UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO-CCB
UNIVERSIDADE
FEDERAL
PERNAMBUCO-CCB
DEPARTAMENTO
DEDE
GENÉTICA
DEPARTAMENTO
DE GENÉTICA
PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM GENÉTICA
PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM GENÉTICA
Disciplina
de Genética Molecular
Disciplina
dePaulo
Genética
Molecular
Professor
Andrade
Professor Paulo Andrade
Anticorpos Monoclonais
Nanocorpos
Proteína Vif e Imunização intracelular
HIV-I
• Tem capacidade de infectar células com
receptor específico CD4 e co-receptores
CCR5 e CXCR4 que se encontram na
superfície das células T (linfócitos) CD4
(Klatsmann et al..1984) além de outras
células que apresentam estes receptores
como monócitos, macrófagos, lifócitos B e
células dendríticas
Proteína Vif
• Fator de Infecção Viral (Vif)
– Proteína acessória do do HIV para bloquear a ação do
Apobec3g (citidina deaminase) que torna o HIV-I não infeccioso
promovendo hipermutações GA durante a síntese do DNA
viral
– Proteína fosfolrilada multimérica que se encontra
maioritariamente no citoplasma das células infectadas
(Golçalves et al.1994)
– Peso molecular 23 Kdaltons (192 aminiácidos)
– Atua nos últimos estágios da replicação viral aumentando de 50
a 1000 vezes a infecção (Fisher et al., 1987; Strebel et al., 1987)
– Na ausência de Vif os vírus têm a capacidade de iniciar a
transcrição reversa, no entanto, não conseguem completar a
síntese do DNA
Apobec3g
• O Apobec3G é uma proteína da família das citidina
deaminases que tem a capacidade de converter
citosinas em uracilos por perda de um grupo amina,
provocando uma alteração de C-G; A-T (Sheehy et
al.,2002; Mariani et al., 2003)
• Hipermutações na cadeia negativa do DNA viral.
• Desencadeia um processo de reparação do DNA por
excisão de bases comprometendo a integridade da
estrutura da cadeia simples de DNA viral resultando na
interrupção da transcrição.
• Na presença de Vif, esta proteína viral interage com o
Apobec3G, prevenindo a seu encapsulamento,
protegendo o genoma viral de eventuais mutações.
Solução terapêutica Gênica
• Desenvolvimento de anticorpos
recombinantes de cadeia única (scFv)
específicos contra o Vif
Obstáculos
• Expressão intracelular dos anticorpos é
confrontado por:
– Diminuição da solubilidade
– Níveis de expressão
– Tempo de meia-vida
– Instabilidade da ligação entre VH e VL
• Impedem a capacidade de neutralização
da proteína alvo
• Anticorpos de cadeia única VH ou VL
Alternativa
• Construção de anticorpos de
domínio único baseados nas
características dos anticorpos de
cadeia pesada dos camelos (VHH)
– solubilidade e estabilidade elevadas devido a
substituições específicas dos aminoácidos
(Phe-37, Glu-44, Arg-45, Gly-47 e Arg-103) na
região correspondente a interação com VL
– Aminoácidos hidrofóbicos  hidrofílicos
Anticorpos de cadeia pesada de camelo
• Anticorpos com apenas um par de cadeias pesadas nos
gêneros Tylopoda (dromedários, camelos e lhamas)
• Não apresentam cadeia leve, e a cadeia pesada
apresenta apenas três domínios, pois o equivalente ao
primeiro domínio constante (CH1) está ausente
• Apresenta um domínio variável também na região Nterminal, denominado VHH, seguindo-se os dois
domínios CH2 e CH3 (Muyldermans, 2001a,b).
• A ausência do domínio VL nos anticorpos IgG VHH retira
teoricamente aproximadamente metade do potencial de
ligação ao antígenio. Esta perda foi no entanto
compensada com uma CDR3 mais longa (loop com 17
resíduos) do que a dos humanos (12 resíduos).
Anticorpos de cadeia pesada de camelo
• Substituições específicas de aminoácidos, na região
correspondente à interação com o domínio VL (Vu, et al,
1997) localizadas na FR2 e FR4 (Phe-37, Glu-44, Arg45, Gly-47 e Arg103)
• Aumento da hidrofilicidade dos VHH nesta região,
melhorando a solubilidade dos anticorpos dos
dromedários, camelos e lhamas (Muyldermans,
2001a,b).
• Os domínios VHH representam a mais pequena unidade
de ligação ao antígeno com um tamanho molecular
perto de 15 kDa em comparação com os fragmentos
scFv (30 kDa), fragmentos Fab (60 kDa ) e o anticorpo
inteiro (150kDa).
Região determinante de complementaridade CDR
Fr (Frameworks)
OBJETIVOS
• Desenvolvimento de anticorpos de
domínio único VH anti-Vif de coelho
menores e robustos que mantenham as
suas propriedade de ligação e
neutralização do antígeno (Vif) no
ambiente redutor do citoplasma
Domínio VH anti-Vif
• Domínio VH anti-Vif de um dos anticorpos
isolados que apresentou uma das afinidades
mais elevadas e que inibiu a replicação do HIV1 (Goncalves et al., 2002). O fragmento VH foi
clonado no vetor pComb3X (Barbas et al.,
2001).
• Plasmídeo pComb3X-VH foi introduzido em
células de E. coli TOP 10F’ Ampr.
Domínio VH anti-Vif
• A indução da expressão do domínio VH
– IPTG. Após 18 horas
– purificação por cromatografia de afinidade.
– Aproximadamente 80% do domínio VH
expresso está localizado na fração insolúvel..
Camelização do domínio VH anti-Vif
• Mutações na região de interface.
• Em anticorpos de camelo,estes aminoácidos são
substituídos pelo resíduos Phe-37, Glu-44, Arg-45 e Gly47 (Muyldermans, 2001).
• Trp-103 situado na FR4
• Três mutantes denominados, VH-W, VH-CAM e VH-D,
Camelização do domínio VH anti-Vif
• Método de Kundel, utilizando oligonucleótideos que
introduzem a mutação desejada e sequência alvo para
uma enzima de restrição.
• VH-W  mutação W103R na FR4 do domínio VH antiVif.
• VH-CAM,  mutações V37F, G44E, L44R e W47G
dentro da FR2.
• VH-D todas as mutações descritas foram introduzidas
no domínio VH anti-Vif (V37F, G44E, L44R, W47G e
W103R).
• Os resultados de expressão e purificação demonstram
que a solubilidade do domínio VH vai aumentando à
medida que o processo de camelização aumenta
(W_CAM_ D) (Aires da Silva et al., 2004).
Camelização do domínio VH anti-Vif
Avaliação da especificidade e
afinidade dos domínios VH anti-Vif
• Para avaliar se o domínio VH selvagem e o mutantes
construídos mantinham a mesma especificidade e
afinidade na ausência do domínio VL, realizaram-se
ensaios de ELISA
• VH e VHs camelizados apresentaram uma diminuição
de ~50% na capacidade de ligação ao Vif.
• O decréscimo na afinidade dos VHs anti-Vif não
aparenta ser dramático na avaliação do domínios únicos
de coelho como anticorpos intracelulares, permitindo
mesmo assim um reconhecimento específico da
proteína Vif do VIH-1 (Aires da Silva et al., 2004).
Expressão dos domínios VH em células
eucariontes
• VH, VH-W, VH-CAM e VH-D foi clonado no vetor
pcDNA3.1.
• Os plasmídeos resultantes destas clonagens,
designados por pcDNA3.1-VH,pcDNA3.1-VH-W,
pcDNA3.1-VH-CAM, e pcDNA3.1-VH-D, foram
utilizados para transfectar células 293T.
• Após 48 horas de transfecção, as células foram
lisadas e os domínios VH expressos foram
imunoprecipitados com a matriz anti-HA.
Expressão dos domínios VH em células
eucariontes
• VH-CAM e o VH-D foram os dois domínios
que apresentaram os níveis de expressão
mais elevados e significativos.
• Células eucariontes há correlação entre o
aumento da solubilidade e níveis de
expressão dos domínios VH, com o
aumento da camelização (W_ CAM_ D)
(Aires da Silva et al., 2004).
Expressão dos domínios VH em células
eucariontes
• Tempo de meia vida - níveis de expressão dos VHs no
ambiente redutor de células eucariontes  pulse-chase.
• pcDNA3.1-VH-W, pcDNA3.1-VH-CAM e pcDNA3.1-D, as
células (293T) incubadas meio sem metionina/cisteína
durante 2 horas e de seguida marcadas
metabolicamente com [35S] metionina/cisteína.
• Incubação com meio suplementado com excesso de
metionina (40x) e cisteína (20x) durante vários períodos.
A expressão da proteína foi analisada após
imunoprecipitação com a matriz anti-HA e electroforese
em gel de SDS-PAGE.
Expressão dos domínios VH em células
eucariontes
Domínios VH anti-Vif impedem a síntese
de ADN viral e inibem a degradação do
Apobec3G
• O PCR em tempo real, oligonucleótideos específicos
– vírus VIH-1 foram produzidos em células 293T na presença de
Apobec3G
– plasmídeos pcDNA3.1-VH, pcDNA3.1-VH-W, pcDNA3.1VHCAM, pcDNA3.1-VH-D ou pcDNA3.1-4BL. Infectar células
Hela CD4.
• Pico na fase inicial da transcrição reversa entre as 9
horas e 12 horas.
• O domínio VH selvagem e domínio VH-W SEM EFEITO
• VH-CAM, VH-D e scFv-4BL EFEITO NEGATIVO na
eficiência da síntese tardia da transcrição reversa.
Domínios VH anti-Vif impedem a síntese
de ADN viral e inibem a degradação do
Apobec3G
• Diminuição na integração do provírus mais
acentuada na presença do domínio VH-D
e scFv-4BL.
• Confirmam que os domínios mais solúveis
e estáveis são os que apresentam a maior
capacidade de inibição da replicação viral
(Aires da Silva et al., 2004).
CONCLUSÃO
• A terapia gênica é uma nova estratégia de
medicina molecular com enormes
potencialidades na terapêutica de doenças
infecciosas e cancerígenas (Cattaneo & Biocca,
1997).
• A imunização intracelular através da expressão
de zonas variáveis de anticorpos dentro do
citoplasma da célula, é uma estratégia cujo
objetivo é neutralizar proteínas essenciais a
processos biológicos.
CONCLUSÃO
• Têm sido propostos uma variedade de métodos
para obter estes pequenos fragmentos de
anticorpos, ou anticorpos de cadeia única
(scFv).
• Estes anticorpos apresentam normalmente uma
especificidade e afinidade idêntica à molécula
inteira do anticorpo. No entanto, as regiões de
ligação aos antígenos (CDR) dos anticorpos
clássicos apresentam desvantagens.
CONCLUSÃO cont.
• Os resultados de expressão mostraram
que existe uma excelente correlação entre
o aumento da solubilidade dos domínios
VH, com o aumento da camelização (W_
CAM_ D).
CONCLUSÃO cont.
• Os resultados obtidos com o ensaio de
pulse-chase indicaram também que o
processo de camelização do domínio VH
anti-Vif tem um papel importante não só
no aumento da solubilidade e expressão
como também melhora a estabilidade e
tempo de vida intracelular dos domínios
CONCLUSÃO cont.
• Os resultados obtidos neste estudo abrem
novas perspectivas na área da
manipulação de anticorpos intracelulares.
A camelização de domínios VH de coelho
poderá ser assim uma nova abordagem
para desenvolver anticorpos mais
pequenos, robustos e eficientes na
neutralização da proteína alvo.
• Muito Obrigado!!!