food Protection, Ames, v. 60, v.8, p. 954960, 1997.
OLIVEIRA, S. J. J.; MEYER, A.; MOREIRA, J. C. Cholinesterase activities determination
in frozen blood samples: An improvement to the occupational monitoring in developing
countries. Human & Environ Toxicology; vol. 15. p.173-177. Set. 2000
ORNELLAS, L. H. Técnica Dietética: seleção e preparo de alimentos. Atheuneu Editora.
7ª ed. São Paulo:, 2001.
REGITANO, J. B.; BONFLEUR, E. J. Pesticides residues in the environment:
processes. II Simpósio Internacional sobre Gerenciamento de Resíduos Agropecuários e
Agroindustriais – II SIGERA 15 a 17 de março de 2011 - Foz do Iguaçu, PR. Volume I –
Palestras.
RODRIGUES, N. R.; ANDRIETTA, M. G. S. Biodegradação do diclosulam por bactérias
isoladas de solos cultivados com soja. Universidade Estadual de Campinas. Planta
Daninha, Viçosa-MG, v. 28, n. 2, p. 393-400, 2010
SAMBROOK, J.; TRITSCH, E. F.; MANIATS, T. Molecular cloning: a laboratory
manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
SANTOS, A. S. R.; Biodiversidade, Bioprospecção, Conhecimento tradicional e futuro
da
.vida.
Centro
de
Computação
da
Unicamp.
Disponivel
em
<http://www.ccuec.unicamp.br/revista/infotec/artigos/silveira.html> Acesso em 14 mar.
2011.
SILVA, M. A.; SOUZA, R.; SOUZA, R. R. Biodegradação de resíduos agrícolas como
alternativa à redução de riscos ambientais no semi-árido sergipano. Cidade
Universitária “Prof. José Aloísio de Campos”, Av. Marechal Rondon, S/N, São Cristóvão –
SE, Brasil, 2002.
SILVA, T. M.; STETS, M. I. Degradation of 2,4-D herbicide by microorganisms isolated
from brazilian contaminated soil. Braz. J. Microbiol. vol.38 no.3 p. 522-525. Jul. 2006.
SINGER, A. C.; CROWLEY, D. E.; THOMPSON, I. P. Secondary plant metabolites in
phytoremediation and biotransformation. Trends in Biotechnology, v. 21, n. 3, p. 123130, 2003.
30
SMALLA, K.; WIELAND, G.; BUCHNER, A.; ZOCK, A.; PARZY, J.; KAISER, S.;
ROSKOT, N.; HEUER, H.; BERG, G. Bulk and rhizosphere soil bacterial communities
studied by denaturing gradient gel electrophoresis: plant-dependent enrichment and
seasonal shifts revealed. Applied and Environmental Microbiology, v. 67, n. 10, p.
4742-4751, Out. 2001.
TADEO, J. L.; SÁNCHEZ, B. C.; BEATRIZ, A. B.; LORENA, G. L. Analysis of
pesticide residues in juice and beverages. Critical Rev. Analytical Chem;. v 34. p. 121131. Jan. 2004.
TRIGUEIRO, M. G. S. Bioprospecção; uma nova fronteira da sociedade, 2009.
Disponivel em:
<http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=Bioprospec%C3%A7%C3%A3o%3B%20
uma%20nova%20fronteira%20da%20sociedade%2C&source=web&cd=1&ved=0CFAQFj
AA&url=http%3A%2F%2Fwww.sbsociologia.com.br%2Fportal%2Findex.php%3Foption
%3Dcom_docman%26task%3Ddoc_download%26gid%3D3001%26Itemid%3D171&ei=1
b3vT9dh59brAZvXrKsG&usg=AFQjCNG32ajZRhjI3frSCC3eyA_smho-gw&cad=rja>.
Acesso em 18 de abr. 2012.
VALLA, V. V. Procurando compreender a fala das classes populares. Saúde e Educação.
vol 5. p. 38-46, 2000.
VEIGA, M. M. Agrotóxicos: Eficiência econômica e injustiça socioambiental, 2007.
Disponível em < redalyc.uaemex.mx/pdf/630/63012113.pdf>. Acesso em 03 de set. 2011.
VIEIRA, E. M.; PRADO, A. G. S. Estudo da adsorção/dessorção do ácido 2,4
diclorofenoxiacético (2,4d) em solo na ausência e presença de matéria orgânica. Química
Nova, vol. 22. p. 305-308. Nov. 1998.
WILSON.
Biodiversidade,
1997.
Disponível
em
<
http://www.ccuec.unicamp.br/revista/infotec/artigos/silveira.html>. Acesso em 07 de jul.
2011
YANG, C. F.; LEE, C. M.; WANG, C. C. Isolation and physiological characterization of
the pentachorolophenol degrading bacterium Sphingomonas chlorophenolica.
Chemosphere, v. 62: p. 709-714, 2006.
31
ANEXO I
Meios de cultura
1) Meio de cultura MEMB (Chong, 2005)
10 g Peptona
2 g K2HPO4
3,25 mg Azul de Metileno
40 mg Eosina B
300 mg Extrato de Levedura
300 mg 2,4-D
15 g Agar (para meio sólido)
Misturar todos os reagentes, com exceção do 2,4-D, até que fique homogêneo.
Completar o volume com água destilada para 1000 mL. Adicionar o 2,4-D. Autoclavar
por 15 min.
2) Meio de cultura 2,4-D (Füschslin et al., 2003)
275 mg NH4Cl
75 mg MgSO4.7H2O
5 mg CaCl2.H2O
35 mg KCl
1,5 mg FeCl2
60 µg H3BO3
100 µg MnCl2.4H2O
Fração autoclavável
120µg CoCl2.6H2O
70µg ZnCl2
25µg NiCl2.6H2O
15µg CuCl2.2H2O
25µg Na2MoO4.2H2O
5,2 mg EDTA.Na4(H2O)4
500 mg 2,4-D
100 mL Tampão fosfato (Na2HPO4.2H2O/KH2PO4 0,56 M pH 7,5)
0,05 mL Solução estoque de vitaminas
15 g Agar (para meio sólido)
Modo de preparo do meio de cultura 2,4-D: Misturar todos os reagentes da fração
autoclavável até que fique homogêneo. Completar o volume com água destilada para
900 mL. Para o meio sólido adicionar o agar. Autoclavar por 15 min. Quando a fração
autoclavável estiver com aproximadamente 60 ºC adicione por filtração (porosidade de
0,22 µm) o tampão fosfato, a solução estoque de vitaminas e o 2,4-D. A solução de
vitaminas pode ser diluída no tampão fosfato para a filtragem e adição à base mineral do
meio. O 2,4-D deve ser diluído em 2 mL de etanol e filtrado em um novo filtro para
evitar a precipitação do mesmo. Deve ser realizada a homogenização do meio e sua
distribuição.
Reagentes do tampão fosfato (Na2HPO4.2H2O/KH2PO4 0,56 M pH 7,5):
850 mL Na2HPO4.2H2O 1 M
150 mL KH2PO4 1 M
32
Modo de preparo do tampão fosfato: Misturar os reagentes até que fique homogêneo.
Ajustar o volume para 1000 mL com água destilada.
Reagentes da solução estoque de vitaminas:
100 mg Piridoxina-HCl
50 mg Tiamina-HCl
50 mg Riboflavina
50 mg Ácido nicotínico
50 mg Ácido D-Ca-pantotênico
50 mg Ácido p-amino benzóico
50 mg Ácido lipóico
50 mg Nicotinamida
50 mg Vitamina B12
20 mg Biotina
20 mg Ácido fólico
Água destilada suficiente para completar o volume para 1000 mL de solução.
Modo de preparo da solução estoque de vitaminas: Misturar todos os reagentes até que
fique homogêneo. Ajustar o volume para 1000 mL com água destilada. Armazenar sob
refrigeração (4 ºC).
3) Meio de cultura LB (Sambrook et al., 1989)
10 g Triptona
5 g Extrato de Levedura
10 g NaCl
15 g Agar (para meio sólido)
Misturar todos os reagentes até que fique homogêneo. Completar o volume com água
destilada para 1000 mL. Ajustar para pH 7,0 com NaOH. Autoclavar por 15 min.